ITESI

INSTITUTO TECNOLOGICO SUPERIOR DE IRAPUATO

MICROBIOLOGA:
Actividad 3: Mtodos y Tcnicas Microbiolgicas

NOMBRE: Antonio de Jess Serrano Carrera

PROFESOR: Francisco Alejo Iturbide

CARRERA: Ing. Bioqumica

Martes 29 de Enero del 2013

MTODOS Y TCNICAS MICROBIOLGICAS

La mayora de las operaciones de trabajo que se realiza en microbiologa se centran en objetivos especficos: El aislamiento y separacin de un microorganismo concreto, a partir de poblaciones mixtas presentes en la naturaleza. El cultivo, que es el crecimiento de poblaciones microbianas en ambientes artificiales bajo condiciones de laboratorio determinadas previamente. El crecimiento de los microorganismos depende bsicamente de la

disponibilidad del agua. Para sintetizar los materiales celulares requieren, adems, la presencia de bio y oligoelementos. Los microorganismos muy exigentes y algunos mutantes defectuosos necesitan que se aporte al medio determinado compuestos incapaces de sintetizar, y son los denominados por algunos autores factores de crecimiento. [1] Los mtodos y tcnicas microbiolgicas se dividen bsicamente en tres tipos: Caractersticas morfolgicas. Tcnica de crecimiento poblacional. Microscopia.

Caractersticas morfolgicas Los microorganismos se pueden caracterizar por principalmente tres aspectos que son: forma, tamao y agrupaciones. Debido a su pequeo tamao, las bacterias no pueden poseer toda la arquitectura y los componentes de una clula eucariota. Por ejemplo una bacteria de tamao promedio tiene las dimensiones de una mitocondria, lo que limita fsicamente la cantidad de estructuras y macromolculas que puede contener. Es interesante hacer notar que las mitocondrias habran sido ancestralmente bacterias que alcanzaron en un momento de su evolucin un grado tal de simbiosis con las clulas eucariotas que pasaron a ser parte esencial de stas. [4] Las bacterias pueden definirse como organismos unicelulares que se reproducen por fisin binaria, la mayora vive libremente y contienen toda la

informacin gentica, sistemas productores de energa y biosintticos necesarios para el crecimiento y la reproduccin. Las diferencias

fundamentales entre clulas procariotas y eucariotas ya las mencionamos en el cuadro, pero a pesar de las diferencias, la composicin qumica general es similar a la de la clula eucariota. Ms del 90% del peso seco de una bacteria est integrado por: 55%de protenas, 20% de ARN, en sus tres tipos, 3% de ADN, 5% de hidratos de carbono, y 6% de fosfolpidos. Adems de stas existen otras macromolculas exclusivas de las procariotas, como el peptidoglicano o murena, los cidos teicoicos y los lipopolisacridos. [1]

Tamao de las bacterias Las bacterias son los microorganismos de vida libre de menor tamao que existen en la naturaleza, algunas son tan pequeas que se considera que tienen el mnimo tamao posible para ser una forma de vida independiente. El tamao se mide en micrmetros, m, para microorganismos ms pequeos se usa el nanmetro, nm. [4] Las bacterias esfricas se miden por el dimetro, y la gran mayora tienen un dimetro que vara entre 0,2 y 2 m. Las bacterias alargadas se miden por el largo y el ancho y la mayora de ellas tienen un ancho de 0,2 a 2 m por 1 a 15 m de largo. [1] Las bacterias espiraladas se miden por la longitud total, la amplitud de la espira y la profundidad de la misma. Existen bacterias cuyo tamao est en el extremo inferior de la escala, son las rickettsias, clamidias y micoplasmas, su tamao es similar al de los virus ms grandes, los poxvirus. En el otro extremo de la escala, hay algunas bacterias alargadas que tienen una longitud semejante al dimetro de una clula eucariota, por ejemplo, los lactobacilos tienen un largo que puede superar al dimetro de un eritrocito. [1]

Forma de las bacterias La microscopa ptica permite reconocer bacterias de distintas formas. [2]

Las bacterias esfricas o ligeramente ovoides se denominan cocos.

Las bacterias con forma de bastn se denominan bacilos. Los bacilos de corto tamao que pueden confundirse con un coco se denominan cocobacilos. Algunos bacilos tienen extremos afinados y reciben el nombre de bacilos fusiformes, mientras que otros poseen forma de clava o garrote.

Los bacilos cortos curvos, con forma de coma reciben el nombre de vibrios. Las bacterias espiraladas se llaman comnmente espirilos cuando son rgidas y espiroquetas si son ms flexibles y ondulantes.

Agrupacin bacteriana Algunos gneros bacterianos se agrupan de una manera caracterstica. Esta agrupacin se debe a la tendencia de las clulas hijas a permanecer parcialmente adheridas despus de la divisin celular. [2] Los cocos pueden disponerse:

De a pares y se los llama diplococos. Si se disponen en cadena se llaman estreptococos. Cuatro clulas esfricas conforman una ttrada. En forma de racimo o irregular se llaman estafilococos. En paquetes cbicos se denominan sarcinas.

Los bacilos pueden disponerse:

Aislados. Adosados a lo largo, de forma paralela formando una agrupacin en empalizada (haemophilus).

Pueden quedar adheridos por sus extremos y tomar apariencias de letras chinas (corynebacterium).

