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CINCIA EQUATORIAL

Artigo Original

ISSN 2179-9563 Volume 2 - Nmero 1 - 1 Semestre 2012

REVISO TERICA DAS TCNICAS UTILIZADAS NA DETECO DE ENTEROTOXINAS ESTAFILOCCICAS


Tiago Fernando Chaves

RESUMO A intoxicao alimentar estafiloccica provocada pela ingesto de enterotoxinas pr-formadas no alimento contaminado. So toxinas denominadas de enterotoxinas estafiloccicas (EE). Enterotoxina A a mais relacionada a casos e surtos de intoxicao alimentar, Staphylococcus aureus coagulase-positiva o principal agente de intoxicao alimentar. Identificar a EE relevante na elucidao de surtos de doenas alimentares, podendo indicar a fonte de contaminao. Ferramentas empregadas na deteco de EE so cruciais nas pesquisas, divididas em mtodos biolgicos e imunolgicos. Os mtodos imunolgicos so simples e de baixo custo, OSP sensvel na avaliao de EE. Nos ensaios biolgicos as EE so detectadas pela sua atividade emtica in vivo. ELISA rpido, sensvel e permite analisar grande volume de amostras simultaneamente. A tcnica Western blot usada para anlise de protenas detectando EE. RPLA consiste no anticorpo especfico ligado covalentemente ao ltex, misturado com a amostra onde se h ou no aglutinao. Na imunodifuso a protena e um anticorpo especfico difundem por um gel, formando linha de positividade. A PCR tem resultado imediato. Na avaliao da melhor escolha para a deteco de EE os mtodos imunoqumicos so sensveis, especficos, prticos, rpidos e bem vistos, e proporcionando analisar grande nmero de materiais. Palavras-chave: Enterotoxinas, Staphylococcus spp., Intoxicao Alimentar, Deteco de Enterotoxinas.

THEORETICAL REVIEW OF TECHNIQUES USED IN STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXINS

ABSTRACT The staphylococcal food poisoning is caused by ingestion of enterotoxinspreformed in contaminated food. They are called toxins staphylococcalenterotoxin (SE). A enterotoxin is more related to cases and outbreaks of food poisoning, coagulase-positive Staphylococcus aureus is the main agent of food poisoning. Identify the EE is relevant in the elucidation of outbreaks offoodborne illness, which may indicate the source of contamination. Tools usedin the detection of EE are crucial in the polls, divided into biological and immunological methods. Immunological methods are simple and inexpensive, the OSP is sensitive in the evaluation of EE. In biological assays the EE are detected by their emetic activity in vivo. ELISA is rapid, sensitive and allows to analyze large volumes of samples simultaneously. The Western blot techniqueis used to analyze proteins by detecting EE. RPLA is the specific antibodycovalently bound to latex mixed with the sample in which whether or notagglutination. In immunodiffusion protein and an antibody specific for a diffusegel, positive forming line. PCR has an immediate result. In the evaluation of the best choice for the detection of the EE immunochemical methods are sensitive, specific, practical, quick and well viewed, and analyzing providing large number of materials. Keywords: Enterotoxins, Staphylococcus spp., Food poisoning, Detection of enterot.

