Neonatal TSH Screening ELISA

ENGLISH ESPAOL

(en) (es)

ZenTech s.a.
Lige Science Park Avenue du Pr Aily, 10 4031 ANGLEUR, Belgium Tel. : + 32-(0)4-361.42.32 Fax : + 32-(0)4-367.00.63 info@zentech.be www.zentech.be

Neonatal TSH Screening ELISA / E-GP-MZ-003 / 03-10

ISO15223

MEDICAL DEVICES SYMBOL

STORAGE TEMPERATURE LIMITATION BATCH CODE USE BY

SMBOLOS PARA APARATOS DE USO EN MEDICINA LIMITACION DE

TEMPERATURA DE ALMACENAMIENTO

CDIGO DE LOTE CONSUMIR ANTES DE CONSULTAR LAS INSTRUCCIONES DE MANEJO O FUNCIONAMIENTO DISPOSITIVO DE DIAGNOSTICO IN VITRO FABRICADO POR NUMERO DE CATALOGO

CONSULT OPERATING INSTRUCTIONS IN VITRO DIAGNOSTIC DEVICE MANUFACTURED BY CATALOGUE NUMBER

SYMBOLS (EDMA recommendations) Number of determinations (192 - 480 - 2400) Calibrators Control serum Microtiterplate Enzyme conjugate Extraction solution Conjugate diluent Chromogen Substrate Washing solution to be diluted ten-fold Blocking reagent

SMBOLOS (recomendaciones de la EDMA) Nmero de determinaciones (192 - 480 - 2400) Calibradores Suero de control Piaca de microvaloracion HRP conjugato Solucion de Extraccion Diluente conjugato Sustrato cromogeno Solucin de lavado que debe diluirse 10 veces Reactivo de bloqueo

Neonatal TSH Screening ELISA / E-GP-MZ-003 / 03-10

ENGLISH
Enzyme immunoassay for the titration of Thyrod Stimulating Hormone in dried blood spots of neonates.
E-GP-192B (192 tests: 2x (12 strips x 8 wells)) E-GP-480B (480 tests; 5x (12 strips x 8 wells)) E-GP-2400B (2400 tests; 25x (12 strips x 8 wells))

stopped by addition of sulfuric acid and absorbance at 450 nm is read using an ELISA microtiter plate reader.

3. KIT CONTENTS
1. Coated microtiterplate: strips coated with anti TSH. 2. TSH calibrators and controls: Aluminium bag with calibrators C0C5 and internal controls L1-L2 (dried blood spots on Whatman 903 specimen collection paper using human matrix containing specified amount of human TSH). 3. TSH conjugate: 100x concentrated anti-TSH antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRPO). Preservatives: Thimerosal (0.02%). Caution: see safety section 6. Dilute concentrated solution 1: 100 with Conjugate diluent, e.g. 300l + 30 ml. 4. Extraction buffer: Ready for use buffer with BSA and Tween 20. Preservative: thimerosal 0.1%. 5. Conjugate diluent: Ready for use buffer with BSA and Tween 20. Preservative: thimerosal 0.1%. 6. Washing solution: 10 x concentrated Phosphate buffer with detergent. Preservative: Thimerosal 0.01%. Dilute concentrated solution 1: 10 with fresh and germ free distilled or deionised water, e.g. 55 ml + 495 ml = 550ml. Conservation of concentrated washing solution at low temperatures (2-8 may C) lead to crystal formation. These crystals dissolve upon heating (37 or dilution to working concentration. C) Stability after dilution: 10 weeks at RT (20-25 C ). 7. Chromogenic substrate: 3.3 - 5.5 Tetramethylbenzidine. Ready for use. 8. Blocking reagent: H2SO4, 0.5M. Ready for use. 9. Sealing tapes Reagents 192
Wells Calibrators 0-5 Control 1-2 TSH conjugate Extraction buffer Conjugate diluent Washing Solution Chromogenic substrate Blocking Reagent Sealing tapes 2x (12x8) 1 aluminium pouch 1 x 300 l 1 x 30 ml 1 x 30 ml 2 x 55 ml 1 x 30 ml 1 x 30 ml 2 sheets

