7 GENTICA MOLECULAR

TEMA 7 (4 horas) INTRODUCCION A LA GENTICA MOLECULAR. Mutacin. Recombinacin y Manipulacin gentica.

OBJETIVOS ESPECFICOS Al finalizar el tema el estudiante podr: 1. Resumir los procesos de replicacin, transcripcin y traduccin de los cidos nuclicos en las bacterias. 2. Definir mutacin. Tipos de mutaciones. 3. Dar ejemplos de diferentes tipos de mutantes (catablicas, anablicas, resistentes a drogas, y a fagos) 4. Analizar las consecuencias de las diferentes categoras de mutaciones. 5. Describir los mtodos utilizados para el aislamiento de mutantes nutricionales. 6. Dar ejemplos de agentes mutagnicos, sealando su mecanismo de accin. 7. Explicar los mecanismos de reparacin del ADN bacteriano. 8. Sealar las aplicaciones prcticas de la mutagnesis.

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9. Sealar la importancia de los procesos de regulacin de la expresin gentica de las bacterias. 10. Comparar los mecanismos de regulacin de operones inducibles y represibles y sujetos a represin por catabolito. 11. Analizar el efecto de mutaciones en algunos de los constituyentes de un opern, sobre la expresin del mismo. 12. Distinguir entre transformacin, conjugacin y transduccin como formas de recombinacin en los microorganismos. 13. Explicar resumidamente en qu consiste la manipulacin gentica, contrastar los beneficios y peligros potenciales de la misma.

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GENTICA La Gentica es la ciencia que estudia lo relacionado con la herencia, esto incluye qu son los genes, cmo ellos llevan esa informacin, cmo se replican y pasan a las generaciones posteriores y cmo la expresin de su informacin dentro de un organismo determina sus caractersticas particulares. En este captulo de Introduccin a la Gentica Bacteriana, revisaremos, a un nivel bsico, los aspectos de la gentica de los microorganismos que son importantes para la comprensin de otros temas que son contemplados en sta o en otras asignaturas, sin profundizar en los detalles que ya fueron cubiertos en la asignatura Bioqumica, la cual es prelacin de Microbiologa. NATURALEZA DEL MATERIAL GENTICO Los cromosomas son estructuras celulares que llevan la informacin hereditaria; en estos cromosomas estn contenidos los genes. En las bacterias el cromosoma est constituido por una sla molcula de ADN circular con unas protenas asociadas. Los genes son segmentos de ADN (excepto en algunos virus en que son ARN) que codifican por productos funcionales. Recordemos entonces que el ADN es una macromolcula constituida por unidades repetitivas de nucletidos. Cada nucletido consta de una base nitrogenada (adenina (A), timina (T), citosina (C) o guanina (G)), una pentosa (desoxirribosa) y un grupo fosfato. El ADN es una molcula de doble cadena de nucletidos, las dos cadenas se mantienen unidas mediante puentes de hidrgeno entre sus bases nitrogenadas. El apareamiento de las bases ocurre siempre en una forma especfica: la adenina siempre se aparea con la timina y la citosina siempre se aparea con la guanina, debido a esto la secuencia de bases de una cadena determina la secuencia de la otra, a esto se le denomina complementariedad. Esta propiedad es importante porque permite la replicacin de la molcula de ADN conservando fielmente la informacin. Para que este apareamiento sea posible ambas cadenas estn orientadas en direccin opuesta, una con respecto a la otra, a eso se le dice que son antiparalelas.

De la misma manera la informacin contenida en el ADN puede ser copiada por partes, en molculas especficas de ARN denominadas ARN mensajeros (ARNm), este proceso se denomina transcripcin. La informacin codificada en el ARNm es luego traducida en una secuencia especfica de aminocidos que forman una protena. Este ltimo proceso se denomina traduccin.

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REPLICACIN DEL ADN En la replicacin del ADN, una molcula original de ADN de doble cadena es convertida en dos molculas hijas de ADN idnticas. La clave para entender esta replicacin del ADN es la estructura complementaria de las secuencias de los pares de bases en las dos cadenas del ADN, una cadena sirve de molde para la produccin de la otra.

La replicacin del ADN requiere la presencia de protenas celulares complejas que dirigen una secuencia particular de eventos. Cuando comienza la replicacin, las dos cadenas se desenrollan y se separan una de otra en un pequeo segmento de la molcula. Los nucletidos libres presentes en el citoplasma de la clula se unen a las bases expuestas del fragmento de ADN de cadena simple expuesto de la molcula original. Donde hay T en la cadena original se incorporar una A, y donde hay G se incorporar una C. La replicacin del ADN comienza siempre en el mismo punto llamado de iniciacin u origen. En este punto de iniciacin y zonas cercanas a l, se unen a las cadenas de ADN molculas de protenas desenrolladoras, las cuales hacen que el ADN en esa zona se abra formando una especie de burbuja, en este momento una ARN polimerasa ADN dependiente se une al punto de iniciacin mediante la ayuda de una o ms protenas iniciadoras especficas, las cuales son las que reconocen el punto de iniciacin. Aparentemente este punto de iniciacin est anclado a la membrana celular y dicho anclaje parece ser necesario para ayudar a compensar las fuerzas de torsin que se originan cuando el cromosoma se desenrolla para ser copiado.

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El desenrollamiento de la doble hlice y el que las dos cadenas se mantengan separadas es posible por varias protenas especializadas. Enzimas conocidas como helicasas desenrollan fragmentos cortos de ADN por delante de la horquilla de replicacin. El desenrollamiento del ADN requiere energa que es aportada por la hidrlisis de dos molculas de ATP. Tan pronto como una secuencia corta se ha desenrollado, varias molculas de unas protenas que se unen al ADN de cadena simple (se conocen en ingls como DBA por DNA binding proteins) se unen fuertemente a cada una de las cadenas simples mantenindolas separadas para que puedan actuar las enzimas de la replicacin. En 1 de la figura siguiente puede observarse una clula joven recin formada y en fase de crecimiento activo, por lo que su cromosoma ya ha iniciado la replicacin. En 2 ya el cromosoma se ha duplicado y en 3 comienza la divisin para dar origen a dos nuevas clulas. Igualmente comienza la replicacin del cromosoma, de manera que en el momento de separarse las dos clulas en 4, ya la duplicacin est bastante avanzada. De igual manera se continuar repitiendo el mismo ciclo para dar origen a nuevas clulas.

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En la tabla siguiente se resume el papel de las principales protenas que participan en la replicacin del ADN sealando el sustrato y la funcin. Protena Sustrato(s) Funcin Mantiene separadas las cadenas negativo

Protenas que se unen al ADN de ADN de cadena simple cadena simple Topoisomerasas (girasas)

ADN de cadena doble, Superenrollamiento requiere ATP del ADN ADN de cadena doble

Helicasa

Desenrolla el ADN en la horquilla de replicacin

Primasa (ARN polimerasa dependiente) ADN polimerasa III (1) sintetasa

ADN ADN de cadena doble, Forma el ARN cebador (pritrifosfato-5-ribonucletidos mer)

ARN cebador en el ex- Forma las nuevas cadenas del tremo 3 , trifosfato-5- ADN desoxirribonucletidos Bases apareadas en for- Corrige errores ma incorrecta Remueve el ARN cebador ARN cebador (5 3 ) Bases apareadas en for- Corrige errores ma incorrecta ADN de cadena simple Reemplaza el ARN cebador con ADN Fragmentos de ADN de Une los extremos cadena simple

(2) ADN exonucleasa

ADN polimerasa I (1) ARN exonucleasa (2) ADN exonucleasa (3) sintetasa ADN ligasa

