EFECTO DE LA DILUCIN, REFRIGERACIN Y CRIOPRESERVACIN DEL SEMEN OVINO SOBRE CAMBIOS CELULARES RELACIONADOS CON LA CAPACITACIN ESPERMTICA

POR: M.V.Z. CARLOS OCTAVIO AVILA COTA

Tesis presentada como requisito parcial para obtener el grado de Maestro en Ciencias

Universidad Autnoma de Chihuahua Facultad de Zootecnia Secretara de Investigacin y Posgrado

Chihuahua, Chih., Mxico

Junio 2006

40 Efecto de la dilucin, refrigeracin y criopreservacin del semen ovino sobre cambios celulares relacionados con la capacitacin espermtica. Tesis presentada por el M.V.Z. Carlos Octavio Avila Cota, como requisito parcial para obtener el grado de Maestro en Ciencias

M. A. Javier Martnez Nevrez Director de la Facultad de Zootecnia

Ph. D. Felipe Alonso Rodrguez Almeida Secretario de Investigacin y Posgrado

Ing. Francisco Javier Camarillo Acosta Coordinador Acadmico de Investigacin y Posgrado

Ph. D. Felipe Alonso Rodrguez Almeida Presidente

Fecha

Comit: Ph. D. Felipe Alonso Rodrguez Almeida M. C. Alfredo Anchondo Garay Ph. D. Jorge Alfonso Jimnez Castro Ph. D. Alma Delia Alarcn Rojo

40 AGRADECIMIENTOS A mi familia, Octavio Avila Camargo, Leticia Cota Soto, Nadya Leticia Avila Cota y Nubia Liliana Avila Cota, quienes impulsaron el desarrollo de mi formacin acadmica apoyndome en todo momento y llenndome de su cario. A Vernica, que siempre estuvo a mi lado llenndome de su amor incondicional, siendo un impulso para seguir adelante. Al Ph.D. Felipe Alonso Rodrguez Almeida, por brindarme la oportunidad de ser parte de su equipo y colaborar en una de sus investigaciones. Al CONACYT, por el apoyo econmico aportado para realizar mis estudios de maestra. A la Facultad de Zootecnia de la UACH, por el aporte de sus instalaciones durante el desarrollo de mis estudios de maestra. A la Facultad de Ciencias Qumicas, por facilitarme el uso de sus instalaciones durante la realizacin de este trabajo. Al Ph.D. Juan A. Ortega, Ph.D. Jorge Jimnez, M.C. Alfredo Anchondo, M.C. Leonardo Carlos, Ph.D. Alma Alarcn, M.A. Javier Martnez y al M.C. Manuel Prez por sus consejos, enseanza y apoyo brindado durante la realizacin de mis estudios. A mis amigos, Luis ngel Olivas, Jos Manuel Oropeza, Manuel Nieblas, Gildardo Gil, Rodolfo Gastelum, Alfonso Prieto, Eleazar Rivas y Carlos Ayala, por su apoyo y todos los ratos agradables que pasamos juntos. A Coralia Manzanilla Pech, por su compaa, gran amistad y apoyo incondicional.

40 A mi gran amigo Wenceslao Csme Reyes, por su gran amistad, apoyo incondicional y principalmente su valiosa colaboracin en la realizacin de este trabajo. A la Ph.D. Blanca Snchez, por su asesora y entrenamiento para el uso del microscopio con iluminacin azul violeta en la evaluacin de la capacitacin espermtica A la seora Consuelo Benavides por su gran amistad y ayuda incondicional.

40 DEDICATORIA A la Familia Avila Cota, por ser el estandarte que me conduce a seguir adelante y obtener lo que me propongo. Todo mi esfuerzo se v reflejado en este trabajo y es un orgullo podrselos brindar. Ustedes saben el amor y cario que les tengo, es por eso que todo esto lo hago por ustedes.

40 CURRICULUM VITAE El autor naci el 4 de noviembre de 1980 en Navojoa, Son., Mxico. 1998-2003 Estudios de Licenciatura en el Instituto Tecnolgico de Sonora, obteniendo el ttulo de Mdico Veterinario

Zootecnista. 2003-2005 Estudiante Graduado de la Secretara de Investigacin y Posgrado de la Facultad de Zootecnia de la Universidad Autnoma de Chihuahua.

40 RESUMEN EFECTO DE LA DILUCIN, REFRIGERACIN Y CRIOPRESERVACIN DEL SEMEN OVINO SOBRE CAMBIOS CELULARES RELACIONADOS CON LA CAPACITACIN ESPERMTICA EN EL SEMEN OVINO POR: M.V.Z. CARLOS OCTAVIO AVILA COTA Facultad de Zootecnia Universidad Autnoma de Chihuahua Secretara de Investigacin y Posgrado rea Mayor: Reproduccin y Gentica Animal Presidente: Ph. D. Felipe Alonso Rodrguez Almeida El objetivo fue cuantificar la capacitacin espermtica en semen fresco, refrigerado y congelado en diferentes tiempos. Se utilizaron tres sementales jvenes y tres adultos de cada una de las razas Pelibuey y Blackbelly. Se obtuvieron 5 eyaculados por semental mediante vagina artificial, con un periodo de descanso entre sesin de al menos 3 d. En algunos de ellos se obtuvieron 2 eyaculados por sesin. Cada eyaculado se diluy con citrato de sodio, fructosa, yema de huevo y penicilina-estreptomicina, y se dividi en 3 alcuotas. Una muestra se conserv como semen fresco a 36 C (F) y se evalu a las 3 (F3) y 6 h (F6). Una segunda alcuota se conserv bajo refrigeracin a 5 C (R) y se evalu a las 3 (R3), 6 (R6) y 24 h (R24). A la tercera alcuota se le agreg una segunda fraccin del diluyente utilizado mas glicerol y se congel (CON) en nitrgeno lquido. Las muestras se evaluaron para motilidad progresiva (MP) y posteriormente se purificaron por el mtodo de gradientes de Percoll y se

40 evaluaron para los patrones del ensayo de epifluorescencia de clortetraciclina (CTC): patrn B, espermatozoides capacitados con acrosoma intacto; y patrn RA, espermatozoides capacitados con reaccin acrosomal. Para el anlisis estadstico, se ajust un modelo que incluy los efectos fijos de la subclase tipotiempo de conservacin (TTC), raza del semental, edad del semental (adulto y joven), las interacciones dobles y triple entre estos efectos, y los efectos aleatorios del semental dentro de raza por edad, y la interaccin del semental por TTC dentro de raza por edad. Las medias de los cuadrados mnimos para el porcentaje del patrn B fueron 23.9, 30.8, 32.8, 42.5, 44.5 y 36.6 (EE = 2.3; P < 0.01) para F3, F6, R3, R6, R24, y CON, respectivamente. Hubo efecto de la interaccin de TTC por edad del semental para el patrn RA. La media del porcentaje de patrn RA fue mayor (P < 0.01) en los sementales jvenes que en los adultos en el semen refrigerado por 24 h (27.8 1.6 vs 19.8 1.6) y en el semen congelado (33.9 1.6 vs 26.3 1.6), pero no en las dems subclases de TTC. La MP se redujo (P < 0.01) a las 6 h de conservacin a 36 C y con el congelado, comparado con el resto de las subclases de TTC. En conclusin, el semen fresco se conserva bien durante 3 h, pero la motilidad se reduce a las 6 h si el semen no se refrigera. La criopreservacin incrementa el porcentaje de espermatozoides capacitados con reaccin acrosomal y disminuye la MP.

40 ABSTRACT EFFECT OF DILUTION, REFRIGERATION AND CRYOPRESERVATION ON CAPACITATION-LIKE CHANGES IN RAM SPERMATOZOA The objective was to quantify capacitation-like changes on spermatozoa of diluted, refrigerated and frozen ram semen at different time periods. Three young (1 yr old) and three adult rams of each Pelibuey and Blackbelly hair sheep breeds were used. Five ejaculations in sessions at least 3 d apart were obtained per ram using an artificial vagina. In some cases two ejaculations per session were obtained. Each ejaculation sample was diluted with a Na-citrateyolk-fructose-penicillin-streptomycin base extender and divided into three aliquots. One sample was conserved as fresh semen in a digital water bath at 36C and was evaluated at 3 (F3) and 6 h (F6). A second aliquot was cooled at 5C and evaluated at 3 (R3), 6 (R6) and 24 h (R24). The third aliquot was added with a second part of the extender (Na-citrate-yolk-fructose-penicillinstreptomycin + glycerol) and frozen (FN) in liquid nitrogen. The sample was then thawed for evaluation. Evaluation was for sperm progressive motility (PM) and for patterns B (acrosome intact capacitated spermatozoa) and AR (acrosome reacted spermatozoa) of the chlortetracicline epifluorescence assay (CTC). A linear model with fixed effects of type-time subclass of preservation (PRE), breed of ram, age of ram (young and adult), double and triple interactions among those effects, and random effects of ram within breed by age, and interaction of ram by PRE within breed by age subclasses, was adjusted. Least squares means for the B pattern percentages were 23.9, 30.8, 32.8, 42.5, 44.5 and 36.6 (SE = 2.3; P < 0.01) for F3, F6, R3, R6, R24, and FN,

40 respectively. There was an interaction effect of PRE by age of ram for pattern AR. The mean percentage of the AR pattern was greater (P< 0.01) for the young than for the adult rams in refrigerated semen at 24 h (27.8 1.6 vs 19.8 1.6) and in frozen semen (33.9 1.6 vs 26.3 1.6), but not for the rest of PRE levels. Progressive motility of spermatozoa was reduced (P < 0.01) with dilution at 36 C for 6 h and with freezing, in comparison to the remaining PRE levels. In conclusion, fresh diluted semen is well preserved for 3 h but progressive motility is reduced at 6 h if semen is not refrigerated. Freezing increases

acrosome reacted spermatozoa and decreases progressive motility.