In vitro Diagnostic (Professional use only) 1. Introduction

The Neonatal TSH Screening ELISA from Zentech is an enzyme immunoassay for the quantitative determination of thyroid stimulating hormone in dried blood samples on Whatman 903 filter paper. This kit is particularly suitable for screening for primary hypothyroidism in newborns. Elevated results indicate the need for further study to assess congenital hypothyrodism. Thyroid Stimulating Hormone (TSH) is responsible for providing the primary stimulus for the synthesis and secretion of the thyroid hormones thyroxine (T4) and triiodothyronine (T3). This glycoprotein hormone is secreted in the anterior pituitary gland, under the control of thyrotropin releasing factor (TRH), produced in the hypothalamus. The thyroid hormones produced under the direction of TSH exert a negative feedback on the pituitary gland, which regulates the secretion of TSH. This negative feedback relationship between the thyroid and pituitary glands implies that TSH is always elevated in primary hypothyroidism, often to very high levels. It is, therefore, the most sensitive test of hypothyroidism, including patients whose T4 values are still within the normal range (1, 2). Primary congenital hypothyroidism, caused by athyroidism and hypoplasia, occurs in one out of every 3,000 to 7,000 infants (3). Transient and mild hypothyroidism can also occur, especially in very preterm or very low birth weight infants (11, 13, 14). It is probably one of the most preventable causes of mental retardation. Studies have shown that the early clinical diagnosis and subsequent treatment of this disorder, usually within the first two weeks after birth, tends to prevent irreversible mental retardation, neurologic dysfunction or disabling. (4, 5,10). It has been suggested that the most effective method of assessing the infants thyroid function is a combination of a T4 and TSH screening program (4, 5, 6, 10, 11, 12). This is due to the fact that TSH screening may miss hypothyroidism of the secondary type, while some T4 determinations may miss minimal hypothyroidism. Therefore, the combination of T4 and TSH affords the clinician with the best possible overview of the infants thyroid state. Infants suspected of marginal or borderline hypothyroidism by virtue of the blood spot screening procedures should have confirmation test, performed by using serum T3, T4, and TSH determinations as well as other thyroid tests prior to initiating therapy, such as thyroid controlled stimulation by TSH, scintigraphy or sonography. Concentrations of TSH and T4 have been shown to vary with demographic variations, infant age, gender, weight, and prematurity. Therefore, it is important that each laboratory determines its own normals and cut-offs with infant age taken into account (11, 13, 14).

Quantity 480
5x (12x8) 2 aluminium pouches 3 x 300 l 3 x 30 ml 3 x 30 ml 6 x 55 ml 3 x 30 ml 3 x 30 ml 5 sheets

Physical state 2400

25 (12x8) 4 aluminium pouches 13 x 300 l 13 x 30 ml 13 x 30 ml 26 x 55 ml 13 x 30 ml 13 x 30 ml 25 sheets Ready for use Dried blood spots Concentrated 100x Ready for use Ready for use Concentrated 10x Ready for use Ready for use

4. STORAGE AND STABILITY OF THE KIT

When stored at 2 8 unopened reagents will retai n reactivity until C expiration date. Do not use reagents beyond this date. Microtiter wells must be stored at 2- 8 Once th e foil pouch has been C. opened care should be taken to seal it tightly again.

2. PRINCIPLE OF THE TEST

The Neonatal TSH Screening ELISA is an enzyme immunoassay to quantitate human thyroid stimulating hormone (TSH) using dried blood spots. The Neonatal TSH Screening ELISA is a sandwich ELISA. The strips are coated with an anti-TSH antibody that capture TSH present in the sample. After incubation and a washing step to remove unbound material, a monoclonal antibody anti-TSH conjugated to horseradish peroxidase (HRP) is added and allowed to bind to TSH. The following complex is formed: Mouse anti-TSH * TSH * Mouse anti-TSH-HRP conjugate After a second incubation and a washing step, the immuno-complex is detected by reduction of 3.3-5.5-tetramethylbenzidine (TMB) by HRP. The development of a blue colour is directly proportional to the amount of antigen in the sample or standard. The enzymatic reaction is

5. MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED

Single or multichannel automatic pipettes to deliver volumes in the range of 10 to 1000 l with an accuracy of 1.5% over the range 10-100 l. A microtitration plate reader capable of reading absorbances at 450 and 630 nm in dual wavelenght reading mode. A hole-punch which produces 3 mm (1/8") discs. A microtitration plate shaker (900rpm). Blood collection cards. The minimum pre-printed information required is: - infants name - mothers name - patient ID number - date of birth - sex - specimen collection date

Neonatal TSH Screening ELISA / E-GP-MZ-003 / 03-10

submitters identity and address physicians name and telephone number manufacturer and lot number of filter paper indicated on filter paper Filter paper should be Whatman903 only.