La morfologa y agrupacin bacteriana se ponen de manifiesto por la observacin microscpica de frotis teidos. El mtodo de coloracin ms utilizado en bacteriologa es la coloracin de Gram. Las bacterias se clasifican en dos grandes grupos teniendo en cuenta el comportamiento de las mismas frente al procedimiento de coloracin de Gram [1]:

Gram positivas: G (+), se tie de color violeta. Gram negativas: G (-), se tien de color rojo o fucsia.

Tcnicas de crecimiento poblacional Los microorganismos en fase de crecimiento realizan rplicas de s mismos y requieren de los elementos que se encuentran en su composicin qumica. Se le deben brindar los elementos nutritivos en una forma accesible desde el punto de vista metablico. Adems, los microorganismos requieren energa metablica con el objetivo de sintetizar macromolculas y conservar los gradientes qumicos esenciales a travs de sus membranas. Durante el crecimiento se deben regular los factores nutricionales (carbono, nitrgeno, azufre y fsforo, elementos trazas y vitaminas) y los factores fsicos (pH, temperatura, oxgeno, humedad, presin hidrosttica, presin osmtica y radiacin). [8] Durante el crecimiento, un microorganismo requiere todos los elementos de su materia orgnica y el complemento total de iones necesarios para la energtica y la catlisis. Adems, debe haber una fuente de energa que establezca la fuerza motriz protnica y que permita la sntesis macromolecular. Los

microorganismos varan ampliamente en cuanto a sus demandas nutricionales y sus fuentes de energa metablica. [8] El crecimiento se define como un incremento ordenado de los principales constituyentes de un organismo. Involucra sntesis de estructuras celulares, cidos nucleicos, protenas y otros componentes celulares a partir de nutrientes. Todos los seres vivos toman nutrientes y excretan productos de desecho. [7] Es importante distinguir entre el crecimiento de clulas individuales y el crecimiento de poblaciones, ya que en los microorganismos debido a su pequeo tamao no se hacen estudios de crecimiento individual sino estudios de crecimiento de las poblaciones. [8] El crecimiento de una poblacin es el aumento del nmero de clulas como consecuencia de un crecimiento individual y posterior divisin. El crecimiento de una poblacin ocurre de una manera exponencial. El crecimiento exponencial es una consecuencia del hecho de que cada clula se divide dando dos clulas hijas, las cuales al dividirse darn cada una dos clulas hijas, as es que en cada perodo de divisin la poblacin se duplica. [8] La velocidad de crecimiento exponencial se expresa como tiempo de generacin y este se define como el tiempo que tarda una poblacin en duplicarse. Los tiempos de generacin varan ampliamente entre los

microorganismos, algunos crecen rpidamente y presentan tiempos de generacin de unos 30 minutos y otros tienen tiempos de generacin de varias horas o incluso das. [5]

Determinacin de masa celular de una poblacin: 1.1 Mtodos directos [6]: Peso seco Peso hmedo Volumen hmedo

1.2 Mtodos indirectos [6]: Determinacin de Nitrgeno total Espectrofotometra Radiacin IR

Determinacin del Nmero de microorganismos 2.1 Mtodos Directos [6] Cuenta total microscpica (Cmara de Neubauer, de Petroff) Cuenta viable (Vaciado en placa, Extensin con varilla de vidrio, Cuenta en tubo de Hungate) Medicin lineal o radial

2.2 Mtodos Indirectos [6] Nmero ms Probable (NMP) Turbidimetra Nefelometra

Determinacin de metabolitos asociados a crecimiento 3.1 Mtodos Directos [7] Componentes de Pared celular Protenas cidos nucleicos

3.2 Mtodos Indirectos [7] Produccin de cidos orgnicos Produccin de alcoholes y glcidos Produccin de CO2

Determinacin de la utilizacin de algn nutriente 4.1 Mtodos Indirectos [7] Oxgeno Azcares

CO2 cidos grasos

El crecimiento microbiano se mide por cambios sucesivos en el nmero de clulas o por el aumento de peso de la masa de las clulas. Hay varios

mtodos para enumerar las clulas o estimar la masa de stas. [7]

Determinacin del nmero de clulas totales Recuento directo mediante contadores electrnicos Los contadores electrnicos diseados para contar glbulos rojos se puede usar para este fin. Esencialmente un contador electrnico consta de dos cmaras que estn separadas por un material que no conduce la corriente, en este material no conductor hay un orificio de un tamao similar al de las clulas a ser contadas. [5] Cada cmara contiene un electrodo, la suspensin de clulas a ser contadas se coloca en una de las cmaras y se aplica presin para que las clulas pasen a la otra cmara a travs del orificio, cada vez que una clula pasa a travs del orificio ocasiona un cambio en la conductividad elctrica que es registrado por un dispositivo electrnico y de esta manera el contador indica el nmero de clulas en esa suspensin. [5] Las limitaciones de este mtodo son las siguientes: Se cuentan clulas vivas y muertas. Las suspensiones deben estar libres de partculas diferentes a los microorganismos que estamos contando por que el aparato no puede distinguir entre una u otra. [5]

Recuento directo al microscopio Se determina directamente el nmero de clulas contndolas al microscopio con la ayuda de cmaras especiales que albergan un volumen conocido de lquido (Hemocitmetros, Cmara de Petroff- Hausser). [5]

El recuento directo al microscopio es tedioso, pero es una forma rpida de estimar el nmero de clulas microbianas. Sin embargo, presenta algunas limitaciones [5]: No se pueden distinguir las clulas vivas de las clulas muertas. Las clulas muy pequeas son difciles de contar. La precisin es difcil de lograr El mtodo no es adecuado para suspensiones celulares de baja densidad, es decir las soluciones deben contener aproximadamente 10 7 clulas/mL o ms.