40 CONTENIDO Pgina RESUMEN...... ABSTRACT..... LISTA DE CUADROS.... vi viii xii

LISTA DE GRFICAS xiii INTRODUCCIN REVISIN DE LITERATURA... Aspectos Generales de la Criopreservacin de Semen... Capacitacin Espermtica (CE) in vivo........... Conservacin y Capacitacin Prematura del Semen Ovino. Semen fresco..... Semen refrigerado........ Semen congelado......... Mtodos para la Determinacin de la Capacitacin Espermtica... Imagen de fase de contraste y microscopio diferencial 16 1 3 3 4 8 8 8 10 15

interferencial de contraste (DIC).....

Tintes para microscopio de campo brillante...... 17 Rtulo por fluorescencia....... 18 MATERIALES Y MTODOS.... Descripcin del rea de Estudio.......... 21 21

Descripcin de la Poblacin.......... 21 Recoleccin del Semen..... 21

40 Evaluacin Microscpica del Semen....... Motilidad progresiva...... Porcentaje de clulas vivas......... Porcentaje de clulas anormales....... Determinacin de la concentracin espermtica......... Diseo del Experimento........ Nmero de Pajillas por Eyaculado... Dilucin y Enfriamiento.......... Envasado y Congelado...... Evaluacin Posdescongelado....... Purificacin del Semen...... Concentracin espermtica........ Determinacin de la Capacitacin Espermtica (CE).......... Anlisis Estadstico........ RESULTADOS Y DISCUSIN.... Motilidad Progresiva (MP)......... Espermatozoides Capacitados con Acrosoma Intacto (Patrn B)...... Espermatozoides Capacitados con Reaccin Acrosomal (Patrn RA).. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES.... LITERATURA CITADA.. 22 22 22 23 23 24 24 26 26 26 28 31 31 33 35 35 37 42 46 47

40 LISTA DE CUADROS Cuadro 1 2 3 4 5 CRITERIOS ESTABLECIDOS PARA INCLUIR UNA MUESTRA DE SEMEN EN EL ESTUDIO..... COMPOSICIN DEL DILUYENTE UTILIZADO PARA LA CRIOPRESERVACIN DEL SEMEN COMPOSICIN DEL PERCOLL AL 90 % PARA LA PURIFICACIN DEL SEMEN. COMPOSICIN DEL SPERM TL SIN ALBUMINA SRICA BOVINA PARA DILUIR EL PERCOLL... COMPOSICIN DEL MEDIO DE FERTILIZACIN PARA DILUIR LA CONCENTRACIN ESPERMTICA.. Pgina 25 27 29 30 32

40 LISTA DE GRFICAS Grfica 1 Medias de los cuadrados mnimos ( error estndar) para el porcentaje de motilidad progresiva en diferentes subclases tipotiempo de conservacin.. cuadrados mnimos ( error estndar) 2 Medias de los para el porcentaje motilidad progresiva por raza del semental......................................................................... 3 Medias de los cuadrados mnimos ( error estndar) para el porcentaje de espermatozoides capacitados con acrosoma intacto (Patrn B) en diferentes subclases tipo-tiempo de conservacin. 4 Medias de los cuadrados mnimos ( error estndar) para el porcentaje de espermatozoides capacitados con acrosoma intacto (Patrn B) por raza del semental. 5 Medias de los cuadrados mnimos ( error estndar) para el porcentaje de espermatozoides capacitados con reaccin acrosomal (Patron RA) por edad del semental en diferentes subclases tipo-tiempo de conservacin.......... Pgina

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40 INTRODUCCIN El uso de biotecnologas como la transferencia de embriones y la inseminacin artificial (IA) en la ovinocultura es una excelente alternativa para mejorar la calidad gentica de los animales, al permitir acelerar

considerablemente el flujo de material gentico superior de los rebaos de pie de cra hacia los rebaos multiplicadores y comerciales, as como facilitar el transporte de material gentico a nivel internacional, evitndose el costoso traslado de los reproductores y disminuyendo los riesgos sanitarios, pero sobre todo, en la estructuracin de esquemas eficientes para la evaluacin gentica de los animales reproductores. Sin embargo, la IA con semen congelado en ovinos presenta varias dificultades, debido a la reduccin de la viabilidad espermtica producida por el proceso de congelamiento y descongelamiento. Actualmente se conoce que la refrigeracin y el proceso de criopreservacin del semen ovino producen diversos cambios en la estructura y funcin de los espermatozoides, parecido a lo que sucede en el tracto reproductor de la hembra durante la capacitacin espermtica (CE). Tambin se ha observado un efecto similar debido al tiempo de conservacin en el semen fresco o refrigerado, lo cual puede resultar en una baja capacidad de fertilizacin (Salamon y Maxwell, 2000). Por lo anterior, es necesario realizar una evaluacin integral del grado de capacitacin del semen ovino que se produce al usar diferentes tipos y tiempos de conservacin, ya que hasta la fecha solo se han hecho evaluaciones separadas para ver los efectos de las bajas temperaturas y del tiempo de conservacin en la viabilidad de los espermatozoides.

40 La epifluorescencia con clortetraciclina (CTC) es el mtodo de anlisis mas utilizado para evaluar el grado de CE (Perez et al., 1996; Green y Watson, 2001; Chamberland et al., 2001; Cormier y Bailey, 2003), el cual permite clasificar a los espermatozoides de humanos, bovinos, ovinos y equinos, en tres categoras de acuerdo al patrn de fluorescencia mostrado: patrn F, con fluorescencia ligera uniformemente distribuida en toda la cabeza del espermatozoide, representado por los espermatozoides incapacitados con acrosoma intacto; patrn B, con fluorescencia en la regin acrosomal, representado por los espermatozoides capacitados con acrosoma intacto; y patrn RA, con ausencia o presencia de una fluorescencia pequea en la cabeza, y presencia de una delgada banda fluorescente en la regin ecuatorial del espermatozoide, representado por los espermatozoides capacitados con reaccin acrosomal (Fraser et al., 1995). El objetivo del presente estudio fue determinar la incidencia de CE de acuerdo al tipo (fresco, refrigerado y congelado) y tiempo de conservacin del semen ovino, as como generar informacin que permita dar un mejor uso en programas de IA al semen conservado.

40 REVISIN DE LITERATURA Aspectos Generales de la Criopreservacin de Semen El objetivo de la criopreservacin es la interrupcin del metabolismo celular por un tiempo determinado, con lo cual los espermatozoides se mantienen en una anabiosis artificial (Gorlach, 1999) con el fin de guardar material gentico valioso sin importar la poca del ao, distancia y lugar donde se encuentre la hembra o el semental (Zarco y Boeta, 2000). Los principios de la criopreservacin son los mismos para todas las clulas vivas, siendo el aspecto mas importante de este proceso la eliminacin del agua del interior de la clula antes de congelar (Gordon, 1999). La criopreservacin del semen involucra una serie de pasos: dilucin, crioproteccin, refrigeracin y congelamiento, almacenamiento y descongelado, los cuales afectan la estructura y funcin de los espermatozoides (Hammerstedt et al., 1990); considerando que el momento mas crtico para la criopreservacin del semen es al inicio de la congelacin y al momento del descongelado, puesto que es aqu donde se presentan un sinnmero de procesos fsico-qumicos regidos por las diferencias de temperatura y transporte de agua entre las clulas y el medio (Gorlach, 1999). Inmediatamente despus de la coleccin, el semen es diluido en un medio apropiado, normalmente basado en yema de huevo o leche (Bailey et al., 2000). Segn Maxwell y Jonhson (1999), el alto nivel de dilucin produce un fenmeno llamado efecto de dilucin que reduce las funciones del espermatozoide en el toro y el borrego, lo cual puede ser debido a que se reduce el contacto entre los espermatozoides y los componentes del tracto reproductor del macho (Garner et al., 2001). Tradicionalmente, la dilucin del

40 semen se ha hecho a temperatura corporal (30 a 39 C), entonces se refrigera a 5 C y se le agrega un crioprotector. La adicin de un crioprotector, comnmente glicerol para semen de mamfero, es esencial para la supervivencia de la clula durante la criopreservacin. La eficacia del glicerol es parcialmente debida al efecto osmtico marcado, pero transitorio, que produce rpidos cambios en el volumen celular, lo cual no parece perjudicar la funcin del espermatozoide (Liu y Floote, 1998). Por lo tanto, el glicerol acta directamente sobre la membrana plasmtica del espermatozoide, posiblemente para reducir algunas de las fases de transicin e incrementa la fluidez de la membrana durante la refrigeracin (Noiles et al., 1995). En mamferos, los protocolos ptimos de criopreservacin de semen parecen ser capaces de mantener el 50% de los espermatozoides vivos; sin embargo, estudios recientes sobre congelamiento de semen mencionan que los espermatozoides al congelarse y descongelarse se ven alterados en sus propiedades estructurales de la membrana plasmtica, lo cual se asemeja a un estado de capacitacin prematura y reaccin acrosomal (RA) que puede resultar en bajas tasas de preez (Watson, 1995). Capacitacin Espermtica (CE) In Vivo Los tubos seminferos dentro de los testculos son los encargados de la produccin de los espermatozoides, los cuales pasan hacia la rete testis y despus hacia los conductos eferentes que desembocan en la cabeza del epiddimo. La cabeza y el cuerpo del epiddimo se encargan de iniciar la

maduracin, se adquiere la motilidad de los espermatozoides y en la cola se almacenan. Los espermatozoides pasan de la cola del epiddimo al conducto