paper. Repeat procedure to fill the required number of preprinted circles on the specimen collection card. Do not milk or squeeze the puncture site during collection as it may cause hemolysis or dilution of the blood with tissue fluids. Do not apply successive drops of blood to the same preprinted circle. If blood flow diminishes before complete filling of the preprinted circle, repeat the sampling in a new circle. Do not touch or smear the blood spots. Allow the blood specimen to air dry in a suspended horizontal position for three hours at room temperature (18-22 C) away from direct sunlight or heat source, avoiding contact of the spots with any surface. Arrange transport of the collection card to the screening laboratory within 24 hours of collection. Cord blood should not be used as a sample. The receiving laboratory should store the samples at 2-8 for shortC term storage in a moisture-proof environment shielded from direct light. For long-term storage, samples should be stored at below 20 in a C moisture-proof environment.

6. PRECAUTIONS
A. Safety - This kit is for in vitro diagnostic only. - Washing solution and extraction buffer contain Thimerosal. This product is highly toxic by inhalation, swallowing and contact with skin. Keep away from food and drink. - Wear protective clothes and gloves. In case of contact with skin or eyes, rinse thoroughly with water. In case of accident, consult immediately a physician and show him/her the product label. - Stopping solution contains H2SO4 that is irritating for eyes and skin. Keep out of the reach of children. - Wear protective clothes and gloves. In case of contact with skin or eyes, rinse thoroughly with water and consult a doctor. - Do not smoke, eat, drink or apply cosmetics in areas where kits and blood specimens are handled. - Human blood samples should be regarded as representing a potential microbiological hazard. - Wear protective clothes and gloves when handling the samples. Samples should be incinerated after being tested. B. Operating - Do not pipette with mouth. - Do not freeze kits. - Do not use kit components after the expiration dates stated on their labels. - Do not keep diluted reagents for longer that the recommended periods (see section 3). - Keep all reagents at normal refrigerator temperature (2-8 in C) closed containers when not in use. - Ensure that all reagents are equilibrated to 18-25 before C use. - Do not use any solutions which have become turbid. - The strips, calibrators and internal controls are packed in an outer aluminium pouch containing a desiccant. Immediately after removal of strips, the remaining strips should be resealed or closed with a Scotch tape in the outer bag along with the desiccant and stored at 2-8 C. It is important to ensure the desiccant remains in the bag. - The general purpose reagents washing solution and stopping solution are interchangeable between different lots while all other reagents are specific for the individual package lot and must not be interchanged with other lots. - Do not use reagents from other manufacturers along with the kit reagents for a given test run. - Do not interchange reagent vials and their screw caps to avoid cross-contamination. Use a clean, fresh, disposable pipette tip for each reagent or specimen manipulation. - Close reagent vials tightly immediately after use to avoid evaporation and microbial contamination

8. ASSAY PROCEDURE
Results reliability depends on strict adherence to the described procedure. Suggested assay plate layout (included only as a guide). 1 A B C D E F G H C0 C1 C2 C3 C4 C5 L1 L2 2 C0 C1 C2 C3 C4 C5 L1 L2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Sample preparation: 1. Bring all reagents and samples to room temperature before use. 2. Select the required number of microtiter strips and place them in the strip holder, taking account of the number of calibrators, controls L1-L2 and samples to be assayed. It is recommended to perform the standard curve in duplicate. 3. Following the suggested plate layout, punch 3 mm (1/8") diameter blood spots from the calibrators (C0 to C5) and controls (L1 and L2) into their respective wells. Punch patient specimens into the remaining individual wells, noting the position of each patient sample on the plate. Spots should be punched in the center of the disks. Do not autoclave calibrators, internal controls or patients samples prior to punching. TSH extraction 1. Add 100 l of extraction solution to each well. Each well should be visually examined to ensure the blood spots are completely immersed in extraction buffer. Cover wells with sealing tape to prevent evaporation. 2. Incubate the plate for 1 hour at room temperature on a microtitration plate shaker (the recommended speed is 900 rpm). Ensure by periodic visual inspection that each disc is fully immersed in the extraction buffer. 3. During this incubation, prepare working washing solution and Working conjugate solution (See section 3 - 5). 4. After incubation, empty all wells completely by plate inversion. Ensure that all blood spots are discarded. Refer to section 6A for appropriate elimination of biological samples. 5. Wash each well 3 times with 350 l of diluted washing solution. After each washing step, ensure that all the wells are empty (remaining liquid < 15 l). After the last washing, carefully remove remaining fluid by tapping the strips on tissue paper prior to next step. Please note that incomplete or inefficient washing will cause poor precision and high background. Immuno-complex formation Add 100 l of diluted peroxidase conjugated antibody to each well. Cover wells with adhesive film. Incubate for 1 hour at room temperature on a microtitration plate shaker (the recommended speed is 900 rpm). After incubation repeat washing as described above.

