A Clula como Unidade de Vida Microscopia e Estudo da Clula

At ao incio do sc. XVII o conhecimento dos seres vivos limitava-se, fundamentalmente, a organismos macroscpicos. A descoberta da clula s foi possvel quando o avano tcnico permitiu o aperfeioamento das lentes e a construo do microscpio ptico composto (MOC). Numerosos investigadores interessaram-se, pelo estudo de diversos materiais vivos; os pequenos avanos de uns constituam, para outros, pontos de partida para estudos mais alargados. Simultaneamente, as tcnicas de observao foram sendo melhoradas o que, por sua vez, tornou possveis observaes mais minuciosas e rigorosas. Foi longo o caminho que conduziu a uma das mais importantes generalizaes da Biologia a Teoria Celular.

TEORIA CELULAR
Princpio Unificador da Biologia A clula a unidade bsica de estrutura e funo de todos os seres vivos. Todos os seres vivos, dos mais simples aos mais complexos, so constitudos por clulas, nas quais ocorre um conjunto de reaces qumicas necessrias manuteno da vida. Todas as clulas provm de clulas preexistentes, pois qualquer clula se forma por diviso de uma outra. A clula a unidade de reproduo e desenvolvimento dos seres vivos; numerosos seres vivos formam-se por divises sucessivas a partir de uma nica clula ovo. A clula a unidade hereditria de todos os seres vivos. na clula que est contida a informao gentica que transmitida de gerao em gerao, durante os processos de diviso celular, permitindo a continuidade das espcies.

Microscpio ptico
Constituio e Funcionamento

O microscpio ptico um instrumento indispensvel aos trabalhos laboratoriais que envolvam o estudo da clula. Ao fornecer imagens ampliadas de grande preciso, torna possvel a observao de estruturas invisveis vista desarmada. Para uma rentabilizao das suas potencialidades torna-se absolutamente essencial conhecer a sua constituio e funcionamento.
Conjunto de lentes que permitem a ampliao do objecto. A ampliao dada pelo microscpio igual ao produto da ampliao da objectiva pela ampliao da ocular. Ex.: Ampliao da ocular: 10 x Ampliao da objectiva: 15 x Ampliao do microscpio: 10 x 15 = 150 x A objectiva aumenta a imagem do objecto A ocular aumenta a imagem que recebe da objectiva. O espelho duplo, pois tem uma face plana (para a luz natural) e uma face cncava (para a luz artificial). Destina-se a reflectir para a platina a luz que recebe da fonte luminosa. Distribui regularmente, no campo visual do microscpio, a luz reflectida pelo espelho. Regula a intensidade luminosa no campo visual do microscpio. Suporta o microscpio, assegurando a sua estabilidade. Nos microscpios actuais frequentemente articulada na zona junto platina, o que permite inclinar o microscpio, tornando as observaes mais cmodos. Cilindro que suporta os sistemas de lentes, localizando-se na extremidade superior a ocular e na inferior o revlver com os objectivas. Placa onde se colocam as preparaes a observar. Tem no centro uma abertura circular, a janela, por onde passam os raios luminosos que vo iluminar a preparao (depois de atravessarem o sistema de iluminao). Engrenagem que suporta o tubo e que permite a sua deslocao ou a da platina. indispensvel para fazer a focagem. Imprime ao tubo ou platina movimentos de amplitude muito reduzida, completando a focagem. Permite explorar a profundidade de campo do microscpio. Disco adaptado zona inferior do tubo, que suporta 2 a 4 objectivas de diferentes ampliaes; por rotao, possvel trocar rpida e comodamente de objectiva

Sistema de oculares

Parte ptica

Sistema de objectivas

Espelho duplo Sistema de iluminao Condensador Diafragma P

Coluna

Tubo ou canho

Parte Mecnica

Platina ou mesa do microscpio Macromtrico ou Cremalheira Micromtrico

Parafusos

Revlver

Microscpio ptico Composto (M.O.C.)