40 deferente, el cual acta como pasaje de los mismos durante la eyaculacin. Posteriormente, los espermatozoides siguen su recorrido por el mpula del conducto deferente, por la uretra y posteriormente pasan por las glndulas bulbouretrales, las glndulas seminales y la prstata. Las glndulas seminales aportan plasma enriquecido con protenas y carbohidratos y la prstata secreta un lquido viscoso que limpia y lubrica la uretra, a la vez que aumenta ligeramente el volumen del semen. Finalmente, los espermatozoides llegan al pene, siendo expulsados durante la eyaculacin por la uretra peneana (Sorensen Jr., 1982; Hafez y Hafez, 2002). En los mamferos, el semen fresco recin eyaculado es incapaz de fertilizar al vulo. Su habilitacin para esta accin se lleva a cabo a travs de su recorrido dentro del aparato genital femenino. A este proceso se le llama CE (Austin, 1951; Chang, 1951). La capacitacin permite al espermatozoide llegar a la zona pelcida del vulo, donde sta induce la RA y el espermatozoide fertiliza al vulo (Cormier y Bailey, 2003). Numerosos estudios han demostrado que el espermatozoide sufre varios cambios estructurales y bioqumicos durante el proceso de la capacitacin, como cambios en la fluidez de la membrana (Langlais y Roberts, 1985; Harrison et al., 1996), incremento del calcio (Ca+2) intracelular (Handrow et al., 1989; Visconti et al., 1995) alcalinizacin citoplasmtica (Parrish et al., 1989; Vredenburgh-Wilberg y Parrish, 1995), activacin de los canales de Ca+2 y de Na/K (Arnoult et al., 1996; Florman et al., 1994), cambio interno del pH (Parrish et al., 1993) y generacin de oxgeno reactivo (Leclerc et al., 1997; de Lamirande et al., 1998). La capacitacin tambin est asociada con la

40 fosforilacin de las protenas de la tirosina (Visconti et al., 1995; Flesch et al., 1999), la cual est regulada va cAMP y el decremento de la relacin

colesterol:fosfolpidos en la membrana (Langlais y Robert, 1985; Parks y Ehrenwald, 1990). La hiperactivacin es un cambio radical en la motilidad del espermatozoide, vindose un espermatozoide vigoroso con un movimiento asimtrico de la cola y frecuentes cambios de direccin (Gordon, 1994). El incremento en la hiperactivacin est asociado con la CE, ya que se cree que es el resultado de la distribucin de los componentes de la membrana durante la capacitacin (Yanagimachi, 1994). En el tracto reproductor femenino se encuentran lipoprotenas de alta densidad (HDL, por sus siglas en ingls) localizadas en los folculos y en el fluido del oviducto (Brantmeier et al., 1987; Ehrenwald et al., 1990), las cuales inducen la CE (Thrien et al., 1997). Estas HDL facilitan la salida de colesterol del espermatozoide, lo cual ocurre durante las primeras etapas de la capacitacin. Se ha encontrado variacin en la concentracin de HDL en los folculos y fluido oviductual durante el ciclo estral (Langlais et al., 1988; Parks y Ehrenwald, 1990), siendo los niveles mas altos durante el periodo de ovulacin y los mas bajos durante el resto del ciclo (Parks y Ehrenwald, 1990). Lane et al. (1999) mencionan que la capacitacin en bovinos comienza tan pronto los espermatozoides se mezclan con las secreciones de las vesculas seminales, las cuales producen las protenas del plasma seminal bovino (BSP, por sus siglas en ingls), que inducen inicialmente la salida de colesterol del espermatozoide, despus de la interaccin con los

glicosaminoglicanos (GAGs) como la heparina o con las HDL en el oviducto.

40 La heparina induce la capacitacin cuando las protenas del BSP se ligan al espermatozoide y actan como receptores de la heparina. Esta ltima puede interactuar con la membrana del espermatozoide por medio de las protenas del BSP para inducir una serie de eventos intracelulares tales como el incremento del pH, Ca+2 y cAMP (Lane et al., 1999). Las HDL inducen la capacitacin, ya que en el oviducto pueden iniciar un segundo paso que consiste en la salida de colesterol y que resulta posteriormente en una alteracin significativa en la membrana del espermatozoide. La capacitacin inducida por las HDL no incluye la cascada del cAMP, ya que no hay un incremento significativo en la fosforilacin de las protenas de la tirosina. Recientemente se han investigado los efectos de los anticuerpos de las BSP en la fosforilacin de las protenas de la tirosina, para establecer si las interacciones del pH y Ca+2 ocurren junto con la salida de colesterol durante la induccin de la capacitacin con las HDL. Se han encontrado altos niveles de GAGs como la heparina en el oviducto del bovino (Lee y Ax, 1984) y ovino, siendo las concentraciones mas altas durante la ovulacin (Parrish et al., 1989). El supuesto mecanismo de la funcin de la heparina es que se liga a protenas enlazadoras de heparina (HBPs, por sus siglas en ingls) y produce cambios en la membrana plasmtica. Las HDLs decoran la cabeza del espermatozoide permitindole volverse sensible a la heparina que es la responsable de la capacitacin in vitro del espermatozoide (Ax et al., 2005). La heparina est sujeta al

espermatozoide, y aparentemente estimula la elevacin del Ca+2 intracelular, pH y cAMP, los cuales parecen ser necesarios para la iniciacin de la capacitacin (Parrish et al., 1988; Parrish et al., 1994). Luego se remueven las

40 protenas del plasma seminal, las cuales son absorbidas por la membrana plasmtica del espermatozoide. Esas protenas se consideran como promotores de la capacitacin (Miller et al., 1990; Therien et al., 1995). Conservacin y Capacitacin Prematura del Semen Ovino Semen fresco. En la IA en ovinos se usa normalmente semen fresco, generalmente utilizado inmediatamente despus de su coleccin y dilucin requerida. Por lo regular se conserva de 30 a 39 C por no mas de 4 h, debido a que la actividad metablica es muy alta, lo cual incrementa la concentracin de cido lctico en el medio, afectando negativamente la motilidad y viabilidad del espermatozoide (Vivianco, 1998). As mismo, Prez et al. (1997) observaron una disminucin del 10% en la MP al mantener semen durante 6 h a 20 C (85 2 vs 75 4%); adems, encontraron un 30 a 35% de espermatozoides con patrn B despus de 4 h de almacenamiento a 20 C. Cormier et al. (1997), al trabajar con semen bovino observaron un 19% de patrn B en semen fresco (23 C durante 4h), y Paulenz et al. (2002) reportaron presencia de patrn RA en semen conservado a 20 C durante 6 h. Sin embargo, una de las mayores ventajas que justifican su uso, es que mantienen altas tasas de fertilidad con un bajo nmero de espermatozoides, en comparacin con el semen congelado (Yoshida, 2000), ya que en este ltimo, gran parte de la poblacin de espermatozoides muere y otra parte tiende a capacitarse prematuramente (Watson, 1995). Semen refrigerado. El mtodo mayormente utilizado para conservar semen en forma lquida por perodos de tiempo mayores a 24 h es mediante la reduccin de la temperatura, debido a que con esto se produce una reduccin

40 de la motilidad y actividad metablica, aumentando la vida media del espermatozoide hasta su utilizacin. La motilidad se detiene totalmente a los 5 C, pero se puede restituir si se eleva nuevamente la temperatura a los niveles normales, siempre y cuando no se hayan producido daos de tipo estructural causados por shock trmico (Vivianco, 1998). Cuando el semen es conservado a temperaturas cercanas a los 0 C, se debe de tener en cuenta que los espermatozoides se someten a un shock trmico, lo cual puede causar cambios irreversibles en la clula espermtica (Salomn y Maxwell, 2000). El descubrimiento de las propiedades protectoras de las lipoprotenas de la yema de huevo contribuy a incrementar la sobrevivencia y proteccin del espermatozoide cuando se somete al proceso de enfriamiento (Vishwanath y Shannon, 2000). Evaluaciones en el laboratorio han demostrado que el semen diluido y refrigerado a 5 C muestra una gran variabilidad en sobrevivencia y fertilidad en las siguientes 72 h de conservacin. Existen algunos diluyentes en los cuales los espermatozoides de borrego pueden conservarse a 4 C durante 8 a 15 d con una buena viabilidad y con fertilidad aceptable a los 8 d (Salamon et al., 1979). As mismo, Paulenz et al. (2002) no observaron diferencia estadstica en MP al monitorear semen diluido a 5 C durante 0, 6, 24 y 30 h. Morrier et al. (2002) obtuvieron resultados similares al probar la adicin o no adicin de glicerol en semen conservado a 5 C durante 0, 8, 16 y 24 h. Ellos observaron que la adicin del glicerol no afectaba la motilidad en los diferentes tiempos, mantenindose sta ligeramente por debajo de la motilidad inicial (84 3.3). Sin embargo, la conservacin del semen a 5 C reduce la actividad metablica, pero tambin puede acarrear consecuencias perjudiciales como el

40 decremento en la actividad metablica Na/K intracelular, lo cual provoca una marcada disfuncin en el cruzamiento intramembranal de algunos iones, ocasionando una disminucin en la sobrevivencia del espermatozoide (Vishwanath y Shannon, 2000). Tambin, Bailey et al. (2002) demostraron que el proceso de refrigeracin provoca un cambio estructural en la membrana plasmtica del espermatozoide parecido a lo que sucede durante la capacitacin. As mismo, Fuller y Whittingham (1997) y Cormier et al. (1997) reportan que la capacitacin puede ocurrir a los 5 C. Por otro lado, Salomn y Maxwell (2000) mencionan que independientemente del diluyente, tasa de dilucin, temperatura o condiciones de almacenaje, el deterioro del

espermatozoide se debe al incremento en el tiempo de almacenaje, reduciendo la capacidad de controlar la entrada de Ca+2 (Bailey y Buhr, 1994), lo cual est asociado con la capacitacin, hiperactivacin y RA (De Blas et al., 2002), y que la fertilidad del semen refrigerado declina rpidamente despus de las 24 h (Maxwell y Salamon, 1993). El descenso en fertilidad se considera entre un 10 y 33 % por cada da transcurrido. Si lo anterior se compara con la fertilidad obtenida con semen fresco (75 a 80%), se encuentra que con semen refrigerado por 42, 48 y 72 h, se tienen porcentajes de fertilidad de 45 a 50, 25 a 30 y 15 a 20%, respectivamente (Salamon y Maxwell, 2000). Semen congelado. La conservacin del semen mediante la congelacin implica una gama de procesos sumamente complicados que se inician al momento de la obtencin de la muestra y termina despus de la descongelacin (Vishwanath y Shannon, 2000). La conservacin de los