Para entender el papel de esas enzimas debemos ver lo que sucede en la horquilla de replicacin. Ya dijimos que a partir del origen o punto de iniciacin la replicacin ocurre sobre las dos cadenas originales simultneamente, pero este crecimiento es ligeramente diferente en las dos cadenas de ADN. La cadena 3' 5' del ADN que sirve de molde para la cadena nueva de ADN que se forma en sentido 5' 3, es sintetizada continuamente por la ADN polimerasa III y se le llama cadena conductora. En contraste la otra cadena (cadena seguidora) se sintetiza en forma discontinua en pequeos segmentos de 1000 a 2000 nucletidos. Para que la ADN polimerasa pueda copiar en este sentido, requiere de unos fragmentos de ARN cebadores (primers) sintetizados por una ARN polimerasa ADN dependiente, a la cual se le ha denominado primasa. En el extremo 3 de este ARN cebador se aaden luego las unidades de desoxirribonucletidos complementarios a la cadena original de ADN que sirve de molde. Una vez que se ha sintetizado un corto fragmento de ADN, el ARN cebador es degradado nucletido a nucletido, por la actividad ARN exonucleasa de la ADN polimerasa I, a medida que cada ribonucletido es removido, es reemplazado por el desoxirribonucletido correspondiente por la ADN polimerasa I y los extremos 5 y 3 son unidos por la accin de la ADN ligasa.

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TRANSCRIPCIN El paso de la informacin gentica contenida en el ADN al ARN se denomina transcripcin. Se conocen tres tipos fundamentales de ARN, el ARN mensajero (ARNm), el ARN de transferencia (ARNt) y el ARN ribosmico (ARNr), todos ellos productos de la transcripcin del ADN. Es importante sealar que el ARN acta a dos niveles: el gentico y el funcional. A nivel gentico el ARNm es portador de la informacin gentica contenida en el ADN. A nivel funcional el ARNr forma parte de los ribosomas y el ARNt interviene en el reconocimiento de los aminocidos para ser incorporados en la sntesis de las protenas codificadas en el ARNm. La transcripcin de la informacin gentica del ADN al ARN es llevada a cabo por una enzima llamada ARN-POLIMERASA o TRANSCRIPTASA. Una de las ARN polimerasas mejor estudiadas es la de la Escherichia coli; esta enzima est constituida por cinco sub8

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unidades polipeptdicas denominadas: , ', dos pptidos , y . La subunidad sigma () no est fuertemente unida y se disocia con facilidad, originndose lo que se denomina el ncleo de la enzima mnima. El lugar del ADN en el cual se inicia la sntesis del ARNm, no es un lugar cualquiera seleccionado al azar por la enzima, para cada GEN (conjunto de tripletes del ADN que codifican por la sntesis de una determinada protena) o grupo de genes relacionados (OPERN), hay un lugar especfico para la iniciacin de la sntesis del ARNm, este lugar se denomina PROMOTOR. La ARN polimerasa puede unirse reversiblemente al ADN en varios sitios, pero cuando esta unin se hace en el promotor, la subunidad reconoce a la secuencia nucleotdica, estabilizando el complejo ADN-ARN POLIMERASA, lo cual permite que la enzima inicie la separacin de las cadenas de la doble hlice del ADN, comenzando la transcripcin. La transcripcin se inicia mediante la unin de dos nuclesidos trifosfato a la enzima, siendo las bases de estos nuclesidos complementarias a las del ADN. Luego de reaccionar estos nuclesidos se origina el correspondiente dinuclesido trifosfato y pirofosfato; la ARN polimerasa se va desplazando progresivamente a lo largo del ADN incorporando nuevas bases, y a medida que ella abandona una regin del ADN, la doble hlice de ste se cierra nuevamente. Una vez que se ha formado una pequea porcin de ARN, el factor se disocia; y la transcripcin sigue siendo catalizada por el ncleo mnimo de la enzima. Normalmente, en el proceso de transcripcin, slo la informacin contenida en una de las dos cadenas del ADN es transcrita. La terminacin de la sntesis del ARNm tambin ocurre en lugares especficos del ADN, mediante uno de estos mecanismos de terminacin: 1. Terminacin codificada por una secuencia del ADN que es reconocida por la ARN polimerasa como una seal de fin del mensaje. Terminacin que adems de una secuencia de ADN que indica el fin del mensaje requiere factores proteicos adicionales. Por ejemplo, en la E. coli, un tipo de terminador de la transcripcin requiere de una protena llamada rho (), esta protena no se une al ADN ni a la ARN polimerasa sino que se une al ARN que se est sintetizando y se mueve hacia el complejo ARN polimerasa-ADN. Cuando la ARN polimerasa se detiene en la seal de terminacin dependiente de , ste puede hacer que el ARN y la polimerasa se separen del ADN, terminando as la transcripcin.

2.

La transcripcin del ADN se efecta en direccin 5' 3, y usualmente una molcula de este cido ribonucleico mensajero contiene la informacin para la sntesis de una sola molcula proteica, pero en muchas oportunidades un ARNm puede codificar la sntesis de varias protenas, esto generalmente ocurre cuando es el producto de la transcripcin de un opern.

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SNTESIS DE PROTENAS (TRADUCCIN) El ARNm va a los ribosomas de la clula, los cuales leen el mensaje que ste trae y proceden a la sntesis de la correspondiente protena. Este proceso se denomina TRADUCCIN; con frecuencia y errneamente, el trmino TRANSLATION con el cual se denomina este proceso en ingls, es traducido TRASLACIN, lo cual en castellano tiene un significado que no guarda relacin con el proceso que se pretende describir. Para proceder a esa traduccin la lectura del mensaje contenido en el ARNm se lee por grupos de tres bases denominados CODONES, y cada codn codifica por un determinado aminocido. El conjunto de codones se conoce como CDIGO GENTICO. Hay 64 posibles combinaciones de las cuatro bases en secuencias de tres, y como hay slo 20 ami-

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nocidos, ms de un codn codifica por un mismo aminocido, por lo que se dice que el cdigo gentico es DEGENERADO. Hay tres codones que no codifican por ningn aminocido, ellos se denominan CODONES SIN SENTIDO, los cuales actan como signos de puntuacin sealando la terminacin de la sntesis de la protena codificada por un determinado gen.

Los aminocidos no son capaces de reconocer la informacin contenida en los codones, por consiguiente ellos se unen a un ARN que tiene una secuencia de bases denominada ANTICODN, la cual es capaz de reconocer los codones del ARNm que codifican por los distintos aminocidos. Este ARN es denominado ARN de TRANSFERENCIA o ARNt y los aminocidos se unen a l mediante la energa aportada por el ATP para formar un aminoacil-ARNt. Para cada aminocido existe un ARNt y en algunos casos existe ms de un ARNt para el
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mismo aminocido. Cada aminocido se une a su ARNt por mediacin de enzimas altamente especficas, denominadas aminoacil ARNt sintetasas.

Aunque la molcula del ARNt est constituida por una sola cadena, debido al plegamiento de la misma, hay grandes zonas de doble cadena, originadas por la complementacin de las bases al quedar adyacentes por el citado plegamiento. Varias partes de la molcula de ARNt tiene funciones especficas en el proceso de traduccin, estas partes se sealan en la figura siguiente:

Una de las partes variables de la molcula de ARNt contiene el anticodn, otra regin llamada asa T C ( es el smbolo de la pseudouridina) es la que se une al ribosoma, mientras que el asa D est involucrada en la unin a la enzima activadora (aminoacil ARNt sintetasa). Como puede observarse en la figura, en el extremo 3' de la molcula de ARNt, hay una secuencia de tres nucletidos (CCA) que es igual para todos los ARNt; es con la ribosa unida a la base A terminal, que va a reaccionar el aminocido, unindose mediante un enlace ster.