INTRODUO A intoxicao alimentar estafiloccica provocada pela ingesto de enterotoxinas pr-formadas no alimento contaminado essencialmente atravs da manipulao humana, ou da matria-prima obtida de animais. So toxinas denominadas de enterotoxinas estafiloccicas (EE), pertencentes famlia de exotoxinas pirognicas, com uma relao filogentica comum e seqncias homlogas, so protenas extracelulares de baixo peso molecular (25.000 a 30.000 daltons), hidrossolveis, compostas por aminocidos, estrutura molecular e atividades farmacolgicas semelhantes entre si, possuindo, propriedades imunolgicas distintas (LEBEAU, 1994; CUNHA, 2006). Enterotoxina A (sea) a mais relacionada a casos e surtos de intoxicao alimentar, sendo responsvel por mais de 75% dos surtos, seguida, em ordem decrescente de freqncia, por EED, EEC e EEB (BALABAN; RASOOLY, 2000; VERNOZY-ROZAND, 2004). Staphylococcus aureus coagulasepositiva o o principal agente de intoxicao alimentar, embora alguns pesquisadores enfatizem que os estafilococos coagulasenegativos (ECN) so capazes de produzir enterotoxinas estafiloccicas, e devido a estarem envolvidos em uma variedade de infeces humanas e animais, podem ser um potencial causador de intoxicao alimentar (CUNHA, 2006). Muito pouco se sabe sobre o crescimento do ECN em alimentos, esses microrganismos tm sido raramente envolvidos em intoxicaes alimentares, porque eles no crescem rapidamente em alimentos, no entanto ECN podem contaminar os alimentos, porque os seres humanos so portadores comuns desses microrganismos e alguns podem ser relacionados a determinadas infeces humanas (CUNHA, 2006). A determinao do tipo de enterotoxinas estafiloccicas de estrema importncia na elucidao de casos e surtos de doenas alimentares sendo que sua identificao nos alimentos indica possvel fonte de contaminao (LANCETTE; BENNETT, 2001; NJERA-SANCHEZ, 2003). Estudos recentes relacionam as EEA e EEB esto
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associadas com contaminao humana, atravs de manipuladores de alimentos, e as EEC e EED ocasionalmente associadas com contaminao animal, geralmente bovino e suno (NJERA-SANCHEZ; CENCI-GOGA, 2003). Devido a esses riscos de contaminaes as indstrias de alimentos necessitam de mtodos rpidos e confiveis para determinar a microbiota especifica e o potencial risco patognico nos produtos. Com isso, as ferramentas para a deteco de EE so cruciais nas investigaes de fontes de surtos de intoxicaes alimentares, mesmo tendo vantagens e desvantagens no seu emprego. Ferramentas baseadas em cidos nucleicos, como a reao em cadeia da polimerase (PCR), podem ter grande impacto para resultados imediato, pelo fato de a PCR detectar uma regio nica de um genoma bacteriano, a tcnica demonstra maior especificidade quando comparada com os mtodos microbiolgicos tradicionais. (VAN DER ZEE, 1997). A utilizao de tcnicas in vivo uma ferramenta baseada em ensaios biolgicos, onde o uso de animais fonte de investigao dessas EE, suas desvantagens destacam se a variao na sensibilidade dos animais, a incapacidade de diferenciao entre os sorotipos das enterotoxinas, o desenvolvimento de resistncia do organismo e o alto custo dos ensaios (SANTILIANO et al, 2011). Ensaios imunolgicos tambm ferramentas utilizadas na deteco de EE em alimentos, dentre eles o ELISA (Enzymelinked Immunosorbent Assay), destaca se devido sua simplicidade e sensibilidade, sendo baseado no uso de anticorpos policlonais ou monoclonais especficos para as enterotoxinas, o ELISA utiliza uma matriz slida, sendo normalmente padronizado em microplacas ou em esferas de poliestireno revestidas com anticorpo permitindo uma fcil visualizao de resultados e pode ser finalizado sem a adio de materiais radioativos (DORO et al, 2004). O Western blot outra ferramenta que se baseiam em deteco imunolgica, sendo amplamente usada para anlise de protenas, permitindo assim ser usado para detectar EE. A
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Aglutinao Reversa Passiva em Ltex (RPLAReversed Passive Latex Agglutinations) outra ferramenta baseada em ensaio imunolgico, anticorpos especficos aderidos a partculas de ltex, apresentando uma sensibilidade de 1 ng/mL (WONG, 2002). Uma ferramenta de referncia a imunodifuso, que requer de trs a dez dias para obteno dos resultados. Neste mtodo, a protena e um anticorpo especfico difundem por um gel e a reao entre ambas as forma uma linha de precipitao caracterstica de positividade na deteco das toxinas (SANTILIANO et al, 2011). A tcnica de Sensibilidade tima em Placas (OSP- Optimum Sensitivy Plate) permite a deteco de 0,5 ug de EE/mL, sendo sua sensibilidade adequada para maioria das cepas enterotoxignicas, no sendo possvel detectar linhagens pouco produtoras (WONG; BERGDOLL, 2002).

STAPHYLOCOCCUS Observados pela primeira vez de um material purulento em 1878 por Robert Kock, onde sua publicao no ano 1881 caracterizava a sua forma de cocos e sua presena em abscessos agudos e crnicos. A relao dos Staphylococcus spp. com surtos de intoxicao alimentar s foi evidencia em 1884, no Michigan, EUA, devido a casos onde ocorreu consumo de queijo tipo cheddar contaminado com estafilococos (PEREIRA et al., 2000). De acordo com Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, o gnero Staphylococcus (do grego staphyle = cacho de uvas e coccus = semente ou gro) pertence famlia Micrococcaceae (KONEMAN et al., 2001) se apresentando em forma de coco onde tendem formar agrupamento semelhante a cachos de uva, so bactrias Gram positivas, com dimetro variando entre 0,5 e 1,5 m, imveis e no formam esporos, possuem metabolismo fermentativo e respiratrio, mesfilos com temperatura de crescimento entre 7 e 47,8C e temperatura tima entre 40 e 45C, seu pH ideal para crescimento entre 7 a 7,5, porem eventualmente ocorre sua multiplicao em alimentos com pH na faixa entre 4,2 e 9,3, so capazes de sobreviver e se multiplicar em uma
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concentrao de cloreto de sdio de at 15%, so nicos com a capacidade de se multiplicarem em substratos com baixos nveis de atividade de gua, em torno 0,86 com relatos de crescimento em 0,83, valores inferiores ao considerados mnimos para outros grupos de bactrias halfilas. O gnero dividido em dois grupos com base na produo da coagulase; as espcies coagulasenegativas so distinguidas das S. aureus, S. delphini, S. intermedius, S. schleiferi coagulans e algumas cepas de S. hyicus (coagulase-positiva) pela sua incapacidade de coagular plasma de coelho, as bactrias pertencentes ao gnero Staphylococcus so sensveis ao da lisostafina, caracterstica esta que permite a sua diferenciao do gnero Micrococcus (TRABULSI et al., 2002). Diferem tambm dos Micrococcus spp. por serem oxidase-negativa, fermentarem glicose em anaerobiose, possurem cido teicico como constituinte de sua parede celular e DNA com contedo bastante reduzido de Guanina + Citosina (GC) (30 a 39%) (ANDRADE, 2008), Staphylococcus spp. tem uma distribuio ubiquitria, seu reservatrio primrio so as membranas mucosas e pele, especialmente a regio naso-farngea de mamferos e aves, o gnero atualmente compreende 41 espcies e 24 subespcies, entre seus representantes 20 so associados a uma ampla variedade de infeces de carter oportunista, em seres humanos e animais (KONEMAN et al., 2001). Entre as trs principais espcies de cocos Gram positivos patognicas para o homem esto: S. aureus, S. epidermidis e S. saprophyticus (TRABULSI et al., 2002), sendo que o S. Aureus a espcie mais virulenta e o patgeno com maior relevncia sendo ele responsvel por uma imensa quantidade de problemas mdicos, incluindo infeces de pele e tecidos moles, infeces de stios cirrgicos, endocardites e bacteremias adquiridas em hospitais. Um grande nmero de infeces j foi relatado por conta do desenvolvimento de procedimentos mdicos, incluindo o uso de prteses, imunossupressores e cateteres (CASEY; LAMBERT; ELLIOTT, 2007). Entretanto a incidncia de infeces causadas por estafilococos coagulase-negativa vem aumentando em todo o mundo (SAKAI, 2004.
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EUSBY, 2009). No gado, a infeco pelo Staphylococcus spp. provoca a mastite estafiloccica, vindo a contaminar o leite a ser consumido ou utilizado no preparo de seus derivados, podendo causar intoxicao alimentar (FRANCO; LANDGRAF, 2002).