espermatozoides a -76 C en hielo seco o a -196 C en nitrgeno lquido,

40 conserva indefinidamente su potencial fertilizante. El desarrollo fortuito del glicerol como una sustancia efectiva para la criopreservacin de semen de mamferos, introdujo por completo un nuevo sistema de conservacin, cuya metodologa se practica hasta nuestros das. Inicialmente esta tecnologa fue creada para preservar el semen de bovinos, la cual se ha trasladado a otras especies con algunos pequeos cambios. Los resultados obtenidos en ovinos bajo IA intrauterina han sido considerados pobres con un 9 a 25% de gestacin, moderados con 30 a 50% y satisfactorios con alrededor de un 70% de

gestacin (Windsor et al., 1994; Maxwell, 1986; Gurley y Riese, 1990; Moses et al., 1997). La utilizacin de semen congelado brinda una gran flexibilidad al empleo de la IA y posibilita el comercio internacional de semen. Por otra parte, la reduccin de la temperatura seminal por debajo de los 4 C enfrenta los problemas de la cristalizacin de agua intra y extracelular, causando daos estructurales con ruptura de la membrana por aumento del volumen del agua al cristalizarse y por aumento de la presin osmtica intracelular al aumentar la concentracin de sales (Vivianco, 1998). Al adicionar glicerol al semen diluido antes de la congelacin, baja el punto de congelacin del agua al mezclarse ambas sustancias, lo cual ocasiona una reduccin de la cristalizacin y

cambios osmticos. El glicerol tambin deshidrata parcialmente la clula espermtica, reduciendo an mas el riesgo de cristalizacin intracelular (Salomn y Maxwell, 2000). Gillan y Maxwell (1998) encontraron que la congelacin del semen de carnero a pesar de todos los aditivos convencionales (glicerol, yema de huevo y algunos azcares de alto peso molecular como disacridos y trisacridos),

40 produce capacitacin prematura del espermatozoide. Bailey et al. (2002) demostraron que en una porcin del semen enfriado o criopreservado ocurre una modificacin en los espermatozoides parecida a la capacitacin. El dao que ocurre puede reducir la fertilidad in vivo del espermatozoide, ya que las membranas del espermatozoide capacitado estn sujetas a un deterioro rpido. La criopreservacin parece ser uno de los factores que mas afecta a la CE. El congelado y descongelado puede causar daos directos en el mecanismo del espermatozoide, como cambios dentro de la estructura de la membrana, niveles altos de Ca+2 intracelular (Bailey y Buhr, 1994), lo cual est asociado con la capacitacin, hiperactivacin, y RA (Cormier y Bailey, 2003). La desestabilizacin de la membrana est asociada con el enfriamiento a temperaturas menores de 15 C, la cual puede estar relacionada con la composicin de los lpidos de la bicapa, afectando la fluidez de la membrana plasmtica, pero no la capacidad de fertilizar del espermatozoide (O`Flaherty et al., 1999). La membrana plasmtica es el sitio principal que sufre dao durante la criopreservacin del semen, ocurriendo ste principalmente durante el congelamiento y descongelamiento (Parks y Graham, 1992). Para la mayora de los animales domsticos, el enfriamiento desde temperaturas corporales hasta cerca del congelamiento representa un estrs en la membrana plasmtica de los espermatozoides, resultando en una desestabilizacin de los componentes de la membrana y en la entrada de Ca+2 (Collin et al., 2000). Adems, Bailey y Buhr (1994) demostraron que la criopreservacin interfiere con la regulacin normal de Ca+2 en el espermatozoide. La criopreservacin causa niveles de

40 Ca+2 intracelular y disrupcin en la habilidad para controlar la entrada de Ca+2 durante este proceso, en semen congelado de bovino comparado con semen fresco. El dao que ocurre en el sistema de regulacin del Ca+2 por el congelamiento y descongelamiento puede predisponer a que el espermatozoide empiece con el proceso de capacitacin y RA, contribuyendo posiblemente a la reduccin de la fertilidad del semen de toro. Cormier y Bailey (2003) mencionan que la CE de bovinos inducida por heparina o por criopreservacin est asociada con la fosforilacin de protenas, ya que no muestran la misma caracterstica de fosforilacin de las protenas de la tirosina, debido a que se requiere la presencia de albmina srica bovina, Ca+2 y bicarbonato (Visconti y Kopf, 1998). El semen criopreservado no mostr la misma caracterstica de fosfoprotena que la tirosina en comparacin con el semen fresco, una parte de la fosfotirosina que contiene protenas en el semen congelado se detect a las 0 h, no observndose mayor incremento de intensidad de estas protenas durante el tiempo de incubacin (5 h), inclusive en condiciones que se utilizan para inducir la capacitacin espermtica en semen fresco (heparina). Sin embargo, en el semen fresco se aument la intensidad de varias protenas durante el tiempo de incubacin en presencia de heparina. Lane et al. (1999) reportaron que las HDL inducen capacitacin espermtica en el bovino sin inducir la fosforilacin de las protenas de la tirosina y mencionan que es probable que la heparina y las HDL induzcan capacitacin por diferentes vas. Es posible que los niveles iniciales de fosforilacin de la tirosina en ciertas protenas del semen congelado y descongelado sean suficientes para

40 iniciar una seal va intracelular relacionada con la capacitacin mediada por heparina (Cormier y Bailey, 2003). Existen reportes que indican que el proceso de congelado descongelado en semen bovino produce patrones de fosfoproteinas diferentes a los patrones mostrados por clulas frescas, al momento de estar bajo condiciones de capacitacin (Cormier et al., 2000). Mendes Jr. et al. (2003) reportaron un 40.3 3.2% de ovocitos fertilizados y un 11.6 1.3% de embriones producidos sin la adicin de heparina, reportando que la adicin de heparina al medio de fertilizacin no era necesaria cuando se utilizaba semen criopreservado y centrifugado por el mtodo de gradientes de Percoll. Cormier et al. (1997) reportaron mayor incidencia de espermatozoides de bovino con patrn B en semen congelado que en semen fresco, evaluado por CTC e incubado durante 4 h sin medio capacitante, mencionando que la criopreservacin induce capacitacin relacionada con modificaciones en la superficie del espermatozoide. El semen congelado fertiliz (in vitro) poco mas del 20% de ovocitos que el semen fresco, inclusive el semen que se enfri a 4 C tambin fue capaz de penetrar un nmero importante de ovocitos. Cormier y Bailey (2003) tambin reportaron un mayor porcentaje de espermatozoides con patrn B en semen congelado que en semen fresco a las 0 h de incubacin, mencionando que el dao inicial asociado con la criopreservacin parece ser suficiente para facilitar o provocar que el semen congelado y descongelado se empiece a capacitar. Collin et al. (2000) compararon semen de toros con alto y bajo porcentaje de fertilidad a las 0 y 4 h de incubacin, encontrando que el

40 semen de toros mas frtiles contiene menos Ca+2 que el semen de toros con baja fertilidad. Durante la criopreservacin, los espermatozoides de toros de baja fertilidad son mas susceptibles a alteraciones en la membrana favoreciendo la entrada de Ca+2, lo cual est relacionado con baja fertilidad. Ellos creen que la criocapacitacin y la fertilidad del semen estn asociadas con anormalidades en los niveles de Ca+2 intracelular en el espermatozoide, por que la criopreservacin modifica la estructura de la membrana del espermatozoide y favorece la entrada del Ca+2. Green y Watson (2001) reportaron que durante la incubacin por 3 h en medio TALP a 39 C, el nmero de espermatozoides con patrn B y RA se increment progresivamente, mientras que el nmero de espermatozoides con patrn F disminuy. Se detect un incremento en la proporcin de clulas con patrn B despus del enfriamiento a 15 C en comparacin con el semen que se incub a 39 y 22 C. La proporcin de clulas que mostraron el patrn B se increment mientras la temperatura disminua, vindose reflejada la

disminucin de clulas con patrn F y mantenindose la proporcin de clulas con patrn RA. Mtodos para la Determinacin de la Capacitacin Espermtica (CE) Existen diferentes mtodos para evaluar la CE, pero el mtodo ideal para determinar el porcentaje de espermatozoides con RA debe ser preciso, consistente, rpido, aplicable a un nmero pequeo de clulas, inofensivo a las funciones del espermatozoide, usable en fluidos biolgicos y ambientes en los que se encuentra el espermatozoide, y capaz de distinguir entre una RA normal de una falsa (Cross y Meizel, 1989).