El ARNm no puede comenzar a ser traducido en cualquier punto de su cadena, ya que habra una alteracin de la informacin en l contenida. Hay puntos especficos para la iniciacin de la traduccin, estos puntos son los codones que codifican por la incorporacin de formil metionina en la protena (GUG y AUG), y para los que existen los ARNt correspondientes. Por tal razn las protenas tienen como primer aminocido formil metionina o metionina, sin embargo, en ciertos organismos existen enzimas capaces de eliminar la formil metionina inicial de la protena, quedando entonces como primer aminocido el que ocupaba el segundo
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lugar. En el proceso de traduccin podemos distinguir las siguientes fases: 1. 2. 3. INICIACIN ELONGACIN TERMINACIN Y LIBERACIN

INICIACIN Los ribosomas de las bacterias constan de dos subunidades con constantes de sedimentacin de 30 S y 50 S respectivamente, el ribosoma es activo cuando sus dos subunidades estn asociadas, y en el proceso de asociacin y disociacin de las mismas tiene gran importancia la concentracin de Mg++ (5 mM ptima). Cuando los ribosomas no estn sintetizando protenas, se encuentran disociados en sus dos subunidades. El proceso de iniciacin de la sntesis de protenas requiere de la participacin de tres protenas especficas denominadas FACTORES DE INICIACIN (IF-1, IF-2 e IF-3). Para iniciarse la sntesis de las protenas, la subunidad 30 S del ribosoma forma un complejo con IF-3 y a este complejo se une el ARNm, luego de unido el ARNm se combina a este complejo IF-1. Por otra parte IF-2, la formil metionina-ARNt y un GTP, se unen para dar otro complejo, el cual se une con el antes formado para dar origen a un gran complejo denominado COMPLEJO DE INICIACIN, constituido por: la subunidad 30 S, el ARNm, el formil metionina-ARNt, los tres factores de iniciacin y GTP. El complejo de iniciacin se une a la subunidad 50 S del ribosoma para formar el ribosoma completo, 70 S, el cual es activo. En este proceso el GTP es hidrolizado a GDP y fosfato, y los tres factores de iniciacin se disocian del ribosoma. ELONGACIN En los ribosomas existen dos regiones denominadas A y P respectivamente, la regin A es el sitio para el aminocido, el cual recibe al ARNt con su correspondiente aminocido, y el sitio P lugar peptdico, el cual recibe el ARNt con la cadena peptdica en formacin. En el proceso de elongacin ya tenemos la formil metionina-ARNt correspondiente al primer codn en el sitio P. Para que el aminoacil-ARNt correspondiente al segundo codn del ARNm se fije en el sitio A del ribosoma es necesario que reaccione con una protena denominada FACTOR DE ELONGACIN T(EF-T) el cual est constituido por dos subunidades: EF-Ts y EF-Tu. En primer lugar EF-T reacciona con GTP para formar el complejo EF-Tu-GTP con liberacin de EF-T, este complejo se une al aminoacil-ARNt para formar el complejo EFTu-GTP-aminoacil-ARNt. Este complejo se une al ribosoma de forma tal que el aminoacilARNt queda colocado en el lugar A con su anticodn unido mediante puentes de hidrgeno al codn correspondiente en el ARNm. Simultneamente el GTP del complejo es hidrolizado a GDP y fosfato, abandonando el ribosoma en la forma del complejo EF-Tu-GDP. La energa producida por la hidrlisis del GTP parece ser requerida para colocar el aminoacil-ARNt en la posicin correcta. Al estar unidos a los sitios P y A del ribosoma la formil metionina y el aminoacil-ARNt respectivamente, la reaccin entre el grupo amino del aminoacil-ARNt y el carboxilo de la formil metionina-ARNt para formar el primer enlace
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peptdico, es catalizada por la enzima PEPTIDIL TRANSFERASA, la cual se encuentra en la subunidad 50 S del ribosoma. El producto de la reaccin es un dipeptidil-ARNt unido al sitio A, en el lugar P se encuentra ahora un ARNt vaco, sin ningn aminocido unido a l. Para lograr que el ribosoma se desplace a lo largo el ARNm para que pueda leer el siguiente codn, y para que el dipeptidil-ARNt pase del lugar A al lugar P, se requiere de una protena llamada FACTOR DE ELONGACIN G (EF-G). EF-G reacciona con GTP para originar un complejo que se une al ribosoma, una vez unido, el GTP se hidroliza a GDP y fosfato. Esta hidrlisis produce la energa necesaria para desplazar el ribosoma al prximo codn y el peptidil-ARNt al sitio P; este proceso se denomina TRANSLOCACIN. Todo el proceso se repite hasta que haya sido incorporado a la cadena peptdica, el ltimo aminocido codificado por el ARNm para esa protena en particular. TERMINACIN Y LIBERACIN Despus de ser aadido el ltimo aminocido a la cadena peptdica, sta se encuentra unida covalentemente por su grupo carboxilo terminal al ARNt, el cual se encuentra situado en el lugar A del ribosoma. La liberacin del polipeptidil-ARNt del ribosoma es promovida por tres protenas llamadas FACTORES DE LIBERACIN (R1-R2-R3). Los factores de liberacin se unen al ribosoma ocasionando que el peptidil-ARNt se desplace del lugar A al P, y el enlace entre el ARNt y la cadena peptdica es hidrolizado aparentemente por la peptidil transferasa, cuya especificidad y accin cataltica parecen haber sido alteradas por la unin con los factores de liberacin. Una vez que la protena es liberada, el ltimo ARNt y el ARNm se separan del ribosoma, el cual entonces se disocia en sus dos sub-unidades, quedando en condiciones de iniciar el proceso de nuevo. Usualmente un mismo ARNm es traducido por varios ribosomas al mismo tiempo, y mientras ms cercano al final del ARNm se encuentre un ribosoma, mayor ser la longitud de la cadena peptdica ya que en ella se habrn incorporado la casi totalidad de los aminocidos de su secuencia. Esta asociacin de un ARNm con varios ribosomas es denominada POLISOMA o POLIRIBOSOMA.

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MUTACIN En los ltimos aos se han hecho grandes progresos en el conocimiento de la manera cmo los seres vivos transmiten sus caractersticas a sus descendientes. Muchos de los experimentos que han permitido lograr este conocimiento, han sido efectuados utilizando microorganismos, por presentar ellos un conjunto de ventajas para el estudio de los fenmenos de la herencia. Algunas de esas ventajas son: Tienen un tiempo de generacin corto, lo que permite estudiar muchas generaciones y los efectos que sobre ellas tienen diversos factores, en un muy corto tiempo. Son genticamente simples, tienen un solo cromosoma, son haploides.

Antes de proseguir definiremos algunos trminos utilizados frecuentemente en gentica de microorganismos. CEPA O CLN Es una poblacin de clulas en la cual todas son descendientes de una sola clula, y por tal razn deben ser genticamente idnticas. GENOMA Es la totalidad de los genes presentes en un organismo. Este trmino es equivalente al de GENOTIPO. FENOTIPO Son todas las caractersticas del organismo observables por el investigador. Debido a que no todos los genes son expresados al mismo momento y en todo momento, el medio ambiente ejerce notable influencia sobre los caracteres de un organismo que son expresados, es decir influye marcadamente sobre el fenotipo. Por ejemplo est el muy conocido caso de bacterias que producen - galactosidasa, pero que slo lo hacen cuando hay lactosa presente en el medio de cultivo. La Serratia marcescens produce un pigmento rojo a temperatura ambiente mientras que a 37C no lo produce. Como puede apreciarse las modificaciones fenotpicas son transitorias, dependen del medio ambiente y tan pronto como ste es cambiado, se recuperan las propiedades originales. Los microorganismos pueden experimentar cambios permanentes en sus propiedades y estos cambios son transmitidos a su descendencia. Este tipo de cambio permanente y hereditario, implica una modificacin del genotipo y puede ocurrir por MUTACIN o por RECOMBINACIN. MUTACIN Se puede definir mutacin, como cualquier alteracin permanente en la secuencia de bases del ADN del genoma de un organismo. Esta alteracin trae como consecuencia la prdida de alguna de las propiedades que posea el organismo mutado y/o la aparicin de alguna nueva propiedad que l no posea.

