Anda di halaman 1dari 9

High Performance Liquid Cromatography (HPLC) HPLC adalah singkatan dari High Performance Liquid Cromatography, yaitu alat

yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam ( yaitu sebuah tube dengan partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan memompa cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom. Sampel yang akan dianalisis dijadikan dalam volume yang kecil dari fase bergerak dan diubah melalui reaksi kimia oleh fase diam ketika sampel melalui sepanjang kolom. Tujuan penggunaan alat ini adalah mengetahui kadar asam organik.
SISTEM PERALATAN HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

ada dua perbedaan dalam HPLC, yang mana tergantung pada polaritas relatif dari pelarut dan fase diam. 1. Fase normal HPLC
Normal phase HPLC (NP HPLC) merupakan metode yaang mengeksplorasi perbedaan kepolaran antara analit dalam campuran dengan fase diam. semakin kuat interaksi fase diam dengan analit, semakin lama retensi analit. Normal phase HPLC (NP HPLC) merupakan metode yaang mengeksplorasi perbedaan kepolaran antara analit dalam campuran dengan fase diam. semakin kuat interaksi fase diam dengan analit, semakin lama retensi analit. Pemilihan normal phase HPLC berhubungan dengan kelarutan sampel dalam fase gerak. Dengan pelarut utama nonpolar, biasanya fase normal dipilih sebagai metode untuk pemisahan senyawa yang sangat hidrofobik, yang tidak larut dengan senyawa polar atau air.

Pada HPLC ada yang disebut dengan waktu retensi, yaitu Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:

tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)

kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel)

komposisi yang tepat dari pelarut temperatur pada kolom pada praktikum HPLC ada yang disebut dengan detektor, yaitu suatu alat

untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom.yang umum digunakan adalah serapan ultra violet.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu. 2. Fase balik HPLC Pada fase ini ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan

waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawasenyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom. Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom. Wadah Fase gerak dan Fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak

juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas. Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik. Pompa Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah

untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan. Tempat penyuntikan sampel Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.

Posisi pada saat memuat sampel

Posisi pada saat menyuntik sampel

Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk

berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 l/menit).

Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.

Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

HPLC ini digunakan untuk asam organik, seperti asam formiat dan asam asetat. Pada praktikum kali ini zat yang digunakan adalah asam asetat sebgai fasa gerak nya. Jika sampel mula-mula berbentuk padatan harus di-distruksi dulu kemudian di-treatment sehingga berupa larutan homogen yang tidak terdapat endapan lagi dan bening karena syarat sampel yang dapat dianalisa menggunakan HPLC adalah harus tidak ada endapan dan harus bening.

Langkah yang dilakukan dalam HPLC :

Langkah-langkah menganalisa menggunakan HPLC yaitu mula-mula sampel diinjeksi dengan syringe. Sampel yang digunakan sebanyak 500 ppm.Kemudian sampel masuk ke injection hall. Dari injection hall ini proses utama cara kerja HPLC dimulai, yaitu dengan memompa sampel ke kolom oleh LC20AT dalam tekanan tinggi. Dari kolom, sampel dijadikan fase bergerak dan diolah dengan fase, Setelah terpisah dengan berbagai perhitungan matematis, HPLC yang sudah

disambungkan dengan komputer ini memberikan pembacaan berupa peak. Setelah itu kita mencari luasan di bawah peak untuk mengetahui kadar analit. Keuntungan dari penggunaan HPLC yaitu :

1. Lebih teliti 2. Sudah digital sehingga penggunaannya cepat dan lebih praktis Sedangkan kerugian dari penggunaan HPLC yaitu :

1. Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dulu 2. Hanya bisa digunakan untuk asam organik 3. Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradien elusi 4. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas Diameter internal dari kolom HPLC adalah aspek yang penting yang menentukan kapasitas analit yang dapat dimasukkan dan dapat mempengaruhi

sensitivitas. Kolom yang lebih lebar dijumpai di aplikasi industri seperti pemurnian obat-obatan, sedangkan kolom yang lebih sempit menaikkan sensitivitas dan hanya membutuhkan sedikit solven. Ukuran partikel juga berpengaruh. HPLC tradisional kebanyakan fase diamnya melekat pada partikel silika. Ukuran partikel yang paling umum adalah 5m. Ukuran yang lebih kecil menyediakan luas area lebih besar dan separasi yang lebih baik, namun tekanan yang dibutuhkan untuk kecepatan linear optimum berbanding terbalik dengan kuadrat diameter partikel. Tekanan pompa yang besar dibutuhkan untuk partikel yang sangat kecil, dan sekarang ada UHPLC (Ultra HPLC) yang dapat bekerja pada tekanan sangat tinggi (1000 atm).