CROMATOGRAFIA INICA

http://www.ufpa.br/ccen/quimica/cromatografia_arquivos/page0002.htm
A cromatografia de troca inica, que geralmente chamada de cromatografia inica, refere-se a mtodos modernos e eficientes de separao e determinao de ons com base em resinas trocadoras de ons. A cromatografia inica foi desenvolvida em meados dos anos 1970, quando foi mostrado que misturas de ction e nion podem ser facilmente resolvidas em colunas de HPLC com resinas trocadoras de ction e nions como fases estacionrias. Nesta poca, a deteco era feita por medidas de condutividade. Atualmente, outros detectores esto disponveis p/ a cromatografia inica. A cromatografia inica foi conseqncia de troca inica, desenvolvida durante o projeto Manhattan para a separao de ctions de terras raras de propriedades semelhantes entre si, com resinas trocadoras de ctions. Esse trabalho monumental, que forneceu a base terica das separaes de troca inica, aps a Segunda guerra Mundial, foi estendido para muitos outros tipos de materiais. Em ultima analise, levou aos mtodos automticos para separao e deteco de aminocidos e outras espcies inicas em misturas complexas. O desenvolvimento da tcnica moderna HPLC comeou no final dos anos 60 mas a sua aplicao na separao de espcies inicas foi retardada pela falta de um mtodo geral sensvel para deteco das espcies inicas eludas, como ctions alcalinos e alcalinos terrosos e nions haletos, acetatos e nitratos. Essa situao foi remediada em 1975, com o desenvolvimento de trabalhos na Dow Chemical Company de uma tcnica de supresso do eluente que tornou possvel a deteco condutomtrica dos ons eluidos.

EQUILIBRIO DE TROCA INICA Os processos de troca inica esto baseados em equilbrios de troca entre ons em soluo e ons de mesmo sinal na superfcie de um slido essencialmente insolvel de alto peso molecular. Alguns trocadores de ons naturais, como argilas e zelitas, foram identificados e tm sido utilizados por dcadas. Resinas trocadoras sintticas foram produzidas em meados dos anos 1930 para amolecer gua, para deionizao de gua e para purificao de solues. Os stios ativos mais comuns para as resinas trocadoras de ctions so o grupo acido sulfnico SO3-H+ , um cido forte, e o grupo cido carboxlico COO-H+, um cido fraco. Trocadores aninico contm grupos amina tercirias N(CH3)3+OH- ou grupos de aminas primrias NH3+OH- . O primeiro uma base forte e o segundo, uma base fraca. Quando um trocador inico de cido sulfnico colocado em contato com um solvente aquoso contendo um ction Mx+, o equilbrio de troca estabelece pode ser descrito como onde RSO3-H+ representa um dos muitos grupos sulfnicos ligados a molculas polimricas grandes. Analogamente, um trocador que seja uma base forte interage com nion A-x como mostrado na reao. Como exemplo da aplicao da lei de ao das massas no equilbrio de troca inica, vamos considerar a reao entre um on com carga monopositiva com a resina de acido sulfnico mantida em uma coluna cromatogrfica. A partir da soluo neutra, a reteno inicial de ons no topo da coluna ocorre devido reao Neste caso, os smbolos (s) e (aq) enfatizam que o sistema contm um slido e uma fase aquosa. A eluio com soluo diluda desloca o equilbrio da eq.28-5 para a esquerda, fazendo com que parte dos ons B+ na fase estacionaria seja transferncia para a fase mvel. Esse ons movem-se ento coluna abaixo em uma srie de transferncias entre as fase estacionarias e mvel. A constante de equilbrio Ktr para a reao mostrada na eq. 28-5 toma a forma Neste caso. [(RSO3-)x Bx+ (s) ] e [RSO3-H+(s)] so concentraes( arigor, atividades) de B+ e H+ na fase slida. Rearranjando, temos: Durante a eluio, a concentrao aquosa de ons hidrognio muito maior do que a concentrao dos ons monopositivos na fase mvel. Alem disso, o trocador tem um numero enorme de stios de troca relativos aos ons B+ que esto sendo retidos. Assim, as concentraes totais de [H+]aq e de [RSO3-H+(s)] no so afetadas de modo significativo pelos deslocamentos no equilbrio. Portanto, quando [RSO3-H+(s)] > > [RSO3-B+(s)] e [H+aq ] > > [B+]aq, o lado direito da eq. essencialmente constante e podemos escrever: onde K a constante que corresponde constante de distribuio definida na eq.. todas as eq. Na tabela podem ser aplicada cromatografia de troca inica da mesma forma que aos demais tipos que j foram considerados. Observe que Ktr na eq. Representa a afinidade da resina pelo on B+ em relao a outro on(aqui, H+). Quando Ktr for grande, existir uma tendncia da fase em reter B+. Quando Ktr for pequena, tem-se o inverso. Por seleo de um on de referencia comum, como H+, as razes de distribuio para os diferentes ons com um mesmo tipo de resina podem ser comparadas experimentalmente. Esses experimentos revelam que ons polivalentes ficam presos muito mais fortemente do que espcies monocarregadas. Dentro de um dado grupo, entretanto, aparecem diferenas relacionadas com o tamanho do on hidratado e com outras propriedades.