ENTEROTOXINAS ESTAFILOCCICAS As enterotoxinas compreendem uma famlia de mltiplos sorotipos (Sea-See SegSej) sendo 18 diferentes EE, com sua classificao baseada nas suas caractersticas antignicas. Porm recentes estudos complementam as novas descobertas de enterotoxinas sendo elas SEK, SEL, SEM, SEM, SEO, SEP, SEQ, SER e SEU. A filogentica existente entre as enterotoxinas estimada pela anlise da seqncia de nucleotdeos de seus respectivos genes, onde a heterogeneidade das toxinas produzidas devese a uma seleo gentica para a modificao das seqncias de seus aminocidos, suas cadeias polipeptdicas apresentam quantidades apreciveis de lisina, acido asprtico, cido glutmico e tirosina. Seqncias divergentes das EE possibilitaram dividi-las hierrquica em dois grupos distintos. O grupo que consiste em genes codificadores da EEA, EEE, EED, tendo uma homologia de seqncia na sua cadeia de aminocidos variando entre 51 e 81%. E o outro grupo compreende a EEC, EEB, com uma seqncia homloga de 42 a 67%. EEJ, bem como as EEI e EEH foram caracterizadas recentemente com uma homologia com as outras enterotoxinas variando entre 52 e 66% e 31 e 38%, respectivamente. Os genes das EE so controlados por um complexo sistema global regulatrio, o gene acessrio regulador (agr), atuam em combinao com o acessrio regulador estafilococal (sar) , genes seb, sec e sed tm sido demonstrados como agr dependentes, enquanto os sea e sej como agr independentes. A expresso do agrdependente em alimentos est correlacionada com quantidade de S. aureus e aos fatores ambientais (LOIR et al., 2003; WONG, 2002). Estes genes so carreados por plasmdios - sed e sej, por fagos - sea e see, ou pelo cromossomo - seb, sec, seg, seh, sei, sek, sel,
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sem, sen, seo, sep e seq (LETERTRE et al., 2003). Caracterstica importante das EE a resistncia inativao por proteases gastrointestinais, a ao da pepsina, caracterstica que explica a capacidade de permanecerem ativas aps sua ingesto e a manuteno de sua atividade em certos alimentos, a produo de enterotoxinas acontece em concentraes de sal de at 10%, sua termoestabilidade, extremamente importante em termos de segurana alimentar, uma vez que elas permanecero ativas no alimento mesmo aps seu processamento trmico (JARRAUD, 2001; DINGES, 2000; ZOCCHE, 2005), essa termoestabilidade das EE tem grande influencia do meio onde esteja inserida e podem ser sensveis a variao do pH, concentrao salina e dentre outros fatores ambientais correlacionados ao nvel de desnaturao da toxina, enterotoxinas termorresistentes so produzidas em temperaturas entre 10 e 46C, baixas temperaturas pode ser usada no controle da produo de enterotoxinas, pois a multiplicao bacteriana diminui e a sntese de enterotoxinas quase totalmente inibida.(SORIANO, 2002;BALABAN; RASOOLY, 2000). As EE tm propriedades superantignicas, de onde vem a denominao de superantgenos, esses antgenos no so processados e apresentados pelos macrfagos, em associao com a molcula do complexo de histocompatibilidade da classe II (MHC II), porm possuem a capacidade de interagir ao mesmo tempo com essa molcula e com o receptor dos linfcitos auxiliares que as reconhecem. Devido a essas caractersticas, os superantgenos unem macrfagos e linfcitos T, mas como no so preparados pelos macrfagos, esta unio indiscriminada, formando-se muitos pares de macrfagos e linfcitos T. pelo fato de ocorrer esse tipo de associao, expressiva quantidade de linfcitos T so simultaneamente estimulados, ocorrendo elevada produo de interleucina 2 (IL-2), onde em grande quantidade, entra para a corrente sangnea, ocasionando uma variedade de sintomas, como febre, nuseas e vmitos. Ocorrendo a proliferao abundante de linfcitos T e a conseqente produo
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excessiva de IL-2 determinam a produo excessiva de outras interleucinas, o que pode resultar em choque, processo que torna as EE semelhante toxina da sndrome do choque txico (TSST-1) (TRABULSI; TEIXEIRA, 2004). Outros dois mecanismos de ao so apresentados em estudos relacionados ingesto das enterotoxinas e a ocorrncia de sintomas patognicos. Depois de ingeridas, as EE ligam-se aos seus receptores que esto localizados no intestino. Gerando estmulos que so transferidos atravs dos nervos vago e simptico at o centro do vmito, induzindo o retroperistaltismo do estmago e do intestino delgado. O outro mecanismo sugerido e pouco elucidado, parece se relacionar a ativao de um mecanismo secretor de sdio e cloro, provocando um desequilbrio hidroeletroltico no intestino, por conseqncia ocasionando a diarria (FRANCO; LANDGRAF, 2002). Enterotoxina A (sea) responsvel pela maioria dos casos de intoxicaes em humanos, com doses to baixas quanto 100 ng da protena, capaz de promover surtos alimentares (EVENSON et al., 1988) e uma concentrao equivalente a 1pg por mililitro de SEA desencadeia a proliferao de linfcitos de ratos e humanos in vitro, ela considerada a EE principal pelos surtos alimentares em todo o mundo (RASOOLY,1997; BALABAN, 2000).

