Toxicologia in vitro: Principais modelos utilizados

Alexandre Bella Cruz Rilton Alves de Freitas

Toxicologia in vitro: Principais modelos utilizados

Objetivo Conhecer Mtodos para Avaliao de Genotoxicidade Contedo Introduo Testes - Micro-organismos - Eletroforese para clula nica em gel (SCGE) Teste do Cometa - Microncleo

Qualidade MP
- Eficcia - Segurana - Qualidade final

Qualidade MP
- Eficcia Comprovao de ensaios farmacolgicos pr-clnicos e clnicos - Segurana Ensaios que comprovem ausncia de efeitos txicos - Ausncia de contaminantes Metais pesados, Agrotxicos, Produtos de degradao, Micro-organismos e metablitos, etc.

Qualidade MP
- Eficcia Comprovao de ensaios farmacolgicos pr-clnicos e clnicos - Segurana Ensaios que comprovem ausncia de efeitos txicos - Ausncia de contaminantes Metais pesados, Agrotxicos, Produtos de degradao, Micro-organismos e metablitos, etc.

n ensaios toxicolgicos GENOTOXICIDADE

Testes de produtos farmacuticos para a toxicidade gentica Unio Europeia (1987) Japo (1989) EUA (1993)

Testes de produtos farmacuticos para a toxicidade gentica Resoluo RE n.90 (16/03/2004) "Guia para a realizao de estudos de toxicidade pr-clnica de fitoterpicos"

Toxicidade aguda, Toxicidade de doses repetidas (longa durao), Estudo especial - Genotoxicidade

Testes de produtos farmacuticos para a toxicidade gentica "Guia para a realizao de estudos de toxicidade pr-clnica de fitoterpicos"

Estudo especial - Genotoxicidade

1 - Genotoxicidade: Avaliao in vitro da reverso de mutao em bactrias incluindo ativao metablica ou de dano a cromossomas de clulas de mamferos ou de linfoma de camundongo. 2 - Avaliao in vivo do dano em cromossoma em clulas hematopoiticas de roedores (teste de microncleo).

Relao:

Agentes genotxicos X efeitos nocivos sade

- incidncia de cnceres - problemas reprodutivos Ocupacional: laboratrios qumicos, clnicos, toxicolgicos e indstrias em geral Agentes qumicos: medicamentos, inseticidas, fungicidas, herbicidas, fertilizantes e outros produtos

DNA
James D. Watson & Francis Crick (1953) No uma molcula estvel Para garantir integridade Sistemas de reparo Sistemas de tolerncia

DNA

Leses (Humanos)

Processos degenerativos (envelhecimento, cncer)

Definies
Genotoxicidade: O estudo dos efeitos adversos de agentes fsicos e qumicos no material gentico de clulas (DNA ou cromossomos) e a subsequente expresso de tais mudanas. Mutagenicidade: Mudana ou dano gnico ou inibio ou dano do mecanismo de reparo ao DNA resultando em uma clula alterada.

Definies
Mutao: Processo pelo qual um gene sofre mudana estrutural Indica mudana fenotpica resultante de um gene mutado O termo mutante usado para designar um indivduo que expressa a alterao do gentipo resultante de mutao

Definies
Mutao: uma mudana na sequncia do DNA, que leva a uma alterao herdvel da funo gnica Os agentes que mudam a sequncia do DNA so txicos para o gene e so, ento, chamados de genotxicos

Genotoxicidade no uma medida de carcinogenicidade Indicador para o cncer Testes de mutagenicidade medem um evento inicial ou intermedirio da tumorignese Alta associao Testes de genotoxicidade X Carcinogenicidade Por isso so utilizados avaliao do espectro toxicolgico

Vida

DNA (alteraes)

Erros durante duplicao

Todos seres vivos Mutao Evoluo e diversidade das espcies

Agentes mutagnicos Alterao da seqncia das bases (DNA)

Acelera ou aumenta mutaes

Neoplasias (cncer)

Testes de genotoxicidade - Diversas metodologias - Importante pesquisa para avaliao da toxicidade celular - Identificar potencial carcinognico e a mutagenicidade - Proteger o material gentico humano

Genotoxicidade - Sistema experimental (4 Nveis):

Primeiro nvel: engloba ensaios moleculares e em bactrias (mutao em gene bacteriano) Segundo: provas in vitro em clulas de cultivo (aberraes cromossmicas) Terceiro: compreende anlises in vivo (mutao gnica em clulas de mamferos) Quarto: corresponde a estudos em populaes expostas

Genotoxicidade - Sistema experimental (4 Nveis):

Outras tcnicas: - coeficiente DNA/protena - atividade das enzimas mitocondriais - proliferao celular - ndices mitticos - identificao de danos - quebras e reparos no DNA - aberraes cromossmicas - no disjunes - a deteco de apoptose e necrose

Sistema de avaliao de novos agentes qumicos: Testes de Genotoxicidade ! Sistema apropriado e protocolo: Em construo

Testes - Micro-organismos - Eletroforese para clula nica em gel (SCGE) Teste do Cometa - Microncleo

Mutagenicidade Teste de Ames

Bruce Ames, 1970 Cepas (estirpes) Salmonella typhimurium Mede a induo de mutaes reversas em cepas auxotrficas (His-) para o aminocido histidina que revertem as mesmas prototrofia (His+) (selvagem).