EMPACOTAMENTO DE TROCA INICA Historicamente, a cromatografia de troca inica foi feita em pequenos leitos porosos formados durante copolomerizao de emulso de estireno e divinilbenzeno. A presena de divinilbenzeno (usualmente = 8%) resulta em ligaes cruzadas que conferem estabilidade mecnica aos leitos. Para tornar o polmero ativo com relao aos ons, grupos funcionais cidos ou bsicos so quimicamente ligados sua estrutura. Os grupos mais comuns so cidos sulfnicos e aminas quaternrias. A figura 2 mostra a estrutura de uma resina cida forte. Observe que as ligaes cruzadas mantm juntas as molculas lineares de poliestireno. Os outros tipos de resinas tm estruturas similares, exceto pelo grupo funcional ativo. Partculas polimricas porosas no so inteiramente satisfatrias para empacotamento cromatogrfico devido lenta velocidade de difuso das molculas do analito atravs dos microporos da matriz polimrica e compressibilidade da matriz. Para contornar ees problema, dois novos tipos de fase estacionarias foram desenvolvidos e tm uso mais geral do que os tipo polmero poroso e relativamente grande, recoberto com resina de troca inica sinttica. Um segundo tipo de empacotamento preparado por recobrimento de micropartculas porosas de slica, como as usadas em cromatografia de adsoro, com um filme Lino do trocador. Com qualquer tipo, a difuso mais rpida no filme polimrico leva a um aumento da eficincia. Por outro lado, a capacidade de amostra dessa partculas menor, particularmente para o tipo pelicular.

APLICAES INORGNICAS DA CROMATOGRAFIA DE TROCA INICA A fase mvel na cromatografia de troca inica deve ter as mesmas propriedades gerais requerida nos outros tipos de cromatografia. Isto , deve dissolver a amostra, ter uma fora de solvente que leve a tempos de reteno razoveis e interagir com solutos de modo a levar seletividade. As fases moveis da cromatografia de troca inica. Cromatografia de Troca Inica em Colunas Supressoras de Eluente A ampla aplicao da cromatografia inica para a determinao de espcies inorgnicas foi restringida pela falta de um bom detector genrico que permitisse a determinao quantitativa de ons com base nas reas dos picos cromatogrficos. Detectores de condutividade seriam uma escolha obvia para esta tarefa. Eles podem ser altamente sensveis, so universais para espcies carregadas e, como regra geral, respondem de modo previsvel a mudanas e manuteno baratas, fceis de serem miniaturizados e comumente funcionam por longo tempo sem problemas. Somente uma limitao dos detectores de condutividade provou ser muito seria e atrasou o seu uso geral. Essa limitao vem da alta concentrao de eletrlito necessria para eluir a maioria dos analitos inicos em um tempo razovel. Em conseqncia, a condutividade dos componentes da fase mvel tende a sobrepujar a dos ons do analito, reduzindo acentuadamente a sensibilidade do detector. Em 1975, o problema da alta condutncia do eluente foi resolvido com a introduo da chamada coluna supressora de eluente imediatamente aps a coluna analtica de troca inica. A coluna supressora empacotada com uma segunda resina de troca inica que efetivamente converte os ons do solvente a espcies moleculares de ionizao limitada, sem afetar os io0ns do analito. Por exemplo, quando ctions esto sendo separados e determinados, freqentemente, escolhido cido clordrico como reagente eluente e acoluna supressora resina de troca aninica na forma de hidrxido. evidente que os ctions do analito no so retidos por esta segunda coluna. Para separaes aninicas, a fase estacionaria supressora a forma cida de uma resina de troca catinica. Neste caso, carbonato ou bicarbonato de