Determinacin de clulas viables En los mtodos anteriores se determina el nmero de clulas totales, pero en muchos casos nicamente interesa contar clulas viables. [5] Se define como clula viable, aquella clula que es capaz de dividirse y forma una progenie y la manera usual para realizar un recuento de clulas viables es determinando el nmero de clulas en la muestra, capaces de formar colonias sobre un medio de cultivo slido (agar) y esto se conoce como recuento en placa. [5] En este procedimiento se realizan diluciones seriadas de la muestra y se inoculan pequeos volmenes conocidos, de cada una de las diluciones, en placas de Petri conteniendo un medio slido adecuado estril y se extiende con una varilla de vidrio (mtodo de siembra en placa por extensin o diseminacin) o en placas de Petri estriles a las cuales se les adiciona un medio slido fundido y enfriado a 45C y se mezclan bien (mtodo de siembra por incorporacin o de vertido en placa), luego se incuban en las condiciones ptimas hasta que aparezcan las colonias correspondientes. Se asume que cada colonia proviene de la divisin sucesiva de una sola clula, conociendo el volumen sembrado y la dilucin de la cual proviene y contando el nmero de colonias en la placa correspondiente se puede calcular el nmero de clulas viables en la muestra. Debido a que es difcil saber si una sola bacteria dio origen a una colonia, se expresa usualmente el nmero de clulas viables

como unidades formadoras de colonias (UFC). Para realizar el recuento se seleccionan las placas de la que contengan entre 25 y 250 colonias. [3]

A pesar de las deficiencias que pueda presentar la tcnica del recuento en placas, se usa frecuentemente, y con resultados satisfactorios, para la estimacin de las poblaciones bacterianas en la leche, agua, y otros

productos. Es fcil de realizar y se adapta a la medicin de poblaciones de cualquier densidad. [5] En el siguiente esquema se presenta un ejemplo de un recuento en placa haciendo diluciones seriadas con un factor de dilucin de 100, para ello se toma 1 mL de la muestra, la cual puede ser un cultivo de bacterias o cualquier otra muestra que contenga bacterias en suspensin, se aade a un frasco de dilucin que contiene 99 mL del diluente adecuado, se agita y se toma de esta primera dilucin (1:100 o 10-2) 1 mL y se transfiere a un segundo frasco de dilucin que contiene 99 mL del diluente adecuado, se agita y se toma de esta segunda dilucin (1:10.000 o 10-4) 1 mL y se transfiere a un tercer frasco de dilucin que contiene 99 mL del diluente adecuado (esa corresponde a la dilucin 1:1.000.000 o 10-6). De cada se siembran por triplicado muestras de 1 mL y se incuban en posicin invertida por 24 horas o ms y se cuentan las colonias. [5]

Determinacin de la masa microbiana Para muchos estudios especialmente aquellos relacionados con la bioqumica de los procesos de crecimiento, se prefiere determinar la masa de la poblacin ms que el nmero de clulas presentes. La masa se puede determinar

directamente determinando el peso seco o hmedo de la muestra. Tambin se puede determinar el contenido de nitrgeno o el contenido de protenas o de ADN. [5] Otra forma de estimar la masa celular de una manera indirecta es

determinando la actividad metablica de la clula por ejemplo determinando el consumo de oxgeno o produccin de dixido de carbono. Asumiendo que la cantidad del producto metablico est en proporcin directa al nmero de bacterias presentes en la poblacin. [5] Un mtodo ms sencillo y til para obtener la estimacin relativa de la masa bacteriana es utilizar mtodos pticos (turbidimtricos) que consisten en medir la turbidez, ya que, dentro de ciertos lmites, las suspensiones bacterianas dispersan la luz proporcionalmente a su concentracin. [5]

Esterilizacin La esterilizacin es un proceso a travs del que se logra la destruccin total de los microorganismos viables presentes en un determinado material. Existen diversos mtodos de esterilizacin. La seleccin del mtodo a aplicar en cada caso est determinada por el tipo de producto a esterilizar. [9]

Clasificacin de los mtodos de esterilizacin A continuacin se presenta un esquema de los principales mtodos de esterilizacin, clasificados de acuerdo al tipo de agente que acta. [9] Agentes fsicos El calor se puede aplicar como agente esterilizante de dos formas: el calor hmedo el cual destruye a los microorganismos por desnaturalizacin de las protenas y el calor seco que destruye a los microorganismos por oxidacin de sus componentes celulares. El calor es considerado como el mtodo de esterilizacin por excelencia siempre y cuando el material a esterilizar soporte altas temperaturas sin sufrir ningn tipo de dao. [9] La radiacin, o emisin y propagacin de la energa a travs de un medio, puede ser utilizada como agente para la eliminacin de microorganismos. As tenemos que las radiaciones ionizantes se pueden utilizar para la esterilizacin de materiales termolbiles, como por ejemplo materiales plsticos, y las radiaciones no ionizantes, como la luz ultravioleta, puede ser empleada en el control de reas cerradas. [9] Calor hmedo. Las clulas vegetativas de las bacterias y hongos ya son destruidas a temperaturas de alrededor de 60De (5-10 minutos), las esporas de las levaduras y de los hongos solo por encima de 80De y las esporas de las bacterias por encima de l20De (15 minutos). El tiempo que se necesita que actu el calor hmedo para destruir las esporas de algunas especies bacterianas representativas, extraordinariamente resistentes al calor, puede calcularse a partir de los tiempos de reduccin decimal dados en la tabla 6.5. Obsrvese que cuanto mayor es el grado de contaminacin, p. ej. el nmero de esporas termorresistentes, hay que calentar durante ms tiempo. [9] Calor seco. Si se someten a calor seco las esporas de las bacterias s6Jo son destruidas a temperaturas ms altas y con tiempos de acci6n ms