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Las mutaciones pueden producirse espontneamente, pero ste es un fenmeno que ocurre con poca frecuencia, frecuencia que puede aumentarse sometiendo los microorganismos a la accin de ciertos agentes tales como los rayos X, la radiacin ultravioleta, perxidos orgnicos, gas mostaza, xido nitroso, etc. Las mutantes obtenidas mediante este procedimiento se denominan MUTANTES INDUCIDAS y el agente inductor se llama MUTGENO. El nmero de mutantes que se originan en una poblacin bacteriana se expresa por la TASA o VELOCIDAD DE MUTACIN, la cual puede definirse como la posibilidad de mutacin de una clula en un tiempo determinado, habitualmente el tiempo elegido es una generacin o ciclo de divisin de la clula. As una tasa de mutacin de 1 x 10-8 significa que cuando 108 clulas se dividen para dar origen a 2 x 108 clulas, se originar una clula mutante, y cuando estas 2 x 108 clulas se dividen nuevamente para dar origen a 4 x 108 clulas, se originan dos nuevas clulas mutantes. Generaciones No. clulas No. mutantes Total mutantes 8 0 0 n 10 2 2 n+1 2x108 n+2 4x108 2 2 4 n+3 8x108 4 4 4 12 8 8 8 8 32 n+4 16x108 16 16 16 16 16 80 n+5 32x108 y as sucesivamente. Prcticamente cualquier propiedad de un microorganismo puede ser alterada por mutacin. Entre los tipos de mutantes ms frecuentemente estudiados estn: Mutantes cuya resistencia a agentes inhibidores est aumentada, principalmente su resistencia a los antibiticos. Mutantes que presentan alterada alguna propiedad fermentativa, como es el caso de algunas bacterias que eran capaces de fermentar un determinado carbohidrato y dejan de hacerlo. Mutantes cuyas vas anablicas son alteradas perdiendo la capacidad de sintetizar algn nutriente que les es esencial, requiriendo un medio de cultivo al cual hay que aadirle dicho nutriente. Mutantes que pierden la motilidad por incapacidad para sintetizar la protena flagelar. etc.

Entre las mutaciones podemos distinguir dos clases, las MUTACIONES NO SELECTIVAS y las MUTACIONES SELECTIVAS. Las no selectivas son aquellas en las cuales el carcter que ha mutado no les representa ventaja o desventaja alguna, por ejemplo un cambio en la capacidad para producir un pigmento. Una mutacin selectiva le confiere a la mutante ventajas sobre ciertas condiciones ambientales, de manera que la descendencia de esa mutante puede crecer en un determinado medio mientras que las no mutantes no lo pueden hacer. Por ejemplo si una bacteria muta hacin-

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dose resistente a una droga, esta mutante resistente puede crecer en presencia de la droga mientras que la no mutada no puede crecer, transformndose de esta manera toda la poblacin en resistente. En algunas oportunidades la mutacin produce una alteracin tal que el microorganismo no puede multiplicarse y muere, este tipo de mutaciones se llaman MUTACIONES LETALES. Existen adems las llamadas MUTACIONES LETALES CONDICIONADAS, por ejemplo cuando por mutacin una bacteria pierde la capacidad de sintetizar un nutriente imprescindible para poder vivir, si la bacteria es cultivada en un medio que carece de ese nutriente, ella no puede crecer y muere, pero si se le suministra este nutriente ella puede crecer. AISLAMIENTO DE MUTANTES El procedimiento utilizado para aislar las mutantes depender de la propiedad alterada por la mutacin, as tenemos que una bacteria cuya resistencia a una droga haya sido desarrollada por mutacin, puede ser aislada cultivndola en un medio de cultivo que contenga dicha droga, la cual impedir que las bacterias que no han mutado puedan crecer, permitiendo el desarrollo de las que han mutado. En el caso de las mutantes que han perdido la capacidad de sintetizar algn nutriente que les es indispensable, ellas pueden ser aisladas aprovechando la propiedad que tiene la penicilina de actuar slo sobre las bacterias que estn creciendo y multiplicndose. El procedimiento consiste en colocar la poblacin bacteriana que contiene las mutantes en un medio de cultivo que carece del nutriente necesario para ellas; a este medio de cultivo se le ha aadido penicilina en concentracin bactericida. Las mutantes no crecern por carecer del nutriente y por consiguiente no son afectadas por la penicilina. Por el contrario las clulas no mutadas crecern y sern destruidas por la penicilina. Luego se aade penicilinasa para destruir la penicilina y se siembran las clulas sobrevivientes en un medio completo, que contenga el nutriente que no puede sintetizar la mutante, con lo cual se logra que estas crezcan. Por supuesto, es necesario comprobar que las clulas obtenidas no son capaces de sintetizar el nutriente al cual nos hemos venido refiriendo. Las mutantes que han perdido la capacidad de sintetizar un nutriente que les es imprescindible, pueden tambin ser aisladas mediante el mtodo de la REPLICA EN PLACA el cual consiste en lo siguiente: La poblacin bacteriana que contiene las mutantes es sembrada en un medio de cultivo completo que contiene el nutriente que las mutantes no pueden sintetizar. El medio usado es slido y las bacterias se diseminan sobre su superficie de manera de obtener colonias aisladas. Lgicamente en este medio crecern tanto las clulas mutadas como las no mutadas. Una vez obtenidas las colonias, se usa un disco cubierto con tela, el cual se pone en contacto con la superficie del medio de cultivo donde han crecido las colonias, quedando porciones de ellas adheridas a la tela, luego el disco se oprime sobre la superficie de una placa que contiene medio de cultivo al cual le falta el nutriente (medio mnimo) que las mutantes no pueden sintetizar, las mutantes no crecern y las colonias que aparezcan en este medio correspondern a las bacterias no mutadas. Por comparacin con la placa original se podr determinar cules de las colonias que aparecen en ellas no se multiplicaron en la placa de medio de cultivo mnimo. Esas colonias correspondern a las clulas mutadas.