sdio serve como agente de eluio. Neste caso, o cido carbnico muito pouco dissociado no contribui de modo significativo para a condutividade. Uma inconvenincia associada s colunas supressoras originais era a necessidade de regenerao peridica para reconverter a coluna forma original cida ou bsico . recentemente, entretanto,foram disponibilizados supressores de membrana fibrosa que operam continuamente, como mostra na figura 3. Neste caso, o eluente e a soluo supressora fluem em direo oposta, de cada lado de uma membrana permevel de troca inica, indicada como M. para analise de anions as membranas so de troca catinicas. Para ctions so de troca aninica. Em equipamentos comerciais projetados recentemente, a regenerao de solues supressoras feita automaticamente com ons hidroxila ou hidrognio eletroregenerados de modo que no so necessrias interrupes no uso dos equipamentos.

CROMATOGRAFIA IONICA EM COLUNA NICA Esto disponveis no mercado equipamentos para cromatografia inica nos quais nenhuma coluna supressora usada. Esta abordagem depende de pequenas diferenas na condutividade entre ons eludos da amostra e os ons prevalentes no eluentes. Para amplificar essas diferenas, so usados trocadores de baixa capacidade, o que torna possvel a eluio com espcies de baixa condutncia equivalente. A cromatografia em coluna nica tende a ser um pouco menos sensvel a ter uma faixa mais limitante do que a cromatografia inica com coluna supressora. Recentemente, foi descoberto um mtodo fotomtrico indireto que permite separao e deteco de anions e ctions que no absorvem sem uso de uma coluna supressora. A figura 5 mostra um cromatograma obtido por esse mtodo. Neste caso, o eluente uma soluo diluda de FTALATO DE SDIO e o ON deslocado e que absorve no U.V. a deteco indireta apresenta uma faixa de trabalho mais restrita do que a deteco direta.

Aplicaes da Cromatografia de Troca Inica em Sistema Orgnicos e Bioqumicos A cromatografia de troca inica tem sido aplicada a vrios sistemas orgnicos e bioqumicos, incluindo drogas e seus metablitos, soros, conservantes de alimentos, misturas de vitaminas, aucares e preparados farmacuticos. A figura 6 mostra um exemplo dessas aplicaes, no 1.10-8 mol de cada um de 17 aminocidos foram separados por uma coluna catinica. CROMATOGRAFIA DE EXCLUSO DE ONS A cromatografia de excluso de ons no uma forma de cromatografia inica porque a espcie neutra, em vez dos ons, que separada. Entretanto, convm discuti-la porque a cromatografia de excluso de ons, como cromatografia inica, emprega colunas de troca inica para fazer as separaes. A teoria e as aplicaes da cromatografia de excluso de ons esto convenientemente ilustradas pela separao de cidos carboxlicos simples apresentada no cromatograma da figura 7. Neste caso, a fase estacionria era uma resina de troca de ctions na sua forma cida e a eluio foi feita com soluo diluda de acido clordrico. A cromatografia de excluso de ons encontra numerosas aplicaes na identificao e determinao de espcies cidas em materiais como leite, caf, vinho e muitos outros produtos comerciais. Sais de cidos fracos tambm podem ser analisados porque so convertidos ao acido correspondente por ons hidrognio no trocadores. Bases fracas e seus sais tambm podem ser determinados por cromatografia de excluso de ons. Nessas aplicaes empregam-se uma coluna de troca aninica na forma de hidrxido.