40 Imagen de fase de contraste y microscopio diferencial interferencial de contraste (DIC). La imagen de fase de contraste trabaja con luz trasmitida que se implementa con un sistema adecuado de deteccin para un microscopio comercial estndar de escner. Detecta la diferencia de intensidad en medio, al frente de las mitades o cuadrantes de un detector en un campo abierto. La imagen de fase de contraste y microscopio DIC son generalmente similares, pero la imagen de contraste parece tener una mejor y mayor profundidad de campo (Amos et al., 2003). Los dos mtodos son fciles de usar para detectar parcial o completamente la RA en espermatozoides con acrosoma largo, por ejemplo el de cerdo de guinea y el de hmster. Ambos mtodos se pueden utilizar, pero con mas dificultad, en espermatozoides con acrosoma pequeo, como el de conejo, perro, cerdo y toro); pero ninguno de los dos mtodos es adecuado para observar los espermatozoides del humano (Cross y Meizel, 1989). Ambos mtodos pueden detectar algunas veces fases intermedias de la prdida del acrosoma, por ejemplo durante la RA fisiolgica en el espermatozoide del hmster (Talbot y Franklin, 1976) o durante la prdida degenerativa del acrosoma del bovino (Saacke y Marshall, 1968). Las ventajas de usar ambos mtodos con espermatozoides sin fijarse es que se requiere de pocos espermatozoides. La viabilidad y la forma del acrosoma se pueden analizar simultneamente. El espermatozoide puede ser analizado en una gran variedad de ambientes y condiciones, y los estados intermedios de RA son frecuentemente visibles. Las desventajas de estos mtodos son que se pueden utilizar solamente en pocas especies, el

40 movimiento espermtico se tiene que reducir (Cross y Meizel, 1989) y la evaluacin no se puede retardar. Puede haber errores en la evaluacin por prdida total del material acrosomal si hay un nmero substancial de espermatozoides en etapas tempranas de la RA o si el espermatozoide ha estado expuesto a agentes que retardan la dispersin del material acrosomal (Green, 1978) Tintes para microscopio de campo brillante. Existen pocos tintes disponibles para teir la regin acrosomal sin teir la regin postacrosomal. El tinte Giemsa (Didion et al., 1989) y el reactivo peridico de cido de Schiffs (Leblond y Clermont, 1952) son adecuados para muchas especies, pero no para el humano. Una estrategia comn es usar dos tintes: un tinte acrosomal y un tinte para el ncleo de diferente color que provea contraste en la parte posterior de la cabeza y que reduzca la cantidad de tinte acrosomal tomado por el ncleo (Cross y Meizel, 1989). El tinte Wells-Awa modificado trabaja bien con los ensayos de microscopios de transmisin electrnica (TEM, por sus siglas en ingls) para estudios de espermatozoides del verraco (Berger et al., 1989). El triple tinte es tal vez el mas utilizado, se ha aplicado a semen de humanos (Talbot y Chacon, 1981), ratn (Dudenhausen y Talbot, 1982), caballo (Varner et al., 1987) y macho cabro (Kusunoki et al., 1989). El tinte azul se utiliza para diferenciar a los espermatozoides vivos de los muertos al momento de la tincin, con el tinte rosa se tien los espermatozoides con patrn B (sin distinguir los capacitados de los no capacitados) y con el caf se tien los espermatozoides con patrn RA (Talbot y Chacon, 1981). Las ventajas de

estos protocolos son la posibilidad de hacer frotis permanentes, usarlos en

40 microscopios estndar para campos brillantes y el uso de reactivos accesibles y baratos. La desventaja es que pocos protocolos son rpidos (el tinte Wells-Awa toma 15 min en realizarlos), ya que estos mtodos toman comnmente horas para completarlos. Todos los tintes pueden revelar la presencia o ausencia de contenido acrosomal, por lo tanto, solo indican cuando hay una RA completa (Cross y Meizel, 1989). Rtulo por fluorescencia. Existen dos clases de fluorescencia que examinan la condicin acrosomal: aquellos que detectan material asociado con el acrosoma intracelular (requieren que la clula sea permeable antes de la rotulacin) y los que se pueden utilizar en los espermatozoides vivos (clulas no permeables). En la primera categora se encuentran las lectinas, anticuerpos intracelulares y los antgenos acrosomales; en la segunda categora est la clortetraciclina (CTC) y anticuerpos expuestos externamente al antgeno (Cross y Meizel, 1989). Las lectinas son el reactivo mas accesible para el primer grupo, estn ligadas a los glicoconjugados (glicoprotenas, glicolpidos, oligosacaridos, polisacridos y proteoglicanos) del acrosoma o a la membrana acrosomal exterior (Cross et al., 1986) y requieren de 5 min para la rotulacin (Talbot y Chacon, 1980). La fluorescencia de isotiocianato (FITC) conjugada con aglutinina Ricinos communis fue la primera lectina usada (Talbot y Chacon, 1980). Aunque las lectinas son txicas y deben de manejarse con cuidado, la aglutinina Pisum savitum y aglutinina de cacahuate (PNA) son sustitutos adecuados para utilizarse (Cross et al., 1986). La CTC utiliza patrones no permeables y produce patrones de

40 fluorescencia que reflejan el estado del acrosoma. No se entiende muy bien el funcionamiento de la CTC, pero el incremento de la emisin de fluorescencia puede estar relacionado con el ligamiento a un catin divalente en un ambiente no polar (Salig y Storey, 1979). Se puede utilizar en espermatozoides mtiles (Salig y Storey, 1979) o se pueden fijar utilizando glutaraldehdo (Lee et al., 1987). Se ha reportado la clasificacin de los patrones de fluorescencia con CTC para la CE (Ward y Storey, 1984; Fraser et al., 1995), siendo de la siguiente manera: patrn F, con fluorescencia ligera uniformemente distribuida en toda la cabeza del espermatozoide, representado por los espermatozoides incapacitados con acrosoma intacto; patrn B, con fluorescencia en la regin acrosomal, representado por los espermatozoides capacitados con acrosoma intacto; y patrn RA, con ausencia o presencia de una fluorescencia pequea en la cabeza, y presencia de una delgada banda fluorescente en la regin ecuatorial del espermatozoide, representado por los espermatozoides

capacitados con reaccin acrosomal. El mtodo CTC es el mas utilizado para determinar la CE durante la incubacin de los espermatozoides. Con este mtodo se ha monitoreado exitosamente la CE en varias especies como el ratn (Ward y Storey, 1984), humano (DasGupt et al., 1993), mono (Kholkute et al., 1990), caballo (Varner et al., 1987), toro (Fraser et al., 1993), verraco

(Maxwell y Johnson, 1999) y borrego (Prez et al., 1996). La CTC es una prueba muy rpida y tiene el potencial de revelar la dinmica del proceso de capacitacin (Cross y Meizel, 1989). Adems, permite distinguir entre los espermatozoides con patrn B y RA, dividiendo en dos categoras a los espermatozoides intactos: incapacitados y capacitados.

40 MATERIALES Y MTODOS Descripcin del rea de Estudio La presente investigacin se llev a cabo en el Laboratorio de Fertilizacin In Vitro y el Laboratorio de Procesamiento de Semen e Inseminacin Artificial de la Facultad de Zootecnia de la Universidad Autnoma de Chihuahua, con coordenadas de 28 38 latitud norte y 106 04 longitud oeste, a una altitud de 1,440 msnm y con una precipitacin media anual de 336 mm y una temperatura media anual de 18.6 C (INEGI, 2001); en dos perodos, mayo-julio y septiembre-noviembre. El conteo de los espermatozoides con capacitacin espermtica (CE) y reaccin acrosomal (RA) se llev a cabo en el Laboratorio de Inmunologa de la Facultad de Ciencias Qumicas de la Universidad Autnoma de Chihuahua. Descripcin de la Poblacin Se utilizaron seis sementales de cada una de las razas Blackbelly y Pelibuey, divididos dentro de cada raza en adultos (n= 3; mayores de un ao) y jvenes (n= 3; menores de un ao) a los cuales se les realiz un examen mdico y de calidad seminal. Se alojaron en corrales con una dieta a base de concentrado (250 g/d) con 12% de protena y heno de alfalfa a discrecin, as como agua ad limitum. Recoleccin del Semen De cada semental se obtuvieron 5 eyaculados mediante vagina artificial, utilizando la tcnica descrita por Evans y Maxwell (1990), la cual consiste en un tubo rgido de hule de 20 a 25 cm de longitud y de 6 cm de dimetro, provisto en su interior de una camisa de ltex. El tubo lleva un orificio lateral dotado de

40 un pivote por donde se introduce aire para regular la presin. Se introduce agua entre el tubo y la camisa de ltex, a una temperatura de 45 a 50 C (dependiendo de la temperatura ambiental), para que al momento de ser utilizada se encuentre entre 42 y 45 C. La cantidad de agua que se aade es de aproximadamente 2/3 del volumen del tubo. En un extremo de la vagina se coloca un cono de plstico flexible de aproximadamente 18 cm de longitud y al final del mismo se coloca un tubo de ensayo graduado, en el cual se deposita el semen despus de la eyaculacin. Los sementales se trasladaron desde su corral al rea de extraccin del semen, en donde se les permiti dar una monta falsa sobre una borrega sujeta, que le sirvi de seuelo para estimular su lbido. Inmediatamente despus de obtener la muestra se retir el tubo, se midi volumen, aspecto y color del semen y se coloc en bao mara a 36 C, del cual se tom una muestra para su evaluacin. Entre sesiones de trabajo para cada semental se tuvo un periodo de descanso de al menos 3 d, aunque con algunos de ellos se obtuvieron 2 eyaculados en una misma sesin. Evaluacin Microscpica del Semen Motilidad progresiva. Esta variable se evalu por medio de apreciacin visual con valores que van de 0 a 95%. Para la evaluacin se coloc una gota de semen en un portaobjetos templado a 36 C en una platina trmica, se cubri con un cubreobjetos a igual temperatura e inmediatamente se observ al microscopio con un objetivo de 40 X. Porcentaje de clulas vivas. Para el conteo de los espermatozoides vivos, se coloc una gota de semen y una gota de tinte eosina-nigrosina en un

40 portaobjetos y se mezclaron, posteriormente se prepar un frotis con la mezcla y se coloc en una platina a 35 C para fijar las clulas y finalmente realizar el conteo. Se contabilizaron 100 clulas en el microscopio con un objetivo de 40 X. Se identificaron las clulas vivas, que fueron aquellas que no absorbieron el colorante, mientras que las que s lo hicieron se clasificaron como muertas. Porcentaje de clulas anormales. Esta evaluacin se realiz con el mismo frotis, del cual se contabilizaron 100 clulas con un objetivo de 40 X, clasificndolas en clulas con anormalidades primarias y secundarias, y clulas normales. Determinacin de la concentracin espermtica. Antes de llevar a cabo la dilucin del semen, se determin la concentracin espermtica por medio de la tcnica modificada del hemocitmetro, descrita por Sorensen (1986), la cual consiste en agregar 50 l de semen en 15 ml de una solucin que contiene 14 partes de citrato de sodio al 2.9% y una parte de solucin Hayem (0.5 g de cloruro de mercurio, 5 g de sulfato de sodio, 1 g de cloruro de sodio y 200 ml de agua destilada) descrita por Chavira (1997), para inmovilizar a los espermatozoides. La cmara del hemocitmetro se llen por capilaridad con la ayuda de una pipeta de 50 l, contndose los espermatozoides contenidos en cinco cuadros grandes (los de las esquinas y el centro) de los 25 (cuadrcula 5x5) con la ayuda de un microscopio de luz con un objetivo de 40 X. El nmero total de espermatozoides contabilizado se multiplic por 15 x 106, obteniendo as el nmero de espermatozoides/ml de eyaculado. Despus de la evaluacin se decidi si la muestra poda ser utilizada para congelarse considerando los criterios de calidad establecidos en el