INTOXICAO ESTAFILOCCICA

ALIMENTAR

Doenas transmitidas por alimentos (DTA) tm um grande impacto na sade pblica. Segundo o Centro para o Controle e Preveno de Doenas CDC - Center for Diseases Control a cada ano, nos Estados Unidos, entre 76 a 80 milhes de pessoas sejam afetadas por essas doenas, gerando em torno de 325 mil internaes hospitalares e causando 5.200 mortes (Center for Diseases Control, 2009) e um custo entre 5 e 17 bilhes de dlares com medicamentos, internamentos e queda na produtividade (SANTANA et al, 2010) sendo que 4,5% das DTAs que ocorrem anualmente nos Estados Unidos da America se atribuem ao o S. aureus (U.S. Departament of Agriculture, 2004). J na Frana, 1.267 surtos
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de doenas veiculadas por alimentos ocorreram nos anos de 1999 a 2000, totalizando 17.378 indivduos afetados, e 1.383 hospitalizaes com um bito, no Brasil, anualmente so notificados cerca de 620 surtos em media, gerando 12 mil casos de DTAs, entre os anos de 2009 a 2010 foram notificados aproximadamente 1700 surtos alimentares e 1800 casos, sendo no segundo ano as notificaes somam a metade do primeiro no numero de surtos (ANVISA, 2011). De acordo com o Sistema de Informao sobre Mortalidade (SIM), de 1999 a 2002, ocorreram 25.281 bitos por DTAs, com uma mdia de 6.320 bitos/ano e um custo entorno de 280 milhes de reais com internamento entre 1999 a 2004, mdia de 46 milhes de reais ao ano (SANTANA et al. 2010). Se tratando das intoxicaes estafiloccicas sua real frequncia no Brasil desconhecida, devido a erros de diagnsticos, por serem similares a outras intoxicaes (Bacillus cereus - toxina do vmito); por coletas inadequadas, exames laboratoriais imprprios ou investigaes epidemiolgicas inadequadas dos surtos, e por ser uma doena de notificao no compulsria. Dos casos onde o a gente etiolgico foram identificados nos surtos alimentares de 2000 a outubro de 2011, S. aureus foi o segundo microrganismo mais envolvido, estando presente em 800 surtos (ANVISA, 2011). No estado de So Paulo foram notificados 25 surtos por S. aureus, envolvendo quase 200 pessoas, nos anos de 2001 e 2002, em Minas Gerais entre ao nos de 1995 a 2001 foram 12.820 pessoas intoxicadas causando 17 mortes aps ao ingerirem alimentos contaminados por EE, segundo o Instituto Panamericano de Proteo dos Alimentos e Zoonoses nos anos de 1993 a 2002, foram notificados 18 surtos de intoxicao estafiloccica envolvendo produtos lcteos (BALABAN; RASOOLY, 2000). Intoxicao alimentar estafiloccica resultado da ingesto de alimentos contaminados com EE. Leite e derivados lcteos, como leite cru, leite pasteurizado, leite UHT e queijos, so os alimentos mais envolvidos com intoxicao alimentar estafiloccicas, no entanto, tortas recheadas com creme, saladas de batata, atum, frango e
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derivados crneos, podem ser veculos do microrganismo e de suas enterotoxinas (FRANCO; LANDGRAF, 2002; CENCIGOGA, 2003). A intoxicao estafiloccica raramente letal, sendo que as fatalidades da intoxicao ocorrem ocasionalmente em indivduos debilitados imunologicamente, idosos so mais susceptveis do que os jovens. Em determinados casos, a intoxicao alimentar estafiloccicas pode causar morte devido a complicaes secundrias. Tento como principais sintomas da intoxicao estafiloccicas, as nuseas, vmitos, sudorese abdominais, diarria, clicas, dores de cabea e, ate mesmo podendo ocorrer diminuio da temperatura corporal. Sintomas desencadeados, em mdia, a partir de cerca de 4 horas aps ingesto do alimento contaminado, variando de 1 a 6 horas, geralmente durando, 24 a 48 horas (JAY, 1992; FRANCO; LANDGRAF, 2002). No de 2000, 13.420 pessoas foram afetadas por um surto de intoxicao ao consumirem leite desnatado no Japo, anlises comprovaram que o alimento estava contaminado com enterotoxinas A produzidas por estafilococos (IKEDA et al., 2005). Embora ECN possam produzir quantidades menores de EE quando comparada com S. aureus, esses microrganismos no devem ser excludos da investigao quando a ocorrncia em surtos de intoxicaes alimentares (SANTANA et al.,2010).