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSO POR TAMANHO A cromatografia de excluso por tamanho, tambm pode ser chamada de cromatografia por permeao em gel ou por filtrao em gel uma tcnica poderosa aplicvel particularmente a espcies de alto peso molecular. Os empacotamentos para cromatografia de excluso por tamanho consistem de partculas pequenas de slica ou de polmeros contendo uma rede de poros uniformes nos quais molculas do soluto e do solvente podem se difundir. Enquanto esto nos poros, as molculas esto efetivamente retidas e ausentes do fluxo da fase mvel. O tempo mdio de residncia nos poros depende do tamanho efetivo das molculas do analito. Molculas maiores do que o tamanho mdio dos poros da fase so excludas e essencialmente no sofrem reteno. Essas espcies so as primeiras a serem eludas. Molculas com dimetros significativamente menores do que os poros podem penetrar ou permear atravs do emaranhado de poros e ficar retidas por tempos maiores. Estas so as ltimas a serem eludas. EMPACOTAMENTO DA COLUNA Dois tipos de empacotamento para cromatografia de excluso por tamanho so encontrados: leitos de polmeros e partculas base de slica, ambos com dimetros de 5 a 10mm. O segundo tem vantagens de maior rigidez, que leva ao empacotamento mais fcil e permite o uso de presses mais altas; maior estabilidade, que permite o uso em uma variedade de solvente, incluindo gua; maior rapidez para atingir o equilbrio com novos solventes e estabilidade em temperaturas mais altas. As desvantagens das partculas base de slica incluem sua tendncia a reter solutos por adsoro e seu potencial para catalisar a degradao de molculas do soluto. Vidros porosos e partculas de slicas com tamanho mdio de poro variando de 40 A a 2.500A(angstron) esto agora disponveis no mercado. Para produzir a adsoro, as superfcies destas partculas so freqentemente modificados por reao com substituintes orgnicos. Por exemplo, a superfcie de uma fase estacionaria hidroflica. A tabela 2 lista as propriedades de algumas fases estacionrias comerciais tpicas para excluso por tamanho.

TEORIA DA CROMATOGRAFIA DE EXCLUSO POR TAMANHO O volume total Vt de uma coluna empacotada com um polmero poroso ou slica gel dado por:

Vt = Vg + Vi + Vo Onde Vg o volume ocupado pela matriz slida de gel, Vi o volume de solvente mantido nos seus poros e Vo o volume livre fora das partculas de gel. Considerando que no h mistura nem difuso, Vo tambm representa o volume terico de solvente necessrio para transportar atravs da coluna os componentes muito grandes para penetrar nos poros do gel. Mas, na verdade, alguma mistura e difuso ir ocorrer e, em conseqncia, os componentes no-retidos vo aparecer em uma banda de forma gaussiana com concentrao mxima em Vo. Para componentes pequenos o suficiente oara penetrar livremente nos poros do gel, o Maximo da banda aparecer na sada da coluna em um volume de eluente correspondente a ( Vi + Vo). Geralmente, Vi,Vo e Vg so da mesma ordem de magnitude. Assim, uma coluna de gel permite a separao de molculas grandes das pequenas de uma amostra, com um mnimo de volume eluente. Molculas de tamanho intermedirio so capazes de transferir para uma frao K do solvente retido nos poros. O volume de eluio V para essas molculas retidas : Ve = Vo + K Vi A eq. acima aplica-se a todos os solutos na coluna. Para molculas grandes demais para penetrar nos poros do gel, K=0 e Ve =0 . Para molculas que podem penetrar em poros no escondidos, K=1 e Ve = (Vo+Vi). Com adsoro, a quantidade de soluto retido nas intersticialidades ir aumentar. Com molculas menores, K ser maior do que a unidade. Os valores de K variam de zero para grandes molculas totalmente excludas at um para molculas pequenas. A constante de distribuio um parmetro valioso para a comparao de dados de diferentes fases estacionarias. O limite de excluso define a massa molecular da espcie alem da qual no ocorre reteno. Todas as espcies com massa molecular maior do que o limite de excluso so grandes demais e no podem ser retidas e eluem juntas para dar o pico o limite de permeao a massa molecular abaixo da qual as molculas do soluto podem penetrar completamente nos poros. Todas as molculas abaixo dessa massa molecular so pequenas demais e eluem em uma nica banda denominada D. Conforme a massa molecular diminui abaixo do limite de excluso, as molculas do soluto gastam mais tempo nos poros das partcula e, portanto, movem-se de modo progressivamente mais lento. Na regio de permeao seletiva ocorre fracionamento, gerando picos individuais de soluto com B e C no cromatograma. Aplicao da Cromatografia de Excluso por Tamanho Os mtodos de excluso por tamanho so subdivididos em cromatografia por filtrao em gel e permeao em gel. A primeira est baseada em solventes aquosos e fases estacionarias hidroflicas. A segunda est baseada em solventes orgnicos no-polares e fases estacionarias hidrofbicas. Os mtodos so complementares no sentido em que um se aplica a amostras solveis em gua e o outro a substancias solveis em solventes orgnicos menos polares. Uma aplicao til do procedimento de excluso por tamanho a separao de molculas de produtos naturais de alta massa molecular de espcies de baixa massa molecular e sais. Por exemplo, um gel com limite de excluso de alguns milhares de unidades pode separar claramente protenas de aminocidos e de pepitdeos de baixa massa molecular. Uma outra aplicao importante da cromatografia de excluso por tamanho a rpida determinao da massa molecular de polmeros maiores ou de produtos naturais. Neste caso, os volumes de eluio da amostra so comparados com os volumes de eluio da amostra so comparados com os volumes de eluio de uma srie de compostos-padro que possuem as mesmas caractersticas qumicas. As vantagens mais importantes desse procedimento incluem: (1) tempos de separao pequenos e bem definidos [ todos os solutos deixam a coluna entre Vo e (Vo+Vi) na eq.]; (2) bandas estreitas que levam boa sensibilidade; (3) no h perde de amostra porque o soluto no interagem com a fase estacionaria e (4) no-desativao da coluna devido interao do soluto com a fase estacionaria. Desvantagens so: (1) somente um numero limitado de bandas podem ser acomodadas porque a escala de tempo do cromatograma pequeno e (2) no-aplicvel a amostras de tamanhos similares como ismeros. Geralmente, necessria uma diferena de 10% na massa molecular para resoluo razovel.