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NOMENCLATURA DE LAS MUTANTES Habitualmente se designan con la caracterstica fenotpica que ha sido alterada, por ejemplo las mutantes incapaces de usar la lactosa como fuente de energa se llaman lac- y las que si pueden usarla se llaman lac+, las que no sintetizan triptfano se denominarn trp- y las que si lo sintetizan trp+. A cada mutante para un mismo carcter se le asigna un nmero, as por ejemplo trp-12, significa que es la mutante No. 12 aislada y que requiere triptfano. BASES MOLECULARES DE LA MUTACIN Hay varias clases de alteraciones en el ADN que dan origen a mutaciones, entre ellas podemos distinguir las siguientes: MUTACIONES PUNTUALES Implican un cambio o supresin de un solo nucletido. Estas mutantes pueden subdividirse en cuatro clases de acuerdo al cambio sufrido por el ADN; estas clases son: Transicin Transversin Insercin Eliminacin

Transicin
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En este tipo de mutacin puntual, un par de bases es cambiado por otro, sustituyendo una purina por otra purina o una pirimidina por otra pirimidina, por ejemplo un par A-T es cambiado por un G-C o un G-C por un A-T. Estas mutantes ocurren espontneamente, pero pueden ser inducidas por anlogos de las bases, particularmente por el 5 Bromo uracilo y la 2 amino purina. Dado que el bromouracilo (BU) posee una notable semejanza estructural con la Timina, durante el proceso de replicacin del ADN se inserta en ste reemplazando a la Timina. La forma cetnica del BU, que se apareara con la Adenina tal como lo hace la Timina, experimenta tautomerizacin transformndose en la forma enlica, la cual se aparea an ms fcilmente con la Guanina, por consiguiente la sustitucin de T por BU conduce a la incorporacin de G con preferencia a A, y cuando sta cadena se replica, G se aparea con C en la nueva cadena. Transversin En este tipo de mutaciones, al igual que en el anterior, un par de bases es cambiado por otro pero sustituyendo una purina por una pirimidina y una pirimidina por una purina. Este tipo de mutacin ocurre comnmente en las mutaciones espontneas. Insercin Este tipo de mutaciones involucran la insercin de un par extra de bases, y son fcilmente inducidas por derivados de la acridina, los cuales se intercalan entre dos bases sucesivas del ADN, separndolas; cuando la cadena de ADN se replica, una base extra se inserta en la cadena complementaria en un lugar opuesto a la acridina. Cuando esta cadena se replica, la nueva cadena tambin contendr una base extra complementaria a la que se haba insertado por efecto de la acridina. Eliminacin Este tipo de mutacin consiste en la eliminacin de una o ms bases del ADN, lo cual puede ser inducido por reactivos deaminantes o alquilantes que originan la formacin de bases que no pueden aparearse, tambin puede ocurrir esta mutacin por prdida hidroltica de una base prica a bajo pH. Lgicamente slo sern puntuales si la eliminacin es de una sola base. Las mutaciones puntuales no son siempre letales, las transiciones y transversiones son relativamente benignas porque inducen la sustitucin de un solo aminocido en la cadena peptdica que es codificada por el gen mutado, y en muchas oportunidades la protena, aunque defectuosa, es todava funcional, pasando inadvertida la mutacin, por lo que se denomina MUTACIN SILENCIOSA. Sin embargo, en algunas oportunidades cuando un aminocido como la glicina es reemplazado por otro de los aminocidos que poseen ms de un grupo amino o ms de un carboxilo, los cuales conferirn a la protena, cargas elctricas mayores que las que le confiere la glicina, estas cargas tendrn marcado efecto sobre el plegamiento de la molcula proteica con la consiguiente alteracin de su estructura y actividad. Las mutaciones de insercin o de eliminacin son ms graves porque provocan una lectura errnea del ADN ms all del punto de la mutacin, y generalmente son letales.
CONSECUENCIAS DE LAS MUTACIONES

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Codn original

Codn Original

Codn Original

Codn Original

Codn Original

Codn que Codn que codifica por Codn que codifica codifica por el un a.a. de funcin similar por un a.a. de funmismo a.a. cin diferente

Codn sin sentido

Inserciones o Eliminaciones

Protena igual Protena diferente pero Protena defectuosa funcional

Detencin de la lectura

Desplazamiento de la lectura

REPARACIN DEL ADN Los seres vivientes estn sometidos constantemente a la accin de agentes mutagnicos que se encuentran en el ambiente donde ellos se desarrollan, con la consiguiente alteracin de su material gentico. Igualmente ocurren alteraciones espontneas de dicho material gentico, considerndose espontneas en el sentido de que no se conoce que algn mutgeno haya sido introducido en su ambiente. Es lgico asumir que los seres vivientes deben poseer algn mecanismo que les permita reparar los daos causados a su material gentico, ya que de lo contrario la frecuencia de las mutaciones sera mucho mayor. Uno de los agentes mutagnicos ms ampliamente estudiado es la radiacin ultravioleta (UV), y se conoce que ella ejerce su efecto provocando la asociacin de dos molculas de timina adyacentes en el cromosoma para formar un dmero, el cual causa una distorsin del cromosoma e impide su normal duplicacin, y as tenemos, que una bacteria con unos pocos dmeros de timina en su cromosoma, no puede multiplicarse. Se ha encontrado que el efecto letal de la radiacin UV sobre las bacterias puede ser revertido por exposicin a la luz visible ordinaria. Este fenmeno se denomina FOTOREACTIVACIN, y se ha determinado que l ocurre cuando una enzima, que poseen las bacterias en las que se produce este tipo de mecanismo de reparacin del ADN, es activada por la absorcin de un fotn de la luz visible, y acta sobre el dmero de timina transformndolo en los correspondientes monmeros. Otro tipo de mecanismo de reparacin del ADN, ha sido identificado en la E. coli, y por no requerir de la luz visible ha sido denominado REACTIVACIN A OSCURAS; tambin ha sido llamado REPARACIN POR EXCISIN. Para la realizacin de este mecanismo de reparacin se requiere de varias enzimas que actan secuencialmente. Primero acta una endonucleasa que aparentemente reconoce la ubicacin del dmero de timina por la distorsin que ste causa en la doble hlice del ADN, esta endonucleasa
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rompe la cadena del ADN donde se encuentra el dmero de timina, luego una exonucleasa entra en la apertura originada por esta rotura y digiere una porcin de la cadena de ADN, incluyendo al dmero; por ltimo una polimerasa sintetiza el fragmento de cadena de ADN necesario para reemplazar la porcin digerida y una ligasa la une al cromosoma.

APLICACIONES PRCTICAS DE LA MUTAGNESIS La induccin y seleccin de mutantes tiene grandes aplicaciones, tanto de ndole comercial, cientfico, de salud pblica, e incluso aplicaciones blicas.
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En la actualidad muchas sustancias son obtenidas por procesos en los que intervienen microorganismos, como es el caso de los antibiticos, vitaminas, aminocidos, y muchas otras, y mediante los mtodos descritos se pueden inducir y seleccionar mutantes que produzcan estas sustancias con mayor eficiencia, lo que permite su obtencin en mayor cantidad y a ms bajo costo. Tambin pueden obtenerse mutantes que manteniendo su capacidad inmunognica tengan reducida su virulencia natural, con las cuales se pueden lograr vacunas ms eficientes para proteger contra las enfermedades, como es el caso de las vacunas contra la poliomielitis y el sarampin, para citar slo dos casos. De manera opuesta a la antes sealada, se pueden obtener mutantes con una virulencia mayor, para ser utilizadas con fines blicos. REGULACIN DE LA SNTESIS DE PROTENAS En las clulas, todos los genes no son expresados en todo momento, sera un derroche de energa y de nutrientes sintetizar una enzima en ausencia de su substrato, o continuar sintetizando un producto despus que se han satisfecho las necesidades de la clula. Normalmente lo que hacen las clulas es sintetizar las enzimas slo en presencia de su substrato, a estas enzimas se las denomina ENZIMAS INDUCIBLES. Por otra parte, cuando un conjunto de enzimas son las responsables de la sntesis de un determinado compuesto, y la concentracin de ste alcanza un determinado nivel, las enzimas responsables de su produccin son reprimidas (ENZIMAS REPRESIBLES). Sin embargo, no siempre las clulas se comportan de la manera descrita, hay casos en que una enzima es sintetizada continuamente durante el crecimiento, y no est sujeta a represin o induccin (ENZIMAS CONSTITUTIVAS). Una de las enzimas inducibles mejor estudiadas es la responsable de la fermentacin de la lactosa, la cual se denomina -galactosidasa. La induccin de esta enzima es explicada mediante el modelo de Jacob y Monod, quienes mediante estudios en la E. coli demostraron que en la fermentacin de la lactosa participan tres enzimas, la -galactosidasa responsable de la hidrlisis de la lactosa, la - galactsido permeasa que es la responsable de la entrada de la lactosa a la clula, y la -galactsido transacetilasa que permite la utilizacin de ciertos disacridos diferentes a la lactosa. La sntesis de estas tres enzimas est codificada por tres genes que se encuentran adyacentes en el ADN de la clula, entre el gen inicial de esta secuencia y el promotor, existe una regin del ADN denominada OPERADOR, la cual acta como una especie de interruptor en el proceso de transcripcin. Anterior al promotor existe un gen denominado REPRESOR el cual codifica la sntesis de una protena represora que por su interaccin con el operador, permitir o inhibir la transcripcin de los genes que codifican por las enzimas responsables del proceso de fermentacin de la lactosa. El gen que codifica por la protena represora tambin es denominado REGULADOR. El represor codifica por una protena alostrica, esta informacin es transcrita a un ARNm, el cual es traducido en los ribosomas y la protena resultante tiene una configuracin complementaria a la del operador, al cual se une impidiendo la transcripcin de los genes que codifican las enzimas fermentadoras de la lactosa.

