Anda di halaman 1dari 12

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI UMUM

ACARA IV PERHITUNGAN SEL SECARA LANGSUNG

Kelompok 6 : 1. ARSY HUDANI 2. FENY MARGITA L 3. IKA PUSPITASARI DR 4. KAHIYANG AYU 5. RIRIN HANIFAH H0909011 H0909029 H0909041 ( 085642135282 ) H0909045 H0909061

ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA 2010

IV. PERHITUNGAN SEL SECARA LANGSUNG

A.

Tujuan Praktikum Tujuan dari praktikum acara IV Perhitungan Sel Secara Langsung ini adalah melakukan perhitungan sel secara langsung dengan hemocytometer.

B. Tinjauan Pustaka Untuk menentukan jumlah mikroorganisme yang terdapat pada suatu populasi tertentu. Hal ini dapat dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer optik untuk mengukur kepadatan penduduk, dengan langsung menghitung mikroorganisme menggunakan haemocytometer, atau dengan serial menipiskan plating bakteri dan bakteri yang diencerkan pada media yang mendukung pertumbuhan mikro-organisme. Metode yang terakhir lebih memakan waktu, tetapi secara statistik memberikan hasil yang akurat dan berulang. Metode ini juga merupakan metode yang ideal bagi mikroorganisme pencacahan di populasi tertentu karena hanya mengidentifikasi organisme hidup dalam populasi. Menghitung mikroba berguna dalam ilmu-ilmu dasar dan digunakan menentukan jumlah bakteri fisiologis atau hadiah untuk studi biokimia. Sebagai contoh, jika ada yang tahu jumlah bakteri hadir dalam suatu budaya maka kita dapat menghitung jumlah protein atau DNA yang dapat terisolasi dari populasi. Microbial enumerasinya juga secara rutin digunakan di bidang kesehatan masyarakat. Pangan atau makanan uji mikrobiologi air, susu atau air untuk jumlah mikroba patogen untuk menentukan apakah produk ini aman untuk dikonsumsi manusia (Anonim 1 , 2010). Di dalam suatu populasi bakteri tidak semua sel mampu hidup terus menerus. Yang dianggap sel hidup adalah sel yang mampu membentuk koloni di dalam agar biak atau membentuk suatu suspensi. Sel sel hidup itulah yang nantinya akan di hitung dengan menggunakan beberapa metode untuk menetapkan jumlah sel hidup. Pada jumlah sel total semua sel yang nampak baik itu yang hidu atauun yang sudah mati dihitung. Sedangkan

untuk jumlah sel hidup biasanya hanya dihitung jumlah koloni yang berasal dari sel sel yang mampu terus hidup ada kondisi pertumbuhan yang menguntungkan (Schlegel, 1994). Pengukuran kuantitatif populasi mikroba seringkali sangat diperlukan dalam berbagai macam penelaahan mikrobiologis. Dalam penghitungan kuantitatif terdapat dua macam pengukuran dasar yaitu: a. Penentuan jumlah sel b. Penentuan massa sel Penentuan/pengukuran jumlah sel biasanya dilakukan untuk organisme bersel tunggal, tetapi juga untuk menghitung organisme berfilamen. Cara pengukuran jumlah sel ada berbagai macam, antara lain yaitu: 1. Metode Mikroskopis Langsung (Direct Microscopic Count) 2. Metode Penghitungan Cawan (Plate Count) 3. Secara Elektronis dengan alat penghitung coulter (Coulter Count) 4. Metode Penyaringan dengan menggunakan saringan membrane (Taviana, 1994). Pada metoda hitungan mikroskopik langsung, sampel ditaruh di suatu ruang hitung, seperti hemasitometer, dan jumlah gel dapat ditentukan secara langsung dengan bantuan mikroskop. Keuntungan metoda ini adalah pelaksanaannya cepat dan tidak memerlukan banyak perlatan. Kelemahannya ialah tidak dapat membedakan sel-sel yang hidup dan yang mati, dengan perkataan lain hasil yang diperoleh adalah jumlah total sel yang ada di dalam populasi. Pada beberapa macam sel eukariotik, penambahan zat warna tertentu, misalnya biru metilen 0,1%, pada sampel yang akan dihitung dapat dibedakan sel hidup dan yang mati. Pada sel khamir misalnya baik sel hidup maupun gel mati akan menyerap biru metilen namun hanya sel hidup dapat mereduksi zat warna tersebut secara enzimatik menjadi tidak berwarna, jadi gel-gel mati akan tampak biru. Kelemahan lain metoda mikroskopik langsung adalah sulitnya menghitung sel yang berukuran sangat kecil seperti batten karena ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya lensa objektif celup