Cromatografia em Camada Delgada Os mtodos planares de cromatografia incluem cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia de papel (CP) e eletrocromatografia. Cada um usa uma camada relativamente fina e plana de material que auto-suportado ou reveste uma superfcie vtrea, plstica ou metlica. A fase mvel desloca se atravs da fase estacionria por ao de capilaridade, algumas vezes assistida por potencial eltrico ou gravitacional bidimensional, embora essa descrio no seja estritamente correta uma vez que a fase estacionaria tem espessura finita.

Como So Feitas as Separaes em Camada Delgada Separaes em camada delgada tpicas so feitas sobre placas de vidro ou plsticos recobertos com uma camada fina e aderente de partcula finamente divididas. Essa camada constitui a fase estacionaria. As partculas so similares s descritas na discusso sobre adsoro, partio em fase reversa e em fase normal e sobre cromatografia em coluna de excluso por tamanho. As fases moveis tambm so similares s empregadas em cromatografia liquida de alta eficincia em coluna. APLICAO DE AMOSTRA Aplicao da amostra talvez o aspecto mais critico da cromatografia em camada delgada, principalmente para medidas quantitativas. Usualmente, a amostra, como soluo 0,01 a 0,1% aplicada como uma mancha de 1 a 2 cm na borda da placa. Para melhor eficincia na separao, a mancha deve ter um dimetro mnimo- cerca de 5mm para trabalhos qualitativos e menores para analise quantitativa. Para solues diludas, so 3 ou 4 aplicaes repetidas, com secagem entre elas.

