Enzime

7.1. Aspecte generale

Enzimele sunt substane chimice complexe de natur organic-proteine coloidal solubile - elaborate de plante, animale i microorganisme, capabile s mreasc viteza reaciilor chimice ce se desfoar n sistemele biologice, fr s se consume n cursul lor. Sunt deci, o clas special de proteine dotate cu activitate catalitic; se mai numesc i biocatalizatori. Denumirea de enzime a fost dat de ctre Kuhne (1878) i provine de la expresia "en zima = n levur" (n 1. greac), pornind de la faptul c din drojdii s-au extras pentru prima dat enzime. Procese enzimatice, cum sunt fermentaia vinului, dospirea pinii, acidifierea laptelui etc. sunt cunoscute din cea mai ndeprtat antichitate. Dar cunotine sistematice n acest domeniu s-au obinut ncepnd cu identificarea primelor enzime: amilaza din mal (Kirchoff, 1814), amilaza salivar (Leuchs, 1831) i pepsina (Schwann, 1836). Ulterior, progrese importante s-au realizat prin lucrrile privind cataliza i biocataliza ale lui Berzelius i Liebig, prin studiile asupra cineticii ale lui Michaelis i Menten (1912), prin obinerea enzimelor n stare cristalizat (Sunner, 1926). Enzimologia, domeniu al biochimiei care se ocup cu studiul enzimelor, s-a dezvoltat exploziv pe baza unor cercetri ample privind structura enzimelor, mecanismele de reacie studiate la nivel electronic i cuantic, reglarea proceselor enzimatice n cadrul metabolismului intermediar. Ca urmare, enzimologia constituie studiul bazelor moleculare ale vieii. Prin aciunea lor catalitic, enzimele fac posibil, n condiii compatibile cu viaa, realizarea unei ntregi serii de reacii chimice, care n vitro nu se pot realiza dect n condiii foarte dure, improprii vieii celulare. Astfel, hidroliza proteinelor pe cale chimic se realizeaz la 37C, numai n mediu puternic acid i ntr-un interval de timp foarte lung (3 luni); n organism, n stomac, aceast degradare are loc extrem de rapid i n mediu mai slab acid. Pentru a realiza "in vitro" tot att de repede aceast hidroliz sunt necesare o temperatur de 120- 140C i o mare aciditate, deci

Biochimia produselor alimentare condiii absolut incompatibile cu viaa organismelor. n mod similar, arderea glucozei n organismele vii cu producerea apei, a dioxidului de carbon i a energiei se realizeaz prin intermediul enzimelor n condiii specifice vieii celulare. n absena enzimelor, aceleai transformri necesit temperaturi de 180-200C. Ca urmare, rolul enzimelor este fundamental n procesele vieii, iar studiul acestora apare astfel ca problem central a biochimiei. Conform definiiei lui Haldane, "enzima este un catalizator organic, solubil i coloidal produs de celula vie". Ca urmare, enzimele sunt prezente n toate celulele esuturilor, organelor. Organismele vii trebuie s fie capabile s-i sintetizeze singure enzimele de care au nevoie pentru desfurarea normal a activitii vitale. Biosinteza enzimelor este similar cu cea a proteinelor fiind dirijat de acizii nucleici i de substanele specifice din fiecare organism. Dei sinteza lor se face numai n interiorul organismului, enzimele i pot exercita aciunea lor atunci cnd sunt extrase din organism, i n afara acestuia. Numrul enzimelor este foarte mare i mereu se identific altele noi.. n principiu, se poate spune c pentru fiecare substan proprie organismului trebuie s existe cel puin o enzim care s catalizeze, fie reacia de formare a ei dintr-o substan inferioar sau superioar ca structur, fie transformarea ei. n multe cazuri enzima care particip la sinteza substanei este diferit de cea care efectueaz degradarea ei. Substana care este transformat printr-o reacie catalizat de o enzim se numete substrat. Natura i cantitatea de enzime variaz n funcie de genul organismului, de vrsta lui. Animalele sunt mai bine dotate din punct de vedere enzimatic dect plantele. Unele enzime sunt sintetizate de celul sub form inactiv -proenzimedar trec n stare activ cnd celula are nevoie; aceasta constituie o form de reglare deosebit de important pentru viaa celulei. n felul acesta se evit autodistrugerea unor esuturi, organe sau se pot evita o serie de tulburri cu consecine deosebit de grave pentru organism. Dup formarea lor, enzimele (sau proenzimele) sunt difuzate la locul lor din celula respectiv (intracelulare) sau sunt excretate (extracelulare) la locul unde i vor manifesta activitatea lor catalitic. Enzimele intracelulare sunt acele enzime care sunt produse i i desfoar activitatea chiar n celulele n care sunt biosintetizate. Ele sunt legate puternic de structura celulei i nu pot fi extrase dect prin distrugerea acesteia pe cale mecanic (nghe-dezghe, mojarare cu nisip de cuar etc.). Extragerea se face cu ap, glicerin, soluii saline, meninndu-i activitatea ca i n celule.

180

Enzime Enzimele intracelulare pot fi legate prin adsorbie i n acest caz se numesc bioenzime, iar cnd sunt legate profund de celule, de protoplasma celulei, prin legturi chimice, se numesc desmoenzime. Acestea se separ numai dup autoliza substanei celulare i nu prin distrugerea mecanic. Dup autoliz, enzimele se extrag cu ap, glicerin etc., pstrndu-i activitatea. Enzimele extracelulare sunt enzimele care, dei biosintezate n celule, sunt eliminate n lichidele din organism sau n mediile de cultur, exercitndu-i aciunea la acest nivel. Aceste enzime se extrag cu uurin de la locul de aciune, iar activitatea lor este deplin. n organism exist enzime fie independent de prezena substratului (enzime constitutive), fie enzime care sunt sintetizate n caz de nevoie i cnd substratul respectiv este prezent (enzime adaptive sau enzime inductibile). Sisteme enzimatice. Exist reacii catalizate de o singur enzim; n celul ns majoritatea cilor metabolice au un numr de etape intermediare, adic ntre substana iniial (A) ce urmeaz a fi transformat i produsul final (D) iau natere o serie de produi intermediari. Fiecare etap intermediar este catalizat de o anume enzim(E) iar reacia n total este catalizat de un sistem enzimatic:

ntr-un astfel de sistem nu toate enzimele au aceeai importan funcional; cele care au rolul principal se numesc enzime limitative sau enzime "cheie". Sistemul enzimatic este riguros coordonat, etapele se succed ntr-o ordine anumit n aa fel ca produsul unei reacii s serveasc ca substrat pentru etapa urmtoare. Aceast succesiune de reacii trebuie s fie nentrerupt deoarece blocarea uneia conduce la blocarea ntregului sistem. De asemenea, unii intermediari pot fi utilizai n alte ci metabolice. Este necesar deci o coordonare cantitativ pentru fiecare sistem enzimatic.

7.2. Structura enzimelor

7.2.1. Constituenii enzimelor
Toate enzimele sunt de natur proteic i au un nalt grad de structurare

181

Biochimia produselor alimentare posednd o structur primar, imprimat de secvenializarea aminoacizilor n catena polipeptidic fundamental, o structur secundar, o structur teriar i o structur cuaternar, determinate de modul n care catenele polipeptidice se pot plia i asocia ntre ele. Numeroase enzime ns au o structur binar care const dintr-o component proteic, denumit apoenzim i una sau mai multe componente neproteice, denumite cofactori. Complexul apoenzim+cofactor este denumit holoenzim i este activ din punct de vedere catalitic. Prin ndeprtarea cofactorului, rmne componenta proteic inactiv n forma liber. n structura holoenzimei, cofactorul imprim specificitate de aciune, respectiv determin tipul i viteza reaciei catalizate, n timp ce apoenzima imprim specificitate de substrat, respectiv determin substana asupra creia acioneaz enzima. Apoenzima fiind de natur proteic, manifest proprietile generale ale proteinelor; este termolabil i nedializabil; stabilete legtura enzimei cu substratul; manifest grade diferite de afinitate pentru cofactor; este susceptibil de modificri conformaionale n anumite limite. Cofactorii enzimatici reprezint componente neproteice de natur chimic foarte diferit, care sunt indispensabili pentru manifestarea activitii catalitice a numeroase enzime. Dup natura chimic i modul lor de legare la apoenzim, cofactorii se clasific n: coenzime, grupri prostetice, ioni metalici. coenzimele sunt compui organici - majoritatea derivai de la vitamine care se ataeaz temporar la apoenzim prin legturi necovalente i care sunt uor disociabili de aceasta. Ele pot trece uor de la o apoenzim la alta putnd astfel participa la transformarea altor molecule de substrat dup terminarea unei anumite reacii. Dintre acestea fac parte: NAD+, NADP+, ATP, CTP, acidul lipoic etc.

gruprile prostetice sunt substane organice fIxate pe apoenzim i care disociaz greu deoarece sunt legate prin legturi covalente; dintre aceste grupri se pot meniona FAD, FMN, TPP, piridoxalfosfatul, hemul. Gruparea prostetic imprim mecanismul unor procese enzimatice ca: transportul de electroni, de grupri NH2, acetil etc. De exemplu, hemul coninnd ionul Fe2+ este o component a citocromilor (enzime ce transport electroni) puternic legat de apoenzim prin legturi chimice de tip covalent. ionii metalici sunt indispensabili pentru exercitarea funciei catalitice a unor enzime, participnd n calitate de cofactori sau de componente structurale ale acestora. Aceste enzime se numesc i metal-enzime iar printre ionii care ndeplinesc rol de cofactor se pot meniona: Mg2+, Mn2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+(3+), Mo2+. Unele enzime pot conine chiar doi ioni metalici.

182

Enzime

7.2.2. Centrul activ al enzimei

n interaciunea dintre enzim i substratul su, enzima particip cu o poriune limitat din structura sa. Pe aceast poriune exist grupri reacionale capabile s atrag i s fixeze molecula substratului ntr-o poziie privilegiat i ntr-un loc strict determinat; ansamblul acestor grupri chimice i al ncrcrilor electrice constituie centrul activ al enzimei sau centrul catalitic. Astfel, centrul activ al unei enzime reprezint ansamblul regiunilor funcionale ale enzimei, respectiv ansamblul gruprilor chimice active care particip efectiv la reacia catalizat. n cazul enzimelor care nu necesit pentru activitatea lor catalitic prezena unui cofactor, acest centru activ este reprezentat de o secven de aminoacizi i este condiionat de configuraia tridimensional a moleculei. Eficacitatea centrului activ nu depinde numai de gruprile funcionale ce se combin cu substratul ci de integritatea configuraiei moleculei proteice care determin poziiile spaiale relative ale acestor grupri funcionale. Acest fapt subliniaz importana structurii teriare a proteinei pentru activitatea enzimatic. Pentru acest tip de enzime centrul activ coincide cu zona, denumit situs catalitic, unde se gsete secvena de aminoacizi implicai n activitatea catalitic. n cazul enzimelor care conin cofactori enzimatici, centrul activ include situsul catalitic i regiunea din molecul la care este ataat cofactorul (coenzima, metal), adic: centru activ = situs catalitic + cofactor

7.2.3. Organizarea structural a enzimelor

n funcie de organizarea lor structural ca molecule proteice, enzimele se ncadreaz n urmtoarele grupe principale: enzime monomere, enzime oligomere, izoenzime. Enzimele monomere au o structur constituit dintr-un singur lan polipeptidic n care este inclus situsul catalitic. Sunt ntr-un numr restrns, nu pot fi disociate n subuniti i posed mase moleculare relativ mici (13.000 - 35.000). Enzimele oligomere sunt agregate moleculare constituite din dou sau mai multe subuniti (protomeri) asociate ntr-o structur compact dotat cu proprieti catalitice. Au mase moleculare mari, cuprinse ntre 35.000 i

183

Biochimia produselor alimentare cteva sute de mii. Marea majoritate a enzimelor care catalizeaz diferite reacii biochimice ale metabolismului sunt enzime oligomere. Izoenzimele reprezint forme moleculare multiple ale unei enzime care catalizeaz aceeai reacie, au originea n aceeai celul, esut sau lichid biologic, dar difer ca structur (configuraie spaial) i proprieti fizico-chimice (pH optim de aciune, cinetic de reacie, mobilitate electroforetic). Izoenzimele apar datorit diferenelor la nivelul structurilor cuaternare, respectiv combinrilor variate ale unor subuniti structurale de natur polipeptidic. De exemplu, lactat dehidrogenaza din muchi este un tetramer care are dou lanuri polipeptidice de tipul H i dou de tipul M. Cuplarea lanurilor este diferit, ceea ce d natere la 5 forme izomere ale acestei enzime: H H H H; H H H M; H H M M; H M M M; M M M M.

7.3. Specificitatea enzimelor

Enzimele difer de catalizatorii neproteici prin una din cele mai remarcabile i caracteristice proprieti ale lor i anume specificitatea. Se nelege prin specificitatea unei enzime proprietatea sa de a aciona preferenial numai asupra unui anumit substrat sau grup de substrate cu caractere chimice comune. Specificitatea enzimatic se poate manifesta la nivelul tipului de reacie catalizat de enzim i la nivelul substratului. Specificitatea de reacie (de aciune) se manifest asupra unui singur substrat de ctre mai multe enzime, fiecare cataliznd o anumit reacie. De exemplu, un - aminoacid poate constitui substratul de reacie pentru mai multe enzime care catalizeaz reacii diferite - ns specifice - de transformare a sa n produi de reacie diferii:

184

Enzime

Fiecare enzim manifest o anumit specificitate de aciune, cataliznd un anumit tip de reacie biochimic. Specificitatea de substrat. Aceasta se refer la activitatea pe care o manifest enzimele fa de anumite substrate. Gradul specificitii de substrat variaz foarte mult. Se deosebesc astfel: specificitate absolut. Unele enzime nu acioneaz dect asupra unui singur substrat fiind inactive fa de alte substane cu structur asemntoare; de exemplu ureaza hidrolizeaz numai ureea, nu i derivatul su metilat:

Arginaza numai

H2N -C-NH2 O
NH2 C NH NH CH2 3 CH NH2 COOH arginin

ureaza H2O

CO2

+ 2 NH3

hidrolizeaz arginina:

NH2 arginaz H2O CH2 3 CH NH2 COOH ornitin

NH2 C O + NH2 uree

specificitatea de grup o au enzimele care acioneaz asupra unei serii de substane apropiate ca structur chimic. Astfel, pepsina nu atac dect proteinele, dar toate tipurile de proteine, amilaza atac amidonul, dextrinele, glicogenul; hexokinaza catalizeaz fosforilarea unei serii de hexoze n prezen de ATP. Stereospecificitatea. Unele enzime au stereospecificitate fa de izomeria

185

Biochimia produselor alimentare cis-trans. Astfel, fumaraza acioneaz numai asupra acidului fumaric i este inactiv asupra izomerului su cis, acidul maleic:

HOOC C=C H acid fumaric

H fumaraza COOH H2O

HOOC C C

H H OH COOH

acid malic n cazul substanelor optic active, enzimele manifest o aciune specific fa de o anumit form stereoizomer a substratului; de exemplu, L-aminoacidoxidazele nu recunosc dect L-aminoacizii iar pentru transformarea Daminoacizilor este necesar prezena D -aminoacid - oxidazelor.
Unele enzime fac distincie ntre conformaiile i din legturile glicozidice. Maltaza, de exemplu, hidrolizeaz numai legtura (1 4) glicozidic din molecula de maltoz, i nu atac legtura (1 4) glicozidic din celobioz.

7.4. Mecanismul de aciune al enzimelor

Mecanismul general de aciune al enzimelor este cel al tuturor catalizatorilor i anume: - intervin numai n acele reacii care sunt posibile din punct de vedere termodinamic; - nu modific echilibrul unei reacii, ci fac ca acest echilibru s fie atins mai repede; - cantitatea lor rmne neschimbat la sfritul reaciei. Enzimele au i ele aceste proprieti, la care se mai adaug urmtoarele: - natura lor proteic le confer un grad mare de specificitate; - activitatea enzimatic este supus unui control i acest fapt are mare importan pentru reglarea metabolismului celular; - micoreaz energia de activare n reacia respectiv ceea ce determin creterea vitezei acesteia. n general, pentru ca o reacie s aib loc cu o vitez apreciabil, moleculele reactanilor trebuie s fie activate. Energia de activare poate fi furnizat de temperatur ns, n cazul organismelor vii, utilitatea ei este limitat. Enzima are capacitatea de a cobor nivelul energetic care condiioneaz reacia, ceea ce permite moleculelor s reacioneze cu o vitez apreciabil n condiii n care n absena enzimei nu ar reaciona dect cu o vitez extrem de mic.

186

Enzime Deci, enzimele scad nivelul "energiei de activare" necesar ca o reacie s poat avea loc. Aceast scdere a energiei de activare se datoreaz formrii unui complex activat ntre enzim i substrat (ES) care apoi se transform cu vitez mare n produi finali de reacie i enzim, ultima fiind capabil s se combine cu o alt molecul de substrat. Ipoteza formrii complexului intermediar ES a K3 K1 fost emis pentru prima dat de Michaelis i E-S E+S E + P Menten. K2 Reacia de formare a complexului enzimsubstrat este reversibil, constantele de echilibru fiind K1 i K2. La formarea complexului activat, substratul se fixeaz pe centrul catalitic al enzimei. ntre centrul catalitic i molecula substratului exist complementariti conformaionale i chimice (ipoteza "lact-cheie") care permit asamblarea lor (fig. 7.1).

Fig. 7.1. Schema modului de aciune a enzimei Fixarea substratului pe enzim i imprim acestuia o stare de tensiune molecular care are drept consecin labilizarea lui i facilitarea reaciei biochimice. Deci rolul complexului enzim-substrat n procesele de cataliz enzimatic este de a micora energia de activare a reaciei. Astfel, se consider c un substrat S se poate transforma n compusul P att direct, fr enzim (1), ct i prin cataliz enzimatic (2). Energia medie a moleculelor substratului este Er. Prin ocuri se poate ajunge la energia El necesar pentru ca S s dobndeasc o stare activat S l care s-i permit trecerea n P. Energia maxim El necesar transformrii este energia de activare n absena enzimei. n prezena enzimei ns, prin formarea complexului enzim-substrat este nevoie de o energie de activare mult mai mic E2 pentru transformarea substratului. Energia eliberat n ambele reacii este ns aceeai, E (fig. 7.2).

187

Biochimia produselor alimentare

Fig. 7.2. Nivelele de energie ale moleculelor n cursul unei reacii fr enzim (1) i cu enzim (2)

7.5. Cinetica reaciilor enzimatice

Studiul cineticii enzimatice este deosebit de important deoarece permite cunoaterea mecanismelor reaciilor enzimatice, nelegerea i clasificarea proceselor metabolice i importana lor fiziologic pentru organism. Msurarea activitii enzimatice se reduce la 'studiul cineticii sau vitezei reaciei catalizate.

7.5.1. Viteza de reacie

Este caracteristica esenial a unei enzime, reprezint cantitatea de substrat (S) transformat n unitatea de timp (t) i se exprim prin relaia:

188

Enzime

v=

dS dt

Dac se reprezint grafic variaia cantitii de substrat transformat (sau de produs obinut) n unitate a de timp, se obine o curb format dintr-o parte rectilinie (n care viteza este constant) i una curb n care viteza scade (datorit faptului c rmne o cantitate tot mai mic de substrat netransformat). Pentru studiul cineticii se ia n considerare numai prima parte a curbei care indic viteza iniial a reaciei i ea este definit prin panta maxim a curbei (fig. 7.3): vo = tgo. Pentru un timp t1, v1 = tg1.

7.5.2. Factorii care influeneaz cinetica reaciilor enzimatice

Viteza de reacie, respectiv cinetica reaciilor enzimatice este dependent de o serie de factori, i anume: concentraia enzimei, concentraia substratului, temperatur, pH, efectorii enzimatici. a. Concentraia enzimei n condiiile n care concentraia substratului este constant, viteza de reacie iniial (vo) este direct proporional cu concentraii crescnde ale enzimei ntre anumite limite; la concentraii crescute de enzim viteza de reacie rmne constant ca urmare a transformrii ntregii cantiti de substrat (fig. 7.4).

b. Concentraia substratului Meninnd constant cantitatea de enzim i mrind concentraia substratului are loc o cretere a vitezei de reacie pn la o limit (Vmax).