minyak. Hal ini biasanya diatasi dengan cara mewarnai gel sehingga menjadi lebih mudah dilihat. Kelemahan lain lagi ialah kadang-kadang sel cenderung bergerombol sehingga sukar membedakan set gel individu. Cara mengatasinya ialah menceraiberaikan gerombolan sel-sel tersebut dengan menambahkan bahan anti gumpal seperti dinatrium etilen diamin tetraasetat d- Tween 80 sebanyak 0,1% (Dwidjoseputro, 1984). Perangkat yang digunakan untuk menentukan jumlah sel per satuan volume dari suatu suspensi disebut ruang penghitungan. Yang paling banyak digunakan jenis ruang disebut hemocytometer. Hal ini dikarenakan awalnya dirancang untuk melakukan jumlah sel darah (Anonim 2 , 2010). Cara membersihkan permukaan hitung hemasitometer dengan secarik kertas lensa yang telah dibasahi dengan setetes air suling. Lalu bersihkan kaca tutup sampai tidak lagi tertinggal sisa-sisa minyak pada permukaannya, letakkan kaca tutup hemasitometer di atas permukaan hitung hemasitometer, kocok suspensi sel khamir baik-baik, jaga agar sumbat tabung tidak terbasahi, dan dengan menggunakan pipet Pasteur ambil suspensi. Pengambilan suspensi dengan pipet Pasteur dapat dilakukan dengan cara memasukkkan pipet tersebut ke dalam suspensi lalu menutup lubang pangkal pipet dengan telunjuk. Dengan cermat taruh ujung pipet Pasteur pada lekukan berbentuk V pada tepi kaca tutup hemasitometer dan biarkan ruang hemasitometer terpenuhi suspensi secara kapiler. Gunakan telunjuk untuk mengatur aliran suspensi mencegah banjir bahagian bawah kaca tutup oleh aliran yang berlebihan. Usahakan agar tidak ada cairan masuk di antara kaca tutup yang sebenarnya harns berukuran tepat 0,1 mm. Bila sampai terjadi hal demikian, maka seluruh prosedur harus diulang. Taruhlah hemasitometer di mikroskop dengan hati-hati. Amati dengan objektif kekuatan rendah dan hitung jumlah sel yang terdapat pada 80 buah kotak kecil yang terletak di dalam kotak bagian tengah yang berukuran 1 mm2 itu. Yang seluruhnya ada sembilan area masing-masing berukuran 1 mm2. Kotak yang di tengah, kesemua sisi dibatasi dengan garis ganda, juga berukuran 1mm2 dan akan dibagi menjadi 25 kotak besar. Setiap kotak besar ini

dibagi-bagi menjadi 16 kotak kecil, dengan demikian di dalam kotak tengah tersebut seluruhnya terdapat 400 kotak kecil (25 x 16). Contoh perhitungan, andaikan menurut pengamatan terdapat 500 sel khamir di dalam 80 kotak kecil. Maka jumlah sel khamir yang terdapat di dalam setiap ml suspensi asal dapat dihitung dengan cara berikut : 80 kotak kecil mempunyai luas 0,2 mm2, jadi di dalam setiap mm2 terdapat 500 x 5 atau 2500 sel. Kedalaman cairan dibawah hemasitometer 0.1 mm, maka volume cairan yang tercakup oleh kotak berukuran 1 mm2 ialah 0.1 mm3, artinya terdapat 2500 sel / 0,1 mm3 atau 25.000 sel / mm3. 1 ml = 1cm3 atau 100 mm3, maka jumlah sel khamir yang terdapat di dalam suspensi asal ialah 2,5 x 107 sel / ml (Partono, 1993). Konsentrasi di kalkulasi berdasarkan volume dibawah penutup. Satu kotak besar mempunyai volume 0,0001 ml (panjang x lebar x tinggi). Pada kedua metode, haemacytometer diisi oleh tindakan kapiler, pipet diisi dengan suatu campuran sel yang akan diletakkan pada haemacytometer dengan berhati-hati sehingga cairan akan naik oleh tindakan kapiler. Noda sel akan memudahkan visualisasi dan penghitungan. Sel campuran dengan suatu volume berwarna biru untuk menandai bahwa sel tersebut mati, dan untuk mengetahui apakah sel tersebut hidup atau mati. Membunuh sel bisa digunakan formalin dengan kadar 10%. Disini ada 2 metode sederhana untuk menghitung sel berdasarkan area permukaan haemacytometer. Pilihan metode tergantung pada konsentrasi sel, ketelitian prosedur menghitung tergantung banyak sel. Jika konsentrasi sel rendah perlu penghitungan yang lebih teliti (Sastramiharja, 1993).
Metode perhitungan jumlah bakteri total berdasarkan Fardiaz dengan menggunakan cawan pembiakan (plate count). Caranya semua koloni yang tumbuh di dalam cawan media SSW dihitung. Hasil hitungan koloni bakteri yang dapat diandalkan adalah antara 30-300 koloni pada setiap cawan biakan

(Rochima, 2005).