A aplicao manual de amostras feita trocando um tubo capilar contendo a amostra em uma placa ou usando uma seringa hipodrmica. So oferecidos comercialmente vrios aplicadores mecnicos, que aumentam a preciso e exatido da aplicao da amostra. Os detectores de absoro UV mais simples so os fotmetros com uma lmpada de mercrio como fonte. Comumente, a linha intensa em 254 nm isolada por filtros. Em alguns equipamentos, as linhas em 250, 313, 334 e 365 tambm podem ser empregadas fazendo-se a substituio dos filtros. Obviamente esse tipo de detector est restrito a solutos que absorvem em um desses comprimentos de onda. Vrios grupos funcionais orgnicos e varias espcies inorgnicas apresentam banda de absoro larga, compreendendo um ou mais desses comprimentos de onda. Fontes de filamentos de deutrio e tungstnio com filtros de interferncia tambm proporcionam um meio simples de detectar espcie que absorvem, a medida que so eludas em uma coluna. Alguns equipamentos modernos so equipados com discos contendo vrios filtros que podem ser rapidamente trocados para detectar as varias espcies, conforme elas eluem. Esses dispositivos so teis principalmente para analises quantitativas repetitivas nas quais a composio qualitativa da amostra conhecida de modo que uma seqncia adequada de filtros pode ser escolhida. Muitas vezes, a mudana de filtro controlada por computador. A maioria dos fabricantes de HPLC oferece detectores que consistem de espectrofotmetro de varredura com redes pticas. Alguns so limitados radiao UV.Outros compreendem a radiao UVVisvel. Vrios modos de operao podem ser escolhidos. Por exemplo, um cromatograma inteiro pode ser obtido em um nico comprimento de onda. Alternativamente, quando os picos eludos so suficientemente separados no tempo, comprimentos de ondas diferentes podem ser escolhidos para cada pico. Neste caso, o controle por computador geralmente empregado para selecionar o melhor comprimento de onda para cada eluente. Quando se deseja espectros completos para finalidades de identificao, o fluxo de eluente pode ser interrompido por um perodo suficiente para permitir a varredura na regio do comprimento de onda de interesse. Os detectores espectrofotomtricos UV mais poderosos so os equipamentos com arranjos de diodos. Vrios fabricantes oferecem esses instrumentos que permitem a coletas de dados de um espectro inteiro em aproximadamente um segundo. Assim, dados espectrais para cada pico cromatogrfico podem ser coletados e armazenados medida que aparecem na sada da coluna. Uma forma de apresentao dos dados espectrais, til na identificao de espcies e na escolha de condies para a determinao quantitativa, uma curva tridimensional como mostrado na figura abaixo.

Neste caso, os espectros foram obtidos em intervalos sucessivos de cinco segundos. O aparecimento e o desaparecimento de cada dos esterides no eluente evidente. DETECTORES DE ABSORBNCIA NO INFRAVERMELHO Dois tipos de detectores de infravermelho so comercializados. O primeiro com varredura de comprimento de onda feita por trs filtros de cunha semicirculares. A faixa desse instrumento de 2,5 a 14,5mm ou de 4.000 a 690 cm-1. O segundo, e muito mais sofisticado, est baseado em equipamentos com transformada de Fourier. Vrios fabricantes desses equipamentos oferecem acessrios que permitem seu uso como detectores de HPLC. Celas detectoras de infravermelho tem construo semelhantes s usadas com radiao UV, exceto que as janelas so feitas de NaCl ou CaF2. Os comprimentos das celas variam de 0,2 a 1,0 mm e os volumes de 1,5 a 10 mL. Os equipamentos de infravermelho mais simples podem ser operados em um ou mais comprimentos de onda. Alternativamente, os espectros dos picos podem ser varridos com interrupo de fluxo no

momento da eluico. Os instrumentos com transformada de Fourier so usados de modo anlogo ao instrumento com arranjo de diodo para medidas de absorbncia no UV. Uma limitao importante no uso de detectores de infravermelho esta na baixa transparncia de muitos solventes teis. Por exemplo, as bandas largas de absoro no infravermelho de gua e lcoois impedem o uso desse detector em muitas aplicaes. Os detectores de fluorescncia para HPLC tm projetos similares aos fluormetros e espectrofluormetros. Na maioria deles, a fluorescncia observada por um detector fotoeltrico posicionado perpendicularmente ao eixo de excitao. Os detectores mais simples empregam uma fonte de excitao de mercrio e um ou mais filtros para isolar uma banda de emisso de radiao. Os equipamentos mais sofisticados possuem uma fonte de Xennio e empregam um monocromador de rede para isolar a radiao fluorescente. provvel que, futuramente, detectores por fluorescncia usaro fontes de laser sintonizveis, o que levar a um aumento na sensibilidade e na seletividade. Uma vantagem inerente dos mtodos de fluorescncia sua alta sensibilidade, tipicamente mais de uma ordem de magnitude maior do que a da maioria dos procedimentos de absorbncia. Essa vantagem foi explorada na cromatografia liquida para a separao e determinao dos componentes de amostras que fluorescem. Compostos fluorescentes so encontrados freqentemente na analise de materiais farmacuticos, produtos naturais, amostras clinicas e produtos de petrleo. Muitas vezes, o numero de espcies fluorescentes pode ser aumentado por tratamento preliminar com reagentes que formam derivados que fluoerscem. Por exemplo, cloreto de dansila ( 5-dimetilamonionaftaleno-1-sulfonilcloro), que reage com aminas primarias e secundarias, aminocidos e fenis dando compostos fluorescentes, tem sido muito usado para a deteco de aminocidos em protenas hidrolisadas. DETECTORES DE NDICE DE REFRAO