DETECO DE ENTEROTOXINAS ESTAFILOCCICAS Para deteco de enterotoxinas estafiloccicas, vrios mtodos foram desenvolvidos como os biolgicos e imunolgicos. Os mtodos imunolgicos so mais sensveis e especficos (SU e WONG, 1997) e utilizam anticorpos monoclonais e policlonais especficos para identificao das EEs (LANCETTE e TATINI, 1992). O maior problema na identificao da enterotoxinas estafiloccicas em alimentos a pequena quantidade que encontrada no alimento relacionado a surtos de intoxicao alimentar. O primeiro teste sorolgico desenvolvido foi o
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mtodo de imunodifuso baseado na reao em gel da enterotoxina com anticorpo especifico, formando uma linha de precipitao (WONG e BERGDOLL, 2002). A tcnica de OSP permite a deteco de 0,5 ug de EE/mL, sendo sua sensibilidade adequada para maioria das cepas enterotoxignicas (PEREIRA et al., 2001). A utilizao de tcnicas de produo e concentrao como cellophane-over-agar podem aumentar a sensibilidade para 0,1ug/mL (CUNHA et al., 1996). A tcnica de OSP foi desenvolvida com o objetivo de promover um teste com maior sensibilidade, de maneira a no comprometer a visualizao da linha de precipitao. O mtodo de imunodifuso em microlminas (microslide) o mais sensvel na imunodifuso em gel, tendo a capacidade de detectar de 0,05 a 0,1ug/ml, embora apresente resultados de difcil interpretao. A tcnica de ELISA , atualmente, a mais utilizada para deteco de enterotoxinas estafiloccicas. Vrios tipos de ELISA foram desenvolvidos, sendo o ELISA sanduche o mtodo mais comum (SANTOS, 2003), podendo detectar menos de 1ng de EE por mL de sobrenadante (FREED et al., 1982). Para pesquisa de enterotoxinas em alimentos, esto disponveis uma srie de Kits comerciais sendo a maioria baseada na tcnica de ELISA e com sensibilidade variando entre 0,1 e 1 ng / mL (SU e WONG, 1997). A tcnica de RPLA baseada em anticorpos especficos aderidos a partculas de ltex, apresentando uma sensibilidade de 1ng/mL. Tcnicas como a reao em cadeia pela polimerase (PCR) pde ser aplicada para deteco de diversos tipos de estafilococos enterotoxignicos em culturas e alimentos (WONG e BERGDOLL, 2002). Metodos Imunolgicos Tradicionais So mtodos de ensaios imunolgicos simples e de baixo custo que se fundamentalizam se na capacidade do antgeno (enterotoxina) interagir com anticorpos policlonais especficos, consistindo a formao de um precipitado denominado precipitina. A interao do antigeno-anticorpo, incorporados em uma placa de gar ou agarose, determinara o aparecimento do precipitado, surgindo uma banda ou linha branca, sendo que a distncia percorrida por essa unio diretamente coesifo
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quantidade de antgeno, quando os dois componentes so dispostos separadamente, no suporte de Agar ou agarose e se difundem um em direo ao outro, a tcnica denominada imunodifuo dupla, quando ele unidirecional denomina se imunodifuso simples (SANTILIANO, 2011). O procedimento imunolgico "microslide gel double diffusion test"(micro imunodifuso e lmina), onde pequenas quantidade e reagentes utilizados conferem certa sensibilidade e agilidade reao, essa ferramenta permite evidenciar a presena de EE diretamente da amostra testada. Desvantagens da tcnica e de exigir uma prvia separao da amostra, em consequncia aumento do tempo de anlise e requer pessoal especialmente capacitado para a execuo. A metodologia "Optimun Sensitivity Plate- OSP" (Sensibilidade tima em Placa) considerada adequadamente sensvel para a avaliao de linhagens enterotoxignicas, detectando entre 0,5- 1,o ng de enterotoxina, sendo ento menos sensvel que a tcnica de micro imunodifuso em lmina, entretanto sua execuo e leitura so mais facilitadas. A tcnica permite a deteco de 0,5 ug de EE, sendo que sua sensibilidade adequada para maioria das cepas enterotoxignicas (WONG e BERGDOLL, 2002), no possibilitando detectar linhagens pouco produtoras. A utilizao de tcnicas de produo e concentrao como cellophane-over-agar podem aumentar a sensibilidade para 0,1ug/mL (CUNHA et al., 1996). A tcnica de OSP foi desenvolvida com o objetivo de promover um teste com maior sensibilidade, de maneira a no comprometer a visualizao da linha de precipitao. Sabe-se que fatores como o tipo e a concentrao do agar, quantidade distribuda na placa, tamanho e localizao dos poos e a concentrao do antisoro e toxina podem influenciar na sensibilidade e resoluo do teste (SANTANA, 2006). Reao em Cadeia da Polimerase PCR A reao em cadeia da polimerase (PCR) desenvolvida inicialmente por Kary B. Mullis, em 1985, consiste em uma tcnica relativamente simples, pela qual molculas de
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DNA ou cDNA so enzimaticamente amplificadas milhares ou milhes de vezes de uma forma bastante rpida, procedimento realizado in vitro, gerando DNA em quantidade suficiente para anlises posteriores. Ela extremamente sensvel, possibilitando a amplificao de DNA a partir de uma mnima quantidade de amostra. Com essa caracterstica se tem se tornado uma excelente ferramenta de pesquisa bsica, e nas mais complexas, como em testes de identificao gentica, medicina forense, diagnstico de doenas infecciosas, controle de qualidade industrial, entre outros (ZAHA, 2003; KONEMAN, 2001). A base para uma reao de amplificao consiste em DNA com a sequncia alvo a ser amplificada, uma DNA-polimerase termoestvel, dois oligonucleotdeos iniciadores, desoxirribonucleotdeos (dNTPs), tampo de reao e concentrao adequada de MgCl2. Os componentes da reao so misturados e a amostra colocada em um termociclador que possibilita a alternncia de temperaturas por determinados perodos de tempo permitindo a ocorrncia de ciclos repetitivos de desnaturao e sntese do DNA (KONEMAN et al., 2001). A aplicao dessa tecnologia originou diversos estudos na busca de mtodos mais eficazes para a diferenciao e identificao de microrganismos, bem como de genes responsveis pela expresso de toxinas microbianas, um expressivo e diverso numero de trabalhos sugerem a utilizao da PCR, tento como alvos sequencias especficas do genoma microbiano para serem utilizadas como marcadores genticos, com isso o PCR vem se tornando o mais utilizado e popular mtodo gentico para diagnstico microbiolgico. O inicio da utilizao dessa tcnica em diagnstico microbiano proporcionou uma alternativa vivel aos mtodos tradicionais de cultura e aos testes imunolgicos, apresentando inmeras vantagens em relao s tcnicas convencionais, como maior eficincia na tipificao e discriminao, maior rapidez, e significativo limite de deteco, alta seletividade, especificidade, potencial para automao e a possibilidade de trabalhar com bactrias que no so cultivveis em meios de cultura utilizados normalmente (BUSH;
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NITSCHKO, 1999). Os aspectos negativos que trazem desvantagens para sua implementao rotineira em laboratorial esto relacionadas incapacidade em diferenciar clulas vivas de clulas mortas, a presena de inibidores de polimerase em alguns alimentos, o alto investimento em equipamentos e reagentes e a falta de aprovao, padronizao e regulamentao por parte de organizaes oficiais (MALORNY et al., 2003). Modificaes da tcnica PCR bsica j so amplamente difundidas, a RT-PCR (reverse transcriptase PCR) desenvolvida para amplificar RNA, onde nesse processo o RNA alvo primeiramente convertido em DNA complementar (cDNA) pela ao de uma enzima transcriptase (RT) e este cDNA amplificado por PCR (TANG; PERSING, 1999). J a nested PCR, a tcnica onde so realizados variados ciclos de amplificao com um grupo de primers e o produto dessa amplificao amplificado, utilizando-se outro grupo de primers dirigidos para uma seqncia que se encontra dentro da seqncia amplificada pelo primeiro grupo de primers. Se tratando do Polimorfismo de seqncias de DNA amplificadas ao acaso ou DNA polimrfico amplificado ao acaso (RAPD, random amplified polymorphic DNA ou APPCR, arbitrarily primed PCR), ocorre o uso de um nico e pequeno primer, escolhido para amplificar DNA genmico em condies de baixa estringncia, no sendo necessrio o conhecimento prvio da regio de ligao do primer. Apenas a regies genmicas entre duas seqncias flanqueantes ao primer ser amplificada, outra modificao se trata do Real time PCR, ou PCR em tempo real, que consiste em um sistema combinatrio a utilizao de um termociclador automatizado, com a habilidade de detectar, em tempo real, seqncias alvo utilizando a fluorescncia com o uso de sondas, quando formados os produtos hbridos, por fim a tcnica na qual se utiliza mais de um par de primers na mesma reao, o multiplex-PCR, possibilitando a amplificao simultnea de mais de uma seqncia de DNA (TANG; PERSING, 1999). Deteco Baseada em Ensaios Biolgicos