Seguidamente apresenta-se a constituio de um M.O.C.: 1- Condensador 2- Revlver 3- Brao ou coluna 4- Objectivas 5- Pinas 6- Platina 7- Parafuso macromtrico 8- Diafragma 9- Parafuso micromtrico 10- Ocular 11- Espelho 12- Base ou p 13- Tubo ptico do canho

ILUMINAO E FOCAGEM
1- Iluminar o campo do Microscpio ptico - captar uma quantidade de luz adequada para a observao do Material. a) Fonte luminosa incorporada Lig-la; Regular a abertura do diafragma e a posio do Condensador

b) espelho Orient-lo em busca de melhor captao de luz; usando a face plana para a luz natural e a face cncava para a luz artificial Regular a abertura do diafragma e a posio do condensador.

2- Focar regular a distncia entre as lentes e o objecto por forma a obter uma imagem o mais ntida possvel.

CARACTERSTICAS DA IMAGEM EM M.O.

A imagem que se obtm no M.O. Composto : o maior que o objecto (ampliada); o virtual; o invertida e simtrica.

O microscpio ptico composto garante imagens adequadas quando as necessidades de ampliao no ultrapassam as 1500 a 2000 vezes.

PODER DE RESOLUO E LIMITE DE RESOLUO

Poder de resoluo a capacidade que o microscpio apresenta de fornecer imagens ntidas e minuciosas.

Limite de resoluo mnima distncia entre dois pontos a partir da qual eles passam a ser confundidos como um nico ponto.

O Limite de resoluo depende do comprimento de onda da luz utilizada.

DIMENSES EM M.O.
Uma das primeiras preocupaes de quem estuda a clula estabelecer uma relao de grandeza das estruturas celulares com as unidades de medida mais usuais, o milmetro e o metro: Metro (m) - 1 Milmetro (mm) 10-3 m Micrmetro (m) 10-6 m Nanmetro (nm) 10-9 m Angstrom () 10-10 m Picmetro (pm) 10-12 m

OUTROS TIPOS DE MICROSCPIOS PTICOS

Microscpio ptico de fluorescncia Muito usado em Citologia. Permite a observao de estruturas celulares marcadas com substncias qumicas que fluorescem ou emitem luz visvel ao serem iluminadas pela luz ultravioleta.

Microscpio de contraste de fase tem a vantagem de permitir o exame de clulas vivas, no coradas. Microscpio de fundo escuro normalmente utilizado na observao de estruturas de dimenses muito pequenas e transparentes. Microscpio confocal um microscpio bastante recente. O nome confocal significa ter o mesmo foco, o que, neste caso, corresponde a ter duas lentes alinhadas cujos focos se situam num nico ponto do espao. Assim, h formao de um cone de luz que faz um seccionamento ptico; isto tem a vantagem de permitir observar organismos vivos, sem ser necessrio fazer cortes.

Preparaes
Preparaes temporrias ou extemporneas so realizadas quando o objecto se destina a ser observado no momento e depois desaproveitado.

Meios de Montagem utilizados:

gua doce; gua destilada; gua salgada; Soro fisiolgico artificial ou soluto de Ringer ou plasma sanguneo.

Estes meios de montagem no alteram as condies do material a observar Lquidos indiferentes. Preparaes Definitivas Realizam-se quando o objecto se destina a ser guardado para posteriormente poder voltar a ser observado.

TCNICAS PARA OBSERVAO DE CLULAS AO MICROSCPIO PTICO

A microscopia inclui vrios tipos de instrumentos e tcnicas. De acordo com a constituio e funcionamento do microscpio ptico, o material biolgico, para ser observado, tem de ser sujeito a uma srie de manipulaes fsicas e qumicas. No microscpio ptico a luz transmitida atravs do objecto, de modo que o material tem de ser atravessado pela luz, a fim de se produzir a imagem. Este aspecto impe que, na observao de tecidos animais ou vegetais em que as clulas esto justapostas, seja necessrio fazer finos cortes de modo a que se apresentem translcidos. Com esse objectivo, utilizam-se normalmente as seguintes tcnicas: 1- Tcnica do esfregao; 2- Tcnica do esmagamento; 3- Tcnica de cortes finos.