A figura mostra esquematicamente um detector de ndice de refrao diferencial, no qual o solvente passa atravs de uma metade da cela no seu para a coluna. O eluido ento flui atravs de outra cmara. Os dois compartimentos so separados por uma placa de vidro montada em um ngulo tal que a curvatura do feixe incidente ocorre se as duas solues tiverem ndices de refrao diferentes. O deslocamento resultante diferente do feixe com relao a superfcie fotossensvel de um detector causa uma variao no sinal de sada, que amplificada e registrada, fornecendo um cromatograma. Os detectores de ndice de refrao tm uma vantagem significativa por responderem a quase todos os solutos. Isto , so detectores genricos, anlogos aos detectores de condutividade trmica e de chama da cromatografia gasosa. Alem disso, so confiveis e no so afetados pela vazo. Entretanto, so altamente sensveis temperatura e devem ser mantidos a uma temperatura constante, dentro de um intervalo de alguns milsimos de graus Celsius. Alem disso, no so to sensveis quanto a maioria dos outros tipos de detectores. DETECTOR DE ESPALHAMENTO DE LUZ POR EVAPORAO Recentemente, tornou-se disponvel no mercado um novo tipo de detector genrico para HPLC, o detector de espalhamento de luz por evaporao DELE (em ingls, ELSD evaporative light scattering detector). Neste detector, o efluente da coluna passa por um nebulizador no qual convertido em nevoa fina por um fluxo de nitrognio ou ar. As gotculas so ento conduzidas atravs de um tubo com temperatura controlada no qual ocorre a evaporao da fase mvel, levando a formao de finas partculas de analito. A nuvem de partculas de analito passa ento atravs de um feixe de laser. A radiao espalhada detectada perpendicularmente ao fluxo por um fotodiodo de silcio. A principal vantagem desse tipo de detector que sua resposta aproximadamente a mesma para todos os solutos no-volteis. Alem disso, significativamente mais sensvel do que o detector de ndice de refrao, com limites de deteco comeando em 5 ng/ 25mL. Detectores eletroqumicos de vrios tipos esto atualmente disponveis, de vrios fabricantes. Esses

dispositivos baseiam-se em amperometria, polarografia, coulometria e condutometria. Embora os procedimentos eletroanalticos ainda no tenham sido to explorados como detectores pticos, eles parecem oferecer vantagens, convenincia e ampla aplicabilidade.Esta ultima propriedade est ilustrada na figura abaixo, que apresenta um quadro dos intervalos de potenciais nos quais ocorre a oxidao ou a reduo de 16 grupos funcionais orgnicos.

Em principio, ento, espcies contendo qualquer um desses grupos poderiam ser detectadas por procedimentos amperomtricos, polarogrficos ou coulomtricos. Assim a deteco eletroqumica aparentemente teria potencial para atender as necessidades da HPLC que resiste por longo tempo, a saber, ser um detector sensvel, gera ou universal. Vrias celas de detectores eletroqumicos/HPLC foram descritas na literatura e varias so produzidas comercialmente. Afigura abaixo um exemplo de uma cela de fluxo de camada delgada simples para deteco amperomtrica .

Neste caso a superfcie do eletrodo parte de uma parede do canal formado pela colocao de uma tira de teflon de 50 mm entre dois blocos de plstico Kel-F. O eletrodo indicador de platina, ouro,carbono vtreo ou pasta de carbono. Um eletrodo de referencia, e geralmente tambm um contraeletrodo, so localizados corrente abaixo, aps o bloco do eletrodo indicador. O volume da cela de 1 a 5 mL. Uma modificao til desta cela, disponvel no mercado, inclui dois eletrodos de trabalho que podem operar em serie ou em paralelo. A primeira configurao, na qual o eluente flui primeiramente sobre o segundo, requer que o analito sofra uma oxidao (ou reduo) reversvel no primeiro eletrodo. O segundo eletrodo opera, ento, como catodo (ou um anodo) para determinar o produto de oxidao (ou de reduo). Esse arranjo aumenta a seletividade do sistema de deteco. Uma aplicao interessante desse