Nessa tcnica a maiorias dos ensaios biolgicos emprega uso de primatas (Macaca mullata), gatos e cobaias. As enterotoxinas so detectadas pela sua atividade emtica in vivo ou in vitro (cultura de tecido). As amostras suspeitas so aplicadas intragastricamente no modelo animal e os efeitos emticos podem ocorrer em at cinco horas aps ingesto, caso a amostra contenha alguma enterotoxina. O mtodo trs desvantagens quanto variao na sensibilidade dos animais, a inabilidade de diferenciao entre os sorotipos das enterotoxinas, o desenvolvimento de resistncia em animais a repetidas administraes, e o alto custo dos ensaios (SANTILIANO, 2011). Nos gatos, EEC s de produzir efeitos emticos quando utilizada cinco vezes acima da concentrao de EEA ou EEB, outras substncias txicas distintas da EE so encontrados no meio de cultura e so capazes de causar vmitos nestes animais, gerando assim resultados que requerem anlises mais cruciais. A injeo cutnea de toxina aps injeo intravenosa com azul de Evans (1%) em cobaias sensibilizadas com imunoglobulina E anti-EEB resulta na produo de uma rea sensibilizada de aproximadamente 5 mm de dimetro. Sendo assim possvel detectar 10 pg de enterotoxina em dez a quinze minutos, porm impraticvel o uso deste ensaio para analisar um grande nmero de amostras para EEB (ANDRADE, 2009). Deteco Baseada em Ensaio Enzimtico Imunoabsorvente Uma das ferramentas fundamental na deteco de agentes biolgicos o ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) se baseasse nos princpios de interaes antgenoanticorpo, esse tcnica permite uma fcil visualizao de resultados e pode ser finalizado sem a adio de materiais radioativos. O ELISA foi introduzido por SAUNDERS; BARTLETT (1977) para deteco de EEA. Sua maior vantagem a sensibilidade. Utiliza enzimas marcadoras, as quais devem apresentar grande estabilidade, especificidade, disponibilidade na forma pura, custo acessvel e formar produto final quantificvel. Variedades dessas tcnicas
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qualitativas para deteco de toxinas esto disponveis no mercado, incluindo tcnicas de ensaios imunoabsorventes radioativos e os kits EIA (enzyme immunosorbent assay), a disponveis kits de mtodos rpidos para a deteco de EE, sendo aqui citados alguns: SET-RPLA (Oxoid);BOMMELI SET-EIA (Dr Bommeli AG); RIDASCREEN SET (RBiopharm GmbH);TRANSIA (Transia Dffchamb- SA) e o VIDAS- SET (bioMrieux). VERNOZY-ROZAND, compararam especificidade e sensibilidade de trs kits (VIDAS SET - bioMrieux, VIDAS SET2 bioMrieux e TRANSIA PLATE Diffchamb, Lon, France) disponveis no mercado para deteco de EE, onde em seus ensaios em diversos tipos de alimentos, como cozidos, produtos do mar crus, enlatados, lquidos, desidratados e derivados do leite. Nesses alimentos, apenas os crus apresentaram falsopositivos, com especificidade de 82% e 78%, para os kits, VIDAS SET e TRANSIA PLATE, concomitantemente. Tratando se da sensibilidade, o kit VIDAS SET2 foi o mais eficiente gerando resultados comparveis com os imunoensaios Western blot ressaltando que os tempos necessrios para realizar os ensaios so de oitenta minutos para VIDAS SET e VIDAS SET2 e cento e quarenta e cinco minutos para TRANSIA PLATE. Os dois primeiros, por serem automatizados, podem ser incorporados no programa Hazard Critical Controle Point, e serem usados para anlise de enterotoxinas em larga escala. Os mtodos quantitativos tambm esto presentes. Estudos estabeleceram um imunoensaio especfico e quantitativo, utilizando anticorpos monoclonais num sistema, baseado no ELISA sanduche, o ABSELISA (avidin-biotin sandwich ELISA). A ferramenta sensvel e confivel. Pesquisas desenvolveram um mtodo sensvel e mais rpido que utiliza um sistema de dois anticorpos onde um anticorpo policlonal antiEEB est ligado a esferas magnticas e o outro, um anticorpo monoclonal anti-EEB marcado, est ligado com Alexa flor 647 (VERNOZY-ROZAND, 1996). A pesquisa cientfica com os microchips consiste em arranjos de microelementos individuais contendo vrias
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sondas, os microchips permitem anlises paralelas de amostras, para diversos parmetros, utilizando baixas quantidades de material. No entanto, essas anlises so feitas de forma sensvel, segura e eficiente onde os resultados dos imunoensaios podem ser alcanados por vrios mtodos, como intensidade de fluorescncia, pela intensidade de quimioluminescncia da protena conjugada a peroxidase e por espectrometria de massa direta dos elementos do microchip (LIMA, 2005).