TCNICA DO ESFREGAO

Tcnica utilizada com frequncia em bacteriologia. Esta tcnica permite a separao de clulas em meio lquido. Consiste em espalhar um fragmento de tecido ou uma colnia sobre uma lmina de vidro, o que provoca a dissociao de alguns elementos celulares e a sua aderncia ao vidro. Desta maneira forma-se uma camada fina de clulas, facilitando a observao. Mtodo usado para: Observao de sangue e outros lquidos orgnicos. (Coloca-se uma gota do lquido sobre uma lmina e com outra lmina ou lamela, espalha-se bem (esfregao). Aps estar seco, o material, pode ser fixado e corado.

TCNICA DO ESMAGAMENTO

Tcnica utilizada nos casos em que existe uma aderncia fraca entre as clulas do tecido a observar. Para visualizar as clulas, basta colocar um pequeno fragmento do tecido entre a lmina e a lamela e fazer uma pequena presso com o polegar. Provoca-se, desta forma, um esmagamento do tecido, o que faz com que as clulas se espalhem, formando uma fina camada, que facilmente atravessada pela luz.

TCNICA DOS CORTES FINOS

Esta tcnica mais complexa e frequentemente utilizada em Histologia. Quando o material a ser estudado apresenta uma consistncia mole, necessrio proceder sua incluso prvia, embebendo-o, por exemplo, em parafina lquida que, aps solidificar, garante uma consistncia adequada ao corte. Este corte poder ser feito com um micrtomo que permite obter fatias muito finas, com cerca de 3 a 6 m de espessura. O material banhado por um solvente e mergulhado em parafina derretida pelo calor. A parafina penetra nas clulas e endurece; forma-se um bloco de parafina que envolve o tecido a observar. Com a ajuda do micrtomo, este bloco seccionado em fatias finas (espessura 5 m ). O corte ento colocado sobre uma lmina de vidro e a parafina dissolvida por um solvente (xilol), ficando o fino corte de clulas sobre a lmina. O material , em seguida,

corado e desidratado, procedendo-se sua montagem, para a qual se utiliza o blsamo do Canad (meio de montagem), que, ao solidificar, faz aderir a lamela lmina. Outra forma de dar consistncia necessria ao material biolgico para possibilitar o corte empregando a congelao; ou seja, congelando o material antes de o cortar. No caso dos tecidos vegetais, que j apresentam uma certa rigidez, possvel fazer cortes sem incluso, ou ento com uma simples incluso entre dois pedaos de medula de sabugueiro.

Quando no necessrio obter cortes extremamente finos, podemos efectu-los com: - Uma lmina bem afiada (ex.plo: lmina de barbear) - Um bisturi

Colorao e Fixao
Todas as tcnicas citolgicas implicam frequentemente a colorao de material biolgico; a maioria das estruturas celulares s so observveis ao microscpio ptico composto se a clula for previamente tratada por corantes. Cada corante reage apenas com certos elementos celulares, que ficam contrastados em relao aos outros, o que facilita a observao. Para observarmos clulas vivas deve-se ter o cuidado de usar corantes que no alterem nem destruam o material biolgico. Tais corantes os corantes vitais como o caso do azul de metileno, do vermelho neutro e da eosina, so utilizados normalmente nas preparaes extemporneas ou preparaes temporrias preparaes feitas para exames de ocasio. Quando se pretende fazer um grande nmero de observaes ou exames demorados so geralmente utilizadas preparaes definitivas. Neste caso, alm da colorao, h necessidade de preservar, da maneira mais perfeita possvel, a estrutura original das clulas. Tal efeito consegue-se com a utilizao de fixadores substncias qumicas como o formol, o ter, o cido actico e o lcool que matam rapidamente a clula, mantendo as suas estruturas com a menor alterao possvel, sendo assim conservado o material biolgico para futuras observaes.

Os agentes susceptveis de exercerem aco fixadora tambm podem ser de natureza fsica; como o frio e o calor. Consoante a estrutura celular que se pretende observar, deve-se ter o cuidado de escolher o fixador mais adequado, pois estes actuam de diferente forma.