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En presencia de lactosa, la protena represora se une a sta, con lo cual se origina un cambio en la conformacin de la protena represora, la cual ya no ser capaz de unirse al operador y los genes que este controla podrn expresarse.

El esquema de Jacob y Monod tambin permite explicar el mecanismo de represin de enzimas por el producto final de la reaccin de estas con sus substratos. En este caso la protena represora no tiene una configuracin complementaria a la del operador, por lo que no puede unirse a este y los genes que codifican por las enzimas pueden expresarse. Cuando la concentracin del producto de la reaccin de las enzimas ha alcanzado un cierto nivel, hay suficiente cantidad de l para combinarse con la protena represora la cual sufre un cambio en su configuracin, esta nueva configuracin si es complementaria a la del operador, por lo cual ella se une al operador impidiendo la transcripcin de los genes con lo cual se inhibe la sntesis del producto de la reaccin de las enzimas por las cuales codifican esos genes.

REPR ESIN POR CATABOLITO Este es un tipo de control de la sntesis de protenas menos especfico que los ya descri24

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tos. En este tipo de represin, la sntesis de diversas enzimas no relacionadas, es inhibida cuando las clulas crecen en un medio que contiene glucosa. La represin por catabolito ha sido tambin llamada EFECTO GLUCOSA, por haber sido la glucosa la primera sustancia con la cual se observ este tipo de represin. El crecimiento DIUXICO en los microorganismos es una consecuencia de la represin por catabolito; en este tipo de crecimiento, cuando al microorganismo se le proporcionan dos fuentes de energa en el medio de cultivo, l utiliza primero una de ellas hasta agotarla, una vez agotada esta primera fuente de energa cesa temporalmente el crecimiento y luego contina creciendo utilizando la otra fuente de energa. Este fenmeno es ilustrado en la figura siguiente, la cual representa el crecimiento de un microorganismo en un medio que contiene dos fuentes de energa: glucosa y lactosa. La enzima -galactosidasa, responsable de la fermentacin de la lactosa, es inducible, pero su sntesis est sometida a la represin por catabolito. De esta manera, cuando hay glucosa en el medio, la - galactosidasa no es sintetizada y el organismo crece slo a expensas de la glucosa. Cuando se agota la glucosa, cesa la represin por catabolito y despus de un perodo de latencia, se sintetiza la -galactosidasa y el microorganismo puede continuar creciendo, utilizando la lactosa como fuente de energa.

La represin por catabolito ha sido explicada de la siguiente manera: La ARN polimerasa inicia la transcripcin del ADN unindose al promotor, sin embargo en el caso de las enzimas represibles por catabolito, esta unin es estable slo cuando otra protena llamada PROTEINA ACTIVADORA DE CATABOLITO (CAP) o PROTENA ACTIVADORA DEL GEN (CAP), se une tambin al promotor. Esta protena es alostrica, y aparentemente lo que le confiere a ella la configuracin complementaria a la del promotor para que se pueda unir a l, es su reaccin con el monofosfato de adenosina cclico (AMP cclico).

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El AMP cclico es sintetizado a partir del ATP por una enzima denominada adenil ciclasa. Cuando hay glucosa presente, la concentracin de AMP cclico en la clula es muy baja y la ARN polimerasa no puede formar una unin estable con el promotor, por lo cual la CAP no adquiere la configuracin complementaria a la del promotor, no pudiendo unrsele y al no estar unida la CAP al promotor, la polimerasa tampoco puede unirse a ste y no hay transcripcin. RECOMBINACIN La recombinacin consiste en la transferencia de un segmento de genoma de una clula a otra, y este segmento es incorporado en el genoma de la clula receptora cambiando sus caractersticas. La recombinacin puede producirse mediante tres procedimientos diferentes: 1. 2. 3. TRANSFORMACIN TRANSDUCCIN CONJUGACIN

TRANSFORMACIN Este proceso de recombinacin fue descubierto por Griffith en 1928 utilizando cepas de neumococos, y consiste en la transferencia de un segmento de ADN de una clula a otra sin requerir el contacto entre dichas clulas ni de ningn mediador. Se ha demostrado experimentalmente que, adems de los neumococos, otros microorganismos son tambin transformables, por ejemplo, Escherichia coli y miembros de los gneros Haemophilus, Bacillus, Neisseria, y Pseudomonas; sin embargo es muy probable que a medida que se profundicen los estudios, se encontrarn muchas otras especies capaces de sufrir transformacin. Incluso dentro de los gneros que hemos dicho que son transformables, no todas las especies lo son, slo ciertas cepas denominadas COMPETENTES son capaces de ser transformadas; esta competencia para la transformacin parece ser una caracterstica hereditaria de los microorganismos.

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La competencia es afectada por el estado fisiolgico de las clulas y el medio en el cual ellas crecen, y segn la fase de crecimiento en la cual ellas se encuentran. Hay un corto perodo, aproximadamente en la mitad de la fase de crecimiento exponencial, durante el cual la competencia de las clulas se eleva a un mximo y luego cae bruscamente.

Para que el proceso de transformacin ocurra es necesario que el ADN de la bacteria donante se fije a la superficie de la receptora, al principio el ADN se fija de manera reversible a la superficie de las clulas competentes, luego la unin se hace irreversible. Las clulas competentes son capaces de fijar hasta 1000 veces ms ADN que el que pueden fijar las clulas no competentes. Las clulas competentes no pueden diferenciar entre el ADN de su propia especie y el de otras especies, aunque el nico que es activo en el proceso de transformacin es el proveniente de especies genticamente relacionadas. El ADN de una sola cadena es pobremente fijado por las clulas competentes, por lo que tiene escasa capacidad para transformar. Una vez fijado el ADN en la clula receptora, una de sus cadenas es degradada y la otra es incorporada en el genoma de la clula receptora. Cuando la clula se divide, se duplica este ADN hbrido, transmitindose de esta manera la o las nuevas caractersticas adquiridas a las clulas hijas. TRANSDUCCIN