prolongados que si se las somete a calor hmedo. Por eso el material de vidrio, los polvos y aceites insensibles al calor son esterilizados mantenindolos dos horas en un homo con calor seco a 160C. En el caso de materiales de alta capacidad calorfica 0 con propiedades de aislamiento trmico tiene que considerarse el tiempo de calentamiento. No obstante, en todos los casos se recomienda un control de temperatura (por medio de indicadores) o un control de esterilidad. Si el material 10 permite, actualmente se calientan 30 minutos a 180C. La experiencia demuestra que asf se eliminan todas las esporas. La destrucci6n por el calor se debe a la coagulacin de las protenas celulares. [9] Agentes mecnicos La filtracin permite la remocin de todos los microorganismos presentes en un lquido o un gas retenindolos sobre la superficie de un material. [9]

Agentes qumicos Algunas sustancias qumicas pueden ser

usadas como agentes esterilizantes porque tienen la capacidad de promover una o ms reacciones qumicas capaces de daar los componentes celulares de los microorganismos (protenas, membranas, etc.) [9]

Sanitizacin Es una tcnica basada en uno o unos compuestos que reducen pero no necesariamente eliminan los microorganismos del medio ambiente y objetos

inanimados. Son generalmente utilizados en contacto con alimentos. Los sanitizantes son sustancias que reducen el nmero de microorganismos a un nivel seguro. Debe tener propiedades germicidas o antimicrobianos y se aplican a los objetos no vivos para destruir los microorganismos, de las cuales el proceso que se conoce como la desinfeccin o Sanitizacin. [10] La principal diferencia entre un desinfectante y un sanitizante es que, en un determinado uso de la dilucin, el desinfectante debe tener una mayor capacidad para matar bacterias patgenas en comparacin con la de un sanitizante. Una versin oficial y legal establece que un sanitizante debe ser capaz de eliminar el 99,999%, conocido como una reduccin logartmica de 5, de una poblacin bacteriana de prueba, y de hacerlo dentro de 30s, otra diferencia entre sanitizante y desinfectante es que el sanitizante no es capaz de destruir esporas o virus. [10]

Tipos de sanitizante Alcoholes.- Alcoholes que por lo general son el etanol o el isopropanol, al ser ms voltiles se evaporan con rapidez adems de tener un amplio poder microbicida para una mejor desinfeccin, no son corrosivos, pero puede poseer un riesgo de incendio. Tambin tienen limitada actividad residual debido a la evaporacin, lo que resulta en un breve contacto, y tienen una limitada actividad en presencia de material orgnico. Los alcoholes son ms eficaces en combinacin con agua purificada - el alcohol isoproplico del 70% o el alcohol etlico del 62% es ms efectivo que el alcohol del 95%. El alcohol no es eficaz contra hongos o esporas bacterianas. [10] Aldehdos.Aldehdos, como glutaraldehdo, son buenos microbicidas,

esporicidas y fungicidas, que no dejan casi residuos aunque se inactivan parcialmente en presencia de compuestos orgnicos. [10] Halogenuros Cloramina-T: se utiliza en el tratamiento de agua potable en lugar del cloro, ya que produce un menor nmero de subproductos derivados de la

desinfeccin. Mantiene su accin antibacteriana incluso despus de que el cloro se haya agotado. [10] Cloro: se utiliza para desinfectar piscinas, y se agrega en pequeas cantidades al agua potable para reducir las enfermedades transmitidas por el agua. [10] Hipocloritos: (hipoclorito de sodio), a menudo en forma de cloro de uso domstico comn, se utilizan en el hogar para la desinfeccin de los desages, y aseos. Otros hipocloritos, como hipoclorito de calcio tambin se utilizan, sobre todo como aditivo de piscinas. Las soluciones de hipobromito son tambin usadas para el mismo objetivo. [10] Yodo: suele disolverse en un disolvente orgnico o como solucin de yodo de lugol. Se utiliza en la industria avcola. Se agrega al agua potable para las aves. Aunque es poco recomendada porque aumenta el tiempo de curacin, la tintura de yodo tambin se ha utilizado como un antisptico para la piel en cortes y raspaduras. [10] Fenoles.- Los fenoles son ingredientes activos en algunos sanitizantes del hogar. Tambin se encuentran en enjuagues bucales y en algn jabn para manos. [10] Fenol: es probablemente el sanitizante ms antiguo que se conoce, ya que fue usado por primera vez por Joseph Lister, cuando se llamaba cido carblico. Es bastante corrosivo para la piel y a veces, las personas son sensibles a sus vapores txicos. [10] O-fenilfenol: se utiliza a menudo en lugar de fenol, ya que es menos corrosivo. [10] Hexaclorofenol: es un compuesto fenlico que fue utilizado como aditivo germicida en algunos productos para el hogar, pero fue prohibido debido a la sospecha de efectos nocivos. [10] Compuestos de amonio cuaternario.Los compuestos de amonio