179

Biochimia produselor alimentare Crescnd n continuare concentraia substratului viteza de reacie rmne constant, ceea ce denot c la concentraii mari de substrat, toate situsurile catalitice ale moleculelor de enzim sunt complet saturate cu substrat; deci nu mai exist enzim disponibil (fig. 7.5). Dependena vitezei unei reacii enzimatice de concentraia substratului a fost studiat iniial de Michaelis i Menten porninduse de la ecuaia general:

E+S

K1 K2

E-S

K3

E+P

Aplicnd legea maselor i fcnd unele transformri se ajunge la ecuaia lui Michaelis Menten, care se reprezint grafic printr-o hiperbol:

180

Enzime

v=

Vmax [ S] K m + [ S]

n care: v - este viteza reaciei la timpul t; Vmax - viteza maxim de reacie corespunztoare saturrii enzimei cu substrat; [S] - concentraia substratului; Km - constanta Michaelis (moli/l). Aceast ecuaie reprezint expresia matematic care definete relaia cantitativ dintre viteza de reacie enzimatic i concentraia substratului. Din curb se observ c la o valoare a vitezei de reacie (v) egal cu jumtate din valoarea vitezei maxime de reacie (v = Vmax/2) corespunde, pe abscis, o valoare, a concentraiei substratului notat K m care este tocmai constanta Michaelis. Deci, constanta Michaelis (Km) reprezint acea concentraie de substrat pentru care viteza de reacie corespunde la jumtate din viteza maxim de reacie. Aadar, pentru v= Vmax/2, Km = [S]. Constanta Michaelis (Km) reprezint un indicator al afinitii enzimei pentru substrat; cu ct Km are o valoare mai mare, cu att afinitatea enzimei pentru substrat este mai sczut i invers. Astfel, Km constituie un parametru cinetic operaional care furnizeaz indicaii asupra cineticii unei reacii enzimatice, respectiv a comportrii enzimei n raport cu substratul su de reacie. Msurarea direct a valorii algebrice Vmax i deci calculul lui Km implic concentraii mari de substrat pentru a atinge condiii de saturare ceea ce este dificil n experimentele de laborator. Aceast dificultate poate fi evitat prin reprezentarea liniar a ecuaiei Michaelis-Menten, care permite extrapolarea cu uurin a valorilor Vmax i Km plecnd de la vitezele reaciilor msurate n condiii de concentraii de substrat inferioare saturaiei. Ecuaia Michaelis-Menten poate fi inversat i Vmax descompus n factori n modul urmtor:

179

Enzime

v=

Vmax [ S] K m + [ S]

1 Km 1 [S] = + v Vmax [ S] Vmax [ S]

invers

1 K m + [ S] = v Vmax [ S]

sau

179

Enzime

prin simplificare

1 Km 1 1 = + v Vmax [ S] Vmax y = a x + b unde

relaia este o dreapt care nu trece

prin origine, de forma

y=

1 v

x=
i

1 [S] .

179

Enzime

Dac valoarea este reprezentat n funcie de x

y=

1 v

1 sau [ S] , intersecia acestei

drepte, b, este egal cu

1 Vmax , i panta, a, este Km V egal cu max .

179

Enzime

Valoarea negativ a interseciei pe axa x poate fi determinat fcnd y

x=
= 0. n acest caz se obine:

b 1 = a Km .

O astfel de reprezentare (fig. 7.6), denumit Lineweaver-Burk permite estimarea lui Km utiliznd fie panta i punctul de intersecie a axei y, fie punctul de intersecie a axei x. Valoarea lui Km se exprim n moli/l. c. Influena temperaturii La fel ca i n cazul reaciilor chimice, viteza de reacie enzimatic crete cu mrirea temperaturii, dar numai n anumite limite. Urmrindu-se variaia vitezei de reacie n funcie de temperatur i reprezentnd grafic se obine o curb (fig. 7.7) din care se observa ca pentru nceput viteza reaciei crete pana la o anumit valoare denumit temperatur optim (to). Temperatura optim pentru cele mai multe enzime este de 30-40C. Mrind n continuare temperatura se nregistreaz o diminuare progresiva a vitezei de reacie pn la o anulare a sa care se produce la o anumit temperatur, proprie fiecrei enzime i care se numete temperatur de inactivare (ti). Diminuarea activitii enzimei pn la anularea ei se explic prin denaturarea termic a enzimei, al crei edificiu molecular este afectat. Deci, enzimele sunt termolabile; nclzite dincolo de o anumit temperatur i pierd ireversibil activitatea. Majoritatea enzimelor sunt inactive printr-o nclzire la temperaturi n jur de 80C, multe din ele prin nclzire chiar peste 55C, nsa sunt i enzime care rezist la temperaturi de peste 100C. Temperatura de inactivare ca i cea optim este influenata de mai muli factori. Astfel, enzimele pure sunt mai sensibile la inactivarea termic dect preparatele impure care conin o serie de substane ce exercit o aciune de protecie a moleculei de enzim. De asemenea, n stare uscat enzimele rezist mai bine la temperaturi ridicate. Astfel se explic de ce, malul folosit la fabricarea berii, dei a suferit temperaturi ridicate in ultima faz a operaiei de uscare, mai conine o cantitate apreciabil de enzime deosebit de active. La temperaturi sczute, n general, enzimele au o activitate foarte lent

179

Biochimia produselor alimentare sau chiar nul, dar prin ridicarea temperaturii ele devin din nou active. Multe din ele rezist chiar la temperatura aerului lichid (-191C). O dovad a faptului c frigul nu inhib complet activitatea enzimelor sunt transformrile calitative (gust, miros, culoare) pe care le sufer alimentele congelate n timpul pstrrii lor n aceast stare. d. Influena pH-ului Toate reaciile enzimatice sunt puternic influenate de pH-ul mediului. Reacia are o vitez maxim pentru o anumit valoare a pH-ului sau pentru un interval foarte strns de pH, denumit pH optim. Abateri de la aceste valori produc o scdere brusc a vitezei de reacie. Reprezentnd grafic variaiile vitezei n funcie de pH se obine o curb n form de clopot ngust (fig. 7.8). Valoarea pH-ului optim al diverselor enzime coincide n general cu pH-ul lichidelor din organism unde ele i exercit aciunea. De exemplu, pH-ul optim al pepsinei este 1,5-2,5 realizat n sucul gastric de acidul clorhidric; al tripsinei este 8-11, identic cu pHul sucului pancreatic. Majoritatea enzimelor vegetale acioneaz bine la un pH n jur de 6-7. De asemenea, pH-ul optim de activitate al unei enzime are o valoare caracteristic numai n condiii bine precizate. Aceste valori pot suferi variaii sub influena a numeroi factori: - cu temperatura: la 40C amilaza din mal are pH-ul optim 4,4 iar la 60C - pH-ul optim este de 6,6; - cu substratul: maltaza are pH-ul optim pentru maltoz 6,0 iar pentru metilglucoz 6,7; - cu originea enzimei: amilaza din mal are pH-ul optim de aciune 5,2; cea din pancreas 7,0; iar cea din ficat 6,0. La majoritatea enzimelor intervalul de pH n interiorul cruia i manifest aciunea se ntinde pe cteva uniti de pH, de obicei 6-8. Abaterile de la acest interval conduc la imposibilitatea enzimei de a-i mai exercita aciunea. e. Influena radiaiilor Activitatea enzimelor mai poate fi influenat de radiaii. Lumina vizibil nu are influen asupra activitii enzimelor dect n prezen de substane sensibilizante. Radiaiile ultraviolete (UV) fiind absorbite de substanele proteice n domeniul 260-280nm datorit resturilor de aminoacizi aromatici din molecule pot s produc ruperea unor legturi care determin denaturarea proteinelor i deci inactivarea enzimelor.

180

Enzime Radiaiile ionizante (razele X, radiaiile radioactive) n doze mici acioneaz indirect asupra enzimelor datorit substanelor oxidante care iau natere prin descompunerea apei i a oxigenului dizolvat n ap. Sunt sensibile la aceste radiaii enzimele care conin grupe SH. Prin introducerea unor antioxidani (glutation redus, cistein, acid ascorbic) n mediul de reacie, se pot proteja gruprile -SH din situsul catalitic al unor enzime. f. Efectorii enzimatici Pe lng factorii artai anterior, activitatea enzimelor este influenat i de unele substane numite efectori biochimici care pot mri sau scdea viteza de reacie enzimatic, deci pot influena pozitiv sau negativ activitatea catalitic a unei enzime. Substanele capabile s mreasc viteza unei reacii enzimatice se numesc activatori enzimatici, n timp ce substanele ce micoreaz viteza unei reacii enzimatice se numesc inhibitori enzimatici.

Activatorii enzimatici sunt compui de natur organic sau anorganic care n concentraie mic sunt necesari pentru a mri viteza unire reacii enzimatice ntruct ei aduc enzima ntr-o form activ. Activatorii enzimatici i exercit aciunea pe ci diferite n funcie de natura lor. Astfel:
- Ionii metalici mono- sau bivaleni (K+, Ca2+, Mg2+, Zn2+, etc.), activeaz unele enzime prin legarea cu acestea. De exemplu, fosfotransferazele sunt activate de ionii Mg2+ sau K+ (i inhibate de Ca2+ sau Na+). - Activatori ai unor proenzime acioneaz prin nlturarea unor fragmente din molecula inactiv a unor enzime, transformndu-le n enzim activ datorit demascrii situsului catalitic. De exemplu, enterokinaza din intestin, desprinde 6 aminoacizi din molecula inactiv de tripsinogen secretat de pancreas i o transform n tripsin activ. Aceti activatori se mai numesc i kinaze. - Substane protectoare. Acestea au numai indirect rolul de activator. Astfel, substanele reductoare care posed grupri tiolice -SH (cisteina, glutationul) sunt ageni complexani care au proprietatea de a bloca ionii metalelor grele, evitnd astfel inhibarea gruprilor SH din situsul catalitic al enzimei sau a celor ce au rol n meninerea conformaiei enzimei.

Inhibitorii enzimatici. Activitatea enzimatic poate fi diminuat de o mare varietate de compui. Clasificarea lor este dificil datorit compoziiei chimice foarte diferite precum i datorit modului lor de aciune la fel de variat. Astfel, multe enzime sunt inactivate de metale grele (mercur, plumb, cupru) sau de unele metaloide (arsen). Exist i inhibitori de natur proteic. Astfel, n leguminoasele uscate exist un

181

Biochimia produselor alimentare inhibitor al tripsinei care sub aspect chimic este globulin. n general, inhibitorii scad activitatea unei enzime prin dou mecanisme majore: - se combin cu enzima i o inactiveaz; - se combin cu substratul i l fac impropriu pentru transformare. Se deosebesc mai multe tipuri de inhibiie enzimatic: - Inhibiie competitiv. Acest tip de inhibiie este realizat de substanele care au o structur asemntoare cu a substratului (fig. 7.9).

Fig. 7.9. Inhibiie competitiv n acest caz centrul catalitic (situsul catalitic) al enzimei se poate combina att cu substratul ct i cu inhibitorul competitiv: +I EI (inactiv) E+P E
+S -

ES (activ)

E+P

Reaciile fiind reversibile, prin mrirea concentraiei sub-stratului exist

posibilitatea de a scoate enzima din combinaia cu inhibitorul, nct la o concentraie adecvat de substrat influena inhibitorului este anulat (fig. 7.10).

182

Enzime Reprezentarea Lineweaver-Burk a inhibiiei competitive (fig. 7.11) ilustreaz c la o concentraie infinit de mare de substrat (1/[S]=0), viteza este aceeai ca i n absena inhibitorului, dar afinitatea enzimei este sczut. Un exemplu de inhibiie competitiv l constituie cazul reaciei de

dehidrogenare a acidului succinic la acid fumaric, catalizat succinatdehidrogenaz. Acidul malic, diferind de acidul succinic numai prin existena unui hidroxil n locul unui hidrogen la una din gruprile metilenice, poate s se lege de centrul activ al succinatdehidrogenazei. Fraciunea de succinat-dehidrogenaz combinat cu acidul malic poate fi recuperat prin simpla cretere a concentraiei de substrat. - Inhibiie necompetitiv. Inhibitorii necompetitivi se fixeaz pe enzim pe alt loc dect centrul activ (nu exist competiie cu substratul), dar centrii activi ai enzimei i reduc capacitatea de a reaciona cu substratul datorit unui fenomen de mpiedicare steric.
+ -I

de

EI E - IS E+P ES

E
+S -

E+P Inhibitorii necompetitivi diminueaz viteza maxim. Deoarece I i S se pot fixa n locuri diferite, se poate forma att EI ct i EIS. Descompunerea lui EIS n produse de reacie va fi mai lent dect a lui ES, reacia

183

Biochimia produselor alimentare este mai nceat, dar nu oprit. n cazul inhibiiei necompetitive mrirea concentraiei substratului nu suprim inhibarea activitii enzimatice (fig. 7.12). Reprezentarea liniar (fig. 7.13) ilustreaz c n inhibiia necompetitiv valoarea lui Km rmne neschimbat. Astfel de inhibitori necompetitivi sunt cianurile care se combin cu unele metale care sunt necesare pentru activitatea enzimei. Acidul etilendiamino-tetraacetic (EDTA) leag Mg2+ i ali cationi bivaleni inhibnd astfel necompetitiv unele enzime. Unele metale grele (Hg, Pb, Ag, Cu) sunt, de asemenea, inhibitori deoarece se combin cu gruprile SH ale enzimei (din afara situsului catalitic) formnd mercaptide: E - SH + Ag+ E - S - Ag + H+ Inhibiie incompetitiv (mixt). n acest caz inhibitorul se combin numai cu complexul enzim substrat: ES + I ESI un exemplu este cel al inhibrii citocromoxidazei de ctre azid. - Inhibiie prin exces de substrat. Exist unele reacii enzimatice n care excesul de substrat duce la formarea unui complex de forma E-S-S care este mai puin activ sau chiar inactiv. Reprezentnd grafic viteza de reacie n funcie de concentraia substratului se obine o curb n form de clopot (fig. 7.14). Un astfel de exemplu este inhibarea

fructozo-1,6-difosfatazei 1,6-difosfat.

de ctre fructozo-

- Inhibitori enzimatici de origine biologic. Organismele pot s produc substane care s inhibe aciunea enzimelor. Rolul acestor inhibitori naturali este fie de a apra organismul de aciunea duntoare a unei enzime strine de organism, fie de a regla anumite procese

184

Enzime enzimatice n cazul enzimelor proprii. Astfel, paraziii intestinali din genul Ascaris nu sunt atacai de proteazele tubului digestiv (pepsin, tripsin). Ei produc substane care inhib aciunea acestor enzime. Pentru tripsin sunt i ali inhibitori naturali. De exemplu un inhibitor tripsinic se gsete n pancreas, n plasma sngelui, n albuul de ou, n colostru i n leguminoasele uscate (soia, fasole, mazre, etc.).

7.6. Reglarea activitii enzimatice

S-a artat c reaciile catalizate de enzime au loc cu viteze anumite, determinate de concentraia lor, a substratului, de pH, temperatur etc. Aceste reacii nu sunt independente unele de altele, ci sunt grupate, se succed formnd ci metabolice care funcioneaz simultan i n mod coordonat att calitativ ct i cantitativ. La nivel celular, activitatea enzimelor, de care depind procesele metabolice, este sub un control permanent asigurat de mai multe mecanisme de reglare: A Sinteza enzimelor (biosinteza proteinelor- enzime). B Mediul intracelular. La nivelul mediului intracelular pot interveni o serie de factori care s regleze activitatea enzimelor. Astfel: a) pH-ul i electroliii pot avea efect inhibitor sau activator. Ionii de Ca2+ exercit un rol regulator al glicolizei. Astfel, concentraii mari inhib aciunea piruvatkinazei conducnd la acumularea de fosfoenolpiruvat. b) hormonii. Organismele pluricelulare sunt reglate n funcionarea lor de hormoni. Acetia acioneaz asupra activitii enzimelor (ca efectori enzimatici) sau asupra sintezei lor. Astfel, hidrocortizonul mrete de 25 ori activitatea -cetoglutarat-transaminazei; insulina inhib biosinteza enzimelor gluconeogenezei. c) concentraia intracelular a cofactorilor, (NAD+, NADP+, ATP, etc.). Spre exemplu, n metabolismul acidului piruvic calea pe care acesta o va urma este n funcie de concentraia de NAD+ care depinde de coninutul n O2. Dac n celul exist O2 disponibil, NAD+ va fi produs n cantitate suficient i ca urmare, acidul piruvic va fi metabolizat prin ciclul acidului citric (ciclul lui Krebs). Dac exist puin O2, NADH + H+ nu va fi oxidat de NAD +i n acest caz acidul piruvic este redus la acid lactic. C Membranele celulare. Dup cum tie, pentru ca o molecul a unei substane s fie metabolizat de celul, ea trebuie s ptrund n celul. Pentru acest scop exist un sistem specific de transport realizat de permeaze care ele nsele sunt enzime. De asemenea, membranele

185

Biochimia produselor alimentare intracelulare (lizozomale, mitocondriale, etc.) a cror permeabilitate pentru diversele substraturi, cofactori, enzima este diferit, permit funcionarea normal a celulei. D Reglarea allosteric. Mecanismul cel mai complex al coordonrii metabolice este reglarea allosteric n care sunt implicate enzimele allosterice. Prin structura i funciile lor, aceste enzime intervin n reglarea i controlul diferitelor secvene de reacii ale unor ci metabolice, constituind astfel un fenomen natural, necesar n desfurarea proceselor biochimice. Enzimele allosterice au primit aceast denumire datorit faptului c efectorii (activatori sau inhibitori) care influeneaz activitatea lor i care se numesc efectori allosterici se aeaz pe enzim n alt loc loc (situs) allosterioc dect centrul activ.

Fig. 7.15. Modul de aciune al unui activator allosteric

Efectorii allosterici modific conformaia enzimei i deci a centrului catalitic fcndu-l s devin mai apt (activator) sau mai puin apt (inhibitor) de a se combina cu substratul. Modificarea structural a enzimei sub influena efectorului allosteric se numete tranziie allosteric.

Fig. 7.16. Modul de aciune al unui inhibitor allosteric Enzimele allosterice sunt constituite din mai multe subuniti sunt deci oligomere. Efectorii allosterici, dar nu substratul, le confer o rezisten

186

Enzime mrit la denaturarea termic. Ele posed mai multe locuri (situsuri) de legare (cel puin dou), avnd un centru activ (situs catalitic) la care se leag substratul i care este responsabil de activitatea catalitic propriuzis i un situs allosteric la care se leag selectiv i reversibil efectorii enzimatici. Enzimele allosterice manifest o comportare cinetic diferit de cea stabilit de Michaelis-Menten; relaia dintre viteza reaciei i

concentraia substratului indic pentru aceste enzime o curb cu un aspect sigmoid (fig. 7.18). Aceasta se traduce printr-un efect cooperativ, adic fixarea primei molecule de substrat faciliteaz fixarea urmtoarei molecule de substrat; se consider astfel c fiecare molecul de enzim se combin nu cu o singur molecul de substrat ci cu mai multe i acest lucru se explic prin natura oligomer a enzimelor allosterice (existena mai multor lanuri polipeptidice i deci a mai multor situsuri catalitice). n ansamblul proceselor de reglare biochimic a activitii metabolice a organismelor, mecanismul de reglare prin tranziii allosterice deine un rol dominant. Reglarea allosteric este o reglare tip feed-back, care se mai numete reglare prin retroinhibiie sau prin produs final. Reglarea feed-back reprezint un proces specific de reglare prin care produsul final (P) al unei secvene constituit din mai multe reacii biochimice nlnuite i catalizate de enzime diferite acioneaz asupra primei enzime din sistem pe care o inhib: Inhibitie feed-back

E1

E2

E3

E4

187

Biochimia produselor alimentare

n aceast secven prima enzim (E1) este o enzim allosteric. Inhibarea ei de ctre produsul final demonstreaz c acesta (P) se comport ca un efector allosteric; n consecin el se fixeaz la situsul allosteric al enzimei allosterice (E1) care astfel este supus unei tranziii allosterice ce are drept efect o diminuare sau anulare temporar a activitii catalitice. n felul acesta, enzima E1 asigur reglarea activitii ntregului ir de reacii, n sensul c inhibarea activitii ei nu mai permite fucionarea succesiv a celorlalte enzime deoarece substraturile acestora (B, C, D) nu se mai produc. n concluzie, reglarea allosteric se manifest prin efecte de inhibare sau de activare a activitilor enzimatice aferente unui set de reacii caracteristice diferitelor ci metabolice, controlnd astfel dinamica biochimic a metabolismului celular.