7. SPECIMEN COLLECTION
Blood should ideally be collected between the third and the fifth day of life (48 to 120 hours after birth). Collect blood from the infant's heel only using the medial (closest to body centre line) or lateral (furthest from body centre line) portion of the plantar (walking) surface. Blood collection from other areas of the infant foot, e.g. arch, may result in nerve, tendon or cartilage injury. Fill out the required information on the blood collection form or card (see section 5). To increase local blood flow, warm the skin puncture site using a warm (<42 moist towel applied to the site for 2-3 min utes. Similarly, C) holding the infant's limb below the level of the heart will increase venous flow. Clean the skin with 70% (v/v) isopropyl alcohol. Wipe dry with sterile gauze and allow the skin to air dry. Puncture the heel with a sterile lancet (2.4-2.5 mm long) or with an automatic lancet device. Wipe away the first drop of blood with a sterile gauze. Gently touch one side of the filter paper against a large drop of blood and in one step, allow a sufficient quantity of blood to soak into the paper to completely fill the preprinted circle. Ensure that blood has penetrated and saturated the paper by examining both sides of the

Neonatal TSH Screening ELISA / E-GP-MZ-003 / 03-10

Colour generation 1. Dispense 100 l of TMB solution to all wells. 2. Incubate for 15 minutes at room temperature (15-30 keeping C) the plate away from light, without shaking. 3. After 15 minutes incubation, stop the enzymatic reaction by addition of 100 l of stopping solution to all wells. Plate reading 1. Zero the ELISA microtiter plate reader using the substrate blank in well A1. 2. Measure the absorbance at 450 nm. Dual wavelength reading using 620 nm or 690 nm as reference wavelength is recommended but not compulsory. Absorbance should be read within 20 minutes after completing the assay.

10. SUGGESTED NORMAL RANGE

Neonates 0-5 days : less than 10 IU/ml. The normal range for TSH in 0-5 days term neonates has been established extensively by others and by us in our Neonatal TSH ELISA assay. The suggested normal range and cut-off is a guideline only. Each laboratory should establish specific thresholds and range based on performance of the assay in their laboratory and with their constituent demographic population.

11. QUALITY CONTROL

Internal controls (L1-L2) included in the kit should be routinely monitored to check that measured concentrations stay within the stated values. These controls provide valuable information regarding if the kit is working according to manufacturer specifications.

9. CALCULATION OF RESULTS
Titration curve CHECK THE INSERT IN THE BOX OF EACH LOT THE ACCURATE VALUES OF THE CALIBRATORS AND CONTROLS The amount of TSH in the patients sample is calculated from a standard curve calibrated against the 1st ISNS Reference Preparation for Neonatal Screening thyrotropin, phenylalanine and 17-alphahydroxy-progesterone in blood spots. The standard curve may change between lots. The label on the current lot of calibrators should be consulted for calibration values to be used in calculations. TSH values are expressed in whole blood units. For conversion of units, use the following relationship : IU/ml blood = IU/ml serum / 2.2 1 2 Average the absorbance duplicates for all calibrators, references and patients. Draw a semi-log graph as follows: ORDINATES: measured optical density value for each calibrator ABSCISSE: concentrations of each calibrator (decimal logarithmic scale) Plot optical density values of the samples on the curve O.D. = f (concentration C) Read in abscissa concentration value

12. PERFORMANCES OF THE ASSAY

a. Sensitivity Sensitivity is defined as the minimum concentration of TSH which can be statistically distinguished from calibrator 0. This concentration is 1.3 IU/ml. b. Precision Intra-assay The intra-assay imprecision has been tested with 3 samples containing various amounts of TSH in 20 replicates. TSH Concentration (IU/ml) 28.9 31.2 44.8

Standard Deviation 3.9 2.6 3.7

CV (%) 13.4 8.3 8.2

3 4

Results of a typical assay are shown below. This curve is for illustration only and shouldnt be used to calculate patient results. A cubic spline fitted curve with tails may be used to calculate the results. The maximum concentration that can be reported is limited by the linear performance characteristics of the photometer used. If the OD value of the highest calibrator is above the range of the photometer, then this calibrator must be omitted from the plot of the calibrator curve. Similarly any sample measuring above the range of the microplate reader should be simply noted as greater than the highest acceptable calibrator. TSH Concentration (IU/ml) 0 6.1 10.5 16.0 74 150 Mean CONTROL 1 3.7 CONTROL 2 47.8 (3.0 4.4) (38.2 57.3) 1.086 Acceptable range 0.047 Absorbance (450-630 nm) 0,008 0,130 0,408 0,767 1,443 3,513