cuaternario (Quats), como el cloruro de benzalconio, forman un gran grupo de compuestos relacionados. Algunos han sido utilizados como sanitizantes de

bajo nivel. Son eficaces contra las bacterias, pero no sirven contra algunas especies de bacterias Pseudomonas, o en esporas bacterianas. Los quats son biosidas que tambin matan a las algas y se utilizan como aditivos s gran escala en sistemas de abastecimiento de agua industrial para reducir al mnimo el crecimiento de grmenes biolgicos. Los compuestos de amonio cuaternario tambin pueden ser sanitizantes eficaces contra los virus. [10] Pasteurizacin La pasteurizacin es una operacin de estabilizacin de alimentos que persigue la reduccin de la poblacin de microorganismos presentes en stos de forma que se prolongue el tiempo de vida til del alimento. Si se reduce la poblacin de microorganismos al principio del almacenamiento, N0, la vida til del alimento se alarga cuando el parmetro de calidad dominante es la presencia de microorganismos, ya sean patgenos o slo alterantes, porque se tarda ms tiempo en alcanzar una concentracin intolerable de

microorganismos, Nf. [11] La pasteurizacin consigue disminuir la poblacin de microorganismos mediante la elevacin de la temperatura durante un tiempo determinado, lo que implica la aplicacin de calor. [11] La pasteurizacin es un tratamiento trmico suave, en contraposicin con la esterilizacin, que es un tratamiento muy intenso. La pasteurizacin emplea temperaturas y tiempos de contacto relativamente bajos, consiguiendo una prolongacin moderada de la vida til a cambio de una buena conservacin del valor nutritivo y de las cualidades organolpticas del alimento. [11] Sin embargo, pese a ser un tratamiento suave, la pasteurizacin consigue la eliminacin de los microorganismos patgenos, aunque slo consigue una reduccin de los microorganismos alterantes. La pasteurizacin tiene diferentes objetivos segn el tipo de alimento al que se aplique. [11]

MICROSCOPIA El estudio detallado de los componentes de clulas y tejidos animales o vegetales, por el tamao que poseen, requiere el uso de instrumentos que

permitan ampliar muchas veces ms la imagen de las estructuras que los constituyen. El instrumento que fue empleado por los primeros bilogos para estudiar la clula y los tejidos, es el microscopio. El nombre deriva etimolgicamente de dos races griegas: mikrs, que significa pequeo y skopoo, que significa observar. Es decir el microscopio es un instrumento que sirve para observar objetos o estructuras pequeas. [12]

Tipos de microscopios El microscopio ptico El microscopio ptico es un instrumento que sirve para aumentar el tamao de un objeto a travs de un sistema de lentes. Puede conseguirse con este mtodo un aumento de hasta 2000 veces. Las partes de las que se compone un microscopio se pueden dividir en parte mecnica y en parte ptica (figura 1) [13]: Parte mecnica: Sistema de soporte: o Pie: Sirve de apoyo y para darle estabilidad al microscopio. En l est integrada la fuente luminosa. o Brazo: Es una columna que parte del pie sirve para sujetar el tubo. Puede ser recto o arqueado. o Tubo: Es una cmara oscura que est unida al brazo. En su parte inferior est el revlver son los objetivos y en su parte superior los oculares. o Platina: Es una plataforma horizontal sobre la que se engancha con dos pinzas el portaobjetos. Tiene en su zona central un orificio que permite el paso de la luz y un sistema de cremallera manejado por dos tornillos que permiten el movimiento de la muestra. o Revolver: Sujeta los objetivos y gira para permitir el cambio de objetivo. Sistema de ajuste:

o Tornillo macromtrico: Tornillo de enfoque que mueve la platina hacia arriba y hacia abajo de forma brusca y poco precisa. o Tornillo micromtrico: Tornillo de enfoque que mueve la platina hacia arriba y hacia abajo de forma lenta y muy precisa. Parte ptica: Fuente de iluminacin: Es una lmpara halgena que permite el encendido o el apagado con un interruptor y cuya intensidad puede ser graduada. Puede tener en su parte superior un anillo para permitir la colocacin de filtros que facilitan la visualizacin. Condensador: Es un sistema de lentes situado bajo la platina que permite concentrar la luz de la fuente de iluminacin hacia la preparacin. Diafragma iris: Est en el interior del condensador y sirve para limitar el haz de rayos que atraviesa el sistema de lentes eliminando los rayos demasiado desviados (regula la luz y ajusta la apertura numrica). Oculares: Estn colocados en la parte superior del tubo y su funcin es captar y ampliar la imagen obtenida por los objetivos. Actualmente se suelen usar los microscopios binoculares que tienen dos oculares unidos por un mecanismo que permite ajustar la separacin interpupilar. Son normalmente de x10 y x12. Objetivos: Estn colocados en la parte inferior del tubo insertados en el revlver y obtienen la imagen real aumentada e invertida. Sobre su superficie est indicado su aumento y su apertura numrica. Suelen llevar dibujado un anillo de color que indica su aumento y suelen ser de x4 (rojo), x10 (amarillo), x40 (azul) y x100 (blanco).