7.7. Preparate enzimatice

Activitatea catalitic a enzimelor, extrem de important din punct de vedere fiziologic, prezint i o deosebit importan practic. O serie de industrii care prelucreaz materii prime de origine vegetal sau animal au de a face n procesele lor tehnologice cu reacii catalizate de enzime care sunt proprii acestor materii prime sau sunt elaborate de microorganismele ce se dezvolt n /pe ele. Reacii enzimatice similare pot avea loc ns i cu enzime exogene sau cu sisteme enzimatice extrase din diverse surse bogate n enzime i introduse apoi n procesele tehnologice n scopul realizrii unor transformri dorite. Aceste enzime sau sisteme enzimatice izolate din mediile n care au fost elaborate se numesc preparate enzimatice. Ele se caracterizeaz printr-o puritate mai mic sau mai mare n funcie de cantitatea i tipul compuilor, provenii din sursa enzimatic, ce le nsoesc. Cu alte cuvinte, preparatele enzimatice pot fi mai mult sau mai puin pure (purificate). n vederea obinerii preparatelor enzimatice trebuie ales un material biologic bogat n enzime cu o nalt activitate catalitic; materialul trebuie s fie ieftin, uor accesibil i s se prelucreze uor. Materiile prime folosite la obinerea preparatelor enzimatice pot fi de natur vegetal, animal sau microbian. La plante concentraii mari de enzime se ntlnesc n semine, n boabele de cereale germinate i negerminate, n fructe, rdcini, sev, frunze. La animale enzimele se gsesc n toate celulele, ns concentraii mari de anumite enzime se

188

Enzime gsesc localizate n diferite organe ca: ficat, rinichi, inim, muchi. Acestea au ns organe i esuturi specializate n producerea de enzime, aa cum sunt glandele salivare, mucoasa stomacului, pancreasul, mucoasa intestinal. O surs foarte important de enzime pentru obinerea preparatelor enzimatice o constituie microorganismele: bacteriile, drojdiile i mucegaiurile. Acestea prezint avantajul c se pot obine cu uurin n cantiti mari prin nmulirea n instalaii speciale pe medii de cultur ieftine, de obicei subproduse ale industriei alimentare(tre de gru, extract de porumb, melas, roturi de soia i de floarea soarelui, etc.). de asemenea, ciclul de dezvoltare al microorganismelor este foarte scurt n comparaiei cu ciclul de dezvoltare al animalelor i plantelor, iar producia lor de enzime poate fi mult mrit prin selectarea i utilizarea de tulpini i mutante nalt productive i prin utilizarea unor condiii optime de cultivare. Eliberarea enzimelor din celule. Procesul de extracie a enzimelor din materiile prime enzimatice este precedat ntotdeauna, cu excepia enzimelor extracelulare elaborate de microorganisme, de operaia de dezintegrare a celulelor pentru eliberarea enzimelor. Enzimele extracelulare secretate de microorganisme n timpul dezvoltrii lor se gsesc n cea mai mare parte n mediile de cultur lichide sau solide i numai o mic parte se mai afl n interiorul celulelor n momentul opririi procesului de nmulire. Ca urmare,lichidul de cultur sau mediul solid constituie deja preparate enzimatice brute. Pentru eliberarea enzimelor intracelulare este nevoie de distrugerea membranelor celulare. In cazul esuturilor animale se folosesc maini de mrunit sau omogenizatoare. Pentru mrunirea organelor i esuturilor vegetale se folosesc mori cu valuri sau cu ciocane. Ruperea membranelor celulare ale unor microorganisme este o operaie mult mai dificil i poate fi realizat cu ajutorul unor ageni mecanici (mojarare n prezena nisipului de cuar, a sticlei pisate sau agitarea suspensiei de celule n prezena unor abrazivi), ageni fizici (ultrasonare, nghe i dezghe repetat), ageni chimici (detergeni, solveni organici) sau biochimici (enzime). Extracia enzimelor. Dup dezintegrarea celulelor, urmeaz operaia de extracie a lor care const n amestecarea materialului cu solveni care dizolv enzimele i apoi n separarea soluiei de enzime de toate particulele n suspensie. Solubilizarea se realizeaz prin tratarea materialului cu ap sau soluii diluate de sruri, n funcie de solubilitatea enzimei. Molaritatea i pH-ul mediului de extracie, precum i timpul necesar unei extracii optime se stabilesc experimental. Amestecul de material i solvent este centrifugat iar supernatantul reprezint extractul enzimatic brut care poate fi utilizat ca atare, dup concentrare sau dup uscare sau este supus operaiei de purificare. Purificarea enzimelor din extracte. n extracte, enzimele se gsesc alturi de

189

Biochimia produselor alimentare numeroase substane care s-au solubilizat n acelai timp n solvenii de extracie folosii. Deoarece substanele nsoitoare ale enzimei pot influena utilizarea i activitatea preparatelor enzimatice este necesar s se procedeze la purificarea enzimelor. n general, metodele de purificare se refer fie la ndeprtarea impuritilor din extract, fie la ndeprtarea enzimei din extract prin precipitare, absorbie sau extracie. Moleculele mici de impuriti pot fi ndeprtate din extract printr-o simpl dializ fa de ap sau fa de o soluie tampon. Moleculele cu mase moleculare mai mari, (proteinele) sunt separate prin precipitri fracionate cu sruri anorganice sau cu solveni organici, prin cromatografiere pe site moleculare (Sephadex), schimbtori de ioni (DEAE celuloz, CM-celuloz, etc.), absorbani (hidroxilapatita). Dup aceast operaie se obin preparate enzimatice parial purificate. Cristalizarea. Cnd preparatul enzimatic a fost adus ntr-o stare avansat de puritate este posibil cristalizarea lui. Cea mai uzual metod de cristalizare folosete soluii saturate de sulfat de amoniu. Pentru aprecierea puritii preparatelor enzimatice se utilizeaz curbele de solubilitate care stabilesc variaia cantitii de enzim solubilizat n funcie de cantitatea de enzim introdus n soluie. Preparate enzimatice imobilizate. n scopul utilizrii repetate a unei enzime i pentru desfurarea n instalaii continui sau semicontinui a reaciilor enzimatice, n practica industrial au cptat o larg utilizare n ultimul timp preparatele enzimatice imobilizate. Imobilizarea enzimelor const n legarea sau fixarea unei enzime sau a unui sistem enzimatic de un suport insolubil n ap, cu pstrarea proprietilor catalitice. Suporturile sau matricele utilizate n imobilizarea enzimelor pot fi de natur anorganic: silice coloidal, perle de sticl cu grad de porozitate controlat, oxizi metalici (alumina, oxid de zirconiu etc.) i de natur organic: celuloz i derivaii acesteia, agaroz, amidon, dextran, colagen, poliacrilamida, acid metacrilic etc. Metodele de imobilizare pot fi fizice sau chimice. Procedeele fizice se bazeaz pe imobilizarea enzimelor prin intermediul legturilor fizice: interaciuni electrostatice, legturi ionice, de hidrogen. Procedeele chimice de imobilizare a enzimelor constau n formarea de legturi covalente sau parial covalente ntre diferite grupri funcionale care nu sunt eseniale pentru manifestarea activitii catalitice i un suport activat chimic, insolubil n ap. Prin legarea fizic se obin preparate imobilizate sub form de: - enzim absorbit pe un suport insolubil n ap (celuloz, sticl, schimbtori de ioni, crbune); - enzim inclus n structuri macromoleculare formate prin

190

Enzime polimerizarea unor materiale n prezena moleculelor de enzim; se formeaz o matrice de polimer n care sunt incluse moleculele de enzim; - microcapsule din membrane semipermeabile n care enzima este ncapsulat; - celule de ultrafiltrare care conin enzim imobilizat. n legarea chimic a enzimelor de suport, preparatul enzimatic rezult prin copolimerizarea enzimei cu un monomer i legarea ncruciat (cross-linking) sau reticular intra- i inter- molecular a enzimelor legate de un suport cu un reactiv multifuncional. Imobilizarea enzimelor pe un suport anorganic sau organic provoac schimbri n comportamentul acestora i n cinetica reaciilor: se mrete stabilitatea enzimei, se schimb afinitatea enzimei fa de substrat. Preparatele enzimatice imobilizate prezint o serie de avantaje: - utilizarea repetat a enzimei. Cu aceeai cantitate de enzim se poate prelucra o cantitate mai mare de substrat; - utilizarea unor instalaii cu funcionare continu care permit conducerea automatizat a proceselor; - enzima nu rmne n produs; - reacia se poate opri la momentul dorit printr-o simpl operaie mecanic. Cu toate avantajele pe care le prezint enzimele imobilizate, deocamdat industria alimentar utilizeaz numai glucozoizomeraza imobilizat pentru transformarea glucozei n fructoz i lactaza imobilizat pentru hidroliza lactozei din lapte sau zer. Exprimarea activitii enzimatice Studiul cantitativ al enzimelor const n msurarea activitii catalitice a acestora. Dozarea activitii enzimelor se bazeaz pe proprietatea lor de a cataliza o anumit reacie caracterizat, printr-o anumit vitez, n condiii determinate (timp, pH, temperatur). Comisia de Enzimologie de pe lng Uniunea Internaional de Biochimie recomand folosirea urmtoarelor uniti: - unitatea enzimatic (U) reprezint acea cantitate de enzim care catalizeaz transformarea unui micromol (mmol; 10-6 mol) de substrat n timp de 1 minut, la 25C, n condiii optime de pH i de concentraie de substrat Unitile enzimatice se pot exprima i n nanomoli (nmol; 10 -9 mol) sau picomoli (pmol; 10-2 mol) de substrat care reacioneaz, sau de produs de reacie format, ntr-un minut.

191

Biochimia produselor alimentare Se recomand de asemenea , exprimarea activitii enzimatice n Katali (Kat); un Kat reprezint cantitatea de enzim ce transform un mol de substrat ntr-o secund. 1 Kat = 1 mol/s = 60 moli/min = 60 x 106 moli/min = 6 x 107 U - activitate specific reprezint numrul de uniti enzimatice raportat la 1 mg protein; - activitate molar este numrul de moli de substrat transformat (sau de produs format) n decurs de 1 minut de o molecul de enzim; acest mod de exprimare a activitii enzimatice necesit cunoaterea greutii moleculare a enzimei luate n studiu; - activitatea centrului activ se exprim prin numrul de molecule de substrat transformate ntr-un minut de centrul activ al enzimei.

7.8. Nomenclatura i clasificarea enzimelor

Enzimele sunt substane complexe i ntruct la majoritatea nu li se cunoate precis structura, nu li s-a fcut o clasificare pe baza structurii chimice. Iniial ele au fost denumite dup substratul pe care l transform urmat de sufixul "az" (lipaz, maltaz etc.); de asemenea, s-au pstrat denumiri mai vechi care nu aduc informaii speciale: pepsin, papaina, tripsin. Identificarea unui numr tot mai mare de enzime (n prezent sunt cunoscute peste 2000) a impus necesitatea unei nomenclaturi. Astfel, n 1961 Comisia de Enzimologie a Uniunii Internaionale de Biochimie a stabilit un sistem de nomenclatur i clasificare pentru enzime; denumirea unei enzime este constituit din trei pri: 1) denumirea substratului (sau substratelor); 2) tipul de reacie; 3) sufixul - az. De exemplu, enzima care catalizeaz reacia de transformare a acidului lactic n acid piruvic este denumit lactat-dehidrogenaza. Pe acest principiu enzimele sunt clasificate n clase, n subclase i subsubclase n funcie de unele detalii privind gruprile chimice supuse transformrii (hidroliz, transfer, activare, etc.) i natura cofactorilor implicai n reacia pe care o catalizeaz. Fiecare enzim este desemnat printr-un cod format din 4 cifre care conine informaii despre enzima respectiv. De exemplu, lactatdehidrogenaza are codul EC 1.1.1.27; EC reprezint prescurtarea de la Enzyme Commission; prima cifr clasa; a doua subclasa; a treia sub-subclasa, iar a patra numrul de ordine a enzimei din subsubclas.

192

Enzime Uneori este necesar i o infirmaie adiional asupra naturii reaciei. Aceasta este indicat n paranteze. De exemplu, pentru reacia: L-malat + NAD+ piruvat + CO2 + NADH + H+ enzima este denumit L-malat-NAD oxidoreductaza (de decarboxilare). n funcie de tipul reaciei pe care o catalizeaz, enzimele sunt mprite n ase mari clase: Oxidoreductaze sunt sisteme enzimatice care catalizeaz reacii de tip redox. n aceste reacii are loc transferul de electroni sau de hidrogeni ntre diferii parteneri de reacie. Energia liber care se degaj n aceste reacii constituie cea mai important surs energetic pentru metabolismul celulei vii. Transferaze sunt enzime care catalizeaz reaciile de transfer a unui fragment molecular de pe un substrat pe altul. Energia implicat n timpul acestei transformri este de multe ori apropiat ca valoare de cea care rezult din reaciile redox. Hidrolaze cuprind enzimele care catalizeaz reaciile de scindare a substratului cu participarea apei. Liaze catalizeaz reaciile de desfacere n care nu apar fenomene de tip redox sau de hidroliz. Izomeraze sunt sisteme enzimatice care catalizeaz reaciile de izomerizare a substanelor. Ligaze catalizeaz reacii n care se formeaz legturi chimice noi, energia necesar fiind furnizat de ATP.

7.9. Descrierea principalelor clase de enzime

7.9.1. Oxidoreductaze
n clasa oxidoreductazelor sunt cuprinse enzimele care catalizeaz reacii de oxidoreducere ce se manifest prin transfer de electroni de la un donor (agent reductor) ctre un acceptor (agent oxidant). n timpul trecerii electronilor de la agentul reductor la agentul oxidant se creeaz o diferen de potenial care va fi cu att mai mare cu ct compusul care primete electroni are o afinitate mai mare pentru acetia. Transferul de electroni n multe reacii are loc prin transferul atomilor de hidrogen; astfel dehidrogenarea are ca echivalent oxidarea, iar hidrogenarea reducerea.

193

Biochimia produselor alimentare Aceste enzime se deosebesc de enzimele altor clase prin unele particulariti. Astfel, n celula vie oxidoreductazele formeaz sisteme aa numite lanuri de enzime oxido-reductoare, n care are loc un transfer n trepte al atomilor de hidrogen sau al electronilor de la primul substrat la acceptorul final, care, de regul, este oxigenul. n final, atomii de hidrogen sunt transferai pe oxigen i se formeaz apa. Oxidoreductazele care transfer atomii de hidrogen sau electronii direct pe atomii de oxigen se numesc dehidrogenaze aerobe sau oxidaze. Spre deosebire de acestea, oxidoreductazele care transfer atomii de hidrogen i electronii de la un component al lanului de oxidare la altul fr a-i ceda oxigenului, se numesc dehidrogenaze anaerobe. Dac enzima catalizeaz reacia lund hidrogen direct de la substana ce se oxideaz (primul substrat), atunci ea se numete dehidrogenaz primar. Dac enzima accelereaz prelucrarea atomilor de hidrogen de la al doilea substrat, care a primit atomii de hidrogen prin intermediul dehidrogenazei primare (al doilea substrat poate fi chiar oxidoreductaza primar), atunci poart denumirea de dehidrogenaz secundar. O particularitate important a oxidoreductazelor este faptul ca intervin ntr-o mare varietate de reacii redox. Acest lucru se explic prin faptul c, unul i acelai cofactor este capabil s se uneasc cu diverse apoenzime, formnd de fiecare dat o oxidoreductaz specific n raport cu un substrat sau altul. Oxidoreductazele i exercit aciunea lor catalitic n prezena unor coenzime diferite: nicotinamidice, flavinice, heminice care se comport ca acceptori intermediari ntre substratul primar i acceptorul final. 7.9.1.1. Oxidoreductaze NAD+ - sau NADP+ - dependente Aceste enzime denumite i dehidrogenaze (transhidrogenaze) catalizeaz reacii de oxidoreducere prin transfer, n general reversibil, de hidrogen de pe un donor pe un acceptor. Au un caracter anaerob deoarece acceptorul de hidrogen este altul dect oxigenul. Aciunea catalitic a dehidrogenazelor const ntr-o labilizare a hidrogenului din molecula substratului (donorul), astfel c acetsa devine apt s se uneasc cu o alt molecul din sistem acceptorul capabil s-l fixeze. Aciunea de activare se explic prin faptul c dehidrogenazele sunt sisteme oxido-reductoare reversibile, adic fixeaz cu uurin hidrogenul substratului pe care-l pot ceda, cu aceeai uurin, unui acceptor capabil s-l primeasc, dar nu direct, ci numai prin intermediul dehidrogenazelor. Dac se noteaz cu DH2 substratul (donorul de hidrogen), cu T-transportorul de hidrogen (enzima), cu A acceptorul de hidrogen, reacia de oxidoreducere se poate reprezenta schematic astfel:

194

Enzime DH2 + T + A D + T + AH2 Aceasta se realizeaz de fapt prin etapele: DH2 + T D + TH2 TH2 + A T + AH2 n care transportorul intervine direct, dar numai temporar. Mecanismul de aciune al dehidrogenazelor este determinat de cofactorul lor care este NAD+ sau NADP+. Funcia de acceptor de protoni i electroni o ndeplinete nucleul piridinic al acestor coenzime conform reaciei: DH2 D + 2H+ + 2e NAD+ (sau NADP+) + 2e + 2H+ NADH (sau NADPH) + H+ sau

H
4 4 +

H + H+ N R

+ 2H ++ 2e

N R + (NADP+) NAD

NADH (NADPH)

Se observ c, n aceast reacie substratul (DH2) d doi atomi de hidrogen; un atom de hodrogen se leag la molecula coenzimei (n poziia 4 a nucleului piridinic), iar al doilea atom de hidrogen i d electronul coenzimei i se transform n proton (H+) care este absorbit de capacitatea tampon a mediului de reacie. Oxidoreductazele NAD+ - dependente intervin n procese metabolice oxidative (ciclul acidului citric, catena de oxidare celular), iar cele NADP+ - dependente, n procesele reductive de sintez (biosinteza extramitocondrial a acizilor grai, steroizilor etc.) i n untul pentozomonofosfat. Dehidrogenazele au o larg distribuie n diferite esuturi, cataliznd reacii n care intervin diverse substraturi. Cteva exemple de dehidrogenaze:

195

Biochimia produselor alimentare

Enzima Lactatdehidrogenaza Alcooldehidrogenaza Glicerofosfatdehidrogenaza Colindehidrogenaza Malatdehidrogenaza Glutamatdehidrogenaza Glucozo-6-fosfatdehidrogenaza D-izocitricdehidrogenaza Glutationreductaza

Denumirea prescurtat LDH ADH GPDH ChDH MDH GDH G-6-PDH ICDH

Coenzima NAD+ NAD+ NAD+ NAD+ + NAD sau NADP+ NAD+ sau NADP+ NADP+ NADP+ NADP+

Reaciile n care urmtoarele:

intervin

unele

din

aceste

dehidrogenaze

sunt

- lactatdehidrogenaza (LDH) catalizeaz reacia de dehidrogenare a acidului lactic la acid piruvic:

NAD+ NADH+H+

CH3 CH COOH OH acid lactic

CH3

C COOH

O acid piruvic

Are o specificitate n raport cu configuraia L a acidului lactic, forma D fiind mult mai lent dehidrogenat. Lactatdehidrogenaza se gsete n muchi, plmni, ficat i n alte esuturi animale. O enzim similar exist n plante i microorganisme. - alcooldehidrogenaza (ADH) catalizeaz reacia transformare a alcoolului etilic n acetaldehid:
NAD+ NADH+H+

reversibil

de

CH3 CH2 OH alcool etilic

CH3

CHO

acetaldehid

Reacia reprezint etapa final a fermentaiei alcoolice. Enzima se gsete n esuturile animale, vegetale i microorganisme. Alcooldehidrogenaza din drojdie este o enzim ce conine grupe SH drept grupri active. glicerofosfatdehidrogenaza (GPDH) catalizeaz reversibil a -glicerofosfatului n dioxiacetofosfat: dehidrogenarea

196

Enzime

OH CH2 CHOH CH2OH -glicerofosfat O P OH O

NAD+ NADH+H+

OH CH2 C O CH2OH dioxiacetonfosfat O P OH O

Enzima este specific. Intervine n etapele fermentaiei alcoolice i ale glicolizei. Este prezent n drojdie, celulele animale i vegetale. - malatdehidrogenaza (MDH) catalizeaz reacia de oxidare a acidului malic cu formare de acid oxalilacetic:

COOH CH OH CH2 COOH acid malic

NAD+

NADH+H+

COOH C O CH2

COOH acid oxalilacetic

Enzima face parte din sistemul enzimatic al ciclului acidului citric i este prezent n toate organismele. - glucozo-6-fosfatdehidrogenaza (G-6-PDH) transform glucozo-6-fosfatul n acid 6-fosfogluconic:
OH CH2 O H H OH

O
H

P H OH

O OH

NADP+

NADPH+H+

CH2 O OH H H

O OH

OH OH H

OH OH H

COOH

OH

OH

glucozo-6-fosfat
Este o enzim absolut specific.

acid-6-fosfogluconic

- D-izocitricdehidrogenaza (ICDH), important n ciclul acidului citric, face trecerea acidului D-izocitric n acid oxalsuccinic:

HO CH COOH CH COOH CH2 COOH acid izocitric

NADP+

NADPH+H+

O C

COOH

CH COOH CH2 COOH acid oxalsuccinic

Activitatea enzimei necesit prezena Mg2+ sau Mn2+, iar reacia de dehidrogenare este urmat de una de decarboxilare.