Inter-assay The inter-assay imprecision has been tested in 9 separated assays with 3 samples containing various amounts of TSH, each sample tested in triplicate. TSH Concentration (IU/ml) 6.9 19.5 38.2 c. Recovery Recoveries were performed using samples from the Quality Control Program, Centers for Disease Control and Prevention (Alanta, Georgia, USA). Sample Target value (IU/ml) Target value (IU/ml blood) for HCR 50 % 811 812 813 25 40 80 12.5 20.0 40.0 Obtained value (IU/ml blood) 12.8 18.7 39.2

Standard Deviation 0.5 1.1 1.7

CV (%) 7.2 5.6 4.4

Calibrator or Control CAL 0 CAL 1 CAL 2 CAL 3 CAL 4 CAL 5

Recovery (%) 102 93 98

Neonatal TSH Screening ELISA / E-GP-MZ-003 / 03-10

d. Cross-reactivity Cross-reactivity of the ELIZEN Neonatal TSH screening values have been calculated on a weight/weight basis. No other interfering substances have been identified. Peptidic Hormone TSH TSH hLH hCG hFSH Cross Reactivity (%) 100 234 1 < 0.05 1

ESPAOL
Inmunoensayo enzimtico para la titulacin de la Hormona Estimulante de la Tiroides en muestras de sangre seca en recin nacidos.
E-GP-192B (192 tests: 2x (12 tiras x 8 pocillos)) E-GP-480B (480 tests: 5x (12 tiras x 8 pocillos)) E-GP-2400B (2400 tests: 25x (12 tiras x 8 pocillos))

Diagnstico in vitro (Solo para uso profesional) 1. INTRODUCCION

El cribado de Neonatal TSH Screening ELISA de Zentech es un inmunoensayo enzimtico para la determinacin cuantitativa de la hormona estimulante de la tiroides en muestras de sangre seca en papel filtro Whatman 903. Este kit es especialmente adecuado para la deteccin de hipotiroidismo primario en recin nacidos. Resultados elevados indican la necesidad de hacer ms estudios para evaluar hipotiroidismo congnito. La Hormona Estimulante de la Tiroides (TSH) es responsable de proveer el estmulo primario para la sntesis y secrecin de las hormonas tiroideas tiroxina (T4) y triyodotironina (T3). Esta hormona glicoprotica es secretada por la glndula pituitaria anterior, bajo el control del factor de liberacin de tirotropina (TRH), que es producido en el hipotlamo. Las hormonas tiroideas producidas bajo la direccin de la TSH ejercen un efecto de retroalimentacin negativa sobre la glndula pituitaria que regula la secrecin de TSH. Esta relacin de retroalimentacin negativa entre la tiroides y la pituitaria implica que la TSH estar siempre elevada en el hipotiroidismo primario, a menudo a niveles muy altos. Por lo tanto es el test ms sensible para hipotiroidismo, incluyendo aquellos pacientes cuyos valores de T4 an se encuentran dentro del rango normal (1, 2). El hipotiroidismo primario congnito causado por atiroidismo y la hipoplasia, ocurre en uno de cada 3.000 a 7.000 nios (3). El hipotiroidismo transitorio y leve tambin puede ocurrir, especialmente en nios muy prematuros o con bajo peso al nacer (11, 13, 14). Probablemente es una de las causas ms evitables de retardo mental. Estudios han demostrado que el diagnostico clnico precoz y posterior tratamiento de este trastorno, generalmente dentro de las dos primeras semanas despus del nacimiento, tiende a prevenir el retardo mental irreversible, disfuncin neurolgica o incapacidad. (4, 5,10). Se ha sugerido que el mtodo ms efectivo para evaluar la funcin tiroidea en un nio es combinando un programa de cribaje de T4 y TSH (4, 5, 6, 10, 11, 12). Esto se debe al hecho de que el cribaje de TSH puede no detectar hipotiroidismo de tipo secundario mientras que algunas determinaciones de T4 pueden no detectar un hipotiroidismo mnimo. Por lo tanto la combinacin de T4 y TSH le proporciona al mdico la mejor visin general de la situacin de la tiroides en el nio. En aquellos nios en los que existe la sospecha de presentar hipotiroidismo marginal o subclnico, utilizando el procedimiento de cribaje con una muestra de sangre seca, se debe realizar un test de confirmacin utilizando suero para hacer determinaciones de T3, T4 y TSH como tambin otros estudios de la tiroides, tales como estimulacin controlada de la tiroides con TSH, cintigrafa o ecografa antes de comenzar la terapia. Se ha visto que las concentraciones de TSH y T4 varan de acuerdo a variaciones demogrficas, edad del nio, sexo, peso y prematuridad. Por lo tanto es importante que cada laboratorio determine sus propios valores normales y lmites tomando en cuenta las edades de los nios (11, 13, 14).