El microscopio ptico compuesto El microscopio compuesto ha sido de importancia crucial para la microbiologa como ciencia y es todava, con ciertas variaciones, el principal apoyo de la investigacin microbiolgica rutinaria. [13] Un microscopio compuesto tiene dos lentes o sistemas de lentes, el objetivo, situado cerca del objeto que se observa, y el ocular, que est colocado cerca del ojo. El aumento primario del objeto es producido por la lente objetivo y la imagen se transmite al ocular, donde se realiza el aumento final. El aumento total de un microscopio compuesto es el producto del aumento de su objetivo y de su ocular. Con un objetivo que aumenta x40 y un ocular que aumenta x10 el aumento total es de x400. El microscopio compuesto es pues capaz de conseguir aumentos considerablemente mayores que el microscopio construido con una sola lente. [13] Adems del aumento una propiedad del microscopio es su poder resolutivo. Esta es la capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos y, por tanto, cuanto mayor sea el poder resolutivo, mayor ser la definicin de un objeto. Los microscopios de gran poder resolutivo son especialmente buenos para ver pequeas estructuras. El poder resolutivo de un microscopio compuesto depende de la longitud de onda utilizada y de una

propiedad ptica de la lente conocida como apertura numrica. Como la longitud de onda habitualmente est fijada, la resolucin de un objeto es funcin de la apertura numrica: cuanto mayor sea la apertura, el objeto resuelto ser ms pequeo. Hay una correspondencia aproximada entre el aumento de un objetivo y su apertura numrica, de tal modo que las lentes con mayores aumentos habitualmente tendrn mayores aperturas numricas (el valor de la apertura numrica est marcado al lado de la lente). El poder resolutivo viene dado por la siguiente frmula:
( )

Para conseguir un aumento total mximo e idneo este debe estar comprendido entre 500 y 1000 veces la apertura numrica. Si se busca una mayor ampliacin de la imagen lo que se consigue es un mayor aumento, pero una nitidez baja. [13] Un factor que afecta a la apertura numrica adems de la construccin de la lente es el medio a travs del cual pasa la luz. Mientras que el objetivo est separado del objeto por el aire, su apertura numrica nunca ser mayor de 1.0. Para conseguir aperturas numricas mayores que sta el objetivo debe estar inmerso en un lquido de mayor ndice de refraccin que el aire. Se utilizan aceites de varios tipos, y las lentes preparadas para usarse con aceite se denominan lentes de inmersin. La apertura numrica de un objetivo de inmersin de alta calidad esta entre 1.2 y 1.4. Aunque las lentes de inmersin en aceite tienen habitualmente mayores aumentos que las lentes para observacin en seco, esto no es siempre as. Una lente de inmersin utilizada en el aire da una imagen muy poco satisfactoria, por lo que nunca deber emplearse sin aceite. [13] De acuerdo con la teora de la ptica, las mayores resoluciones posibles con un microscopio ptico compuesto permitirn la observacin de un objeto cuyo dimetro sea de unos 0.2 m (1 m = 10-6 m). Si un objeto de 0.2 m de dimetro se aumenta 1000 veces, aparecer a la vista como un objeto de 0.2 mm de dimetro que puede apreciarse fcilmente. Con el microscopio compuesto pueden obtenerse aumentos mayores de x1000 escogiendo los

oculares adecuados, pero con ello no se da mayor resolucin del objeto (esto se denomina aumento ineficaz, puesto que no aade nada a la resolucin). [13] La mayor parte de los microscopios usados en microbiologa tienen oculares de diez aumentos (x10) y objetivos de aumentos diversos, habitualmente x10 (aumento total x100), x40 (aumento total x400) y x90 o x100 (objetivos de inmersin, aumento total x900 o x1000). Las lentes de menor aumento se utilizan para rastrear la preparacin buscando objetos de inters, el objetivo de 40 aumentos permite la observacin detallada de los microorganismos grandes tales como algas, protozoos y hongos, y los objetivos de 90 o 100 aumentos se emplean para ver las bacterias y los pequeos microorganismos eucariticos. [13] El sistema de iluminacin de un microscopio es tambin de considerable importancia, especialmente cuando se utilizan grandes aumentos. La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparacin y para esto se utiliza un sistema de lentes llamado condensador. Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano del foco de la luz y elegirse una posicin que consiga el foco preciso. El condensador tiene tambin un diafragma iris, que controla el dimetro del crculo de luz que pasa por el sistema. Lo que se busca con este diafragma iris no es controlar la intensidad de la luz que alcanza el objeto, sino asegurar que la luz que pasa por el sistema condensador ocupe justamente el objetivo. Si el diafragma iris es demasiado grande parte de la luz pasar no slo al objetivo sino tambin alrededor de l y no se utilizar. Si la luz es demasiado brillante no deber reducirse alterando la posicin del condensador o del diafragma iris, sino usando filtros de neutralizacin o disminuyendo el voltaje de la lmpara. Nunca se insistir lo suficiente en que el ajuste apropiado de la luz es crucial para la buena microscopia, especialmente a los mayores aumentos. [13]

Otros dos factores relacionados con el sistema de lentes utilizado son la profundidad de campo y el rea de campo. Profundidad de campo significa el espesor de la preparacin enfocada en cualquier momento y es siempre mayor a pequeo que a gran aumento. Con inmersin en aceite la profundidad de campo es muy escasa, habitualmente menor de 1 m. El rea de campo se representa por el

dimetro de la parte de la preparacin que se est viendo. El rea de campo es siempre

mayor con pequeo que con gran aumento, y por esta razn las lentes de pequeo aumento son tiles para rastrear la preparacin. [13]