40 laboratorio donde se llev a cabo este estudio (Cuadro 1). Si la muestra

cumpla con los parmetros establecidos se procedi a determinar el nmero de pajillas y diluir el semen. Diseo del Experimento Una vez que se comprob que el eyaculado de cada semental cumpla con la calidad establecida, se extrajeron 0.25 ml (el resto se proces para congelamiento) y se diluyeron en 2.25 ml de diluyente fraccin A, este a su vez se dividi en 1 y 1.5 ml, los cuales estuvieron bajo conservacin a 36 C y 5 C, respectivamente. Posteriormente se tomaron muestras de 0.25 ml de semen a las 0, 3 y 6 h (F, F3 y F6, respectivamente) del semen conservado a 36 C y a las 3, 6 y 24 h (R3, R6 y R24, respectivamente) para el semen conservado a 5 C, y 1/2 pajilla del semen congelado (SC). Cada muestra se evalu para MP y estuvo sometida a un proceso de purificacin por el mtodo de gradientes de Percoll, se redujo su concentracin a 10 x 106/ml, se aplic la tincin CTC, se prepararon los frotis y se procedi a realizar la lectura correspondiente para la determinacin del grado de capacitacin de las clulas espermticas en los diferentes tiempos de conservacin. Nmero de Pajillas por Eyaculado Los clculos para determinar el nmero de pajillas por eyaculado se realizaron por medio de la siguiente frmula (Sorensen, 1982): No. de pajillas = (CE x VE x MP x N) / CDP Donde: CE = concentracin espermtica VE = volumen de eyaculado MP = porcentaje de motilidad progresiva

40

CUADRO 1. CRITERIOS ESTABLECIDOS PARA INCLUIR UNA MUESTRA DE SEMEN EN EL ESTUDIO Caracterstica Motilidad Clulas normales Clulas vivas Concentracin espermtica Volumen de eyaculado Aspecto
1/

Criterio1/ 70% 85% 70% 2 a 3 x 109/ml .5 ml Cremoso o lechoso

Criterios utilizados como referencia para procesar una muestra de semen en el Laboratorio de Procesamiento de Semen de la Facultad de Zootecnia de la UACH.

40 N = porcentaje de clulas normales CDP = concentracin deseada por pajilla Dilucin y Enfriamiento Al semen recin extrado se le agreg 1 ml del diluyente de la fraccin A (Cuadro 2), y una vez determinado el nmero de pajillas se le agreg la cantidad restante del diluyente de la fraccin A. Al semen diluido (diluyente sin glicerol) a 36 C de temperatura y al doble de la concentracin final (240 x 106) se le baj la temperatura hasta 5 C y se le adicion la fraccin B del diluyente (Cuadro 2) en cuatro tiempos (10, 20, 30 y 40% del diluyente) con intervalos de 15 min entre ellos. Posteriormente se inici el tiempo de equilibramiento con una duracin de 2 a 3 h. Envasado y Congelado Al final del periodo de equilibramiento el semen se envas en pajillas de 0.5 ml por medio de una envasadora automtica. Enseguida se procedi a congelar stas en vapor de nitrgeno lquido a una temperatura de -120 C por 12 min, las cuales se colocaron en una parrilla metlica dentro de una caja de unicel con nitrgeno lquido a una altura de 5 cm del espejo del nitrgeno. Finalmente se sumergieron en el nitrgeno a una temperatura de -196 C durante 1 min. Evaluacin Posdescongelado La evaluacin de las pajillas se realiz despus del congelado, descongelndolas en bao mara (Precision, modelo 280) a una temperatura de 36 C durante 40 seg. Se realiz la evaluacin de las caractersticas antes mencionadas para decidir si el semen congelado era apto para evaluar la CE.

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CUADRO 2. COMPOSICIN DEL DILUYENTE UTILIZADO PARA LA CRIOPRESERVACIN DEL SEMEN Ingrediente1/ Citrato de sodio (g) Yema de huevo (%) Fructosa (g) Penicilina sdica (UI/ml) Estreptomicina (mg/ml) Glicerol Cantidad 2.9 20 0.1 1000 1 0 % fraccion A 14 % fraccion B
1/

En base a 100 ml de agua desionizada.

40 Purificacin del Semen El semen fresco, refrigerado y congelado se purific por el mtodo de gradientes de Percoll (Lab. Sigma, St. Louis, M.O., Cat: P1644; Lab Research Organics Cleveland, OH., Cat: 12002), el cual se elabor de la siguiente manera: a partir del Percoll al 90% (Cuadro 3), se diluyeron dos soluciones al 70 y 45 %, con Sperm TL sin albmina srica bovina (Cuadro 4) y en un tubo cnico de 15 ml se adicion, primero 1.5 ml de Percoll al 70% y luego se agreg lentamente 1.5 ml de Percoll al 45%, utilizando una pipeta serolgica de 2 ml con un succionador automtico para pipeta de 2 ml. Del semen a 36 y 5 C se tomaron 0.25 ml a las 0, 3 y 6 h y a las 3, 6, y 24 h, respectivamente, se colocaron sobre el gradiente de Percoll previamente calentado a 36 C. En el caso del semen congelado, se utiliz 1/2 pajilla y se coloc en bao mara (Presicion, modelo 280) a 36 C por 40 seg. Posteriormente se coloc sobre la capa de Percoll al 45%. Previo a la purificacin, a las muestras de cada tratamiento se les hizo un examen microscpico con un objetivo de 40 X para analizar la motilidad de los espermatozoides. El gradiente de Percoll, junto con el semen, se coloc dentro de una canastilla de centrfuga (Presicion, modelo Durafuge 200) previamente templada a 36 C, centrifugndose a 2000 rpm durante 30 min. Posteriormente se colocaron en bao mara (Presicion, modelo Durafuge 280) a 36 C, retirando el sobrenadante de Percoll con una pipeta Pasteur, hasta quedar el sedimento de semen el cual se colect con una pipeta Eppendorf para medir la cantidad de semen colectado y transferirlo a un tubo cnico de 15 ml.

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CUADRO 3. COMPOSICIN DEL PERCOLL PURIFICACIN DEL SEMEN Ingredientes SP-TL 10X1/ (ml) Bicarbonato de sodio (g) Lactato de sodio al 98 % (l) Percoll (ml) MgCl2 (l) CaCl2 (l)
1/

AL 90 % PARA LA Cantidad 2 0.042 45 18 79 39

4.674 mg de NaCl, 0.23 mg de KCl, 0.40 mg de NaH2PO4+H2O y 2.38 Mg de Hepes en 100 ml de agua desionizada; ajustar el pH a 7.3; filtrarlo en botellas estriles y almacenarlo indefinidamente a 4 C.

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CUADRO 4. COMPOSICIN DEL SPERM TL SIN ALBUMINA SRICA BOVINA PARA DILUIR EL PERCOLL Ingredientes Sperm TL Stock1/ (ml) Penicilina Estreptomicina (l) Piruvato Sperm Stock2/
1/

Cantidad 100 100 100

582 mg de NaCl, 23 mg de KCl, 209 mg de NaHCO3, 4.1 mg de NaH2PO4H2O, 238 mg de hepes, 225 l de lactato de sodio, 100 l de rojo fenol, 29 mg de CaCl22H2O y 31 mg de MgCl26H2O. Ajustar el pH a 7.2. 2/ 22 mg de piruvato de sodio y 10 ml de solucin salina; utilizado dentro de 2 a 4 sem. Filtrado en acrodisco de 0.2 m y almacenado a 5 C.

40 Concentracin espermtica. Para determinar la concentracin

espermtica se adicionaron 10 l de semen a 90 l de agua y se colocaron 10 l de la mezcla en un hemocitmetro, se contaron las clulas espermticas de 5 cuadros de la cuadrcula de la cmara, se sum el conteo de los 5 cuadros y se multiplic por 500,000 para determinar la concentracin espermtica. La suspensin de semen se diluy con medio de fertilizacin (Cuadro 5) hasta tener una concentracin de alrededor de 10 X 106 de espermatozoides/ml. Determinacin de la Capacitacin Espermtica (CE) La evaluacin de la CE se llev a cabo por el mtodo de anlisis de epifluorescencia con clortetraciclina (CTC), modificado por Chamberland et al. (2001), de la siguiente manera: la solucin se prepar al disolver 750 M de hidroclorato de clortetraciclina (CTC-HCl; Lab. Sigma, St. Louis, M.O., Cat: C4881) en un buffer de 5 mM de DL-cistena (Lab. Sigma, St. Louis, M.O., Cat: C4022), 130 mM de NaCl y 20 mM de cido Tris (Lab. Sigma, St. Louis, M.O., Cat: T5941). La solucin se prepar para uso diario ajustando a un pH de 7.8 con NaOH (2N) en un tubo de microcentrfuga de 1.5 ml. Inmediatamente despus, los espermatozoides se fijaron adicionando 4 l de solucin

glutaraldehdo al 8% (pH 7.4: Lab. Sigma, St. Louis, M.O., Cat: G7526) mezclndolos suavemente. En un portaobjetos se colocaron 10 l de la solucin espermtica fijada y 5 l de 1,4-diaza,2,2,2-biciclo-octano (Lab.