Corantes Especficos
CORANTES Orcena actica gua iodada Eosina Soluto de lugol Vermelho neutro Azul de metileno ESTRUTURAS Cromossoma Ncleo, gros de amido Citoplasma Parede celulsica, gros de amido Vacolos Ncleo

Montagem
Consiste na colocao do material num meio, entre a lmina e a lamela, que o isola do exterior, protegendo-o da aco de fungos e bactrias. Usam-se por exemplo a gelatina glicerada e o blsamo do canad. A montagem poder ser completada com a colocao de um verniz ou lacre que recobre as extremidades da lamela utilizada, reforando o isolamento do exterior.

Microscpio Electrnico de Transmisso (MET)

Consideraes gerais O nosso conhecimento sobre a complexa organizao celular relativamente recente. At dcada de 40 apenas se conhecia da estrutura celular o que era possvel observar em funo do poder de resoluo do microscpio ptico. Olhando ao longe uma floresta, ela surge como uma mancha verde; mas ao perto constatamos ser constituda por rvores e arbustos de espcies e

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tamanhos diferentes. Do mesmo modo, tambm s depois do aperfeioamento das tcnicas microscpicas e do aparecimento do microscpio electrnico a clula pde ser olhada de perto e observadas, detalhadamente, as suas ultra-estruturas, at a escondidas na massa semifluida do citoplasma. Com um poder de resoluo e de ampliao muito superior ao do microscpio ptico, o microscpio electrnico permitiu penetrar no mundo microscpico da clula. Embora se apresente com uma construo fsica bastante mais complexa e robusta, o microscpio electrnico de transmisso (M.E.T.) tem, na globalidade, uma estrutura muito semelhante do microscpio ptico. A diferena fundamental entre estes dois instrumentos de observao reside no facto de o microscpio electrnico no utilizar a luz para dar a imagem do objecto, mas sim um feixe de electres acelerados, o que faz com que as lentes usadas no sejam de vidro ou cristal, como no microscpio ptico, mas lentes electromagnticas. O comprimento de onda do feixe de electres pode ser muito reduzido; obtendo-se assim um elevado poder de resoluo. No microscpio electrnico de transmisso o feixe de electres atravessa o material a observar, de modo que a imagem resulta da maior ou menor absoro dos electres por parte das diferentes estruturas celulares. A imagem visualizada atravs de um ecr fluorescente ou registada numa pelcula fotogrfica.

Microscpio Electrnico de Transmisso (MET)

Constituio e funcionamento O Microscpio electrnico de transmisso tem basicamente duas partes: 1 Parte electrnica 2 Parte do vcuo

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1 PARTE ELECTRNICA

O tipos de radiao so feixes de electres. Existe um filamento de tungstnio em forma de V que est ligado a alta voltagem (40 KV a 120 KV). Esse filamento levado incandescncia atravs do aquecimento, o que conduz emisso de electres.

No MET no existem lentes de vidro ou cristal, mas sim lentes electrnicas (electrostticas e electromagnticas).

Lentes electrnicas:

Lente electrosttica esta lente que proporciona a formao do feixe de electres canho de electres. Lentes electromagnticas So cilindros ocos, metlicos,

percorridos por uma corrente elctrica que cria um campo magntico permitindo a deflexo do feixe electrnico.

A focagem do feixe conseguida atravs da variao da corrente que passa nas lentes.

2 PARTE DO VCUO

Bombas rotativas e bombas de difuso; Pontos na coluna onde o ar aspirado; Aparelhos de medida; Reservatrios; Vlvulas; Existncia, na zona da preparao, de um sistema de isolamento que permite mudar a preparao sem que seja preciso pr ar no vcuo de toda a coluna.

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A IMPORTNCIA DO VCUO

importante que exista vcuo pela simples razo de que se existisse ar na coluna do microscpio, a coliso dos electres com as partculas do ar iria fazer com que os electres se deslocassem, somente, escassos milmetros, quando, na realidade, tm de percorrer cerca de 2 metros.