sistema a deteco e a determinao dos componentes de misturas contendo tiois e dissulfetos. Neste caso, o primeiro eletrodo de mercrio reduz os dissulfetos a 1,0 V. Isto , RRSS + 2 H + 2e- 2RSH Um eletrodo de mercrio posterior , ento, oxidado na presena de tiois da amostra original e tambm dos que foram formados no primeiro eletrodo. Isto , 2RSH + 2 Hg(l) Hg(SR)2 (s) + 2H+ + 2eNa configurao em paralelo, dois eletrodos esto posicionados, de modo que o eixo entre eles de 90 graus em relao a corrente. Os dois eletrodos podem ser operados em potenciais diferentes (em relao ao eletrodo de referencia), o que costuma dar uma indicao de pureza de pico. Alternativamente, um eletrodo pode ser operado como catodo e o outro como anodo, tornando possvel a deteco simultnea de oxidantes e redutores. DETECTORES DE ESPECTROMETRIA DE MASSA Um problema fundamental no acoplamento de cromatografia com espectrometria de massa o enorme descompasso entre os volumes relativamente grandes de solventes da primeira e os requisitos de vcuo da segunda. Vrias interfaces foram desenvolvidas para resolver esse problema. Em uma, disponvel no mercado, o eluente da coluna dividido, e apenas uma pequena frao introduzida diretamente no espectrmetro de massa.Sistema de introduo direta de liquido parecem promissores quando usados em conjuno com de microdimetros, que tipicamente trabalham com vazes de 10 a 50 mL/min. Em um segundo tipo de interface, que tambm vendida comercialmente, o efluente depositada sobre uma correia continua ou sobre um fio que se move e transporta o solvente e o analito para uma cmara aquecida para remoo do primeiro por volatizao. Aps a evaporao do solvente, os resduos do analito sobre a correia ou sobre passam pela da fonte de ons na qual ocorre a desoroionizao. Uma interface nova e promissora, atualmente no mercado, a chamada termospray ou seja, um termonebulizador que atua como uma interface, permitindo a introduo direta do efluente total da coluna em vazes to altas como 2 mL/min. Com essa interface o liquido vaporizado a medida que ele passa atravs de um tubo capilar aquecido, de ao inoxidvel para formar um jato de aerossol de molculas de solvente e do analito. Na nuvem formada o analito ionizado atravs de um mecanismo de troca de carga com um sal, como acetato de amnio que q incorporado ao eluente. Assim, o termonebulizador no apenas uma interface, mas tambm uma fonte de ionizao. Os espectros resultantes so geralmente simples e fornecem dados de peso molecular porem eles no apresentam os detalhes que fazem os espectros por impacto de eltrons to teis para fins de identificao.E ainda mais, o termonebulizador aplicvel somente a molculas polares de analito e a fases moveis polares que dissolvem um sal como acetato de amnio. Com essas limitaes o termonebulizador fornece espectros para um amplo intervalode compostos termicamente estveis e no-volteis como peptdeos e nucleotdeos. Foram relatados limites de deteco baixos como 1 a 10 picogramas. Recentemente foi introduzida no mercado uma nova interface que possibilitou a obteno de espectros por ionizao qumica ou por impacto de eltrons. Neste dispositivo a nebulizacao trmica e a dessolvatao ocorrem simultaneamente para produzir uma mistura de molculas de soluto particulado e de molcula da fase mvel gasosa. Este aerossol acelerado atravs de um esguicho para a regio de vcuo onde as molculas da fase mvel so bombeadas para fora. As molculas do analito so ento ionizadas por um feixe de eltrons ou quimicamente. Controle por computador e armazenamento de dados so geralmente usados como detectores de espectrometria de massa. Pode-se obter tanto os cromatogramas em tempo real ou reconstrudos por computador e os espectros dos picos eludos. Atualmente, os equipamentos pra HPLC/MS ainda no esto completamente desenvolvidos como os equipamentos para GC/MS. No entanto, essa situao deve mudar nos prximos anos.