13. LIMITATIONS OF THE PROCEDURE

The Neonatal TSH Screening ELISA is a screening method for measuring the TSH concentration in newborn blood spot specimens. Elevated results are not diagnostic per se of primary congenital hypothyroidism, but indicate the need for further study of the newborn from which a presumptive positive specimen was received. To ensure accurate and reliable results, make sure that all blood spot disks are within the extraction solution during the incubation period. Strict adherence to the protocol is advised to obtain reliable results. Any modification or change made to the kit or the assay procedure are under the responsibility of the user. This assay is designed to be used with dried blood specimens that are exclusively collected on Wathmans Filter Paper #903. Do not use cord blood. Demographic variations, infant weight, age, prematurity and twinning can affect the TSH concentrations. Laboratories should be aware of all these factors.

2. PRINCIPIO DEL TEST

El cribado para Neonatal TSH Screening ELISA es un inmunoensayo enzimtico para cuantificar la hormona tiroidea humana (TSH) usando muestras de sangre seca. El cribado de para TSH es un ELISA en sndwich, donde las tiras estn recubiertas con un anticuerpo anti- TSH que fija la TSH presente en la muestra. Despus de la incubacin y el lavado para eliminar el material que no se ha fijado, se agrega un anticuerpo monoclonal antiTSH conjugado con peroxidasa de rbano picante (HRP) permitiendo que se fije a la TSH. Se forma el siguiente complejo: Anti-TSH de ratn * TSH * Conjugado de ratn anti-TSH-HRP
Neonatal TSH Screening ELISA / E-GP-MZ-003 / 03-10

Despus de una segunda incubacin y lavado, el complejo inmune es detectado por la reduccin de la 3.3-5.5-tetrametilbencidina (TMB) por la HRP. El desarrollo del color azul es directamente proporcional a la cantidad de antgeno en la muestra o estndar. La reaccin enzimtica es detenida agregando cido sulfrico y se lee a una absorbancia de 450 nm usando un lector de microplacas ELISA.

Las microplacas deben ser almacenadas entre 2- 8 . Una vez que la C bolsa de aluminio se ha abierto, debe asegurarse de sellarla de manera segura.

5. MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO

Pipetas automticas multicanal o con un canal para dispensar volmenes de 10 a 1000 l con una precisin de 1.5% en el rango de 10-100 l. - Un lector de microplacas capaz de leer absorbancias a 450 y 630 nm en modo de lectura de longitud de onda dual. - Un perforador que produzca discos de 3 mm (1/8"). - Un agitador de microplacas. - Tarjetas de recoleccin de muestra. La informacin necesaria mnima impresa de antemano debe ser: - Nombre del nio - nombre de la madre - nmero de identificacin del paciente - fecha de nacimiento - sexo - fecha de toma de muestra - identificacin y direccin de quin la enva - nombre y nmero de telfono del mdico - fabricante y nmero de lote del papel filtro indicado en el papel El papel filtro debe ser solo Whatman903. -