Metode perhitungan MPN sering digunakan dalam pengamatan untuk menghitung jumlah bakteri yang terdapat di dalam tanah seperti Nitrosomonas dan Nitrobacter. Kedua jenis bakteri ini memegang peranan penting dalam meningkatkan pertumbuhan dan produksi tanaman, sehubungan dengan kemampuannya dalam mengikat N2 dari udara dan mengubah amonium menjadi nitrat (Sutedjo, 1991). Persiapan perhitungan sel setelah 48 jam dalam inkubator: setelah 48 jam kultur sel dikeluarkan dari inkubator, kemudian media kultur sel dibuang, sel dicuci dengan phosphate buffer saline sebanyak 2 kali agar sisa - sisa media benar-benar hilang. Selanjutnya dilakukan tripsinasi dengan menambahkan trypsine versene guna merontokkan sel dari dinding plate dengan cara ditunggu beberapa saat (5 menit) kemudian diberi lagi fetal bouvine serum 10% agar diperoleh suatu suspensi sel (kepadatan sel 2 105 sel/ml). Cara perhitungan: diambil sebanyak 0,1 cc (sel dengan media serum) ditambahkan 0,9 cc cairan tripan biru, kemudian sel dihitung dengan alat hemositometer (0,0025 mm2). Alat tersebut terdiri dari 9 kotak, sehingga hasil yang diperoleh berupa jumlah rata - rata sel hidup dan mati dari ke sembilan kotak tersebut. Sel yang hidup ditandai dengan tidak terserapnya warna biru (warna terang), sedangkan sel mati menyerap warna biru ( Intan, 2005). C. Alat, Bahan, dan Cara Kerja 1. Alat dan Bahan Alat dan bahan yang digunakan pada praktikum kali ini adalah hemocytometer disertai gelas penutup, handtally counter, mikroskop cahaya, pipet tetes, vortex, suspensi Saccharomyces cerevisiae, larutan formalin, larutan alkohol, dan aquades. 2. Cara Kerja Hemocytometer dan gelas penutup yang akan digunakan dibersihkan dengan alkohol kemudian dikeringkan dengan cara dianginkan. Suspensi yeast yang akan ditentukan dengan jumlah selnya dihomogenkan dengan vortex. Hemocytometer dan gelas penutup dipasang diatas meja objek

mikroskop cahaya. Bidang pengamatan pada kotak sedang sebanyak 5 kotak sedang. Pengamatan pertama dilakukan pada bidang kotak pojok kiri atas dengan perbesaran 400X. Sebanyak 1 ml suspensi diteteskan ke dalam petak petak hemocytometer melalui saluran dengan menggunakan pipet tetes. Pemfokusan mikroskop diatur menggunakan pengatur halus. Pencahayaan diatur agar cahaya yang dihasilkan tidak terlalu terang ataupun redup. Garis garis pada kotak dan keseluruhan bidang pengamatan dipastikan terlihat jelas. Jumlah sel dihitung pada setiap petak yang diamati. Teknik yang digunakan adalah teknik sampling. Teknik ini dilakukan dengan cara melakukan perhitungan pada kotak pojok kiri atas dan bawah, pojok kanan atas dan bawah, serta kotak tengah. D. Hasil Pengamatan dan Pembahasan Tabel 1.1 Perhitungan jumlah sel secara langsung Kelompok Jumlah Sel sel / ml 1 31,4 7,85 x 10 6 2 31,4 7,85 x 10 6 3 13,8 3,45 x 10 6 4 13,8 3,45 x 10 6 5 29,2 7,3 x 10 6 6 29,2 7,3 x 10 6 7 12,8 3,2 x 10 6 8 12,8 3,2 x 10 6 Sumber : Laporan Sementara Pembahasan Praktikum acara ini bertujuan untuk menghitung jumlah sel mikroorganisme dengan menggunakan metode langsung. Alat yang digunakan adalah Petroff - Hauser Chamber atau Haemocytometer. Jumlah cairan yang terdapat antara coverglass dan alat ini mempunyai volume tertentu sehingga satuan isi yang terdapat dalam satu bujur sangkar juga tertentu. Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm. Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang

hitung ini adalah 0,1 mm. Sel bakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui. Sel tersebut dapat dihitung secara langsung dengan bantuan mikroskop. Keuntungan dari metode langsung adalah pelaksanaannya cepat dan tidak banyak memerlukan peralatan. Namun metode perhitungan langsung ini sulit untuk menghitung sel yang berukuran sangat kecil. Dari hasil praktikum dapat diketahui jumlah sel yang hidup jumlahnya 146 pada 5 luasan kotak haemacytometer, sehingga jumlah ratarata sel yang hidup adalah 29,2. Dalam haemacytometer tersebut terdapat kotak-kotak dengan volume 0,004 mm3 tiap kotaknya. Sehingga diperoleh jumlah sel yang hidup 7,3 x 10 6 sel/ml. Di dalam praktikum ini, didapat data pada setiap kelompok berbeda beda. Hal ini dipengaruhi oleh praktikan yang mengamati pada setiap kelompok berbeda beda. Selain itu sel sel yang diamati cepat sekali mengalami pergerakan serta pembelahan sel. Oleh karena itu antara kelompok satu dengan kelompok lain jumlah sel yang didapat berbeda beda. Penggunaan formalin dimaksudkan untuk memperlambat pergerakan sel yang akan dihitung. Sedangkan penggunaan alkohol berguna untuk mensterilkan alat dan bahan yang digunakan sehingga alat dan bahan tersebut terbebas dari mikrobia yang akan berkontaminasi dengan mikrobia yang akan digunakan dalam praktikum. Analisis data yang diperoleh pada kelompok 5 dan 6 Kotak C Kotak D Kotak E Kotak F Kotak tengah = 30 = 28 = 33 = 27 = 28

Jumlah

= 146 146 5

sel

= 29,2 Untuk kotak sedang p l t V = 0,2 mm = 0,2 mm = 0,1 mm = 0,2 x 0,2 x 0,1 = 0,004 mm 3 1 ml = 1000 mm 1000 X sel 0,004

sel / ml

= 2,5 x 10 5 x 29,2 = 7,3 x 10 6 sel/ml

Gambar Hemocytometer

E.

Kesimpulan dan Saran Dari percobaan yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa :

1. 2.

Perhitungan jumlah sel bakteri dapat dilakukan secara langsung Perhitungan jumlah bakteri secara langsung memerlukan waktu

dengan menggunakan hemocytometer lebih cepat dan peralatan yang sedikit dibandingkan dengan perhitungan jumlah bakteri secara tidak langsung. 3. Hemocytometer memiliki ruang hitung yang terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm. Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. 4. Kekurangan dari hemocytometer adalah bentuk bakteri yang pada semua sisi hemocytometer adalah sama dan mikroorganisme yang menumpuk numpuk dihitung satu. Sehingga sebaiknya menggunakan Petroft Houser Bacteria Counter ( PBC ). 5. Rumus penentuan jumlah bakteri menggunakan

hemocytometer adalah

1000 xjumlahsel 0,004


6

6. Jumlah sel pada perhitungan secara langsung yaitu 7,85 x 10 3,45 x 10 6 sel/ml, 7,3 x 10 6 sel/ml, dan 3,2 x 10 6 sel/ml.

sel/ml,

7. Dalam memperoleh hasil akhir pada setiap kelompok berbeda beda. Hal ini dipengaruhi oleh sel sel yang diamati cepat sekali mengalami pergerakan serta pembelahan sel. Saran untuk praktikum ini adalah mikroskop yang digunakan hanya beberapa sehingga tidak semua praktikan dapat melakukan perhitungan sel secara individu.

DAFTAR PUSTAKA Anonim 1 , 2010. Enumerasi Bakteri. http//www2.muw.edu//Micro/ enumeration.doc. Diakses tanggal 1 April 2010. Pukul 19.30 WIB. Anonim 2 ,2010. Hemocytometer. http://edu/methods/microscopy/cell.html. Diakses tanggal 1 April 2010. Pukul 19.37 WIB. Dwidjoseputro, D. 1984. Mikrobiologi Dasar. Jembatan. Jakarta Nirmana, Intan. 2005. Sitotoksisitas Resin Akrilik Hybrid Setelah Penambahan Glass Fiber Dengan Metode Berbeda. Bagian Ilmu Material dan Teknologi Kedokteran Gigi Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga Surabaya Partono, A. T. 1993. Pertumbuhan Bakteri. Seminar Bioteknologi. Bandung Rochima, Emma. 2005. Dinamika Jumlah Bakteri Selama Fermentasi Selama Prosesing Ikan Asin Jambal Roti. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjajaran Jatinangor Bandung Sastramiharja, I.1993. Isolasi Bakteri. Seminar Bioteknologi. Bandung Schlegel, Hans G. 1994. Mikrobiologi Umum. UGM Press. Yogyakarta Sutedjo, M. 1991. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta, Jakarta Taviana, Evi. 1994. Penghitungan Kuantitatif Spora Cendawan Dengan Metode Hitungan Mikroskopis Langsung. Staf Perangkat perlindungan Tanaman Disbun Prop. Dati I Kalimantan Barat.