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En la transduccin el ADN es transferido de la clula donante a la clula receptora mediante un virus bacteriano (bacterifago). La transduccin se presenta en una gran variedad de bacterias y puede ser de dos tipos, la transduccin generalizada y la transduccin especializada. Transduccin generalizada En esta transduccin casi cualquier gen puede ser transferido del donante al receptor. Los bacterifagos transductores se forman de la siguiente manera: Cuando un fago infecta una bacteria, el ADN de sta es degradado y la bacteria comienza a sintetizar ADN, protena y otros componentes del fago. Una vez sintetizados todos los componentes del fago, estos comienzan a ser ensamblados para dar origen a nuevos fagos, luego la bacteria es lisada dejando en libertad estos fagos, los cuales pueden iniciar un nuevo ciclo. En algunas oportunidades, cuando los nuevos fagos estn siendo ensamblados, en lugar de colocar dentro de su cubierta proteica, ADN del fago, es colocado un fragmento del ADN de la clula husped. Estos fagos as ensamblados son defectuosos, ellos son capaces de fijarse sobre una clula husped e inyectarle el ADN que contienen, pero no pueden producir nuevos fagos ya que ese ADN pertenece a la clula que lo hosped anteriormente y no codifica por los componentes del fago. Este ADN as transferido a la nueva clula husped es recombinado con el genoma de sta, confirindole los nuevos caracteres por los cuales codifica el fragmento de ADN que se ha recombinado. Como el fragmento de ADN incorporado en los fagos puede ser cualquiera y no un fragmento especfico, cualquiera de los caracteres de la clula husped original, puede ser transducido. Como puede observarse, el fenmeno es semejante a la transformacin, la diferencia reside en que el ADN es transferido de la clula donante a la receptora, mediante un bacterifago.
Clula bacteriana

Transduccin especializada En este caso hay una transferencia eficiente de un grupo restringido de genes mediante
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ciertos bacterifagos denominados FAGOS ATENUADOS (FAGOS TEMPERADOS). Por ejemplo, la transduccin de los genes que controlan la utilizacin de la galactosa (Gal) por el fago en la E. coli. Cuando un fago infecta a una clula bacteriana, usualmente lo que ocurre es la formacin de nuevos fagos y la lisis de la bacteria, tal como se seal anteriormente, pero en algunas oportunidades, con poca frecuencia, el genoma del fago en lugar de dirigir la degradacin el genoma bacteriano y la sntesis de componentes fgicos, se incorpora al genoma bacteriano dando origen a lo que se denomina CELULA LISOGNICA, y al genoma del fago incorporado en el genoma bacteriano se le denomina PROFAGO. A los fagos que tienen la capacidad de incorporar su genoma al genoma bacteriano (es decir de convertirse en profagos), se les denomina FAGOS ATENUADOS (TEMPERADOS). En esta clula lisognica, cuando se duplica el cromosoma bacteriano se duplica tambin el cromosoma fgico que tienen incorporado. En algunas oportunidades, bajo la influencia de algunos factores como la radiacin UV, se produce la INDUCCIN, que consiste en que el genoma del fago se desincorpora del genoma bacteriano, y toma el control de la clula bacteriana, procediendo a la degradacin de su genoma y a la sntesis de componentes fgicos, los cuales son ensamblados para formar nuevos fagos, y stos son liberados al lisarse la clula bacteriana, es decir, ocurre el ciclo ltico habitual. En otras oportunidades, muy poco frecuentes, cuando la clula lisognica es inducida, el ADN del virus se separa del genoma bacteriano llevndose una porcin de ste y dejndole incorporado un fragmento del suyo. En el caso el fago , que usualmente se incorpora al genoma de la E. coli en la zona adyacente a los genes que codifican por las enzimas responsables de la utilizacin de la galactosa, cuando el genoma fgico se desincorpora del genoma bacteriano, se lleva consigo dichos genes, dejando una porcin de los suyos. Las partculas fgicas que contienen este genoma, son defectuosas, y no pueden iniciar el proceso ltico de las bacterias, pero pueden transducir los genes de la galactosa, y son denominados dg (fagos defectuosos, transductores de galactosa). Si se infecta una E. coli galactosa negativa con esos fagos dg, ellos no pueden iniciar un ciclo ltico que conducira a la formacin de nuevos fagos, porque ellos son defectuosos y no pueden codificar por todos los componentes necesarios para constituir una partcula fgica completa, pero si se pueden integrar al genoma bacteriano, haciendo que la bacteria de convierta en galactosa positiva. Esta transduccin se llama especializada porque siempre se transducen los mismos genes, los que se encuentran vecinos al lugar de insercin el genoma fgico en el genoma bacteriano.

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CONJUGACIN Es el proceso de recombinacin que implica la transferencia de material gentico mediante el contacto clula a clula. Se ha descrito en Escherichia coli, Salmonella, Pseudomonas, Vibrio y para que ocurra debe haber una elevada densidad de poblacin para aumentar la posibilidad de que las clulas entren en contacto. En 1946, Lederberg y Tatum, trabajando con dos mutantes dobles auxotrofas cada una, obtuvieron evidencia de la existencia de este proceso de recombinacin. Una de las dos cepas poda sintetizar biotina y metionina, pero no treonina y leucina, mientras que la otra cepa poda sintetizar treonina y leucina pero no biotina y metionina. Si estas cepas se inoculaban por separado en medio mnimo, no crecan, porque cada una de ellas requera la adicin al medio de los dos nutrientes que no podan sintetizar. Pero si se mezclaban las cepas y luego esta mezcla se inoculaba en medio mnimo, si aparecan colonias, en nmero muy inferior al de las bacterias inoculadas, y estas colonias estaban constituidas por clulas bacterianas que podan sintetizar biotina, metionina, treonina, y leucina.

Es decir, en las cepas originales haban ocurrido transferencias de informacin gentica, y la cepa resultante era capaz de sintetizar todos sus requerimientos nutricionales. Posteriormente se demostr que esta transferencia era unidireccional, es decir, no haba intercambio de material gentico sino que una cepa actuaba como donante y otra como receptora. Igualmente se demostr que las recombinantes originadas, requeran para su formacin del contacto directo entre las clulas, y que no eran consecuencia de un proceso de transformacin o de transduccin. Esto fue logrado mediante el siguiente experimento de B.D. Davis. En un tubo de vidrio en forma de U, cuyas dos ramas estn separadas por un filtro de vidrio poroso, que impide el paso de las bacterias pero no el de los virus ni el ADN, se coloc en una de las ramas de dicho tubo una de las cepas auxotrofas, la otra en la otra rama. Se observ que no se obtenan recombinantes, a diferencia de cuando las dos cepas se mezclaban, lo que indicaba que se requera del contacto directo de las clulas, para que se produzca la transferencia de material gentico. Si se hubiesen obtenido recombinantes, stas podran ser la consecuencia de un proceso de transformacin o de transduccin. Para determinar cul de los dos procesos es responsable de la formacin de recombinantes, se aade desoxirrribonucleasa a la mezcla de clulas bacterianas; si en esta oportunidad no se obtienen recombinantes, puede asumirse que se trata de un proceso de transfor30

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macin, que ha sido inhibido por la destruccin del ADN transformante mediante la ADNasa.

Tipos de clulas que participan en la conjugacin Ya dijimos anteriormente que en la conjugacin participan clulas donantes y clulas receptoras. La propiedad de ser donantes se debe a un PLASMIDIO (elemento gentico extracromosmico capaz de reproducirse independientemente del cromosoma bacteriano) conocido como factor F (fertility factor). Este factor porta la informacin gentica necesaria para su propia replicacin y adems codifica para que la bacteria que los posee tenga sobre su superficie ciertos apndices especiales conocidos como pelos sexuales que son los que van a permitir el contacto entre las clulas donantes y receptoras en la conjugacin. Las clulas que llevan el factor F se llaman F+, y las que no lo llevan se llaman F-. Eventualmente el factor F puede integrarse en el cromosoma de la bacteria (por un proceso similar al ya citado en la transduccin especializada donde el fago se integra al cromosoma de la E. coli) de all resultar entonces una clula Hfr (High frecuency of recombination). Este proceso de integracin es reversible y de una clula Hfr podra originarse nuevamente una clula F+. Durante la desincorporacin del factor F del genoma bacteriano, algunos genes podran quedar unidos a l, resultando entonces una clula F'.