El microscopio ptico de contraste de fases El microscopio de contraste de fases hace posible ver fcilmente pequeas clulas, incluso sin teir. Las clulas tienen un ndice de refraccin distinto de su alrededor y esta diferencia puede utilizarse para crear una imagen de mucho mayor contraste que la que puede obtenerse con el microscopio ptico normal. [13] En este microscopio la fuente de luz es un cono hueco de luz que pasa a travs de un diafragma anular al condensador. En el objetivo un anillo de contraste de fases desplaza la fase de luz que lo atraviesa en un cuarto de longitud de onda. La luz que pasa retardada atraviesa el anillo y el ojo la ve como luz blanca normal. La luz que pasa a travs de una muestra con ndice de refraccin diferente del ndice del medio es retardada y tiene un recorrido ms largo, llegando al ocular fuera de fase. La interferencia entre la luz retardada y la no retardada produce una imagen de la muestra. En la mayora de los

microscopios de contraste de fases la imagen aparece clara sobre un fondo oscuro. Puesto que la imagen depende de las diferencias en el ndice de refraccin de la muestra y del medio circundante, la imagen desaparece si la muestra es sumergida en un lquido de igual ndice de refraccin. Para obtener mejores resultados con el microscopio de contraste de fases es esencial que el sistema ptico est cuidadosamente alineado y se emplea un dispositivo especial, el telescopio controlador, para ajustar el diafragma anular en relacin con el anillo de contraste de fases. [13] La microscopia de contraste de fases hace posible observar clulas en estado vivo, ayudndonos as a evitar la creacin de artefactos tales como los introducidos por la tincin. En muchos laboratorios de bacteriologa el microscopio de contraste de fases ha reemplazado prcticamente al microscopio ptico comn como instrumento de investigacin. Pero hay que tener en cuenta que el objetivo de contraste de fases es menos

apropiado que el normal para la observacin de material teido, por lo cual los objetivos de

campo claro son todava necesarios y deberan emplearse siempre para observar teidas. [13] muestras

El microscopio ptico de campo oscuro El microscopio de campo oscuro es un microscopio ptico ordinario cuyo sistema condensador ha sido modificado para dirigir la luz a la preparacin desde los lados de tal modo que slo la luz difractada por la preparacin pasa al ocular y se hace visible. A causa de esta disposicin la muestra aparece

iluminada sobre un fondo oscuro. La microscopia de campo oscuro ha posible la observacin en estado vivo de partculas y clulas que de otra manera estaran por debajo de los lmites de resolucin del microscopio ptico, aunque resulten visibles pocos detalles estructurales. La microscopia de campo oscuro ha sido ampliamente

usada en el estudio de pequeas mviles tales clulas como

Treponema pallidum, la espiroqueta causante

de la sfilis, que es invisible microscopia ordinaria. [13] con la ptica

El microscopio ptico de fluorescencia Se utiliza para poner de manifiesto muestras que tienen fluorescencia, bien a causa de la presencia en su interior de sustancias materiales fluorescentes o que han sido tratadas con colorantes fluorescentes. La fluorescencia es la propiedad que tienen muchas sustancias qumicas de emitir luz de un color despus de excitarlas con luz de otro color. En el microscopio de fluorescencia la luz de excitacin es eliminada con un filtro colocado entre el

objetivo y el ocular, de modo que slo se ve la luz emitida. [13]

El microscopio electrnico Para estudiar la estructura interna de los microorganismos es esencial el uso del microscopio electrnico. En este microscopio se utilizan electrones en vez de rayos de luz, y como lentes funcionan unos electroimanes. Todo el sistema opera en el vaco. Cuando los electrones pasan a travs de la preparacin algunos son difractados creando entonces una imagen que se hace visible en una pantalla sensible a los electrones. La resolucin obtenida con el microscopio electrnico es mucho mayor que la conseguida con el microscopio ptico. Mientras que con estructuras ms pequeas que pueden observarse tienen unos 0.2 m, con el microscopio electrnico pueden verse fcilmente objetos de 0.001 m (= 1 nm = 10-9 m). Con el microscopio electrnico es posible ver muchas sustancias incluso de tamao molecular. Sin embargo, a causa de la naturaleza de este instrumento slo pueden examinarse objetos muy delgados. Si se est interesado en ver estructuras internas, incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser observada directamente. Por consiguiente, para preparar muestras para el microscopio electrnico se necesitan tcnicas especiales de cortes ultrafinos. Para seccionar las clulas primero deben ser fijadas y deshidratadas, realizndose habitualmente esto ltimo transfiriendo las clulas a un disolvente orgnico. Despus de la deshidratacin la muestra es incluida en plstico y en este plstico se cortan secciones finas utilizando un ultramicrtomo, por lo general equipado con una cuchilla de diamante. Una sola clula bacteriana, por ejemplo, puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas, que son examinadas despus individualmente con el microscopio electrnico. Para obtener suficiente contraste, las preparaciones se tratan con colorantes especiales de la microscopia electrnica, tales como cido smico, permanganato, uranio, lantano o plomo. Estos materiales estn compuestos por tomos de elevado peso molecular y, por ello, dispersan bien los electrones. Las estructuras celulares teidas con uno de esos materiales presentan un contraste muy aumentado y, por tanto, se ven mejor. [13]