ECRAN

Os nossos olhos no so capazes de observar, directamente, imagens produzidas por electres. Devido a isso recorre-se a um cran que est

pintado com uma substncia fluorescente, ou ao uso de uma cmara fotogrfica.

CMARA FOTOGRFICA

A utilizao da cmara fotogrfica est relacionada com o facto do feixe de electres destruir o material biolgico. Assim sendo, a imagem recebida num cran fluorescente que permite uma observao directa, ou ento, numa chapa fotogrfica que em seguida revelada.

VANTAGENS E INCONVENIENTES DO USO DO MICROSCPIO ELECTRNICO EM CITOLOGIA

Como os electres s se propagam a distncias considerveis no vazio, toda a parte essencial do microscpio electrnico est encerrada numa coluna hermtica, mantida sob vcuo; logo, as clulas no podem ser observadas vivas nem com as suas cores naturais. Alm disso, o objecto tem de ser extremamente fino, de modo a permitir que um nmero suficiente de electres o atravesse e forme uma imagem.

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Outro aspecto que devemos ter presente que a grande ampliao dada pelo microscpio electrnico, e o seu correspondente poder de resoluo, por vezes possibilita apenas a observao de uma parte de um organito celular, pois a rea do objecto que visualizado varia inversamente ampliao utilizada. A utilizao do microscpio electrnico requer pessoal especializado; o seu preo elevado, comparativamente ao do microscpio ptico, a par das dificuldades inerentes preparao de material biolgico para observao, faz com que este precioso auxiliar de investigao seja apenas privilgio de alguns laboratrios.

Comparao entre o MOC e o MET

M.ELECTRNICO TRANSMISSO Feixe de electres Electromagnticas e electrostticas Vrias lentes electromagnticas 500 000 vezes 0,5 0,1 nm Variao da corrente elctrica que passa atravs das lentes electromagnticas A imagem projectada num ecr ou registada em pelcula fotogrfica Preto e branco

CARACTERSTICAS

M. PTICO COMPOSTO Luz (fotes) Vidro ou cristal Uma ou algumas lentes 2000 vezes 150 - 200 nm As lentes tm um foco fixo e o focagem efectua-se fazendo variar o distncia em relao ao objecto Retina do observador Geralmente colorida

Tipo de radiao Lentes Condensador Ampliao Poder de resoluo mximo Focagem Local de formao da imagem Imagem Material a observar

No vivo, desidratado, Vivo e no vivo, sendo muito fino. normalmente colocado colocado numa grelha de numa lmina de vidro. cobre no vcuo.

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MICROSCPIO ELECTRNICO DE VARRIMENTO (MEV)

H cerca de 30 anos comeou tambm a ser utilizado um outro tipo de microscpio electrnico o microscpico electrnico de varrimento (M.E.V.). Com uma construo e operao totalmente diferentes do microscpio electrnico de transmisso (M.E.T.). O M.E.V. permite obter imagens da superfcie externa de partculas muito pequenas e a trs dimenses.

TCNICAS PARA OBSERVAO DE CLULAS AO MICROSCPIO ELECTRNICO

Como foi referido, dadas as caractersticas de funcionamento do M. E. no possvel a observao de clulas vivas. O material a examinar sujeito a um tratamento fsico e qumico. Este tratamento tem o objectivo de tornar o material suficientemente fino e seco a fim de permitir a passagem de electres e haver formao de imagem. Tal como acontece no microscpio ptico, o material primeiramente fixado e depois desidratado, sofrendo, de seguida, uma incluso em resinas para adquirir a rigidez necessria ao seu seccionamento, com o auxlio de um ultramicrtomo. Uma das tcnicas utilizadas a tcnica dos cortes seriados, que permite reconstituir tridimensionalmente as estruturas celulares, pois a clula no plana e o que observamos em cada preparao no mais do que uma imagem parcial de um plano de corte que foi realizado na clula.

Resumo: Tcnicas citolgicas usadas em M. Electrnica: fixao (com Tetrxido de smio); desidratao; incluso em resinas artificiais; corte (ultramicrtomos); contraste (utilizam-se substncias contrastantes como o smio, o urnio ou o chumbo, que se ligam de forma diferente s vrias estruturas celulares, fazendo variar o grau de penetrao dos electres nesses locais).