197

Biochimia produselor alimentare - glutationreductaza particip la oxidoreducerea glutationului:

NADPH+H+ NADP+

G S S G glutation oxidat

2 G SH glutation redus

n felul acesta este refcut glutationul redus necesar pentru meninerea n form activ a conformaiei unor enzime ce conin grupri SH. 7.9.1.2. Oxidoreductaze FAD sau FMN dependente (Flavinenzime) Flavinenzimele sunt enzime care actalizeaz reacii de oxidoreducere transfernd hidrogenul fie direct de la substrat, fie de la formele reduse ale coenzimelor piridinice la oxigenul molecular sau la ali intermediari. Cele care transfer hidrogenul oxigenului funcioneaz ca dehidrogenaze aerobe, pe cnd cele ce transfer hidrogenul la un acceptor oarecare, diferit de oxigen, au un caracter anaerob. Transferul hidrogenului de ctre aceste enzime se realizeaz prin intermediul cofactorilor lor. Acestea sunt flavinadeninmononucleotidul (FMN) i flavinadenindinucleotidul (FAD). FMN i FAD se deosebesc de NAD+ i NADP+ prin faptul c sunt strns legate de molecula de apoenzim, de care se despart doar printr-o hidroliz acid. Toate nucleotidele flavinice conin riboflavin al crei nucleu izoaloxazinic conine duble legturi conjugate ce confer funcia dehidrogenazic:
R H3C H3C N N O NH O +2H -2H H3C H3C R N H N O NH

N FAD (FMN) (Forma oxidata)

O FADH2 (FMNH2)

N H

Transferul a doi atomi de hidrogen se realizeaz prin adiia i cedarea hidrogenului la nivelul sistemului de duble legturi conjugate la care particip atomii de azot din poziiile 1 i 10 ale ciclului izoaloxazinic.

198

Enzime Enzimele flavinice intervin ca transportori de hidrogen ntr-un mare numr de reacii de oxidoreducere i n special n dehidrogenrile n care, n prima etap, intervin dehidrogenazele cu NAD+ i NADP+, determinnd regenerarea formelor oxidate ale acestor coenzime. n cazul enzimelor flavinice cu caracter aerob, succesiunea de reacii poate fi redat astfel:
DH2 NAD+ FADH2 O2

Acceptorul de D FAD NADH + H+ este oxigenul iar produsul de reacie este apa oxigenat. -

H2O2

hidrogen molecular

n cazul enzimelor flavinice cu caracter anaerob, reaciile decurg n modul urmtor:

DH2 NAD+ FADH2 2 citocromi (Fe3+)

D Aceste 2 citocromi (Fe2+) + 2H+ FAD NADH + H+ reacii constituie o parte a catenei de oxidare celular, n care dup cum se observ, cofactorii FAD sunt situai ntre NAD+ i citocromi. n felul acesta, n lanul reaciilor de oxidoreducere ale respiraiei celulare, enzimele flavinice au funcia de a transporta hidrogenul substratului, preluat iniial de NAD+, la citocromi.

Unele flavinenzime conin n molecula lor i metale, Cu2+, Fe3+ sau Mo2+, ceea ce le confer un rol dublu, fiind i transportoare de electroni. Dintre flavinenzime se menioneaz cteva mai importante: - glucozoxidaza, care catalizeaz reacia de oxidare a glucozei la acid gluconic cu formare de H2O2. Enzima se folosete pentru dozarea glucozei n mod specific. Preparatele enzimatice care conin glucozoxidaz, obinute din culturi de diferite mucegaiuri ,sunt utilizate i n industria alimentar pentru ndeprtarea glucozei i a oxigenului din diverse produse. ndeprtarea glucozei este necesar pentru a se evita desfurarea reaciei Maillard n unele alimente (ex. din albuul de ou ntreg la obinerea prafului de ou). Consumarea oxigenului rezidual din alimente n prezena excesului de glucoz i a glucozoxidazei evit procesele oxidative care afecteaz calitile produselor. ndeprtarea enzimatic a oxigenului se aplic pentru conservarea maionezei, laptelui praf, prafului de ou, cafelei

199

Biochimia produselor alimentare prjite, untului, produselor din carne. Preparatul enzimatic introdus n pungi de polietilen permeabil la aer i impermeabil la ap, se nchide n ambalaj odat cu alimentul, iar oxigenul din acesta difuzeaz prin membran i este consumat de glucozoxidaz. Apa oxigenat format este descompus de catalaz, enzim care nsoete preparatul de glucozoxidaz. De asemenea, prin oxidarea -glucozei sub aciunea glucozoxidazei se formeaz -gluconolactona utilizat n industria preparatelor de carne pentru meninerea culorii roii caracteristice a acestor produse. - D-aminoaxcidoxidazele realizeaz oxidarea formelor D ale aminoacizilor dup reacia general:
COOH H C R NH2 + O2 + H2O FAD FADH2 COOH C R O + NH3 + H2O2

Aceste enzime se gsesc n rinichi, prezint o specificitate n raport cu configuraia aminoacizilor (formele L nu sunt oxidate), iar reaciile de acest tip constituie sursa principal de peroxid de hidrogen n sistemele metabolice. Coenzima lor este FAD. Formele L ale aminoacizilor sunt oxidate de L-aminoacid-oxidaze cofactor FMN. ce au drept

- citocrom-c-reductaza se gsete n ficat, inim, drojdie i acioneaz sinergic cu enzimele NAD+ dependente, dup mecanismul enzimelor flavinice de tip anaerob. - xantinoxidaza catalizeaz oxidarea bazelor purinice xantina i hipoxantina pn la acid uric:
O HN N N H N FAD FADH2 O HN N H N H O N

H2O + O2

H2O2

hipoxantina
O FAD FADH2 O HN N H N H NH O

xantina

H2O + O2

H2O2

acid uric

200

Enzime Xantinoxidaza se gsete n lapte, precum i n esuturile animale i vegetale. Necesit Mo pentru aciune. 7.9.1.3. Citocromii Citocromii sunt enzime care catalizeaz reaciile de oxidoreducere prin transfer de electroni de pe un donor pe un acceptor. Numai puine dehidrogenaze sunt capabile de a ceda hidrogenul preluat de la substrat sau de la dehidrogenaze reduse direct oxigenului din aer. Veriga intermediar ntre piridinele sau enzimele flavinice reduse, pe de o parte, i oxigenul atmosferic pe de alt parte, o constituie sistemul citocromic. Sistemul citocromic este alctuit din citocromi precum i din citocromoxidaz, enzim care activeaz oxigenul molecular i oxideaz cu acesta citocromul redus. Sistemul citocromic se ntlnete practic n toate organismele aerobe. El cuprinde o serie de citocromi care se deosebesc dup spectrul de absorbie, dup afinitatea fa de oxigenul molecular, potenialul redox i sunt denumii prin diferite litere sau litere care poart ca indice o cifr: citocrom a, citocrom a3, citocrom b, citocrom c, citocrom c1, citocrom P-450 etc. Citocromii reprezint n sine nite proteine conjugate (cromoproteide) a cror grupare prostetic este hemul i al cror mecanism de aciune se bazeaz pe posibilitatea de a-i schimba reversibil valena fierului din ion feros n ion feric i invers. -ecit (Fe3+) cit (Fe2+) +e forma oxidata Prin aceast forma redusa schimbare de valen se realizeaz transferul de electroni. n funcie de natura hemului pe care-l conin, citocromii au fost clasificai n patru grupe: - citocromii a - care au drept coenzim formil-porfirina; - citocromii b care conin protoporfirina; - citocromii c conin porfirin substituit legat covalent cu partea proteic; - citocromii d au drept coenzim dihidroporfirina. Dup spectrul de absorbie n soluie alcalin de piridin, citocromii se clasific n: 580-590 nm pentru citocromii a; 556-558 nm pentru citocromii b; 549-551 nm citocromii c i 600-620 nm citocromii d.

201

Biochimia produselor alimentare n funcie de potenialul oxido-reductor, citocromii se difereniaz n: a1, a2, a3, b1, b5, c1, c2, c3, c4. Citocromul a transfer electronii de la citocromul c la citocromul a3. Citocromul a3 mpreun cu citocromul a formeaz o molecul unic, citocromoxidaza care transfer electronii direct oxigenului molecular; este deci o transelectronaz aerob spre deosebire de ceilali citocromi care sunt de tip anaerob. Citocromul a3 are potenialul cel mai electropozitiv i n afar de fier mai conine i cupru, iar partea sa proteic este legat de o lipoproteid a membranei mitocondriale. Accept electronii de la citocromul a i i cedeaz oxigenului care va reaciona cu H+ formnd apa:

2 cit. a (Fe2+) + 2 cit. a3(Fe3+) 2 cit. a3 (Fe2+) + 1/2 O2 O2- + 2H+

2 cit. a (Fe3+) + 2 cit. a3(Fe2+) 2 cit. a3 (Fe3+) + O2H2O

Citocromoxidaza se difereniaz de hemoglobin i de mioglobin ntruct acestea cnd se oxigeneaz nu-i modific valena fierului din structur; la citocromoxidaz valena fierului se modific atunci cnd interacioneaz cu oxigenul. Citocromul b transport electronii de la ubichinon la citocromul c n catena de respiraie celular. Citocromul b5 face parte din structura microzomilor i particip la transportul de electroni i la procesele de hidroxilare mpreun cu citocromul P-450. Citocromul c este cel mai cunoscut citocrom att n ceea ce privete structura, ct i funcia sa. El acioneaz ca transportor de electroni n catena de respiraie celular ntre citocromii b i a. Se gsete n miocard, n ficat, rinichi, n germenii cerealelor, n drojdii.

202

Enzime Citocromul c are legat partea heminic de partea proteic prin puni de sulf; de asemenea, este posibil stabilirea de legturi coordinative ntre fierul din hem i ciclul imidazolic al radicalilor de histidin. O asemenea structur confer moleculelor de citocromi o mare stabilitate. n transferul electronilor de la atomii de hidrogen prin catena de oxidare celular, la nivelul mitocondriilor, iau parte succesiv citocromii b, c1, c, a, a3 dispui n aceast ordine pe baza potenialului redox. Trebuie totodat, precizat c citocromii iau parte nu numai n procesul de respiraie, ci i n procesele de fotosintez, chemosintez i fixare a azotului molecular. 7.9.1.4. Oxidaze Oxidazele sunt enzime care catalizeaz reaciile directe dintre substraturile lor i oxigenul molecular, transfernd hidrogen sau electroni de la substrat la O2. n funcie de mecanismul de aciune, oxidazele, se mpart n urmtoarele tipuri: Oxidaze care transport electroni. Acestea catalizeaz reacii n care electronii substratului sunt transferai pe O2 dup reacia: DH2 D O2 H2O

Fac parte din aceast categorie de enzime citocromoxidaza, al crei rol n procesele redox a fost prezentat anterior, ascorbatoxidaza, fenoloxidazele, ceruloplasmina. a)Ascorbatoxidaza este o cupruenzim ce catalizeaz oxidarea

203

Biochimia produselor alimentare acidului ascorbic la acid dehidroascorbic:

O C HO C HO C HC HO C H CH2OH acid ascorbic O + 1/2 O 2
-H2O

O C O C O C HC HO C H CH2OH acid dehidroascorbic O

Este

larg

rspndit

vegetale.

Deosebit

de

activ

este

ascorbatoxidaza din dovleac, varz i dovlecei. n unele plante aceast enzim are rol de oxidaz final n sistemul enzimatic oxidoreductor al glutationului. Ascorbatoxidaza este foarte specific n privina acceptorului de electroni, care trebuie s fie oxigenul molecular i n privina substratului care trebuie s aib o structur dienolic adiacent gruprii carboxil, o structur n ciclul nchis i izomerul L. Are pH-ul optim 5,6-6,0. Reacia de oxidoreducere a acidului ascorbic are loc n mod permanent n esutul vegetal integru, sub aciunea unor sisteme redox (glutation). Dac esutul este vtmat, reacia de oxidare devine enzimatic datorit prezenei O2, nu mai este reversibil i ca urmare are loc o scdere sensibil a coninutului de acid ascorbic. Ascorbatoxidaza poate fi inactivat prin nclzire la 100C i inhibat prin introducerea n mediu a SO2 sau prin modificarea pH-ului. n acest sens, oprirea fructelor i legumelor tiate, meninerea lor n

204

Enzime soluii acide sau cu SO2 constituie modaliti de aciune pentru contracararea ascorbatoxidazei i evitarea pierderilor de vitamin C la prelucrarea acestor produse. b) Fenoloxidazele sunt enzime prezente n toate esuturile organismelor superioare i la microorganisme cataliznd oxidarea monofenolilor i poilifenolilor. Din punct de vedere chimic, fenoloxidazele sunt cupruenzime care au posibilitatea de a reaciona direct cu oxigenul molecular prin schimbare de valen. Clasificarea lor se face dup natura substratului pe care-l oxideaz, n dou tipuri: - fenoloxidaze de tipul tirozinazei; - polifenoloxidaze. - Tirozinaza este o fenoloxidaz care oxideaz monofenolii i o-difenolii. Este prezent n esuturile plantelor, n ciuperci i n unele esuturi animale. Tirozinaza
OH OH 1/2 O2 OH 1/2 O2 - H2O o-chinona O O

fenol

o-difenol

transform fenolul i o-difenolul n chinone colorate n brun:

n regnul animal tirozinaza particip la formarea melaninelor prin oxidarea tirozinei. ntr-o prim etap, tirozina este oxidat la dioxifenilalanin (DOPA), iar n continuare aceasta este oxidat, tot de ctre tirozinaz, la melanin.
OH OH OH Melanina

CH2 CH COOH NH2 tirozina

CH2 CH COOH NH2 DOPA

205

Biochimia produselor alimentare

O activitate tirozinazic intens exist n mucegaiuri i n fina de secar. Culoare nchis a pinii de secar se explic, n mare parte, prin prezena tirozinazei. Tot acestei cauze se datoreaz uneori culoarea mai nchis a unor paste finoase (unele laturi de fin de gru conin o tirozinaz foarte activ). - Polifenoloxidazele sunt, de asemenea, cupruenzime care oxideaz orto- i para- difenolii n chinone colorate, dar nu acioneaz asupra monofenolilor. Se gsesc n cartofi, mere, struguri, pere, gutui, cereale, la unele mucegaiuri. Prin aciunea polifenoloxidazelor se explic nchiderea la culoare a cartofilor sau merelor tiate, a sucurilor de fructe, sau a vinurilor; de asemenea, aceste enzime iau parte la oxidarea substanelor tanante n timpul fermentrii frunzelor de ceai i tot lor se datoreaz mbrunarea fructelor i legumelor n timpul uscrii. Fenomenul este cunoscut sub denumirea de mbrunare enzimatic, iar pentru c produce o depreciere a culorii produselor este nedorit n indusrtria alimentar. Prevenirea mbrunrii se poate face prin inactivarea termic a polifenoloxidazelor (oprire) sau pe cale chimic (SO 2, acid ascorbic). pHul optim de aciune al acestor oxidaze din fructe este cuprins ntre 5,17,3, iar temperatura optim este 30C. n celulele sau esuturile intacte, fenoloxidazele nu oxideaz polifenolii deoarece lipsete oxigenul molecular; or, aceste enzime nu acioneaz dect n prezena sa. c) Ceruloplasmina se gsete n plasma sanguin, conine cupru i catalizeaz oxidarea hidrochinonei i p-fenilendiaminei pn la pchinone. Dioxigenaze. Sunt enzimele care catalizeaz reacii n care amndoi atomii oxigenului molecular se regsesc n produii de reacie. Reacia general se prezint sub forma: A + O2 AO2 Enzimele acestei grupe pot conine n calitate de grupare activ hem sau fier neheminic, iar pentru aciunea unora, pe lng acesta, este necesar i prezena ( )-cetoglutaratului. Cu predilecie, dioxigenazele catalizeaz ruperea dublelor legturi din ciclul aromatic, ns i alte diverse reacii sunt catalizate n mod asemntor. O astfel de enzim este lipoxidaza (lipoxigenaza) care oxideaz acizii grai nesaturai, carotenii i vitamina A. Este rspndit n vegetale, iar cantiti mari se gsesc n leguminoase i oleaginoase.

206

Enzime Substratul principal al lipoxidazei sunt acizii grai care conin n molecula lor gruparea CH=CH-CH2-CH=CH- cu configuraia cis, adic cel puin dou duble legturi izolate, desprite printr-o grup metilen. Acizii grai care conin asemenea grupe sunt acizii grai polinesaturai: linoleic, linolenic i arahidonic. Procesul de oxidare a acidului linoleic decurge dup schema:
CH3 13 12 11 10 9 (CH2)4 CH CH CH2 CH CH (CH2)7 COOH

O2 13 12 11 10 9 CH3 (CH2)4 CH CH CH CH CH OO

(CH2)7

COOH

Radical liber Formele trans nu sunt atacate. Se observ c n desfurarea reaciilor de oxidare se formeaz radicali liberi care ntrein lanul de reacii pn la antrenarea ntregii cantiti de acizi, precum i a carotenilor i vitaminei A. Reacia catalizat de lipoxidaz este cauza principal a rncezirii grsimilor nesaturate n timpul pstrrii lor, a scderii coninutului de caroteni sau de vitamina A i are deci un rol deosebit n degradarea unor produse alimentare. Prin emulsionarea substratului se mrete suprafaa de contact dintre enzim i substrat, deci viteza de reacie crete. Pentru prevenirea aciunii lipoxidazei se folosesc inhibitori (antioxidani) care prin reacii de terminare blocheaz radicalii liberi. Totui, sunt i implicaii pozitive ale lipoxidazei pentru calitatea unor produse alimentare. Astfel, lipoxidaza grului i mai ales preparatele de lipoxidaz din soia determin albirea aluatului i mbuntirea proprietilor sale reologice. Datorit decolorrii pigmenilor finii, lipoxidaza conduce la obinerea pinii cu miez deschis la culoare. Monooxigenaze. Organismele animale conin o grup numeroas i divers de enzime care poart denumirea de monooxigenaze. n cazul tipic, un atom al moleculei de oxigen este regsit n noua grupare hidroxilic a substratului, iar cellalt este redus pn la ap, n cursul reaciei respective. Pentru aceasta reacia trebuie s decurg n prezena enzimei, substratului, O2 i a unui oarecare agent reductor. Aceste enzime se mai numesc hidroxilaze sau oxidaze cu funcii mixte. Reacia general dup care decurge monooxigenaze este urmtoarea: o reacie catalizat de

D-H + O2 + AH2 D-OH + H2O + A n care: - D-H este substratul care se oxideaz n D-OH; - AH2 este agentul reductor (donor de hidrogen).