Deteco Por Western Blot A tcnica Western blot um mtodo amplamente usado para anlise de protenas e, assim, tem sido usado para detectar EEA e EEC (ORDEM, 1992). Utilizando um imunoblot, as protenas so separadas por tamanho usando a eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sdio (SDS) ou por ponto isoeltrico usando gel de enfoque isoeltrico, transferido para uma membrana, e posteriormente sendo incubada com anticorpos especficos. Assim como ELISA, o Western blot se baseia em deteco imunolgica, apresentando duas vantagens para testes em alimentos. Primeiro, mesmo que o tratamento trmico possa causar agregados proticos, os agregados so solubilizados e desenovelados em gel de SDS. E enfim, a reao cruzada entre antgenos pode ser caracterizada em Western blot, enquanto no ELISA, eles apenas aumentam o background (SANTILIANO, 2011). Deteco Por Aglutinao Em Ltex Os testes de aglutinao em ltex tm amplamente utilizados para vrios alvos e mesmo no serem mtodos padres de deteco tm mostrado alta sensibilidade e especificidade, na comparao com outros mtodos de deteco so mais cleres, o tempo varia de um minuto a dezesseis horas, econmicos e fceis de utilizar, alm de no necessitarem de equipamentos sofisticados ou reagentes de custos mais elevados. Nesse mtodo de deteco, o anticorpo especfico
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ligado covalentemente ao ltex misturado com a amostra suspeita e monitorado se h ou no aglutinao. A presena de antgeno na amostra permite reconhecimento pelo anticorpo e aglutinao do complexo formado no ltex (LEE et al., 2004). Deteco por Imunodifuso O mtodo de imunodifuso ou tcnica de Ouchterlony foi desenvolvido por CASMAN e requer de trs a dez dias para obteno dos resultados. A protena e um anticorpo especfico difundem por um gel e a reao entre ambos, formando uma linha de precipitao caracterstica de positividade. Este mtodo detecta cerca de 500 ng/mL de enterotoxina no material suspeito. A tcnica aprovada pela Associao Oficial de Anlises Qumicas (AOAC), adotada pelo FDA (Food and Drug Administration) e recomendada como mtodo padro para avaliao de novos ensaios. Variaes do mtodo so utilizadas nas tcnicas de microlmina e tima sensibilidade em placa (IGARASHI et al., 1996).