3. CONTENIDOS DEL KIT

1. 2. Microplacas recubiertas: tiras recubiertas con anti TSH. Calibradores y controles TSH: Bolsa de aluminio con los calibradores C0-C5 y los controles internos L1-L2 (muestras de sangre seca en papel Whatman 903 para toma de muestra, usando una matriz humana que contiene una cantidad especfica de TSH humana). Conjugado TSH: anticuerpo anti-TSH conjugado con peroxidasa de rbano picante (HRPO) concentrado x100. Conservante: timerosal (0.02%). Precautin: Vea la seccin 6 de seguridad. Diluya la solucin concentrada 1: 15 con Diluyente del Conjugado, p.ej. 300l + 30 ml. Tampn de Extraccin: Vial con tampn listo para usar con albmina de suero bovino (BSA) y Tween 20. Conservante: timerosal 0.1%. Diluyente del Conjugado: Vial con tampn listo para usar con albmina de suero bovino (BSA) y Tween 20. Conservante: timerosal 0.1%. Solucin de lavado: tampn de Fosfato con detergente, concentrado x 10. Conservante: timerosal 0.01%. Diluya la solucin concentrada 1: 10 con agua destilada o desionizada fresca y sin grmenes p.ej 55 ml + 495 ml = 550ml. La conservacin a bajas temperaturas (2-8 de la solucin de C) lavado concentrada puede producir la formacin de cristales. Estos cristales se disuelven al calentar (37 o a l diluir a C) concentracin de trabajo. Estabilidad despus de la dilucin: 10 semanas a temperatura ambiente (20-25 C). Sustrato Cromogenico: 3.3 - 5.5 Tetrametilbencidina. Listo para usar. Reactivo de bloqueo: H2SO4, 0.5M. Listo para usar. Cintas para sellar Cantidad 192 Pocillos Calibradores 0-5 Control 1-2 Conjugado TSH Tampn extraccin Diluyente del Conjugado Solucin de lavado Sustrato Cromognico Reactivo de bloqueo Cintas para sellar 2x (12x8) 1 bolsa de aluminio 1 x 300 l 1 x 30 ml 1 x 30 ml 2 x 55 ml 1 x 30 ml 1 x 30 ml 2 hojas 480 5x (12x8) 2400 25x (12x8) Estado fsico Listo para usar Muestras de sangre seca Concentrado 100x Listo para usar Listo para usar Concentrado 10x Listo para usar Listo para usar

3.

4.

5.

6. PRECAUCIONES
A. Seguridad - Este kit es solo para uso de diagnstico in vitro. - La solucin de lavado y el tampn de extraccin contienen Timerosal. Este producto es altamente txico si se inhala, se traga o por contacto con la piel. Mantenga alejado de la comida o bebida. - Use ropa de proteccin y guantes. En caso de contacto con la piel u ojos, enjuague muy bien con agua. En caso de un accidente consulte inmediatamente a un mdico y mustrele la etiqueta del producto. - El reactivo de bloqueo contiene H2SO4 que es irritante para los ojos y la piel. Mantenga fuera del alcance de los nios. - Use ropa de proteccin y guantes. En caso de contacto con la piel u ojos, enjuague a fondo con agua y consulte a un mdico. - No fume ni coma ni beba, no se aplique cosmticos en los lugares donde se manipulan los kits o las muestras de sangre. - Las muestras de sangre humana deben considerarse como potencialmente peligrosas desde el punto de vista microbiolgico. - Use ropa de proteccin y guantes cuando manipule las muestras. Las muestras deben ser incineradas despus de ser procesadas. B. Uso - No pipetee con la boca. - No congele los kits. - No use los componentes del kit despus de la fecha de expiracin impresa en la etiqueta. - No guarde los reactivos diluidos mas all de los tiempos recomendados (vea seccin 3). - Mantenga todos los reactivos a la temperatura normal de refrigeracin (2-8 en contenedores cerrados cuan do no C) estn en uso. - Asegrese de que todos los reactivos son equilibrados entre 18-25 antes de su uso. C - No use ninguna solucin que se haya vuelto turbia. - Las tiras, calibradores y controles internos vienen aparte envueltos en una bolsa de aluminio que contiene un desecante. Inmediatamente despus de sacar tiras de la bolsa, las tiras que quedan deben ser selladas o la bolsa debe ser cerrada con tela adhesiva incluyendo el desecante y almacenadas entre 2-8 C. Es importante asegurarse que el desecante este en la bolsa. - Los reactivos para uso general, solucin de lavado y solucin bloqueadora pueden usarse con varios lotes distintos, en cambio todos los dems reactivos son de uso especfico con el lote individual y no deben se intercambiados con otros lotes. - No use reactivos de otros fabricantes junto con los reactivos del kit durante la ejecucin de una prueba. - No intercambie viales de reactivos y sus tapas atornilladas para evitar contaminacin cruzada. Use una punta de pipeta

6.

7.

8. 9.

Reactivos

2 bolsas de 4 bolsas de aluminio aluminio 3 x 300 l 3 x 30 ml 3 x 30 ml 6 x 55 ml 3 x 30 ml 3 x 30 ml 5 hojas 13 x 300 l 13 x 30 ml 13 x 30 ml 26 x 55 ml 13 x 30 ml 13 x 30 ml 25 hojas

4. ALMACENAJE Y ESTABILIDAD DEL KIT

Al ser almacenado entre 2 8 sin abrir, los reac tivos conservarn su C reactividad hasta la fecha de expiracin. No use los reactivos despus de esta fecha.