207

Biochimia produselor alimentare n acest mod agentul reductor care este un donor de hidrogen joac rolul de cosubstrat. De multe ori acest rol de cosubstrat este ndeplinit de NADH + H+. Astfel, unele din enzimele implicate n biosinteza steroizilor sau n transformrile acestora sunt monooxigenaze care utilizeaz NADPH drept cosubstrat. De asemenea, o serie de enzime implicate n metabolismul xenobioticelor (substane biologic active de natur exogen) sunt monooxigenaze care se gsesc n microzomii celulei hepatice mpreun cu citocromul P-450 i citocromul b5. Acest sistem enzimatic hepatic are drept cosubstrat NADH+H+ i realizeaz, prin transfer de electroni i hidroxilare enzimatic, hidroxilarea xenobioticului contribuind la metabolizarea sa:
2H+ NADH+H+ FAD 2 cit b5 (Fe2+) 2 cit P-450 (Fe3+) X-OH + H2O

NAD+

FADH2

2 cit b5 (Fe3+)

2 cit P-450 (Fe2+)

X-H + O 2

n care X este xenobioticul (medicament, drog, compui toxici etc.). Citocromul P-450 poate fi indus tocmai prin prezena diferitor xenobiotice. 7.9.1.5. Ali transportori de electroni Coenzima Q n mitocondrii exist o grup de chinone nrudite care se reduc cnd mitocondria este incubat anaerob cu diverse substraturi. Ele se numesc coenzime Q. Structura i caracteristicile acestui tip de compui au fost redate n capitolul referitor la vitamine i anume n prezentarea ubichinonelor. n catena de respiraie, coenzima Q ocup un loc intermediar ntre FMN i citocromul b, participnd la transferul electronilor de la primul la al doilea din compuii amintii. Superoxiddismutaza n timpul transportului electronilor spre oxigenul molecular pe calea catenei de respiraie mitocondrial, ca i n diferite reacii de hidroxilare i oxigenare ,se pot forma produi toxici rezultai din reducerea parial a oxigenului. Printre acetia fac parte anionul superoxid O2. i H2O2 care sunt extrem de reactivi i capabili de a distruge activitatea unor biomolecule. Pentru eliminarea anionului superoxid, organismele sunt dotate cu o enzim specific superoxiddismutaza (SOD) care catalizeaz reacia:

Aceasta

este

O2 + O2 + 2 H+ SOD

H2O2 + O2 cea mai important

208

Enzime reacie de protecie a organismului, care acioneaz n prima linie de aprare celular, neutraliznd peste 90% din radicalii liberi formai. Superoxiddismutaza este o metal enzim, care conine n centrul activ un metal, de exemplu Cu2+, Mn2+, Fe3+. Enzima din citosolul celulelor de eucariote conine Zn2+ i catalitic, ntr-o vecintate foarte strns. Catalazele i peroxidazele n reaciile de oxidoreducere catalizate de transhidrogenazele aerobe precum i n reacia catalizat de superoxiddimutaz se formeaz peroxid de hidrogen (H2O2) care este un oxidant puternic i acumularea sa n celule n cantitate mare este duntoare. Descompunerea apei oxigenate rezultat din reaciile menionate are loc n organism n mod organizat prin enzime specifice ce o descompun utiliznd-o n scopuri precise de oxidare necesar proceselor metabolice, fie o descompun pur i simplu n ap i oxigen. Enzimele care catalizeaz aceast reacie de descompunere a peroxidului de hidrogen sunt catalazele i peroxidazele. n reaciile catalizate de aceste enzime ndeplinete funcia de acceptor de hidrogen: H2O2 + 2H+ + 2e 2 H2O Catalazele sunt cromoproteide cu hem, a cror grupare prostetic este legat de protein prin dou grupri carboxil Activitate catalazic s-a observat aproape la toate celulele i organele animale. Ficatul, eritrocitele i rinichii sunt surse bogate de catalaz. Aceast activitate a fost evideniat, de asemenea, la toate esuturile vegetale i la majoritatea microorganismelor, cu excepia celor obligator anaerobe. Reacia dup care catalaza descompune apa oxigenat este urmtoarea: peroxidul de hidrogen Cu2+ n centrul

2 H2O + O2 H2O2 + H2O2 Oxigenul molecular rezultat din reacie constituie o surs de oxigenare a unor esuturi i este utilizat totodat de celule pentru efectuarea unor reacii.
Preparatele enzimatice de catalaz obinute din ficat de bovine sau prin biosintez prin cultivarea unor microorganisme, sunt utilizate n industria alimentar pentru distrugerea apei oxigenate folosite pentru pasteurizarea oulor, conservarea laptelui, stabilizarea culturilor starter productoare de acid lactic. Peroxidazele sunt tot cromoproteide cu hem care descompun peroxizii dup reacia:

catalaza

209

Biochimia produselor alimentare

ROOR' + DH2 peroxid

R-OH + R'-OH

n care ROOR este un peroxid oarecare sau peroxidul de hidrogen (H2O2). Pentru descompunerea peroxidului este necesar prezena unui donor de hidrogen (DH2). Acesta poate fi reprezentat de o substan oarecare, de obicei fenoli, aminoacizi, amine, aromatice. Peroxidazele sunt rar ntlnite n esuturile animale. n ficat i rinichi s-a evideniat o slab activitate peroxidazic; peroxidaza se gsete i n lapte; n eritrocite exist glutationperoxidaza care conine Se i care oxideaz specific glutationul redus. Drojdiile conin peroxidaze specifice fa de citocromul c, iar la unele bacterii se gsesc peroxidaze care oxideaz NADH. Toate plantele sunt bogate n peroxidaz. Surse excelente sunt hreanul i ridichea neagr. Peroxidazele din esuturile vegetale lezate, secionate folosesc drept donori de hidrogen polifenolii pe care-i oxideaz la chinone ce prin condensare genereaz pigmeni melanici de culoare brun, afectnd culoarea fructelor i legumelor n timpul prelucrrii lor. Pentru inactivarea acestor enzime este necesar un tratament termic mai intens (temperatura de 90-95C, timp de 2-3 minute) deoarece sunt termostabile. Se poate recurge i la utilizarea unor inhibitori care se combin cu ionul de fier din hem. Peroxidazele acioneaz i n produsele vegetale congelate i se poate aprecia c degradarea culorii cestor produse este cauzat, n mare parte de peroxidaze. Oprirea prealabil a materiilor prime previne acest defect.

7.9.2. Transferaze
Enzimele din aceast clas catalizeaz reacii de transfer, prin care o parte (G) din molecula unui substrat numit donor este cedat unui alt substrat, numit acceptor. Mecanismul general al reaciilor catalizate de aceste enzime este de forma: D-G + A D + A-G

n aceste reacii se formeaz intermediar un complex enzim-grupare transferabil, complex care va reaciona ulterior cu acceptorul, fixnd pe acesta gruparea activat. Denumirea enzimelor din aceast clas se face dup regula: donoracceptor ca prefix, urmat de denumirea gruprii transferate, dup care se adaug cuvntul transferaz. n funcie de natura gruprii transferate, aceste enzime se mpart n mai

210

Enzime multe subclase: 7.9.2.1. Aminotransferaze (Tranaminaze) Aminotransferazele sunt enzimele care catalizeaz transferul unei grupri amino de pe un -aminoacid pe un - cetoacid, cu formarea unui nou aminoacid:
R CH COOH + R' C NH2 O COOH R C O ' COOH + R CH COOH NH2

n procesul de transaminare, aminoacizii dicarboxilici acidul glutamic i acidul aspartic joac un rol central; acceptorul de grupare amino poate fi un cetoacid oarecare, dar cel mai frecvent sunt acizii piruvic, oxalacetic sau cetoglutaric. ns marea majoritate a aminoacizilor particip la procesele de transaminare, fenomen prin care organismele au posibilitatea de a-i sintetiza acizii aminai proprii n funcie de necesitile metabolice. Mecanismul transaminrii const n transferul gruprii amino de pe aminoacid pe cetoacid sub aciunea catalitic a enzimelor de

transaminare care au drept component

prostetic piridoxalfosfatul.

Acest transfer se face n mai multe etape, implicnd o serie de rearanjri intramoleculare, care n final duc la formarea unui nou aminoacid i a unui nou cetoacid. n prima faz are loc o condensare ntre aminoacid i centrul activ al enzimei, cu formarea unui compus de tipul bazelor Schiff. Compusul format sufer o rearanjare intramolecular prin deplasarea unui proton

211

Biochimia produselor alimentare de la un carbon la altul, adic are loc tautomeria bazei Schiff. n faza a treia, n prezena apei enzima preia funcia amino pe care o va ceda unui cetoacid, prin acelai mecanism ca mai sus i rezult cetoacidul corespunztor aminoacidului iniial. Acest tip de transfer poart

denumirea de mecanism de ping-pong.

CHO

R HC NH2 +

HO

CH2

P -H2O +H2O

R HC N CH Pirid

COOH aminoacid R C

H3C

COOH baz Schiff

piridoxalfosfat (Pirid-CHO) N H2C Pirid

+H2O -H2O

R C O + H2N-H2C-Pirid

COOH

COOH

R' C O + H2N-H2C-Pirid

R'
-H2O +H2O

R' N H2C Pirid CH N CH Pirid

COOH R' +H2O -H2O HC NH2 + OHC-Pirid

COOH

COOH

COOH

Activitatea transaminazelor este favorizat de unii ioni metalici cu care enzima formeaz chelai, nlesnind astfel legtura enzim-substrat. Reaciile de transaminare au o importan deosebit n metabolismul intermediar. Cu ajutorul lor se pot sintetiza aminoacizii proprii organismului, utiliznd aminoacizii i cetoacizii n exces, care se gsesc n aa numitul rezervor (pool) metabolic. Tot cu ajutorul acestor reacii se stabilete conexiunea ntre metabolismul proteic i cel glucidic. Exemple de transaminare: - Alanin - -cetoglutarattransaminaza catalizeaz reacia de transaminare reversibil de pe alanin pe acid -cetoglutaric:

212

Enzime

CH3 COOH

COOH CH2 CH2 COOH acid -cetoglutaric

CH3 COOH

COOH CH2 CH2

CH NH2 + C O

C O + CH NH2

alanin

COOH acid piruvic acid glutamic

- Glutamat oxaloacetattransaminaza (GOT) catalizeaz reacia reversibil dintre acidul glutamic i oxalacetic:

COOH CH NH2 + CH2 CH2 COOH acid glutamic

COOH C O CH2 COOH acid oxalacetic

GOT

COOH C O CH2 CH2 COOH acid -cetoglutaric +

COOH CH NH2 CH2 COOH acid aspartic

- Glutamat piruvattransaminaza (GPT) transfer reversibil gruparea amino a acidului glutamic pe acidul piruvic:

COOH

CH3

CH NH2 + C O COOH CH2 CH2 COOH acid glutamic acid piruvic

GPT

COOH C O CH2 CH2 COOH acid -cetoglutaric +

CH3 CH NH2 COOH

alanin

De asemenea, sub aciunea aminotransferazelor specifice, asparagina i glutamina pot s cedeze cetoacizilor gruprile lor aminice. Aminotransferazele exist la microorganisme, plante i animale. 7.9.2.2. Fosfotransferaze (Kinaze) Fosfotransferazele sunt enzime care catalizeaz reaciile de transfer a gruprii fosfat de la un donor la un acceptor specific, conform reaciei generale:

213

Biochimia produselor alimentare R-PO3H2 + R H R PO3H2 + R-H n general, aceste reacii se efectueaz cu o substanial modificare de energie, transferul radicalului fiind virtual ireversibil (cu excepia formrii compuilor macroergici) i nsoit de un important schimb de energie liber. Compuii fosforilai particip ntotdeauna la schimbri energetice importante: energia care rezult din reaciile oxidative exerogonice este folosit n mare msur pentru sinteza compuilor organici fosforilai pe seama fosfatului anorganic (reacie endergonic). Ulterior aceti compui fosforilai sunt utilizai n reaciile de sintez intracelular, ei furniznd energia liber pentru reaciile endergonice. Din aceast subclas fac parte: - Hexokinaza care catalizeaz prima reacie din procesul glicolizei, pornind de la glucoz i n care are loc un transfer de grupare fosfat de la ATP la hexoz:
CH2OH O H H H HO OH H H OH OH CH2 O P O H H H H OH OH

ATP +

ADP +

HO OH H

glucoz

glucozo-6-fosfat
fosforilarea
O H OH HO H

- Fosfohexokinaza fosfohexozelor:
P OH2C
H

care

catalizeaz

mai

departe

O H OH HO H

CH2OH OH + ATP

P OH2C
H

CH2O P
OH

+ ADP

fructozo-6-fosfat

fructozo-1,6-difosfat

- Piruvatkinaza trece fosforul de pe acidul fosfoenolpiruvic pe ADP cu formare de ATP:

COOH O C O ~ P OH + ADP OH CH acid 2-fosfoenolpiruvic

2

COOH C O + ATP CH3 acid piruvic

214

Enzime - Creatinkinaza particip la transferul gruprii fosfat de pe ATP pe creatin cu formare de creatinfosfat i ADP:

HN C

HN2 N CH2 COOH

NH ~ P + ATP HN C N CH2 COOH CH3 creatinfosfat

+ ADP

CH3 creatin

7.9.2.3. Metiltransferaze Sunt enzime care catalizeaz transferul gruprii metil de pe donor pe acceptor. nainte de cedare, gruparea metil trebuie activat de substane macroergice de tip ATP, formndu-se o combinaie intermediar, reactiv. Ca substane donatoare de radical metil funcioneaz metionina, colina etc. iar ca substane acceptoare colamina, glicocolul, noradrenalina, acidul guanidinacetic etc. Astfel, n cursul metabolismului intermediar, metionina furnizeaz grupri metil colaminei, trecnd-o n colin. Mai nti ns are loc activarea metioninei de ctre ATP. Aceasta const n legarea sa la restul de adenozil sub forma unui compus de sulfoniu, o stare mai reactiv, conform reaciei:

S CH3 CH2 2 CH NH3 COO+

NH2

+ ATP

metioninadenoN ziltransferaz H2O Pi + PPi N

CH3

CH2 S + ( CH2)2 CH COON OH OH + NH3 H H H O H

metionin

S-adenozilmetionina (metil activ)

Gruparea metil legat sub aceast form este activ i poate fi cedat uor atomului de azot; dup cedare, ionul de sulfoniu trece la forma normal de adenozintioeter. Transferul metilului se face numai pe un atom de azot care fixeaz gruparea la cei doi electroni neparticipani:

215

Biochimia produselor alimentare

A Rib S CH3 3 CH2 2 H C NH2 COOH S-adenozilmetionin

CH3 + N CH3 metiltransferaz + CH2 OH CH2 OH CH3 colamin colin CH2 NH2 CH2 + CH2 NH2 metiltransferaz CH2 NH CH3 COOH COOH glicocol sarcozin NH2 NH2 metiltransferaz C NH + C NH N CH2 NH CH
2

COOH acid guanidin acetic

CH3 COOH creatin

7.9.2.3. Aciltransferaze Aciltransferazele catalizeaz reaciile de transfer a radicalilor acil (R-CO-) cu ajutorul coenzimei A (CoA-SH) care reprezint gruparea lor prostetic. Reacia general de transfer este urmtoarea: R-CO-R' + R-H R'-H + R-CO-R Ca donori de radicali acil funcioneaz acil-derivaii coenzimei A care sunt formele activate ale acizilor organici prin care acetia se pot degrada oxidativ sau pot s participe la reacii de sintez. Activarea acizilor organici prin transformarea n acil-derivai ai CoA se face cu participarea ATP-ului ca furnizor de energie. Dup activare, radicalul acil este trecut pe acceptorul specific:

acil-donor

CoA-SH

acil-acceptor

donor

CoA~acil

acceptor

n acest transfer, ntre CoA i gruparea acil se stabilete o legtur mercaptoacil macroergic fapt ce explic denumirea de form activat a acidului organic. n legtura mercaptoacil, coenzima particip cu gruparea sa SH. Reacia general de activare se prezint astfel:

R-COOH + CoA-SH + ATP

tiokinaze

R-CO~SCoA + AMP + PPi acil derivat al CoA

216

Enzime iar de transfer:

Aciltransferaza R - CO ~ SCoA + R"- H

CoA - SH + R - CO - R"

Foarte important n procesele metabolice este activarea acetatului sub form de acetil-coenzim A (acetat activat):

CH3-COOH + CoA-SH + ATP

acetiltiokinaza

CH3-CO~SCoA + AMP + PPi acetil-CoA

Acetil-CoA particip n anumite procese biochimice, constituind un fond metabolic comun (pool) prin care se stabilesc corelaii ntre diferite ci metabolice. Unul din cei mai importani formatori de grupri acetil este acidul piruvic, care n cea mai mare parte, provine din glucoz. Transformarea sa n acetil-CoA se face printr-o reacie de decarboxilare oxidativ sub aciunea unui complex enzimatic la care, n afar de CoA, mai particip NAD+, FAD,TPP i acidul lipoic:

CH3

C COOH + CoA-SH

TPP; acid lipoic NAD+ NADH+H+

CH3-CO~SCoA + CO2 acetil-CoA

O acid piruvic

Acceptorul grupei acil poate fi colina, oxalacetatul, glucozamina etc. n cazul n care colina primete restul acil se formeaz acetilcolina care este un mediator chimic neuro-muscular:
CH3 CH3 aciltransferaz + + H3C CO O CH2 CH2 N CH3 CH3-CO~SCoA + HO CH2 CH2 N CH3 - CoA-SH CH3 CH3 acetil-CoA colin acetilcolin

7.9.2.5.Glicoziltransferaze Glicoziltransferazele catalizeaz transferul unui rest de glucid (G) pe un acceptor specific (A), dup reacia: D O G + A OH A O G + D - OH Restul de glucid, respectiv gruprile transferate de glicoziltransferaze sunt de tip hexozil sau pentozil. Donorii acestor grupri sunt oligozaharide, polizaharide, glicozizi, iar acceptorii pot fi alte monozaharide sau derivai ai acestora. Prin reacii de transfer ale gruprii glicozil are loc biosinteza dizaharidelor i polizaharidelor. Pentru a putea fi transferat, restul de glucide trebuie n prealabil activat

217

Biochimia produselor alimentare pentru a avea energia necesar formrii legturii glicozidice. Aceast activare se realizeaz pe baza energiei eliberate prin hidroliza UTP i ATP, iar formele activate ale monozaharidelor ce urmeaz a fi transferate constituie compuii dintre glucid i UDP. Astfel, biosinteza unui dizaharid se efectueaz dup schema general:

monozaharid1- P + ADP pirofosfataz monozaharid1- P + UTP UDP-monozaharid1 + PPi (forma activ) glicoziltransferaz UDP-monozaharid1 + monozaharid2 monozaharid1-monozaharid2 - UDP (dizaharid)
Prin urmare, nucleozid difosfatul, respectiv UDP, funcioneaz ca transportor specific al radicalului glicozil. n biosinteza glicogenului intervin mecanisme asemntoare, ns particip att glicoziltransferaze care formeaz legturi (14) ct i glicoziltransferaze responsabile de formarea legturilor (16) prin care se produce ramificarea macromoleculei. Foarte rspndit n plante, animale i la microorganisme este o glicoziltransferaz care se numete fosforilaz sau -glucanfosforilaza. Aceast enzim catalizeaz transformarea amidonului sau glicogenului n glucozo-l-fosfat, adic transferul unui radical glicozil de pe macromolecul, pe acidul fosforic, astfel:

monozaharid1 + ATP

kinaz

amidon (glicogen) + H3PO4

fosforilaz

glucoz-1- P

Aceast transformare este analog hidrolizei, dar spre deosebire de aceasta, n locul apei acioneaz acidul fosforic. Reacia de fosforoliz este reversibil. ns pentru ca -glucanfosforilaza s sintetizeze in vitro glicogen sau amidon din glucozo-1-fosfat este necesar prezena n mediu de reacie a unor mici cantiti din aceste polizaharide care acioneaz ca nductori. Astfel, fosforilaza din cartofi, mazre, porumb sintetizeaz n vitro din glucozo-1-fosfat un polizaharid asemntor cu amidonul natural, iar fosforilaza din ficat formeaz un polizaharid care amintete de glicogen. Enzima zaharozo-glicoziltransferaza (zaharozofosforilaza) catalizeaz interaciunea zaharozei i ortofosfatului cu formarea glucozo-1-fosfatului i fructozei: zaharoz + ortofosfat glucozo-1-fosfat + fructoza Din aceast relaie se observ c fenomenul este reversibil i pe aceast cale, la unele bacterii, poate decurge sinteza enzimatic a zaharozei din glucoz-1-fosfat i fructoz.