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MECANISMO DE LA CONJUGACIN Cuando se mezclan poblaciones de clulas donantes y receptoras, las clulas donantes se unen a las receptoras mediante los pelos sexuales, stos se retraen, las clulas entran en contacto y se forman los puentes a travs de los cuales se realiza la transferencia de material gentico. Los resultados de estos cruces variarn de acuerdo con el tipo de clula donante involucrado en el cruce: As, si se mezcla una cepa F+ con una cepa F-, usualmente ocurre que las clulas F+ le transfieren a las F- una copia del factor F, transformndolas en F+. Si se mezcla una cepa Hfr con una cepa F-, como el factor F se ha integrado al cromosoma bacteriano, al ser transferido a la clula receptora lleva consigo genes del cromosoma bacteriano.

Cruce F+ con F-

Cruce Hfr con F-

Si vemos la figura siguiente, el factor F lleva unos genes que hemos llamado A, B, C, D y E y la ruptura que inicia la replicacin del plasmidio ocurre entre los genes A y E. Esto sig32

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nifica que el factor F se rompe durante la transferencia, y solamente algunos de sus genes entran a la clula F- al comienzo de la conjugacin. El resto de los genes del factor F sern transferidos a la clula receptora slo despus que haya pasado todo el cromosoma bacteriano. Generalmente esto no es factible ya que el puente de conjugacin se rompe durante la transferencia, por lo tanto la clula receptora usualmente recibe una copia incompleta del factor F y las clulas receptoras permanecen entonces como F-. Los genes, de la bacteria donante transferidos a la receptora pueden recombinar originndose as clulas recombinantes con caractersticas de ambos participantes en el cruce.

Este tipo de cruce es muy utilizado para hacer mapas genticos, es decir para ubicar los diferentes genes sobre el cromosoma bacteriano y para ello se interrumpe el proceso de conjugacin, por agitacin vigorosa, a diferentes tiempos despus de su inicio y se analiza la frecuencia de los recombinantes para los diferentes marcadores genticos (sitios el cromosoma asociados con caractersticas fenotpicas particulares, por ejemplo produccin de una enzima), como cada Hfr comienza a transferir su cromosoma en un punto determinado en una forma lineal, se observa que a medida que aumenta el tiempo de contacto mayor nmero de caractersticas de la cepa Hfr aparecen en los recombinantes y que la mayor proporcin de recombinantes corresponde a los genes que son transferidos primero.

En el experimento sealado en la figura siguiente vemos que los primeros recombinantes en aparecer son los de los marcadores treonina (treo) y leucina (leu) luego los del marcador
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galactosa (gal) y por ltimo los del triptfano (trp).

Es decir el orden de entrada sera: treo+ leu+ 0 8 gal+ 25 trp+ 33 min

Si se cruza una cepa F' con una cepa F-, conjuntamente con el factor F sern transferidos los genes bacterianos que l porta y las clulas receptoras que reciban el factor F sern convertidas en donantes y adems sern recombinantes para un solo carcter, el portador por el factor F. Por ejemplo si se cruza una cepa F' lac+ con una cepa F-lac-, de este cruce resultarn clulas recombinantes para el carcter lac+ y las receptoras se convertirn en donantes al recibir el factor F. MANIPULACIN GENTICA La transformacin, transduccin, y conjugacin son formas naturales por medio de las cuales los microorganismos producen recombinaciones de ADN similares a las de los organismos con reproduccin sexual. Cuando estos procesos se realizan en el laboratorio constituyen lo que se ha llamado manipulacin gentica y de esta manera se puede lograr reunir en el interior de un microorganismo su propio ADN con ADN proveniente de otros organismos no relacionados, haciendo que estos genes se expresen y el microorganismo sintetice protenas para las cuales no posea la codificacin gentica antes de la manipulacin. Hay en la actualidad, tcnicas disponibles para que de una manera relativamente sencilla se manipulen los genes y se construyan en el laboratorio molculas de ADN recombinante que probablemente nunca habran aparecido en la naturaleza en el transcurso de la evolucin. El uso de plasmidios, junto con enzimas de restriccin, y ADN ligasas, permite la construccin de esos ADN hbridos que contienen genes de diversas fuentes. Las enzimas de restriccin tienen la propiedad de reconocer ciertas secuencias especficas en las molculas de ADN cortndolas en varios segmentos. Algunas de las
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enzimas de restriccin hacen sus cortes de manera que los fragmentos de ADN obtenidos son de doble cadena pero en los extremos tienen unas cortas secuencias de una sola cadena que son complementarias y se han llamado extremos cohesivos.

Si se mezclan dos preparaciones de ADN de diferente origen pero tratados con la misma enzima de restriccin, los extremos cohesivos as producidos hacen posible la formacin de hbridos por un apareamiento por complementariedad de bases de los extremos cohesivos de cada molcula. Una vez que las dos molculas se han apareado, se tratan con otra enzima, la ADN ligasa que une los dos fragmento en una sola molcula de ADN de doble cadena hbrido. Como ya hemos dicho, los plasmidios tienen la capacidad de replicarse en forma independiente en la clula, la incorporacin de los fragmentos de ADN en un plasmidio permite la replicacin de este ADN conjuntamente con los genes del plasmidio y de esta manera se logra obtener grandes cantidades de ADN que llevan el fragmento de inters.

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Entre los muchos beneficios potenciales de esta manipulacin tenemos el desarrollo de bacterias capaces de producir por ejemplo insulina u otras hormonas de origen humano o animal. De esta misma forma se pueden logra seres que podran constituir verdaderos peligros si se les introduce en sus genes la capacidad de producir toxinas u otras sustancias dainas para el hombre, animales o plantas.

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BIBLIOGRAFA Clavell L y Pedrique de A. M. (1990) Introduccin a la Gentica Bacteriana (Segunda Edicin). Facultad de Farmacia UCV. Davis, Dulbecco, Eisen and Ginsberg. Microbiology. Fourth Edition. J. B. Lippincott Company 1990. Madigan M.T, Martingo J. M. y Jack Parker. 2004. Dcima Edicin. Brock Biologa de los Microorganismos Prentice Hall Microsoft 1998 Enciclopedia Encarta 98 Pelczar, Reid and Chan. Microbiology. Fourth edition. 1977. Mcgraw-Hill. Stanier, Adelberg and Ingraham. General Microbiology. 4th Edition. 1977. The MacMillan Press Ltd. Tortora G. J., B. R. Funke and Ch. L. Case 2007. Introduccin a la Microbiologa 9na Edicin. Editorial Mdica Panamericana. Weistreich and Lechtman. Microbiology. Fifth Edition. 1988. Macmillan Publishing Co.

Magaly Pedrique de Aulacio Enero 1999 Revisin 2008

ACTIVIDADES ADICIONALES

Buscar y leer un artculo o noticia de prensa relacionado con gentica, subrayar 5 trminos que aparezcan en ese artculo, buscar su significado y elaborar un glosario que facilite la comprensin de tal artculo.

Investigar qu es la terapia gnica o terapia de genes y hacer una lista de las enfermedades en que se est experimentando.

Investigar qu es una secuencia palindrmica y dar un ejemplo

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Buscar en un diccionario de ingls tcnico la traduccin al espaol de las palabras siguientes:

Dark repair Deletion DNA repair Double-stranded DNA Environment Frameshift mutation Gene Genetic code Genetic engineering Heredity Lagging strand Leading strand Messenger RNA Nonsense codon Plasmid Point mutation Replica plating Replication fork Translation Wild type

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