Sigma, St. Louis, M.O., Cat: D2522) disuelto en glicerol (1:9) para atenuar el desvanecimiento de la fluorescencia. Se coloc un cubreobjetos sobre la mezcla, cuidando que no quedaran burbujas de aire entre el portaobjetos y el cubreobjetos y se sellaron con barniz comn para uas. Una vez secado el

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CUADRO 5. COMPOSICIN DEL MEDIO DE FERTILIZACIN PARA DILUIR LA CONCENTRACIN ESPERMTICA Ingredientes NaCl (mg) KCl (mg) NaHCO3 (mg) NaH2PO4H2O (mg) Lactato de sodio al 98 % (l) Rojo fenol (l) CaCl22H2O1/ (mg) MgCl26H2O1/ (mg)
1/

Cantidad 666 23.5 210.4 4.7 114 30 30 10

Agregado al final. Se ajust el pH a 7.2; se filtr en botellas estriles; y se almacen a 5 C.

40 barniz, se cubri con papel aluminio y se almacenaron las muestras a 4 C hasta la evaluacin de la capacitacin espermtica, realizndola en un tiempo no mayor a 10 d. La lectura de laminillas se realiz mediante anlisis de epifluorescencia, con la ayuda de un microscopio equipado con fase de contraste bajo iluminacin epifluorescente y filtro V-2A (400 a 500 nm de excitacin y 470 nm de emisin) con un lente ptico de 40 X. En cada muestra se contaron 100 espermatozoides bajo iluminacin azul-violeta. La clasificacin se realiz bajo los siguientes patrones: F, con fluorescencia ligera uniformemente distribuida en toda la cabeza del espermatozoide, representado por los espermatozoides incapacitados con acrosoma intacto; patrn B, con fluorescencia en la regin acrosomal, representado por los espermatozoides capacitados con acrosoma intacto; y patrn RA, con ausencia o presencia de una fluorescencia pequea en la cabeza, y presencia de una delgada banda fluorescente en la regin ecuatorial del espermatozoide, representado por los espermatozoides

capacitados con reaccin acrosomal (Fraser et al., 1995). Anlisis Estadstico Los porcentajes de MP antes de la purificacin con Percoll, y los patrones B y RA del ensayo de CTC se analizaron estadsticamente mediante PROC MIXED de SAS (1999). Se ajust un modelo que incluy los efectos fijos del tipo y tiempo de conservacin (fresco a las 3 y 6 h; refrigerado a las 3, 6 y 24 h; y congelado), raza del semental (Pelibuey y Blackbelly) y edad del semental (joven y adulto), doble y triple interaccin entre estos efectos, as como el efecto aleatorio de semental dentro de raza por edad y la interaccin de

40 semental por el tipo y tiempo de conservacin dentro de raza por edad. Cuando el tipo y tiempo de conservacin fue estadsticamente diferente se realizaron comparaciones entre medias para cada nivel mediante la prueba de la mnima diferencia (Fishers LSD test).

40 RESULTADOS Y DISCUSIN Motilidad Progresiva (MP) En la evaluacin microscpica del semen se encontr efecto (P < 0.01) del nivel de conservacin, as como de la raza del semental y no se encontr efecto (P > 0.05) de la edad del semental ni de ninguna interaccin. En la Grfica 1 se observa una disminucin en la MP, con respecto al semen fresco diluido al tiempo 0 h, del 8 (P < 0.01) y 19% (P < 0.01) para el F3 y F6, respectivamente, y un 35% (P < 0.01) en el SC (80.7 1.9, 61 1.9 y 53.7 1.9 vs 88.4 1.9). Prez et al. (1997) observaron una disminucin del 10% en la MP al mantener semen durante 6 h a 20 C (85 2 vs 75 4%), y un 21% en semen congelado comparado con semen fresco (43 1 vs 64 1%). La reduccin de la motilidad en el semen conservado a 36 C durante 3 y 6 h, se debe a que el espermatozoide de borrego por su actividad metablica alta, incrementa la concentracin de cido lctico en el medio, lo cual tiene un efecto negativo en la motilidad y viabilidad del mismo, por lo tanto no puede almacenarse entre 30-39 C por mas de 4 h antes de ser utilizado (Vivianco, 1998), mientras que en el semen congelado se debe al efecto del congelamiento, ya que en ste solo el 50% de los espermatozoides conservan su viabilidad, y gran parte del semen pierde su potencial para fertilizar (Bailey y Buhr, 1994; Bailey et al., 2002). No se encontr diferencia estadstica (P > 0.05) entre F y R3, R6 y R4 (88.4 1.9 vs 85.4 1.9, 84.2 1.9 y 83.3 1.9%, respectivamente), debido que al bajar la temperatura se produce una reduccin en la actividad metablica y de motilidad, aumentando la vida media del espermatozoide; la motilidad

40

100 90 Motilidad Progresiva (%) 80

a b

ab

ab

ab

Grafica 1. Medias de los cuadrados mnimos ( error estndar) para el 70 c porcentaje de motilidad progresiva en diferente subclase tipo-tiempo 60 d de conservacin
50 40 30 20 10 0
0h (F) 36 C por 3 h 36 C por 6 h 5 C por 3 h 5 C por 6 h 5 C por 24 h (F3) (F6) (R3) (R6) (R24) Congelado (CON)

Literales diferentes entre subclase tipo-tiempo de conservacin denotan diferencia estadstica (P < 0.05)

a,b,c,d

Subclase Tipo-Tiempo de Conservacin

Grfica 1. Medias de los cuadrados mnimos ( error estandar) para el porcentaje de motilidad progresiva en diferentes subclases tipotiempo de conservacin.
a,b,c,d

Literales diferentes entre subclase tipo-tiempo de conservacin denotan diferencia estadstica (p < 0.05).

40 se detiene totalmente a los 5 C, pero se reestablece nuevamente al subir la temperatura a los niveles normales (30 a 39 C), siempre y cuando no se hayan producido daos de tipo estructural causados por shock trmico (Vivianco, 1998). As mismo, Paulenz et al. (2002) no observaron diferencia estadstica al monitorear semen diluido a 5 C durante 0, 6, 24 y 30 h. Leboeuf et al. (2000) mencionan que los espermatozoides pueden conservarse a 4 C durante 8 a 15 d con una buena viabilidad. Sin embargo, Maxwell y Salamon (1993) indican que la fertilidad del semen refrigerado declina rpidamente despus de las 24 h. El descenso en fertilidad se considera entre un 10 a 33% por cada da transcurrido. Si lo anterior se compara con la fertilidad obtenida con semen fresco (75 a 80%), encontramos que con semen refrigerado por 24, 48 y 72 h se tienen porcentajes de fertilidad de 45 a 50%, 25 a 30% y 15 a 20%, respectivamente. Los resultados de MP por raza de semental se muestran en la Grfica 2, en la cual se observa una diferencia (P < 0.01) del 5% a favor de la raza Pelibuey respecto de la raza Blackbelly (79.4 1 vs 74 1). Bag et al. (2002) observaron un 64.7 1 y 61.9 1% en las razas Malpura y Bharat Merino, respectivamente. Lunstra y Echternkamp (1982) tambin encontraron efecto de raza (P < 0.05) en el porcentaje de MP en toretes de 13 meses de edad de las razas Herford, Angus, Herford x Angus, Angus x Herford, Red Poll y Pardo Suizo (26 4, 46 4, 31 4, 35 4, 39 y 45 4%, respectivamente). Espermatozoides Capacitados con Acrosoma Intacto (Patrn B) Solo se encontr efecto de nivel de conservacin (P < 0.01) y raza de semental (P < 0.06). En la Grfica 3 se observan valores altos de patrn B en

40

82

a
Motilidad Progresiva (%) 80 78 76 74 72 70 Pelibuey Blackbelly

Grafica 2. Medias de los cuadrados mnimos ( error estndar) para el porcentaje de motilidad progresiva por raza de semental
Literales diferentes entre nivel de conservacin denotan diferencia estadstica (P < 0.01)
a,b

40

50 45 40 Patrn B (%) 35 30 25 20 15 10 5 0

d b

d c

b a

36 C por 3 h 36 C por 6 h 5 C por 3 h 5 C por 6 h 5 C por 24 h Congelado (F3) (F6) (R3) (R6) (R24) (CON) Subclase Tipo-Tiempo de Conservacin

Grfica 3. Medias de los cuadrados mnimos ( error estndar) para el porcentaje de espermatozoides capacitados con acrosoma intacto (Patrn B) en diferentes subclases tipo-tiempo de conservacin.
Literales diferentes entre subclase tipo-tiempo de conservacin denotan diferencia estadstica (P < 0.05)
a,b,c,d

40 R6 y R24 (P < 0.01; 42.5 2.2 y 44.5 2.2%), intermedios en F6 y R3 y en el C (30.8, 32.8 y 36.6%, respectivamente; EE = 2.2). As como valores bajos (P < 0.01) en F3 (23.9 2.2%). Morrier et al. (2002) reportaron resultados similares al presente estudio al obtener un 34 2 y 40 4% de patrn B en semen de borrego conservado a 5 C (3 h) y congelado, respectivamente. Esto se debe a que la membrana plasmtica del espermatozoide sufre una desestabilizacin en el proceso de enfriado y criopreservado (Bailey et al., 2002), lo cual esta asociado con niveles altos de Ca+2 intracelular (Bailey y Buhr, 1994), y a su vez con la CE, hiperactivacin y RA (Cormier y Bailey, 2003). Sin embargo, Prez et al. (1997) mencionan que la capacitacin para el semen de borrego se puede dar con el almacenamiento del semen sin ser diluido, ya que ellos encontraron un incremento de 30 a 35% de espermatozoides con patrn B despus de 4 h de almacenamiento a 20 C, resultados que fueron muy similares al presente estudio, donde se monitore el semen durante 3 y 6 h (36 C). Cormier et al. (1997), al trabajar con semen bovino observaron un 19 y 39% de patrn B en semen fresco (23 C durante 4h) y congelado, respectivamente (P < 0.05). Lambrechts et al. (1999) analizaron en epididimal de bfalo africano dos aos (1995 y 1996) semen y observaron una