218

Enzime

7.9.3. Hidrolaze
Hidrolizele sunt enzime care catalizeaz reacia de scindare a moleculelor cu fixarea componentelor apei la produsele rezultate, dup reacia general:

R-R + HOH R-H + R-OH

Din aceast clas fac parte enzimele care hidrolizeaz proteinele pn la aminoacizi, polizaharidele pn la monozaharide i lipidele pn la acizi grai i glicerol. Reaciile catalizate de hidrolaze se produc cu modificri energetice mici, cu degajare de energie liber mic, deci ele nu constituie o surs energetic important pentru organism. Hidrolazele au totui un rol deosebit n metabolismul substanelor aduse cu alimentaia deoarece ele descompun moleculele mari care intr n compoziia alimentelor, n molecule simple uor de asimilat. n general, reaciile de hidroliz enzimatic sunt reversibile, iar principalele legturi chimice care pot fi scindate sunt: legtura ester, legtura glicozidic, legtura peptidic. n funcie de tipul legturii asupra creia acioneaz, hidrolazele se mpart n mai multe subclase. 7.9.3.1. Esteraze Esterazele sunt enzime care catalizeaz reacia reversibil de scindare a legturilor esterice cu formarea acidului i alcoolului corespunztori: R1-COOR + HOH R1-COOH + R-OH Aceste enzime au o specificitate mic n raport cu substratul i ca urmare hidrolizeaz cu viteze comparabile un numr mare de esteri. Exist mai multe tipuri de esteraze n funcie de natura chimic a acidului care particip la formarea legturilor ester. a) Carboxilesteraze. n aceast sub-subclas sunt cuprinse enzimele care catalizeaz scindarea hidrolitic a esterilor carboxilici. Din aceast categorie fac parte: Lipazele sau, conform denumirii sistematice, glicerol-ester-hidrolaze, care catalizeaz hidroliza gliceridelor dup reacia: triglicerid + H2O diglicerid + acid gras Lipazele nu au o specificitate strict, dar viteza de aciune catalitic variaz cu originea diverselor lipaze. Au o specificitate n funcie de lungimea catenei acizilor grai i posed o selectivitate n funcie de

219

Biochimia produselor alimentare configuraia substratului. Posed, de asemenea, o specificitate stereochimic, unul din izomerii optici ai aceluiai substrat putnd fi atacat cu o vitez mai mare dect cellalt. Lipazele scindeaz toi cei trei acizi grai ai gliceridei, ns nu simultan, ci succesiv, fapt foarte important pentru procesul de absorbie a lipidelor. Lipazele sunt enzime foarte rspndite n natur. n organismul animal se gsete lipaz n sucul pancreatic, ficat, snge, limf i n lapte. Plantele oleaginoase (ricin, soia, floarea soarelui) conin, de asemenea, lipaze foarte active O serie de mucegaiuri i bacterii reprezint surse bogate n lipaze, fiind folosite pentru biosinteza carboxilesterazelor i obinerea preparatelor enzimatice de acest tip. Trebuie ns menionat c lipazele de diferite proveniene se deosebesc ntre ele sub aspectul proprietilor i caracterului aciunii. Aciunea lipazelor are o mare importan pentru pstrarea alimentelor, mai ales a celor ce conin cantiti mari de lipide. Prin aciunea acestor enzime, n timpul depozitrii produselor alimentare se produce o rapid descompunere a gliceridelor n acizi grai i glicerol, ceea ce conduce la o cretere a aciditii produselor i la deprecierea lor calitativ. Fosfolipazele sunt esteraze care catalizeaz reacia de scindare hidrolitic a acizilor grai din glicerofosfolipide (fosfatidilcolina, fosfotidiletanolamina):

CH2

O OC R 1

CH O OC R 2 O CH2 O P O CH2 CH2 CH3 + N CH3 CH3

OH fosfatidilcolina si locul de actiune a fosfolipazelor

Colinesterazele scindeaz hidrolitic esterii colinei, prezeni ndeosebi n esutul nervos, sinapse, eritrocite. Astfel, sub aciunea acestor enzime se descompune acetilcolina, mediatorul chimic care faciliteaz transmiterea influxului nervos de la nervii motori la muchii striai.
(H3C)3N+-CH2-CH2-O-CO-CH3 acetilcolina
acetilcolinesteraza

(H3C)3N+-CH2-CH2-OH + HOOC-CH3 colina

Clorofilazele sunt esteraze specifice care se gsesc n plante verzi i care n soluii alcoolice descompun foarte activ clorofila. Reacia catalizat de aceste enzime const n scindarea restului de fitol din molecula de clorofil i nlocuirea lui cu un rest de alcool ce se gsete

220

Enzime n mediu: R-COOC20H39 + C2H5OH clorofila

clorofilaz

R-COOC2H5 + C20H39OH etilclorofilid fitol

Aciunea optim a acestor enzime are loc la pH=5,9. Este interesant de menionat c aciunea clorofilazei din frunze este deosebit de intens n mai i septembrie, adic n perioada cnd se intensific formarea i descompunerea clorofilei. Tanazele catalizeaz descompunerea hidrolitic a taninurilor-esteri compleci ai acizilor aromatici cu fenolii. Tanazele au o aciune specific strict n sensul c ele scindeaz numai esterii compleci al cror component acid conine cel puin doi hidroxili fenolici. Un astfel de ester este didepsidul acidului orselinic numit acid lecanoric:

CH3 HO COO OH
Tanaza este produs de mucegaiuri si plante.

CH3 COOH OH

Acidul lecanoric si locul de actiune a tanazei

Pectinesteraza (PE) sau Pectaza este una din enzimele care realizeaz descompunerea hidrolitic a substanelor pectice. Aciunea specific a pectinesterazei const n hidroliza legturilor esterice dintre acidul poligalacturonic i alcoolul metilic din molecula de pectin:

Pectina + nH2O

PME

Acid poligalacturonic + CH3 - OH

Aceast enzim mai este denumit i pectinmetilesteraz (PME). Pectinesterazele se gsesc n rdcinile, frunzele i fructele plantelor, precum i n bacterii, mucegaiuri i drojdii. Cele mai bine studiate sunt cele din mucegaiuri deoarece intr n preparatele pectolitice comerciale (filtragol, pectinol, aspergol etc.) folosite n industria sucurilor de fructe, conservelor vegetale, vinurilor. Biosinteza pectinmetilesterazelor de ctre microorganisme este mult stimulat de prezena pectinei n mediul de cultur. Este un caz de biosintez indus a acestor enzime. Pectinesterazele au un mare rol n fermentarea tutunului deoarece elibereaz alcoolul metilic din pectinele care se gsesc n frunzele de tutun i n felul acesta fumul este mai puin toxic. Tot datorit aciunii pectinesterazelor se acumuleaz alcoolul metilic n fructele lsate la fermentat n scopul obinerii unor buturi alcoolice. Acest alcool trece la distilare n buturi i prin urmare, la aciunea toxic

221

Biochimia produselor alimentare a alcoolului etilic se adaug i cea a alcoolului provenit din pectina fructelor. b) Tioesteraze. Sunt enzime care catalizeaz scindarea hidrolitic a tioesterilor. O astfel de enzim este, de exemplu, tioglicozidaza sau mirozinaza care hidrolizeaz tioglicozizii, cum ar fi sinigrina ce se gsete n mutar. Prin umectarea seminelor de mutar, sub aciunea mirozinazei sinigrina se descompune n glucoz, ester al alcoolului alilic i bisulfat de potasiu:
S CH2 CH CH2 sinigrina C C 6H11O5
mirozinaza

C6H12O6 + CH2 glucoz

CH CH2

N C S

N O SO3K H2O

KHSO4

ester al alcoolului alilic

c) Fosfoesteraze. Sunt enzime care catalizeaz scindarea hidrolitic a esterilor acidului fosforic cu formare de alcool. Aceste enzime sunt deosebit de importante, deoarece substratul lor particip la metabolismul intermediar al glucidelor, lipidelor, nucleotidelor. Clasificarea fosfoesterazelor are drept criteriu substratul asupra crora acioneaz, i anume: c1- fosfomonoesterazele (fosfatazele) scindeaz hidrolitic monoesterii acidului ortofosforic dup reacia: R-O-PO3H2 + HOH R-OH + H3PO4 Fosfomonoesterazele cu specificitate mai marcant sunt cele ce catalizeaz hidroliza esterilor fosforici ai glucidelor, glicerinei, mononucleotidelor, inozitolului. - glucozo-6-fosfataza este enzima specific de scindare a esterului glucozo-6-fosfat:
CH2 O P O H H H HO OH H CH2OH O H H H HO OH H H OH OH

+HOH -H3PO4 H OH

glucozo-6-fosfat

OH

glucoz

- hexozodifosfataza are drept substrat specific esterul fructozo-1,6-difosfat:

P O H2C
H

O H OH

CH2 O P P O H2C +HOH H OH H HO -H3PO4 H OH

O HO H

CH2OH OH

fructozo-1,6-difosfat

fructozo-6-fosfat

222

Enzime - nucleotidazele sunt fosfomonoesteraze care au ca substrat mononucleotidele, acidul adenozin-5-fosforic din muchi i acidul adenozin-3-fosforic din drojdii. Prin hidroliz se formeaz nucleozidul i acidul fosforic.
NH2 N N N H H OH N O
O

NH2 N N +HOH -H3PO4 N H H OH N

CH2 O H H OH

P OH OH

CH2OH H H OH

5'-ribonucleotid

5'-ribonucleozid

Nucleotidazele bazice se gsesc n intestin i ficat i au optimum de pH=9. Nucleotidazele ce acioneaz n mediu acid au pH optim de 4,9 i se gsesc n frunze, rdcini, semine i la mucegaiuri. - fitazele detaeaz acidul fosforic din acidul fitic, care sub forma srurilor de Ca-Mg reprezint de fapt fitina. Fitaz foarte activ se gsete n drojdii i n seminele multor plante. Fitaza are un rol deosebit de important pentru calitile nutritive ale pinii. Acidul fitic (inozitfosforic), formnd sruri insolubile cu calciul, mpiedic absorbia acestuia n organismul omului. De aceea, fitaza din drojdie i din fin, care descompune n timpul fermentrii aluatului o mare parte din acidul fitic existent n el, contribuie la mbuntirea absorbiei calciului furnizat de fina de gru. c2- fosfodiesterazele acioneaz hidrolitic asupra legturilor fosfodiester, conform reaciei generale:

R O R1 O P

O OH

+H2O

R-OH +

HO R1 O P

O OH

Fac parte din aceast sub-subclas enzimele care catalizeaz hidroliza acizilor nucleici - nucleazele i cele ce hidrolizeaz legturile diesterice din fosfatidil colin. - ribonucleazele depolimerizeaz acizii ribonucleici pe care-i transform n ribonucleotide. Au aciune catalitic de desfacere a legturilor diesterice care unesc mononucleotidele din molecula de ARN, fr formare de acid fosforic liber. Se gsesc n pancreas i sucul pancreatic, ficat, splin. Sunt prezente, de asemenea, n plante i microorganisme. - dezoxiribonucleazele sunt nucleaze ce catalizeaz scindarea hidrolitic a ADN-ului n interiorul catenelor polinucleotidice cu formare de 5- sau 3dezoxiribonucleotide.

223

Biochimia produselor alimentare

7.9.3.2. Glicozidaze Glicozidazele sunt enzime care catalizeaz scindarea hidrolitic a legturilor glicozidice din oligo- i polizaharide precum i din diferii glicozizi. Dup natura substratelor atacate glicozidazele se pot clasifica n: oligozidaze, cele care catalizeaz hidroliza oligozaharidelor i glicozizilor i poliozidaze care hidrolizeaz polizaharidele (amidon, celuloz, glicogen, substane pectice etc.). Glicozidazele prezint specificitate n funcie de tipul de oz legat glicozidic (glucozidaza, galactozidaza), de natura acestei legturi (,), de stereoizometrie (D- sau L-glicozizi). a) Oligozidaze Oligozidazele posed o specificitate redus de grup cataliznd hidroliza unui numr mare de substrate nrudite ntre ele prin natura restului glicozil i prin felul legturii glicozidice. Specificitatea acestor enzime este determinat de natura inelului componentei glicozil (piranozic sau furanozic), de configuraia steric a atomilor de hidrogen i a grupelor OH din inel, de natura legturii glicozidice ( sau ). --glucozidaza se mai numete i maltaz i este enzima care scindeaz legtura - glicozidic din molecula de maltoz:
CH2OH O H H HO OH H H OH CH2OH O H OH H CH2OH H + H2O -H2O O H H OH OH

H H HO OH H

O maltoz

H OH OH

Este rspndit n natur. Se gsete n organismele animale (intestinul subire), la plante, mucegaiuri, drojdii, bacterii. Maltaza din intestin, activ la un pH=6,5, particip la digestie. Cantiti deosebit de mari de maltaz se gsesc n seminele de cereale germinate aa cum este malul obinut prin germinarea orzului i care se utilizeaz pentru fabricarea mustului de bere. Maltaz activ se gsete i n fina de gru. In timpul fermentrii aluatului, ea transform maltoza finii n glucoza necesar ntreinerii procesului fermantativ. Preparatele enzimatice de maltaz obinute prin biosintez cu ajutorul microorganismelor pot fi utilizate n industria alimentar n tehnologiile de obinere a glucozei din amidon n combinaie cu preparate de amilaz. --fructofuranozidaza se mai numete zaharaz i este enzima care

224

Enzime scindeaz hidrolitic legtura -glicozidic din molecula de zaharoz cu formare de - fructoz i glucoz:
CH2OH O H H HO OH H H OH O H OH CH2OH O H H H HO OH H H OH OH O HO H

H
(1)

HOH2C O
(2)

H HO CH2OH H

+H2O

HOH2C

H CH2OH

HO H OH

zaharoz

-glucoz

-fructoz

Deoarece prin aceast hidroliz rezult zahr invertit, enzima se mai numete i invertaz. -fructofuranozidaza (2) rupe legtura care se gsete la atomul de carbon -glicozidic al restului de fructoz, n timp ce, legtura de la atomul de carbon -glicozidic al restului de glucoz este descompus de o -glucozidaz (1). Deoarece i n rafinoz exist o legtur -glicozidic ntre glucoz i fructoz ca i n zaharoz, este de subneles c invertaza hidrolizeaz i rafinoza. n urma acestei aciuni, din rafinoz rezult o molecul de fructoz i una a dizaharidului melibioza. -fructofuranozidaza se gsete n plante, microorganisme i n sucurile digestive ale animalelor. Deosebit de activ este zaharaza din drojdii, din care de regul se obin preparate mai puin purificate, active i stabile n timp destinate scopurilor industriale. Astfel, preparatele de invertaz se utilizeaz la fabricarea produselor zaharoase de tipul bomboanelor cu miez moale mbrcate n ciocolat. Invertaza se omogenizeaz n siropul de zahr i n timpul depozitrii produselor la rece, enzima produce hidroliza zaharozei n mod lent, determinnd formarea unei creme moale localizat n interiorul miezului. Preparatele de invertaz se folosesc i pentru obinerea zahrului invertit destinat fabricrii buturilor nealcolice, ngheatei, lichiorurilor. --glucozidaza este enzima care descompune legtura -glucozidic din dizaharide, precum i din -glucozizi. Viteza de descompunere a diferitelor substraturi ale -glucozidazei depinde de structura moleculei de glucozid ce conine -glucoz. O influen deosebit asupra acestei viteze o au, de asemenea, proprietile prii proteice a enzimei. Cele mai bune substrate pentru aceast enzim sunt celobioza i geniobioza, precum i glicozizii amigdalina, arbutina, glucovanilina. -glucozidaza se poate obine sub form de preparate pure din mucegaiuri, fructe de migdal, unele bacterii. Preparatele enzimatice -glucozidazice prezint importan practic

225

Biochimia produselor alimentare pentru mrirea randamentelor de hidroliz a celulozelor precum i pentru hidroliza unor glicozizi din diferite materii prime alimentare. --galactozidaza sau lactaza este enzima care catalizeaz hidroliza galactozidelor de tipul lactozei punnd n libertate -galactoz:
CH2OH HO H H OH H O O H OH H OH H CH2OH H H O OH H H OH + H2O CH2OH HO H H OH H O CH2OH OH O OH H H OH

H H OH

H HO

H OH H

-lactoz

-galactoz

-glucoz

-galactozidazele sunt produse de unele plante, microorganisme i de mucoasa intestinal a animalelor. Preparatele enzimatice de lactaz, obinute cu ajutorul unor microorganisme productoare de aceast enzim se pot folosi la fabricarea unor produse lactate. Hidroliza lactozei din diverse produse determin o intensificare a gradului de dulce deoarece lactoza are o putere de ndulcire i solubilitate relativ sczut, n timp ce componenii ei sunt mai dulci. Mai mult, aceast hidroliz face posibil consumarea laptelui i de ctre persoanele cu intoleran la lactoz. Totodat, ngheata fabricat cu lapte smntnit tratat cu -galatozidaz este hipocaloric posednd i caliti senzoriale superioare. Efectul hipocaloric se explic prin adaosul mai sczut de zaharoz datorit puterii de ndulcire mai ridicate a hidrolizatului de lactoz. --galactozidaza este o enzim care catalizaeaz reacia de descompunere a -galactozidelor, de exemplu a rafinozei i melibiozei. Prin aciunea -galactozidazei asupra rafinozei are loc hidroliza legturii dintre -galactoz i zaharoz. -galactozidaza se gsete n drojdia de bere i n unele mucegaiuri. Preparatele enzimatice cu aceast enzim au evidente posibiliti de utilizare n industria zahrului deoarece realizeaz o mbuntire a condiiilor de cristalizare a zaharozei i o cretere a randamentului n zahr ca urmare a hidrolizei rafinozei. De asemenea, preparatele de -galactozidaz se pot folosi pentru hidroliza rafinozei i stahiozei din seminele de leguminoase n scopul eliminrii factorilor de flatulen din aceste produse. b) Poliozidaze Poliozidazele sunt enzimele care catalizeaz scindarea hidrolitic a polizaharidelor. Prezint o specificitate marcant n raport cu tipul legturii a crei scindare o realizeaz. - Amilaze. Printre poliozidaze, cea mai mare importan o au amilazele enzimele sub aciunea crora are loc hidroliza amidonului i a

226

Enzime glicogenului. Cele mai active amilaze se gsesc n saliv i n sucul pancreatic al omului i animalelor, n mucegaiuri, n cerealele ncolite. Amilazele hidrolizeaz att amidonul nemodificat ct i pe cel gelifiat. Viteza de descompunere a amidonului de diferite proveniene de ctre amilaze este diferit. Aceast comportare diferit a amidonului la aciunea amilazelor poart denumirea de atacabilitate. n felul acesta viteza de descompunere a amidonului sub aciunea amilazelor depinde nu numai de cantitatea i activitatea enzimelor, ci i de atacabilitatea substratului. Susceptibilitatea amidonului la atacul amilazelor se mrete cu micorarea dimensiunilor granulelor de amidon, sau astfel vorbind, cu creterea suprafeei lor relative. Atacul amidonului de ctre amilaze se intensific rapid, de asemenea, n cazul distrugerii mecanice a structurii granulelor de amidon (ex. mcinarea cerealelor). Totui, aciunea amilazelor asupra granulelor de amidon nemodificat sau chiar degradat mecanic este ntotdeauna mai slab n comparaie cu aciunea lor asupra amidonului gelatinizat. De aceea, ntr-o serie de sectoare ale industriei alimentare, de exemplu n industria spirtului, hidroliza amidonului cu ajutorul unor surse de amilaze are loc numai dup fierberea finii sau a cartofilor mrunii. La ora actual este stabilit existena a trei tipuri de amilaze: -amilaza, -amilaza i glucoamilaza (sau amiloglucozidaza); acestea se deosebesc ntre ele prin proprietile lor, distribuia n natur i capacitatea de aciune asupra amidonului.