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TCNICAS ESPECIAIS PARA OBSERVAO DE ESTRUTURAS CELULARES

Nos ltimos anos tm sido desenvolvidas tcnicas especiais no sentido de permitir o isolamento das diferentes estruturas celulares e,

consequentemente, uma observao mais minuciosa desses constituintes da clula:

Uso de marcadores radioactivos com este mtodo possvel detectar em que local da clula esto a ser sintetizadas determinadas substncias e acompanhar o seu percurso. uma tcnica sofisticada em que se utilizam substncias radioactivas que tm a propriedade de impressionar chapas fotogrficas auto-radiografia.

Criofractura esta tcnica tem contribudo grandemente para o estudo da estrutura interna das biomembranas, pois permite a clivagem da bicamada lipdica, deixando observar o seu interior.

Centrifugao diferencial permite isolar os diferentes organitos celulares em funo da sua massa. Com este mtodo foi possvel estudar detalhadamente vrios organitos celulares, nomeadamente mitocndrias, cloroplastos, ncleos e ribossomas.

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ORGANIZAO CELULAR
De acordo com a Teoria Celular, a clula a unidade bsica estrutural e funcional de todos os seres vivos, comportando-se como unidade independente, mesmo nos organismos multicelulares. Apesar desta universalidade de estrutura e funo, h diversidade no tamanho, forma e grau de complexidade. Algumas clulas possuem uma estrutura muito simples, mas a maioria apresenta uma maior complexidade. As clulas mais simples possuem um nmero muito reduzido de organitos e no tm sequer um ncleo organizado, individualizado do citoplasma por um invlucro so as clulas procariticas. As clulas mais complexas possuem ncleo organizado e individualizado do citoplasma por um invlucro e numerosos organitos so as clulas eucariticas. Os seres constitudos por clulas procariticas chamam-se procariontes; incluem bactrias e algumas algas primitivas (algas azuis). Os seres constitudos por clulas eucariticas chamam-se eucariontes e incluem os restantes seres vivos.

Aspectos comparativos entre Clulas Procariticas e Clulas Eucariticas

Caractersticas
Tamanho da clula

Clulas eucariticas

Clulas procariticas

Parede Celular

Material gentico

Organelos

Estruturas respiratrias Fotossntese

Flagelos

Cerca de 40 m de dimetro; em regra 1000 a 10 000 vezes Dimetro mdio 0,5 5 m o volume da clula procaritica. Presente nas plantas e fungos. rgida e formada por Rgida constituda por polissacelulose nas plantas e por cardeos com aminocidos. quitina nos fungos. No existe invlucro nuclear, Possuem verdadeiro ncleo nem nuclolo. O material que contm um ou mais nuclear est em contacto directo com o citoplasma e nuclolos. constitui o nucleide. Ausncia de organelos com Muitos organelos membranas. Contm muitos membranares como mitoribossomas que tm menores cndrias, retculo, complexo dimenses que os das de Golgi. clulas eucariticas. Hialoplasma e membrana Hialoplasma e mitocndrias. plasmtica. Ocorre em cloroplastos com Sem cloroplastos. Tem lugar, uma estrutura membranar por exemplo, em lamelas complexa. fotossintticas. Organelos locomotores Organelos locomotores complexos, rodeados por simples, no includos na membrana plasmtica membrana plasmtica.

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Aspectos comparativos entre Clulas Eucariticas Animais e Clulas Eucariticas Vegetais

Apesar de em todas as clulas eucariticas existir uma estrutura bsica semelhante, h algumas diferenas entre a clula animal e a clula vegetal. No quadro seguinte esto evidentes algumas dessas diferenas.

Estrutura
Parede Celular Centrolos Plastos Vacolos

Clula animal
Ausente Presentes (em regra) Ausentes

Clula vegetal
Presente Ausentes (nas superiores) Presentes plantas

Presentes, as dimenses Presentes, so pequenos aumentam com a idade e temporrios da clula e o nmero diminui.

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