La fina seccin es montada sobre una rejilla metlica recubierta de colodin y es incorporada al instrumento, luego se aplica el alto vaco. Una vez es evacuada la cmara de la muestra, se enfoca el haz electrnico y la imagen se observa en una pequea pantalla. Se toman fotografas de las imgenes interesantes, ya que slo en la placa fotogrfica se obtiene la resolucin ltima del microscopio electrnico. El intenso haz electrnico causa el deterioro gradual de la muestra, de forma que no es posible una observacin a largo plazo. [13] La fijacin, la inclusin y la tincin son tratamientos potencialmente perjudiciales y pueden alterar grandemente las estructuras celulares. Por esta razn debe tenerse gran cuidado en la interpretacin de las imgenes obtenidas con el microscopio electrnico. Los artefactos o creaciones artificiales son mucho ms comunes que en la microscopia ptica. Procedimientos que van bien con ciertos organismos pueden fallar con otros. En general, se utilizan mtodos diferentes para los organismos procariticos y para los eucariticos. [13] La microscopia electrnica es un arte altamente desarrollado y con esta tcnica somos observar capaces de

estructuras

celulares que no pueden verse de ninguna otra manera. La resolucin

mucho mayor que puede obtenerse justifica el

cuidado, el tiempo y el gasto que representa la preparacin de

micrografas electrnicas. [13]

El sombreado Si slo tiene que observarse el contorno de un organismo, no son necesarias secciones finas y sobre la rejilla metlica pueden montarse clulas enteras. Para aumentar el contraste de las clulas entras se recurre generalmente al sombreado. Esto implica el recubrimiento de la muestra con una fina capa de metal como, por ejemplo, paladio, cromo u oro. El metal se deposita sobre el objeto por un lado de forma que se crea una sombra. De esta manera el objeto aparece con grosor y forma. El sombreado se utiliza a menudo para observar apndices superficiales en las bacterias. [13]

La tincin negativa Otro modo de conseguir contraste con el microscopio electrnico es la tincin negativa. Se aplica el mismo principio que en la tincin negativa del microscopio ptico. Se utiliza una sustancia que no penetra la estructura pero que dispersa los electrones. Una de las tinciones negativas ms comnmente utilizadas en la microscopia

electrnica se realiza con cido fosfovolfrmico (fosfotngstico). [13]

Rplicas de carbono Para examinar las superficies celulares pueden prepararse rplicas de carbono evaporando sobre la superficie de las clulas una fina capa de carbono que se adapta a los contornos de la superficie celular y que cuando es desprendida para al resulta poder

suficientemente observarse

delgada

directamente

microscopio

electrnico. [13]

Criocorrosin Otra tcnica de la microscopia electrnica recientemente desarrollada es la de criocorrosin (freeze-etching), que evita la formacin de artefactos al eliminar la fijacin qumica y la inclusin. La muestra que va a examinarse es congelada sin tratamiento qumico y el bloque congelado se corta con una cuchilla de diamante, de tal modo que quedan expuestas porciones de las superficies de las clulas. Se hacen y se examinan entonces rplicas en carbono de esas superficies, pudindose observar estructuras

superficiales o internas de las clulas. La mayora de las estructuras celulares vistas en secciones ultrafinas de preparaciones fijadas qumicamente se ven tambin en material congelado, lo que sugiere que esas estructuras no son artefactos. [13] El microscopio electrnico explorador Otro instrumento reciente para examinar las estructuras superficiales es el microscopio electrnico explorador (scanning electron microscope). El material que se estudia es recubierto con una pelcula fina de un metal pesado tal como el oro. El rayo de electrones es dirigido sobre la preparacin y la va recorriendo y explorando por todas la superficie. Los electrones dispersados por el metal pesado activan una pantalla de observacin produciendo una imagen. Con el microscopio electrnico explorador pueden observarse incluso muestras muy buena grandes, la siendo muy de

profundidad

campo. El aumento que puede obtenerse oscila entre uno tan bajo como x15 y uno tan alto como x100000, pero slo

puede observarse la superficie

de un objeto. [13] La siguiente figura muestra los distintos tipos de clulas y componentes que pueden ser vistas slo con el microscopio electrnico y no con el microscopio ptico (como las molculas pequeas y los virus), como as tambin otras estructuras que pueden ser vistas con los dos tipos de microscopios (clula animal, clula vegetal y bacterias). [12]

Bibliografa [1] http://www.saberdeciencias.com.ar/index.php/apuntes-de-microbiologia/141-

microbiologia-bacterias-forma-y-tamano [2] Microbiologa general. Introduccin, morfologa y estructura de los

microorganismos pdf. [3] Mtodo de anlisis microbiolgico. Sara cano cuerda. Pdf [4] Microbiologa. Guion de prcticas. Pdf [5] Reproduccin y crecimiento microbiano. Pdf [6] Crecimiento bacteriano. Pdf [7] Crecimiento. Pdf [8] Cultivo y crecimiento de los microorganismos. Pdf [9] Mtodos de esterilizacin. Pdf [10] Sanitizacin online posfjhszdbvjsbinsz jajaja [11] Tema 7. Pasteurizacin pdf [12] Microscopia. Cesar e. Montalvo arenas. Pdf [13] Tipos de microscopios. AcuaNatura. Pdf