-Amilaza se gsete n saliv i sucul intestinal, elaborat de pancreas; are rol important n procesul de digestie unde intervine n transformarea amidonului macromolecular, n compui mai simpli. Acest tip de amilaz se mai gsete n mucegaiuri i boabe germinate de gru, orz, ovz. -Amilaza se gsete numai n vegetale i microorganisme.
Aceste dou enzime se deosebesc sensibil sub aspectul aciunii lor asupra celor dou componente ale amidonului amilaza i amilopectina, dar ambele atac numai legturile (14) -glicozidice din moleculele acestora. Astfel, -amilaza hidrolizeaz, la ntmplare, legaturile glicozidice din interiorul moleculelor de amiloza sau amilopectin genernd dextrine cu mas molecular mic i o cantitate mic de maltoz i izomaltoz In schimb, -amilaza descompune succesiv numai legturile glicozidice penultime ale moleculelor de amiloz sau amilopectim. Ca urmare, amiloza este complet (100%) transformat n maltoz. Dac substratul amilazei este ns amilopectina, atunci se formeaz maltoz i dextrine care dau o coloraie brun rocat cu iodul(dextrine limit). -Amilaza descompune, cu formarea de maltoz, numai capetele libere ale

227

Biochimia produselor alimentare lanurilor glicozidice; aciunea ei nceteaz cnd ajunge la ramificaii. De aceea, -amilaza descompune amilopectina cu formarea maltozei numai n proporie de 54%. Dextrinele care se formeaz sub aciunea -amilazei asupra amilopectinei, sunt hidrolizate de -amilaz cu formarea unor dextrine care au o mas molecular mai mic i nu mai dau coloraie cu iodul.
-amilaz

.
-amilaz

. .

.
Amiloza

100% hidroliz

. .

. .

. .

. .

.
Amilopectin

R . 54% hidroliz . .

n felul acesta, prin aciunea -amilazei asupra amidonului se formeaz n cea mai mare parte maltoza i o mic cantitate de dextrine cu mas molecular mare. Nici -, nici -amilaza separat nu pot hidroliza deplin amidonul cu formarea maltozei. Aciunea iniial a -amilazei care genereaz dextrine, faciliteaz formarea maltozei de ctre -amilaz. Prin aciunea simultan a ambelor amilaze amidonul este hidrolizat la maltoz n proporie de 95%. - i - Amilaza se deosebesc i sub aspectul comportrii fa de reacia mediului: -amilaza este cu mult mai sensibil la acizi. pH-ul optim al amilazei din mal este 5,5-5,7, iar al -amilazei 4,3-4,5. De asemenea, pH-ul optim al amilazelor variaz i cu originea lor: -amilaza din saliv are pH-ul optim 6,9. Cele dou tipuri de amilaze se deosebesc, de asemenea, din punct de vedere al termostabilitii i temperaturii optime de aciune. -Amilaza este mult mai stabil la aciunea temperaturilor ridicate; temperatura ei optim este ceva mai sus (65-66C), dect a -amilazei (50-52C). Este foarte interesant faptul c seminele plantelor se deosebesc ntre ele sub aspectul coninutului lor de - i - amilaze. n seminele negerminate de gru, orz, ovz exist numai -amilaz; -amilaza se formeaz numai prin germinare. n seminele de leguminoase, att negerminate ct i germinate exist numai -amilaz. n seminele negerminate de sorg exist o mare cantitate de -amilaz. Amilazele au o mare importan n unele ramuri ale industriei alimentare: panificaie, hidrolizate de amidon, bere, spirt. Fermentarea aluatului i acumularea n el a dioxidului de carbon care-l afneaz i confer pinii porozitate i volum, depind de coninutul de zaharuri fermentescibile. La rndul lor, acestea depind nu numai de

228

Enzime cantitatea de zaharuri existente n fin, ci i de viteza de acumulare a maltozei sub aciunea amilazelor asupra amidonului. Pe de alt parte, ca urmare a unei aciuni intense a -amilazei care se gsete n cantiti mari n fina din grul ncolit, se produce acumularea n exces a dextrinelor n aluat, acesta are o elasticitate proast i sunt afectate calitile pinii: porozitatea, aspectul, gustul. Malul utilizat pentru fabricarea berii i pentru zaharificarea plmezilor de cereale sau cartofi n industria spirtului constituie surse de amilaze foarte active care determin transformarea amidonului n zahr fermentescibil maltoza. Preparate enzimatice amilolitice deosebit de active se pot obine i din diferite microorganisme, n special din mucegaiuri. Ele se folosesc cu succes n industria berii, spirtului, n panificaie sau n industria hidrolizatelor de amidon. Cu ajutorul preparatelor de -amilaz bacterian se realizeaz dextrinizarea amidonului din cereale sau cartofi, obinndu-se maltodextrine. Acestea se utilizeaz ca ingredient la fabricarea produselor dietetice i pentru copii deoarece sunt foarte asimilabile, precum i n industria produselor zaharoase pentru prepararea cremelor, pudingurilor etc. -Amilaza fungic este folosit pentru mrirea gradului de fermentare a berii, dextrinele fiind hidrolizate la maltoz care este apoi fermentat de drojdii.

Amiloglucozidaza sau glucoamilaza este o enzim care hidrolizeaz amidonul cu formarea preponderent a glucozei i a unei mici cantiti de dextrine. Preparatele de glucoamilaz se obin din mucegaiuri. Deoarece aceast enzim hidrolizeaz amidonul pn la glucoz, cu ajutorul preparatelor de glucoamilaz se obin industrial siropul de glucoz i glucoza cristalin. Pentru fabricarea berii hipoglucidice se ntrebuineaz glucoamilaza care hidrolizeaz dextrinele la glucoz ce este apoi fermentat de drojdii.
--1,6-glucozidaza este enzima care catalizeaz hidroliza legturilor 1,6-glucozidice din amilopectin intensificnd aciunea -amilazei. Preparatele care conin aceste dou enzime permit o hidroliz mai rapid a amidonului pentru obinerea hidrolizatelor bogate n maltoz. - Celulaze. Aceaste enzime realizeaz descompunerea hidrolitic a celulozei cu formarea celobiozei. Este un complex format din dou enzime endoglucanaza i exoglucanaza. Celulazele sunt prezente n cerealele germinate, n unele bacterii i mucegaiuri.O cantitate mare de celulaz activ produc, de asemenea, bacteriile din stomacul ierbivorelor. Preparatele enzimatice celulolitice pot fi utilizate pentru descompunerea hidrolitic a celulozei din diverse surse pn la glucoz care prin procedee microbiologice este transformat n biomas bogat n proteine sau alcool etilic carburant.

229

Biochimia produselor alimentare - Hemicelulaze. Sub aceast denumire sunt reunite enzimele care catalizeaz hidroliza diferitelor hemiceluloze. Se gsesc n seminele germinate i n mucegaiuri. - Inulinaze. Aceste enzime se mai numesc i inulaze. Au fost identificate n plantele care acumuleaz cantiti mari de inulin (napi, cicoare), precum i n mucegaiuri. Sub aciunea inulinazei, inulina se hidrolizeaz cu formarea fructozei. Pe aceast cale se pot valorifica materiile prime bogate n inulin ca surse alternative de obinere a unui ndulcitor (siropul de fructoz) pentru diverse ramuri ale industriei alimentare, ndeosebi pentru realizarea produselor dietetice. - Protopectinaza i poligalacturonaza. Substanele pectice se descompun sub aciunea a dou tipuri de enzime. Descompunerea protopectinei are loc sub aciunea enzimei protopectinaza care hidrolizeaz legtura dintre acidul poligalacturonic metoxilat, arabanii i galactanii legai de el. Ca rezultat se formeaz acid poligalacturonic metoxilat liber (pectina solubil), care la rndul su se hidrolizeaz sub aciunea enzimei pectinesteraza (sau pectaza) care aparine grupei esteraze. Se formeaz acid poligalacturonic i alcool metilic. Enzima poligalacturonaza, care uneori se mai numete i pectinaza, catalizeaz hidroliza legturilor glicozidice existente n substanele pectice ntre resturile de acid galacturonic care nu conin grupri metoxil. Aciunea enzimelor care catalizeaz hidroliza substanelor pectice poate fi reprezentat schematic astfel:

Araban

Acid poligalacturonic metoxilat

Galactan

Actiunea protopectinazei
Actiunea pectinmetil esterazei
COOH O
H

O H H OH O
H

H OH H

COOCH3 O H H OH OH H O
H

COOCH3 O H H OH O
H

COOH H OH H

O H H OH O
H

COOH H OH H

O H H OH O

OH H

poligalacturonaza nu actioneaz

actiunea poligalacturonazei

Spre deosebire de pectinmetilesteraz, care este prezent att n plante ct i n diferite microorganisme, poligalacturonaza se gsete n special n bacterii i mucegaiuri; n plante ea se ntlnete rar. Preparatele enzimatice pectolitice se obin de regul din diverse mucegaiuri. Ele se utilizeaz n industria alimentar pentru limpezirea sucurilor de fructe i pentru mrirea randamentului lor, precum i pentru limpezirea

230

Enzime sucurilor de struguri i bace, n care de regul exist o cantitate mare de pectin solubil ce ngreuneaz filtrarea i constituie o cauz a tulburelii vinului. Aceste preparate transform soluiile coloidale care menin n suspensie i alte impuriti, n soluii adevrate, iar impuritile se depun. Prin aciunea enzimelor pectolitice existente n esuturile vegetale se explic i nmuierea fructelor n timpul coacerii sau depozitrii lor n stare proaspt. Astfel, pe msur ce fructele se coc protopectina insolubil se transform, sub aciunea protopectinazei, n pectin solubil iar esutul devine moale i suculent. - Alte glicozidaze. n saliv, lapte proaspt muls, lacrimi i albuul de ou este prezent o enzim care se numete lizozim i care catalizeaz hidroliza legturilor glicozidice dintre unitile de aminozaharuri din mucopolizaharide. Aceast enzim hidrolizeaz pereii celulari ai bacteriilor i confer astfel mediilor n care se gsete aciune bactericid. n bacterii, veninul de albine i de arpe, n tumorile canceroase i n alte esuturi se gsete hialuronidaza, o enzim care hidrolizeaz acidul hialuronic cu formarea acidului glucuronic i a acetilglucozaminei. 7.9.3.3. Proteaze Proteazele sau enzimele proteolitice sunt enzimele care catalizeaz scindarea legturilor CO-NH- peptidice din moleculele proteinelor i ale produilor lor de degradare, polipeptide i oligopeptide pn la aminoacizi, cu fixarea componentelor apei. n funcie de poziia intern sau terminal a legturii peptidice scindate, proteazele se mpart n exopeptidaze i endopeptidaze. a) Exopeptidaze. Sunt proteazele care atac numai legturile peptidice terminale, situate la capetele lanului polipeptidic, adiacent gruprilor amino- i -carboxil terminale. Aceste enzime acioneaz n general asupra produilor de hidroluiz rezultai prin aciunea endopeptidazelor sau chiar asupra proteinelor nc neatacate; au ca produi de hidroliz, de regul, aminoacizii. n funcie de modul de aciune se mpart n: - Aminopeptidaze proteazele care scindeaz legtura peptidic adiacent unui aminoacid terminal ce are grupare aminic liber, elibernd acest aminoacid:

H2N CH CO R1

NH

CH CO R2

HOH

H2N CH COOH + H2N R1

CH CO R2

231

Biochimia produselor alimentare Produii de hidroliz sunt aminoacizi i oligopeptide. Foarte larg rspndit este leucinaminopeptidaza care hidrolizeaz cu o mare vitez compuii leucinei, dar i o serie de peptide care conin ali aminoacizi Nterminali. Enzima conine zinc. Aminopeptidaze se gsesc n drojdii, n mucoasa intestinal, bacterii i mucegaiuri. - Carboxipeptidaze - enzime care scindeaz n polipeptide legtura peptidic ce se gsete lng o grupare carboxil liber:

CH CO NH CH COOH HOH R2 R1

CH COOH + H2N R2

CH COOH R1

Carboxipeptidaza se gsete n intestinul subire i se utilizeaz pe larg n chimia proteinelor pentru determinarea aminoacizilor C-terminali. Constituie de fapt o metaloenzim ce conine zinc. Produii de hidroliz rezultai prin aciunea carboxipeptidazelor sunt tot oligopeptide i aminoacizi. - Dipeptidaze - catalizeaz scindarea hidrolitic a dipeptidelor n aminoacizi liberi. Astfel, de exemplu glicilglicildipeptidaza hidrolizeaz glicilglicina n dou molecule de glicocol:

NH2 CH2 CO COOH NH CH2 + HOH 2 CH2 NH2 COOH

Se gsete n plante, animale i microorganisme. Sunt prezente n mucoasa intestinal, rinichi, drojdii, mucegaiuri, mal. Prezint specificitate n funcie de aminoacizii constitueni ai substratului i necesit pentru activitatea catalitic diferii ioni metalici. b) Endopeptidaze. Sunt proteazele care hidrolizeaz legturile peptidice din moleculele de proteine. Ca urmare a aciunii lor, proteinele se transform n peptone, polipeptide i aminoacizi liberi. Multe endopeptidaze sunt capabile s produc coagularea laptelui. Se mai numesc i proteinaze. n funcie de gruprile centrului activ, se disting 4 subsubclase de endopeptidaze: - proteinaze serinice al cror centru activ conine un rest de serin; enzimele reprezentative sunt subtilaza, tripsina, elastaza; - proteinaze tiolice (SH- dependente) a cror activitate depinde de prezena n centrul activ a unor grupri SH libere. Sunt reprezentate de papain, ficin, bromelin. - proteinaze acide, au n centrul catalitic grupri carboxilice ionizate, fiind

232

Enzime active n domeniu de pH acid. Acestei subsubclase i aparin enzimele renina, pepsina; - metalproteinaze, sunt activate de ionii metalici legai de centrul activ al enzimei (Ca2+, Zn2+, Mg2+, Fe2+). Sunt reprezentate de colagenaz. Caracteristicile endopeptidazelor mai importante sunt urmtoarele: - Pepsina este enzima proteolitic care hidrolizeaz legturile peptidice n care sunt implicai aminoacizii aromatici; este secretat de celulele glandelor fundice ale stomacului sub form inactiv de pepsinogen. Acidul clorhidric activeaz pepsinogenul punnd n libertate pepsina activ i un polipeptid. Aceeai aciune o are nsi pepsina printr-un efect autocatalitic:

Pepsina are un pH optim de 1,5 2,5 care variaz dup natura substratului. Pepsinogenul i pepsina au acelai aminoacid terminal, alanina. Pepsina desface legturile peptidice formate ntre gruparea aminic a tirozinei i gruparea COOH a unui aminoacid monoaminodicarboxilic (acid aspartic, acid glutamic). Scindeaz o mare varietate de proteine, iniiind astfel procesul de digestie a acestora. Produsele rezultate din hidroliza substanelor proteice sub aciunea pepsinei sunt albumoze i peptone cu greutate molecular relativ mare, dar solubile n ap. Aceast endopeptidaz posed i o anumit activitate de coagulare a laptelui. Pepsina cristalizat este o protein; posed nsuirile de solubilitate ale globulinelor. Industrial se obine un preparat enzimatic de pepsin prin macerarea stomacului de porcine cu acid clorhidric 0,5%. Soluia obinut se poate purifica prin dializ i apoi este concentrat n vid. Se utilizeaz pentru coagularea laptelui n industria brnzeturilor. - Tripsina este o enzim proteolitic care acioneaz n zona pH-urilor alcaline, pH-ul optim fiind de 8-9. Ea acioneaz hidrolitic asupra compuilor rezultai n urma aciunii pepsinei i formeaz diferite polipeptide i peptide. Scindeaz preferenial legturile peptidice la care particip arginina sau lizina. Tripsina este secretat de pancreas sub form de precursor inactiv denumit tripsinogen. Activarea tripsinogenului se face n intestin sub aciunea autocatalitic a tripsinei precum i a enterokinazei secretat de mucoasa intestinal. Trecerea proenzimei la forma activ este accelerat de ionii de Ca2+ i H+ i const n desprinderea unui hexapeptid:

pepsinogen

HCl

pepsina + polipeptid

Tripsinogen

enterokinaza

Tripsina + hexapeptid

233

Biochimia produselor alimentare - Renina (Chimozina sau labfermentul) este o endopeptidaz secretat de stomacul animalelor tinere, acioneaz la pH=4,0 i are proprietatea de a coagula laptele, transformnd cazeina solubil n cazeinat de calciu insolubil. Pentru mrirea activitii sale n coagularea laptelui sunt necesari ionii de Ca2+. Coagulul format este apoi digerat de ctre pepsin. n felul acesta este prevenit trecerea rapid a laptelui prin stomac i se favorizeaz staionarea proteinelor sale precipitate pentru a putea fi digerate. Preparatele de renin, comercializate sub form de cheag sunt obinute prin macerarea stomacului animalelor tinere i sunt utilizate industrial pentru fabricarea brnzeturilor. - Chimotripsina este o proteinaz secretat de pancreas sub form de proenzim denumit chimotripsinogen. Sub aciunea urmelor de tripsin, acesta se transform complet n proteinaza activ chimotripsina. Chimotripsinogenul nu este activat de enterokinaz i chimotripsin. n felul acesta, proteinazele secretate de pancreas rmn inactive pn cnd ajung n curentul intestinului subire i vin n contact cu enterokinaza. Aceasta activeaz tripsinogenul la tripsin, care la rndul su activeaz tripsinogenul i chimotripsinogenul. Activarea zimogenului i transformarea sa n forma activ a enzimei necesit cantiti foarte mici de activatori. Astfel, de exemplu, activarea chimotripsinogenului cristalin are loc deja n prezena a 0,001 mg tripsin. Chimotripsina scindeaz hidrolitic proteine native i denaturate, albumoze, peptone, acionnd asupra legturilor peptidice stabilite ntre un aminoacid aromatic i unul alifatic. Produii si de hidroliz sunt polipeptide i peptide. Are un pH optim de 8,0-9,0. - Catepsine. Sunt proteinaze existente n esuturile animale, localizate intracelular la nivelul lizozomilor. Ele particip la procesele de autoliz i autodegradare a esuturilor. Acioneaz la un pH=4-5. Activitatea lor este deosebit de intens dup moartea animalelor, cnd esuturile devin acide i se creeaz condiii de aciune. - Papaine. Sunt endopeptidaze ce se gsesc n esuturile vegetalelor i n drojdii. Acioneaz asupra proteinelor native, asupra peptidelor i polipetidelor i au o aciune larg nespecific, elibernd aminoacizi. Papainele sunt deci enzime cu aciune complex care nu au corespondeni n organismele animale. Domeniul optim de aciune al acestor enzime este slab acid, neutru sau slab alcalin, n funcie de natura substratului. Astfel, aciunea papainei asupra albuului denaturat termic are loc la pH=7,5, iar asupra gelatinei la pH=5,0. Aceste deosebiri se datoreaz proprietilor substratului utilizat. De aceea, pentru a se obine cea mai bun imagine asupra proprietilor i condiiilor de aciune ale unei anumite proteinaze vegetale este necesar

234

Enzime ca ea s fie studiat pe substratul specific, existent n planta respectiv. Molecula de papain conine trei puni disulfidice i o grupare SH care intr n centrul su activ. Acesta mai include i un rest de histidin. Cea mai caracteristic particularitate a papainei, ca i a altor enzime proteolitice de origine vegetal const n faptul c este activat de acidul cianhidric i compuii ce conin grupri SH. Printre acetia trebuie, nainte de toate, menionai cisteina i glutationul redus. Pornind de la faptul c activarea papainei se realizeaz cu reductori, se consider c n papain exist un sistem reversibil, care este alctuit din enzim oxidat i enzim redus: Pa - S - S - Pa
+2H+ -2H+