ANLISE COMPARATIVA ENTRE OS PRINCIPAIS MTODOS DE DETECO ELISA vem sendo o mtodo mais amplamente empregado nas pesquisas de deteco de toxinas de S. aureus, por sua caracterstica de ser um mtodo rpido, sensvel e que permite analisar um grande volume de amostras simultaneamente. Em contradio suas limitaes ao uso, como a necessidade de equipamentos especiais para a visualizao dos resultados, relativamente caro para a anlise de um pequeno nmero de amostras e alguns de seus componentes podem reagir inapropriadamente de acordo com a composio da amostra utilizada (ZOCCHE, 2011). Focalizao isoeltrica e radioimunoensaio tambm podem detectar toxinas isoladas de pacientes, esta metodologia altamente sensvel, mas no muito especfica na diferenciao das diferentes toxinas relacionadas sndrome. ORDEN em suas
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pesquisas descreve uma tcnica de imunoblotting combinada com um sistema de eletroforese semiautomatizada para a deteco de enterotoxinas em extratos alimentares. Consistindo em um teste rpido, onde as protenas so detectadas com base na reao com anticorpos especficos e na determinao da massa molecular evitando-se assim o surgimento de resultados falso-positivos gerados pela interferncia da protena A e com protenas contaminantes (ORDEN, 2004). Western Blot seria um mtodo vantajoso para amostras de alimento. Alimentos depois de aquecidos podem apresentar agregao de protenas que devem ser solubilizadas em gel contendo SDS o que desnaturaria o anticorpo, sendo ineficaz em testes de ELISA onde os anticorpos so aplicados diretamente sobre a protena. Reaes cruzadas podem ser identificadas, pois possvel visualizar o tamanho da protena que reconhecida pelo anticorpo utilizado. O teste de ELISA muito utilizado por ser simples, sensvel, rpido e disponvel em vrios kits comerciais, mas possui algumas limitaes: no reage bem em amostras de alimentos aquecidos durante o processamento, podendo gerar resultado falso-negativo; dependendo do tipo de alimento, reaes cruzadas podem acontecer gerando um resultado falso-positivo; e, perxidos presentes naturalmente em certos alimentos podem reagir com os cromgenos presentes no ensaio de ELISA (SANTILIANO, 2011). O mtodo de RPLA tem sido utilizado na deteco de toxinas de S. aureus, mostrando-se como um mtodo simples e sensvel para a deteco de TSST-1. No necessrio o uso de equipamentos especiais para visualizao dos resultados que so prontamente visveis atravs da aglutinao das partculas de ltex sensibilizadas quando na presena do antgeno alvo e utilizam quantidades mnimas de anticorpo para a sensibilizao das partculas (IGARASHI et al., 1996). Diversos trabalhos tm relatado a utilizao da tcnica da PCR na deteco de EE, utilizando seqncias especficas para o gene codificante, ou atravs de sistemas de PCR multiplex. Estes sistemas permitiriam a deteco rpida e especfica de diferentes
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genes codificadores de exotoxinas em Staphylococcus spp. Esta tcnica conviria na identificao de cepas portadoras dos genes para toxina e independe da expresso e secreo da toxina, onde seriam mais teis os mtodos imunolgicos (LVSETH; LONCAREVIC; BERDAL; 2004).

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CONCLUSSO As vrias tcnicas e ferramentas descritas na literatura para a deteco de enterotoxinas estafiloccicas, trazem vantagens e desvantagens. Os mtodos biolgicos apesar de serem tcnicas empregadas nas primeiras investigaes de EE, ainda so utilizados, entretanto, so inutilizveis quando se deseja determinar a classe da toxina em questo e seu emprego e na deteco de enterotoxinas em um grande nmero de amostras se torna totalmente inexecutvel. Na avaliao da melhor escolha para a deteco de EE os mtodos os mtodos imunoqumicos, como o Western blot, imunodifuso em gar, ELISA, aglutinao em ltex, PCR, microarranjos, alem de serem mais modernos so sensveis, especficos, prticos, rpidos e bem vistos. E seu suas caractersticas proporcionam analisar um grande nmero de materiais, embora necessitem de certos equipamentos, reagentes e de padres para resultados confiveis.

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1 Tiago Fernando Chaves Bacharel em Cincias Biolgicas Universidade do Oeste de Santa Catarina - UNOESC Campus de So Miguel do Oeste SC Curso de Cincias Biolgicas-nfase em Biotecnologia Email: tiagochavo@msn.com

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