Sequenciamento do DNA

Apresenta conceitos bsicos no sequenciamento do DNA Andre Luis Vettore Para compreender o processo de seqenciamento do DNA necessrio relembrar alguns conceitos. A Estrutura do DNA Uma das mais importantes descobertas da biologia foi a determinao da estrutura tridimensional do DNA por James Watson e Francis Crick em 1953. Tambm contriburam para este feito os estudos de Maurice Wilkins e Rosalind Franklin. Foram Miescher, Kossel, Levene, Chargaff e outros que determinaram a estrutura qumica do DNA, uma macromolcula de cido nuclico composta de 3 tipos de molculas: um acar de 5 carbonos, uma base nitrogenada e um grupo fosfato. Os acares dos cidos nuclicos, chamados ribose, tm 5 carbonos dos quais 4 so unidos por uma molcula de oxignio, formando um anel, e o 5o se projeta para fora desse anel. tomos de hidrognio ou grupos hidroxilas ligamse a cada tomo de carbono. A ribose do RNA tem um tomo de hidrognio no carbono 2, e no uma hidroxila, o que d o nome de cido desoxirribonuclico. O segundo elemento da molcula de DNA a base nitrogenada. So duas bases purinas, adenina (A) e guanina (G), e duas bases pirimidinas, timina (T) e citosina (C). O terceiro componente, o grupo fosfato, consiste em um tomo de fsforo ligado a quatro molculas de oxignio, que freqentemente carregam carga negativa, o que torna o DNA cido. O fosfato est sempre ligado ao carbono 5 da ribose. Miescher, Kossel, Levene, Chargaff descreveram as caractersticas do DNA, entretanto no conseguiram determinar como as bases nucleotdicas interagiam. Em 1947, William Ashbury iniciou o estudo da estrutura do DNA atravs da difrao por raios-X, porm a qualidade das imagens no revelou nenhuma informao relevante. Um grupo do Kings College, em Londres, liderado por Maurice Wilkins e Rosalind Franklin tambm estudou a estrutura do DNA atravs da tcnica de difrao e obteve imagens de melhor qualidade. Watson e Crick utilizaram essas informaes para a construo de modelos de estrutura, cuja chave para a tridimensionalidade foi obtida quando Watson reconheceu que uma adenina se ligava a uma timina, e uma citosina a uma guanina. O modelo desenvolvido demonstrou que o DNA se assemelha a uma escada em caracol, na qual as duas cadeias polinucleotdicas (dupla-hlice) correm em sentidos opostos (antiparalelas) e so mantidas juntas por pontes de hidrognio e ligaes covalentes entre o acar e o grupo fosfato. O artigo com o modelo de Watson e Crick foi publicado na Revista Nature em 1953. No mesmo nmero, Wilkins e Franklin publicaram os dados obtidos com a difrao por raio-X. Em 1962, Watson, Crick e Wilkins receberam um prmio Nobel. Rosalind Franklin faleceu por cncer em 1957 e por isso no pde ser agraciada com o prmio. Replicao do DNA A replicao do DNA necessita de trs elementos: uma fita-molde de DNA, o substrato (nucleotdeos) e as enzimas, alm de outras protenas para ler a fita-molde e transformar o substrato em uma molcula de DNA. A sntese de DNA no ocorre espontaneamente, pois necessita de enzimas e protenas que funcionam de modo coordenado. Todas as DNA polimerases necessitam de um nucleotdeo com um grupo 3-OH, onde um nucleotdeo pode ser adicionado. Em razo dessa exigncia, a DNA polimerase no pode iniciar a sntese de DNA em um molde qualquer, por isso, necessita de um DNA iniciador (primer). Seqenciamento do DNA Atualmente, a tcnica mais utilizada para o seqenciamento de DNA a de Sanger, assim denominada em homenagem a Fred Sanger que, com Walter Gilbert, recebeu o prmio Nobel de qumica, em 1980. A sntese de DNA iniciada por um oligonucleotdeo, sendo que depois a DNA polimerase continua ao longo da seqncia molde, incorporando os nucleotdeos e sinteizando a fita nova. Nessa tcnica existem dois tipos de nucleotdeos: os normais (deoxi) dATP, dGTP, dCTP e dTTP; e os dideoxinucleotdeos (no tem o grupo hidroxila no carbono 3) ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP, que so marcados com material fluorescente. A polimerizao do DNA prossegue, com a incluso dos nucleotdeos normais, at que, por acaso, a DNA polimerase insere um dideoxinucleotdeo, o que interrompe a polimerizao. Ao final desse processo, se observam fragmentos de tamanhos diferentes. Essa reao ento colocada em um gel poroso, no qual, aps a eletroforese, se observa a migrao dos fragmentos os menores migram mais rapidamente. No seqenciamento manual, os dideoxinucleotdeos so marcados com radiao e no com compostos fluorescentes, por isso, uma radiografia necessria para a leitura da seqncia do DNA. No seqenciamento automtico, o seqenciador identifica os fragmentos pela incidncia de laser sobre os dideoxinucleotdeos fluorescentes. Ao final, o seqenciador exibe um grfico no qual cada nucleotdeo tem uma cor. Anlise de mutaes A anlise de mutaes no seqenciamento automtico se d pela identificao de picos diferentes na leitura. Como possumos dois alelos, quando h alterao na seqncia, o que observamos so dois picos na leitura no fragmento de DNA.
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