Pa - SH + HS - Pa

Forma activ a papainei este tocmai cea redus. Ca urmare, oxidarea papainei conduce la diminuarea sau deplina inhibare a activitii hidrolitice. n seminele plantelor, papainazele au o aciune foarte redus datorit cantitii mici de ap. Prin umectarea cerealelor, leguminoasele uscate sau prin umectarea finurilor i crupelor obinute din acestea, papainazele i amplific activitatea i descompun proteinele existente n mediu. Astfel de fenomene au loc la umectarea bobului de orz n fabricile de mal, a bobului de gru n timpul condiionrii i odihnei sale nainte de mcinare, sau n aluatul destinat fabricrii pinii. Foarte intens este aciunea papainazelor n seminele germinate, eliberndu-se aminoacizii necesari dezvoltrii plantulei. Paralel, crete i coninutul n glutation al embrionului, care activeaz procesele de hidroliz a proteinelor. n fructele de ananas se gsete o proteinaz care se numete bromelin. Aceast enzim este activat de compuii sulfhidrilici, iar pH-ul optim este 6,0-7,0. O proteinaz de tipul papainei activat de reductori se gsete i n latexul de smochin precum i n alte plante ce aparin familiei Ficus. Se numete ficin, pH-ul su optim este 7,0 i hidrolizeaz legturile peptidice dintre tirozin i fenilalanin. Enzimele proteolitice particip la transformrile biochimice pe care le sufer compuii de natur proteic n timpul maturrii unor produse alimentare (brnzeturi, preparate din carne, preparate din pete, etc.) contribuind la formarea unor caliti senzoriale (gust, arom, textur, etc.) specifice acestor alimente. Preparatele enzimatice proteazice obinute din materii prime de origine animal, vegetal, sau din microorganisme sunt utilizate n diferite domenii ale industriei alimentare n scopul diversificrii produselor sau mbuntirii calitilor lor. Astfel, n prezent se produc pe scar industrial cheaguri microbiene, care sunt utilizate pentru coagularea laptelui n industria brnzeturilor. Pentru

235

Biochimia produselor alimentare fabricarea supelor pulbere sau a unor adjuvani de arom, se utilizeaz hidrolizate proteice obinute din diverse materii prime vegetale sau de origine animal. Preparatele enzimatice proteolitice se pot folosi i pentru mbuntirea frgezimii crnii de vit sau pentru fabricarea membranelor comestibile din piei de animale. O importan deosebit o au preparatele enzimatice proteolitice pentru mbuntirea calitilor senzoriale sau nutriionale ale proteinelor din unele materii prime, prin reacia de plasteinizare. Plasteinizarea const n resinteza legturilor peptidice dintr-un hidrolizat proteic, dup efectuarea unor modificri dorite n compoziia sa. Prin aceast reacie se pot introduce unii aminoacizi deficitari ai unor proteine (lizin n gluten, lizin i triptofan n zein, metionin n proteinele din soia) realizndu-se o mbuntire a calitilor nutriionale ale proteinelor respective. De asemenea, se poate diminua coninutul proteinelor n anumii aminoacizi fenilalanina de exemplu n scopul obinerii unor produse destinate alimentaiei copiilor cu insuficien genetic fenil-cetonurinic. Tot prin plasteinizare se pot elimina gustul amar al unor hidrolizate sau se pot ndeprta substanele cu miros neplcut din unele proteine (din leguminoase, pete). 7.9.3.4. Amidaze Sub denumirea de amidaze sunt grupate enzimele care catalizeaz hidroliza unor legturi C-N, altele dect cele peptidice. Aparin acestei subclase enzime ca ureaza, asparaginaza, glutaminaza, arginaza i nucleozidazele. - Ureaza scindeaz hidrolitic legturile amidice din uree cu producere de NH3 i CO2:

NH2 O + H2O NH2

2 NH3 + CO2

Ureaza are specificitate absolut. Se gsete n plante, mucegaiuri i unele bacterii. O cantitate deosebit de mare de ureaz conin seminele de soia. Printr-o ureaz foarte activ se disting bacteriile care descompun ureea (urobacterii) i particip astfel la circuitul azotului n natur. - Asparaginaza i glutaminaza sunt enzimele care catalizeaz hidroliza asparaginei i glutaminei n acid aspartic, respectiv acid glutamic i amoniac.

236

Enzime Aceste hidrolaze se gsesc n esuturile animalelor, n mucegaiuri, n drojdii, n bacterii i plante. Zona optim de aciune a asparaginazei i glutaminazei este n jur de pH=8,0. Asparaginaza i glutaminaza au un rol important n metabolismul azotului la plante deoarece catalizeaz transformarea amidelor aminoacizilor dicarboxilici care se acumuleaz n cantiti mari n plante i care constituie produi intermediari de metabolism. - Arginaza este enzima care catalizeaz descompunerea hidrolitic a Largininei n ornitin i uree:
NH H2N C NH CH2 3 arginina CH COOH NH2
+H2O

NH2 O + H2N CH2 3 NH2 uree

CH COOH

NH2 ornitin

D-arginina nu este descompus de arginaz. Aceast enzim se gsete n ficatul mamiferelor; lipsete din ficatul psrilor dar se gsete n alte organe ale acestora. Arginaza face parte din sistemul enzimatic care catalizeaz ciclul ornitinei. Amoniacul toxic pentru celule, rezultat din catabolismul proteinelor i al purinelor se elimin din unele organisme sub form de uree prin ciclul ornitinei. Zona optim de pH pentru activitatea arginazei este n domeniu alcalin (pH=10). Deoarece enzima este activat de sruri de mangan se consider c ea reprezint n sine o protein ce conine un mangan. - Nucleozidaze. sunt enzime care catalizeaz hidroliza legturii C-N din nucleozide, formnd ca produi de reacie o baz azotat i o pentoz:
NH2 N N N H N
O

NH2 CH2OH H H OH H2O N N N H N

H OH

H HO H OH

CH2OH H H OH

Nucleozid

Baz azotat

Pentoz

Se gsesc la plante, animale i microorganisme i acioneaz la un pH de 7-8. 7.9.3.5. Polifosfataze Sunt enzime care catalizeaz scindarea radicalilor fosfat, dar legturile stabilite de aceti radicali n moleculele compuilor respectiv nu sunt de tip esteric, ci legturi de tip -P-O-P-.

237

Biochimia produselor alimentare Enzimele din aceast subclas sunt deosebit de importante datorit substraturilor asupra crora acioneaz: ATP, ADP, NAD+, FAD. Ele au un rol important n schimburile energetice ale celulei. Astfel: - ATP-aza sau ATP-fosfohidrolaza catalizeaz scindarea hidrolitic a legturii fosfat terminal, puternic energetic, din molecula de ATP: ADP + H3PO4 ATP + H2O - Apiraza sau ATP-difosfohidrolaza catalizeaz eliberarea a dou molecule de acid fosforic din ATP: AMP + 2 H3PO 4 ATP + H2O

7.9.4. Liaze
Liazele reprezint clasa de enzime care catalizeaz reacii de descompunere nehidrolitic a compuilor organici prin scindarea legturilor C-C, C-N, C-O etc. Ca urmare a aciunii acestor enzime frecvent apar duble legturi n molecula substratului i se formeaz compui simpli CO2, H2O, NH3 etc. Unele din aceste reacii sunt reversibile i enzimele corespunztoare catalizeaz nu numai descompunere, ci i sintez. Denumirea sistematic a acestor enzime se face adugnd la numele substratului terminal termenul liaza. n cazul unor denumiri curente se admit denumirile decarboxilaz, aldolaz, dehidrataz, etc. 7.9.4.1. Carbon - carbon liaze (C-C-liaze) Reprezint una din cele mai importante subclase de liaze i printre ele, de un interes deosebit sunt: - Decarboxilazele care catalizeaz reaciile de decarboxilare a cetoacizilor dup urmtoarea schem:

CH3 C

COOH

piruvatdecarboxilaza

CH3 CHO + CO2 aldehida acetica

Exist i decarboxilaze care au drept substrat aminoacizii pe care-i transform n aminele corespunztoare:

O acid piruvic

R CH NH2 aminoaciddecarboxilaza
Astfel, de

COOH

R CH2 NH2 + CO2 amina

238

Enzime exemplu, prin decarboxilarea lizinei sub aciunea lizindecarboxilazei se formeaz cadaverina, a ornitinei, de ctre ornitindecarboxilaz putresceina etc. Decarboxilaze ale aminoacizilor se gsesc n plante, animale i microorganisme. n cantiti deosebit de mari sunt n bacteriile care produc degradarea substanelor proteice conducnd la acumularea de amine biogene. Decarboxilazele sunt enzime a cror grupare prostetic (cofactorul) este reprezentat de esterii fosforici ai vitaminelor hidrosolubile: tiaminpirofosfatul (TPP) pentru decarboxilazele -cetoacizilor i piridoxalfosfatul (pirid-CHO) pentru cele ale aminoacizilor. - Aldehidliaza sau aldolaza este un reprezentant caracteristic al C-Cliazelor i reprezint enzima care catalizeaz reacia reversibil de descompunere a fructozodifosfatului pn la fosfotrioze:
CH2 O PO3H2 C O HO C H H C OH H C OH CH2 O PO3H2 fructozo - 1,6-difosfat
aldolaza

CH2 O PO3H2 C O CH2OH

CHO + H C OH CH2 O PO3H2

dioxoaceton1-fosfat

gliceraldehid 3-fosfat

Aldolaza joac un rol deosebit n procesele de respiraie, fotosintez i fermentaie alcoolic. Este o enzim strict specific i acioneaz la toate organismele n metabolismul glucidelor.

7.9.4.2. Carbon-oxigen liaze (C-O-liaze) Enzimele din aceast subclas catalizeaz reacia de scindare a legturii C-O conducnd la formarea unor produi nesaturai. n aceast categorie sunt incluse hidroliazele care accelereaz reacia de hidratare i deshidratare a compuilor organici. Mai importante sunt: - Carbonat hidroliaza sau carbonic anhidraza care reversibil de descompunere a acidului carbonic: catalizeaz reacia

H2CO3

H2O + CO2

239

Biochimia produselor alimentare Aceast enzim se gsete n hematii, mucoasa gastric, rinichi, sistemul nervos central. Conine Zn2+ n molecul. Carbonic anhidraza din mucoasa gastric asigur formarea H2CO3 care furnizeaz ionii de hidrogen (H+) necesari sintezei HCl din stomac i anionii HCO3 ce trec n plasm i particip la meninerea pH-ului sanguin. - Fumarat hidroliaza sau fumaraza catalizeaz reacia reversibil de adiie a apei la dubla legtur din acidul fumaric cu formare de acid L-malic:
COOH HC COOH HOOC CH acid fumaric + H2O
fumaraza

CH2 HO C H COOH acid L-malic

Fumarat hidroliaza este o enzim foarte rspndit n esuturile animale, ale plantelor i microorganismelor; face parte din sistemul enzimatic care intervine n ciclul acidului citric i este absolut specific deoarece alte substrate nrudite nu sunt atacate. - Fosfopiruvathidroliaza sau enolaza catalizeaz reacia reversibil, deosebit de important a glicolizei, de transformare a acidului 2fosfogliceric n acid 2-fosfoenolpiruvic, prin care se obine o legtur macroergic:

CH2 OH CH O PO3H2 COOH enolaza

CH2 C O~ PO3H2 COOH + H2O

acid 2-fosfoenolpiruvic Enolazele acid 2-fosfogliceric sunt foarte rspndite; se gsesc n toate organismele la care degradarea zaharurilor se face prin glicoliz. Sunt nite metalenzime care conin Mg2+, Mn2+.
- Citrat (izocitrat)-hidroliaza (aconitaza) catalizeaz transformarea reversibil a acizilor citric, izocitric i cis-aconitic n ciclul acidului citric. Aceast transformare decurge n modul urmtor: Reactia are un rol deosebit i n transformrile acizilor organici n plante.

240

Enzime
CH2 COOH HO C COOH CH2 COOH acid citric CH COOH -H2O + H2O C COOH CH2 COOH acid cis-aconiticc +H2O -H2O OH CH COOH CH COOH CH2 COOH acid izocitric

7.9.4.3. Carbon-azot liaze (C-N-liaze) Reprezentantul acestei grupe de liaze este L-asparatamoniacliaza sau aspartaza ce transform acidul aspartic n acid fumaric i amoniac:

COOH CH NH2 CH2 COOH acid aspartic

aspartaza

COOH CH HC + NH3

COOH acid fumaric

Ca urmare, aminoacizii se transform n acizi nesaturai datorit dezaminrii. Aceast enzim este caracteristic pentru bacterii i plante. 7.9.4.4. Carbon-sulf liaze (C-S-liaze) Scindarea legturilor carbon-sulf este realizat, de exemplu, cisteindesulfhidraza care transform cisteina n acid piruvic i H2S: de

CH2 SH CH NH2 COOH cistein

H2O

CH3 O + H2S + NH3 COOH acid piruvic C

7.9.5. Izomeraze
Izomerazele sunt enzimele care catalizeaz transformarea intramolecular a unui compus dintr-o form izomer n alt form izomer. Aceste transformri constau din transferul intramolecular al hidrogenului, gruprilor fosfat sau acil, n modificarea distribuiei spaiale a

241

Biochimia produselor alimentare atomilor unor grupri, n deplasarea dublelor legturi etc. Clasa izomerazelor include cteva zeci de enzime individuale care se mpart n mai multe subclase. 7.9.5.1. Racemaze i epimeraze Din aceast categorie fac parte enzimele care catalizeaz reacii de racemizare i epimerizare ale aminoacizilor, hidroxiacizilor, glucidelor i a altor compui. Racemizarea se face dup tipul: L - aminoacid L - lactat D - aminoacid D - lactat

Astfel, enzima alanin-racemaza transform reversibil L-alanina n D-alanin iar lactat-racemaza catalizeaz transformarea D-lactatului n L-lactat.

CH3 H C OH COOH D-acid lactic

CH3 HO C H COOH L-acid lactic

Reaciile catalizate de racemaze au o importan deosebit pentru c permit trecerea formelor D n forme L ale unor molecule ptrunse n organism odat cu hrana, organismul utiliznd numai forma L. De asemenea, prin aceste reacii unele microorganisme pot metaboliza ambele forme ale unor compui. Epimerazele catalizeaz reacii de epimerizare acionnd asupra glucidelor i derivailor lor. Astfel, UDP-glucozo-4-epimeraza transform reversibil UDP-glucoza n UDP-galactoz:
CH2OH H HO H OH H O H H O - UDP OH HO CH2OH H O H H O - UDP OH

H OH H

UDP-glucoz

UDP-galactoz

7.9.5.2. Izomeraze cis-trans Din aceast subclas face parte enzima maleatizomeraza care catalizeaz reacia de transformare reversibil a acidului maleic n acid fumaric:

242

Enzime

H C COOH H C COOH acid maleic

H C COOH HOOC C H acid fumaric

7.9.5.3. Oxidoreductaze intramoleculare Sunt izomeraze care catalizeaz intertransformarea aldozelor i cetozelor. Are loc o reducere concomitent a gruprii aldehidice la gruparea alcool primar i oxidarea gruprii alcool secundar la gruparea cetonic. Astfel de enzime sunt: -Triozofosfatizomeraza - catalizeaz intertransformarea unor produi intermediari ai glicolizei, respectiv a 3-fosfogliceraldehidei i fosfodioxiacetonei (dihidroxiacetonfosfat):

CHO OH CH2 O P O OH 3-fosfogliceraldehida CHOH

CH2OH C O OH CH2 O P O OH fosfodioxiacetona

-Glucozofosfatizomeraza sau glucozoizomeraza catalizeaz o reacie n cadrul procesului de glicoliz i anume transformarea reversibil a glucozo-6-fosfatului n fructozo-6-fosfat:
CH2 O P O H H OH H H OH OH O H OH HO H

H HO

P O H2C
H

CH2OH OH

glucozo-6-fosfat

fructozo-6-fosfat

Glucozoizomeraza produs de ctre microorganisme este utilizat ca atare sau sub form imobilizat pentru izomerizarea industrial discontinu sau continu a siropurilor de glucoz. Prin aceast izomerizare enzimatic se obin siropuri cu coninut ridicat de fructoz (Izosirop sau High Fructose Syrup) care sunt utilizate n industria alimentar ca produi de ndulcire deoarece, prin prezena fructozei, au o putere de ndulcire mai mare dect siropurile din glucoz. Totodat, izosiropul se folosete i pentru obinerea produselor dietetice, deoarece fructoza este mai bine tolerat de diabetici. -Ribozofosfatizomeraza catalizeaz intertransformarea formelor cetonic i aldehidic ale ribozo-5-fosfatului:

243

Biochimia produselor alimentare

P O H2C

OH H OH C

O H

P O H2C

OH CH2OH C O

H H OH

H H OH

Ribo-aldozo-5-fosfat (ribozo-5-fosfat)

Ribo-cetozo-5-fosfat (ribulozo-5-fosfat)

7.9.5.4. Transferaze intramoleculare n aceast subclas sunt incluse izomerazele care catalizeaz transferul unor grupri chimice n diferite poziii ale moleculei de substrat. Se mai numesc mutaze. Astfel sunt: -Fosfoglucomutaza care transport gruparea fosfat de la carbonul 1 la carbonul 6 din molecula de glucozo-1-fosfat:
OH CH2OH O H H H H OH OH O H OH O P OH OH CH2 O P O O H H OH H H OH OH OH H OH

glucozo-1-fosfat

glucozo-6-fosfat

-Fosfogliceromutaza asigur conversia acidului 3-fosfogliceric n acidul 2fosfogliceric:

COOH CHOH O OH CH2 O P

COOH

O OH

CH O P CH2OH OH

OH acid 3-fosfogliceric

acid 2-fosfogliceric

7.9.6. Ligaze
Ligazele sau sintetazele sunt enzime care catalizeaz reaciile de sintez a substanelor organice ce se desfoar cu descompunerea unor donori de energie pentru realizarea proceselor de biosintez. Unul dintre aceti donori naturali de energie este ATP. Energia care se elibereaz prin ruperea resturilor de acid fosforic este utilizat pentru activarea substanelor care reacioneaz.

244

Enzime Prin urmare, ligazele catalizeaz sinteza compuilor organici din substane activate prin descompunerea ATP. Ele conduc la formarea de noi legturi C-C, C-N, C-O, C-S. Sunt enzime ce au o importan deosebit pentru sinteza proteinelor (formarea legturii peptidice), glucidelor (formarea legturii glicozidice) i a lipidelor (formarea legturii ester) pe seama energiei eliberate prin transformarea ATP n ADP sau AMP. -Acil-CoA-ligaze sunt enzime ce catalizeaz legarea resturilor diferitor acizi organici (acetic, succinic etc.) la conezima A, dup reacia:

R-COOH + CoA-SH + ATP

acetiltiokinaza

R-CO~SCoA + AMP + PPi acil-CoA

De exemplu, acetil-CoA-ligaza formeaz acetil-CoA:

acetiltiokinaza CH3-COO + CoA-SH + ATP CH3-CO~SCoA + AMP + PPi acetil-CoA

Compuii coenzimei A care se formeaz n acest mod reprezint surse importante de grupri acil active ce sunt utilizate pentru diverse sinteze care au loc n celule. -Carboxilaze sunt enzime care catalizeaz legarea dioxidului de carbon la diveri acizi organici, adic reacia de lungire a lanului atomilor de carbon ,folosind energia eliberat prin descompunerea molecului de ATP. De exemplu, piruvatcarboxilaza catalizeaz reacia de sintez a acidului oxalacetic din acid piruvic:

COOH C O + H2O + CO2 + ATP

sau

COOH C O CH2 + ADP + H3PO4 COOH acid oxalacetic

CH3 acid piruvic

acetilcarboxilaza care determin legarea CO2 la restul acetil cu formarea malonil-CoA:

CH3 - CO ~ SCoA + CO2 + ATP acetil - CoA

HOO - CH2 - CO ~ SCoA + ADP + H3PO4 malonil - CoA

245

Biochimia produselor alimentare Carboxilazele care catalizeaz legarea CO2 conin n calitate de coenzim biotina. -Aminoacid tARN-ligazele catalizeaz activarea aminoacizilor liberi din citoplasm; acetia, prin intermediul tARN, sunt transferai la nivelul ribozomilor unde particip la biosinteza proteinelor conform informaiei codificat n ADN i transmis la ribozomi prin mARN. Sub aciunea ligazelor se formeaz un complex al aminoacizilor cu tARN. Aminoacid + ATP + tARN aminoacil-tARN + AMP + PPi -Amidligaze sunt enzimele care catalizeaz formarea legturilor C-N. De exemplu, glutaminsintetaza determin sinteza glutaminei din acid glutamic i amoniac: acid glutamic + NH3 + ATP glutamin + ADP + H3PO4

246