(Syncerus caffer)

disminucin del 31 y 39% de espermatozoides con acrosoma intacto en semen equilibrado (4 C durante 4 h) y congelado, respecto del semen fresco en el primer ao y un 29 y 56% para el segundo. En la Grfica 4 se muestra el efecto de raza (P < 0.06) para el patrn B, siendo ste mayor en la raza Pelibuey que en la Blackbelly (38.8 2.4 vs 31.45 2.4%, respectivamente). Al igual que en el presente estudio, Lunstra

40

45 40 35
Patrn B (%)

a b

30 25 20 15 10 5 0 Pelibuey Blackbelly

Grafica 4. Medias de los cuadrados mnimos ( error estndar) para el porcentaje de espermatozoides capacitados con acrosoma intacto (Patrn B) por raza de semental
a,b

Literales diferentes entre raza denotan diferencia estadstica (P < 0.06)

40 y Echternkamp (1982) encontraron efecto de raza en toretes de 13 meses de edad, siendo los porcentajes mas altos para las razas Hereford, Hereford x Angus y Red Poll, en comparacin con Angus, Angus x Hereford y Pardo Suizo. Espermatozoides Capacitados con Reaccin Acrosomal (Patrn RA) Para esta variable se encontr efecto de la interaccin de nivel de conservacin por edad de semental (P < 0.01). En la Grfica 5 se observa una tendencia ascendente en el porcentaje de patrn RA conforme se aumenta el tiempo de conservacin a diferente temperatura. En F3 se encontr la presencia de un 5.6 1.5 y 6.1 1.5% de patrn RA (P > 0.05) para la edad adulto y joven, respectivamente; aumentando un 5 y 6% (10.2 1.6 y 12.4 1.5, respectivamente) en F6 (P > 0.3). Prez et al. (1997) observaron un aumento del 7% de espermatozoides con acrosoma reactor despus de 4 h de almacenamiento a 20 C. La presencia del patrn RA en R3 fue de 14.2 1.5 y 11.6 1.5% (P > 0.05) para la edad adulto y joven, respectivamente. Sin embargo, en R6 el porcentaje de RA en la edad adulto fue menor (P < 0.01) que en la joven (19.8 1.5 vs 27.7 1.5%, respectivamente). Lunstra y Echternkamp (1982), en un estudio realizado en toretes de 7 a 13 meses de edad, encontraron efecto de edad en el porcentaje de patrn RA a travs de los meses, siendo menor conforme avanzaba la edad. Paulenz et al. (2002) tambin reportaron efecto del tiempo de almacenamiento cuando conservaron semen de borrego a 20 y 5 C durante 6, 12, 24 y 30 h. En el caso del semen congelado, la presencia de patrn RA fue de 26.32 1.5 y 33.8 1.6%, (P < 0.001) para la edad adulto y joven, respectivamente. Morrier et al. (2002)

observaron la presencia de un 14, 10, 15 y 25% en semen refrigerado (5 C)

40

40 35 30 Patrn RA (%) 25

Adulto Joven
b a

a
20 15 10 5 0 36 C por 3 h 36 C por 6 h 5 C por 3 h 5 C por 6 h 5 C por 24 h Subclase Tipo-Tiempo de Conservacin Congelado

a a a a

a a

Grafica 5. Medias de los cuadrados mnimos ( error estndar) para el porcentaje de espermatozoides capacitados con reaccin acrosomal (Patrn RA) por edad del semental en diferentes subclases tipo-tiempo de conservacin
Literales diferentes entre edad de semental dentro de subclase tipo-tiempo de conservacin denotan diferencia estadstica (P < 0.01)
a,b

40 durante 3, 8, 16 y 24 h, respectivamente. As mismo, Januskauskas et al. (1999), al comparar 2 mtodos de refrigeracin y 2 edades de toros (14 a 16 y 66 a 79 meses), observaron que la CE estuvo significativamente influenciada por la edad del toro y no por el mtodo de refrigeracin. Los toros viejos tuvieron mayor incidencia de espermatozoides incapacitados, comparado con los jvenes. Maxwell et al. (1996) y Sderquist et al. (1997) mencionan que la criopreservacin causa serios daos al espermatozoide de borrego, lo cual se ve reflejado con bajos porcentajes de preez mediante IA. El semen fresco o refrigerado podra ser una alternativa al semen congelado cuando se va a utilizar con IA poco tiempo despus de su coleccin (Paulenz et al., 2002). Sin embargo, la refrigeracin del semen de borrego le provoca un decremento en la integridad morfolgica de la membrana (Maxwell et al. 1993), reduciendo la capacidad de controlar la entrada de Ca+2 (Bailey y Buhr, 1994), lo cual est asociado con la RA (De Blas et al., 2002). Las diferencias entre edades pueden deberse a que las glndulas sexuales accesorias no se desarrollan por completo, afectando la viabilidad y motilidad del espermatozoide de macho cabro, caballo (Corteel, 1980), toro, borrego y conejo (Corteel, 1980; Dott et al., 1979). As mismo, Lunstra y Echternkamp (1982) reportaron que la concentracin de protenas del plasma seminal aumenta significativamente

entre los 7 y 13 meses de edad en toros de diferentes razas (Hereford, Angus, Herford x Angus, Angus x Hereford, Red Poll y Pardo suizo), mejorando la viabilidad y motilidad de los espermatozoides. Han et al. (1990) reportaron que la exposicin de semen humano a plasma seminal inhibe la RA. As mismo, Ax et al. (2005) mencionan que algunas protenas del plasma seminal (HBPs)

40 pueden proteger el acrosoma de los espermatozoides durante la congelacindescongelacin, evitando la criocapacitacin y finalmente potenciar la capacitacin, seguido de reacciones del acrosoma, mejorando, por lo tanto, la fertilidad del toro utilizado en IA.

40 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES De acuerdo con los resultados obtenidos, se concluye que el tiempo de conservacin reduce el porcentaje de motilidad progresiva en semen fresco, no as en el semen refrigerado. En el semen congelado, se presenta tambin una reduccin de motilidad debido a cambios estructurales y fisiolgicos de los espermatozoides y su severidad depende del genotipo (raza) del semental. El proceso de congelado incrementa el nmero de espermatozoides con patrn B respecto al semen fresco; as mismo, el tiempo de preservacin en el semen fresco tambin incrementa este indicador y su efecto depende de la composicin gentica del animal. El nmero de espermatozoides con patrn RA se incrementa conforme se aumentan las horas de conservacin en semen fresco y refrigerado, pero el mayor efecto se presenta con el congelamiento. El efecto negativo de las bajas temperaturas es mayor en el semen de borregos jvenes que en el de adultos. Por lo tanto, se recomienda que si se va utilizar semen fresco en programas de IA, ste sea utilizado dentro de las primeras 3 h, de lo contrario, se debe de mantener bajo refrigeracin (5 C) o congelado si la IA se va hacer hasta las 24 mas horas. As mismo, se recomienda el estudio de aditivos que retarden la presentacin de los patrones B y RA en semen fresco y refrigerado mediante la proteccin de la membrana celular de los espermatozoides en el proceso de congelado. Adems, se recomienda la utilizacin de tintes que permitan distinguir una clula viva de una muerta, al mismo tiempo que se determinan los patrones de capacitacin del ensayo de CTC.

40 LITERATURA CITADA Amos, W. B., S. Reichelt, D. M. Cattermole, y J. Laufer. 2003. Re-evaluation of differential phase contrast (DPC) in a scanning laser microscope using a split detector as an alternative to differential interference contrast (DIC) optics. J. Microsc. 210:166-75. Arnoult, C., Y. Zeng, y H. M. Florman. 1996. ZP3-dependent activation of sperm cation channels regulates acrosomal secretion during mammalian fertilization. J. Cell Biol. 134:637-645. Austin, C. R. 1951. Observations on the penetration of the sperm into the mammalian egg. Aust. J. Sci. Res. 4:581-596. Ax, R. L., A. R. Cropp, B. Pollard, S. N. Faberl, T. C. McCauley, G. R. Dawson, y D. Fish. 2005. Uso de hormonas para incrementar las tasas de gestacin. Memorias Digal. Cd. Delicias, Chih. Mxico. Bag, S., A. Joshi, P. S. Rawat, y J. P. Mittal. 2002. Effect of initial freezing temperature on the semen characteristics of frozen-thawed ram spermatozoa in a semi-arid tropical environment. J. Small Rumin. 42:23-29. Bailey, J. L., y M. M. Buhr. 1994. Cryopreservation alters the Ca+2 flux of bovine spermatozoa. Can. J. Anim. Sci. 74:45-51. Bailey, J. L., J. F. Bilodeau, y N. Cormier. 2000. Semen cryopreservation in domestic animals; a damaging and capaciting phenomenon. J. Androl. 21:1-7. Bailey, J., A. Morrier, y N. Cormier. 2002. Semen cryopreservation: successes and persistent problems in faro species. En Amino Acids: Meat, Milk and More! Improving Animal Production with Reproductive Physiology Symp. Canadian Society of Animal Science, Qubec, Canada. 86-95 pp. Berger, T., D. O. Turner, S. Meizel, y J. L. Hedrick. 1989. The zona pellucida induced acrosome reaction in boar sperm. Biol. Reprod. 40:525-530. Brantmeier, S. A., R. R. Grimmer, y R. L. Ax. 1987. Concentrations of high density lipoproteins vary among follicular sizes in the bovine. J. Dairy Sci. 70:21452149. Chamberland, A., V. Fournier, S. Tardif, M. A. Sirard, R. Sullivan, y J. L. Bailey. 2001. The effect of heparin on motility parameters and protein phosphorylation during bovine sperm capacitation. Theriogenology 55:823-835. Chang, M. C. 1951. Fertilizing capacity of spermatozoa deposited in fallopian tubes. Nature 168:997-998.

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