Teste de Ames
Resultados de um teste sobre as bactrias tm algum significado na deteco de agentes txicos para os humanos? 1. A natureza gentica e qumica do DNA idntica em todos os organismos 2. Ames e Colaboradores desenvolveram uma forma de simular o metabolismo humano no sistema bacteriano.

Teste de Ames
Mamferos maior parte do processamento de produtos qumicos ocorre no fgado (onde so decompostos) Em alguns casos, a ao de enzimas do fgado pode criar um composto txico ou mutagnico de uma substncia que no era originalmente perigosa. Ames incorporou enzimas do fgado de mamfero (rato) em seu sistema de teste de bactrias.

Teste de Ames

Realizado em presena e ausncia de sistema de metabolizao exgeno (mistura S9) Permite monitorar: - ao direta sobre o material gentico - atividade positiva ou negativa metablitos biotransformao Semelhante o que ocorreria nos fgados de mamferos.

Culturas auxotrficas (exigncia nutricional)

Teste de Ames
Fundamenta-se na restaurao ou compensao de um defeito gentico especfico que causa exigncia a um determinado nutriente. A frequncia de mutao reversa facilmente medida pela contagem do nmero de colnias que crescem em meio mnimo aps exposio de uma populao a um agente mutagnico.

Teste de Ames - Procedimento

Teste de Ames - Procedimento

Teste de Ames - ndice de Mutagenicidade

Teste de Ames - ndice de Mutagenicidade

IM =

n. revertentes induzidos n. revertentes espontneos

IM = 1,0 (indica no houve induo de revertentes) IM entre <0,6 e 0,7 (pode ser indicativo de toxicidade) IM > 1,0 (pode indicar induo de revertentes) IM 2,0 (substncia considerada mutagnica)
Fonte: Invitox, 2004; Borgo, Rosa, Vargas, 2004; Jayaprakasha, Negi, Jena, 2006

Mutagenicidade Teste alternativo: Sacchamomyces cerevisiae

Levedura (fungo unicelular) - Eucorioto Ferramenta importante em pesquisas - mutagenicidade - reparo de DNA - mecanismos estresse oxidativo Complementam os ensaios realizados em bactrias

Teste de mutagenicidade em Saccharomyces cerevisiae

(XV-185-14c)

Dano gentico Ensaio Cometa (Single CeII GeI Electrophoresis - SCGE)

Rydberg & Johanson: Quantificao danos DNA em clulas em agarose - no detecta mutaes - detecta leses genmicas mutao - Leses genmicas so passvel de correo .'. estudo de reparo do DNA

Ensaio Cometa (Single CeII GeI Electrophoresis - SCGE)

Rydberg & Johanson: Quantificao danos DNA em clulas em agarose

Danos DNA so clula e tecido-especficos .'. Permite deteco danos e reparo em uma nica clula Relevante para avaliao de compostos genotxicos.

Cometa - Vias de reparo DNA

- reverso da leso - reparo por exciso - reparo recombinacional - tolerncia a leses

Atuam em conjunto garantir a manuteno gentica

(sobrevivncia dos organismos)

Ensaio Cometa (Single CeII GeI Electrophoresis - SCGE)

Procedimento 1- Clulas embebidas em gel de agarose (lminas) 2- Lisar sob condies alcalinas (ou neutras) 3- Eletroforese 4- Segmentos DNA livres migram fora do ncleo 5- Observao microscpica 6- Classificao das clulas em classes (0-4)

Teste cometa com vrios graus de dano ao DNA: A - clula sem dano B - clula com leves danos C - clula danificada ou clssico cometa D - clula altamente danificada
Fonte: Lebailly et al. Occup Environ Med, 60: 910-917, 2003.

Ensaio Cometa (Single CeII GeI Electrophoresis - SCGE)

Tipo de dano detectado

Fonte: Junqueira, A.P.F., 2006

Ensaio Cometa (Single CeII GeI Electrophoresis - SCGE)

Condies de ensaio

Teste do Microncleo
Ensaio in vivo para a deteco de agentes - clastognicos
(quebram cromossomos);

- aneugnicos
(induzem aneuploidia ou segregao cromossmica anormal)

Teste desenvolvido em eritrcitos de medula ssea

(camundongos, ratos)

Teste do Microncleo
Procedimento
1- Camundongos jovens machos (4-5 semanas) Grupos 10 Controle positivo: ciclofosfamida 50 mg/kg Controle negativo Teste Dieta, Temp. Umidade, Ciclo de luz 2- Administrao substncia (12 - 30 h) 3- Sacrificio (medula ssea fmur, lava, centrifuga 1000 rpm / 5 min.) 4- Sedimento (duas lminas, seca ambiente)

Teste do Microncleo
Procedimento
5- Colorao Leishmann 6- Microscopia de fluorecncia 7- Contagem dos eritroblastos policromticos com microncleo em relao ao total (mnimo 1000 EP/lmina) Pode ser corado com Giemsa ou fluorescena

Teste Microncleo

Teste de carcinogenicidade
in vivo Empregando roedores in vitro Transformao celular BALB/C3T3 (OEDC)*