Neonatal TSH Screening ELISA / E-GP-MZ-003 / 03-10

limpia, nueva y desechable para cada reactivo o manipulacin de muestra. Cierre los viales de reactivos firmemente inmediatamente despus de usarlos para evitar evaporacin y contaminacin microbiana.

7. TOMA DE MUESTRA
Idealmente la sangre debe ser tomada entre el tercer y quinto da de vida (48 a 120 horas despus del nacimiento). Tome la sangre del taln del nio usando solo la porcin medial (ms cerca de la lnea central del cuerpo) o lateral (ms alejada de la lnea central del cuerpo) de la superficie plantar (para caminar). La coleccin de sangre de otras reas del pie del nio p. ej. el arco, puede resultar en dao a un nervio, tendn o cartlago Rellene la informacin necesaria en el formulario de recoleccin de sangre o tarjeta (vea seccin 5). Para aumentar el flujo de sangre local, entibie el sitio de puncin de la piel usando una toalla tibia (<42 y hmeda aplic ndola al lugar C) durante 2-3 minutos. Del mismo modo manteniendo la extremidad del nio bajo el nivel del corazn, aumentara el flujo venoso. Limpie la piel con alcohol isopropil 70% (v/v). Limpie con una gasa estril y deje la piel secar al aire. Pinche el taln con una lanceta estril (2.4-2.5 mm de largo) o con un aparato para lancetas automtico. Limpie la primera gota de sangre con una gasa estril. Suavemente toque con un lado del papel filtro una gota grande de sangre y de una vez permita que una cantidad suficiente de sangre se absorba en el papel de modo de cubrir totalmente el circulo pre impreso. Asegrese que la sangre ha penetrado y saturado el papel examinando ambos lados del papel. Repita el procedimiento para llenar el nmero necesario de crculos pre impresos en la tarjeta para toma de muestra. No apriete o exprima el lugar del pinchazo durante la coleccin ya que puede causar hemlisis o dilucin de la muestra con fluidos del tejido. No aplique gotas sucesivas de sangre al mismo crculo pre impreso. Si el flujo sanguneo disminuye antes de terminar de llenar el crculo pre impreso, repita la toma de muestra en un nuevo crculo. No toque o manche las gotas de sangre. Deje que la muestra de sangre se seque al aire en una posicin suspendida horizontalmente por tres horas a temperatura ambiente (18-22 apartada del sol directo o fuente de calo r, evitando que las C) muestras tomen contacto con ninguna superficie. Organice transporte de la tarjeta de toma de muestra al laboratorio donde se examinar dentro de 24 horas de tomada la muestra. No se debe usar sangre de cordn como muestra. El laboratorio que las recibe debe guardarlas entre 2-8 si el C almacenaje es por corto tiempo en un ambiente a prueba de humedad y protegido de luz directa. Para almacenarlas por largo tiempo las muestras deben ser mantenidas a 20 en un ambient e a prueba de C humedad.

3. Siguiendo la distribucin sugerida para la placa, perfore muestras de sangre de 3 mm (1/8") de dimetro de los calibradores (C0 a C5) y controles (L1 y L2) dentro de sus respectivos pocillos. Perfore las muestras de los pacientes dentro de los pocillos individuales que quedan tomando nota de la ubicacin de la muestra de cada paciente en la placa. Las muestras deben ser perforadas en el centro de los discos. No autoclave los calibradores, controles internos o muestras de pacientes antes de hacer la perforacin. Extraccin de TSH 1. Agregue 100 l de solucin de extraccin a cada pocillo. Cada pocillo debe ser examinado visualmente para asegurar que las muestras de sangre estn totalmente sumergidas en el tampn de extraccin. Cubra los pocillos con cintas selladoras para prevenir evaporacin. 2. Incube la placa por 1 hora a temperatura ambiente en un agitador de microplacas (la velocidad recomendada es de 900 rpm). Asegrese revisando en forma peridica visualmente que cada disco este totalmente sumergido en el tampn de extraccin. 3. Durante esta incubacin, prepare la solucin de lavado de trabajo. (Vea secciones 3 - 5) 4. Despus de la incubacin vace todos los pocillos completamente invirtiendo la placa. Asegrese de que todas las muestras de sangre sean eliminadas. Refirase a la seccin 6 para eliminacin adecuada de muestras biolgicas. 5. Lave cada pocillo 3 veces con 350 l de solucin de lavado diluida. Despus de cada lavado, asegrese de todos los pocillos estn vacos (lquido restante < 15 l). Despus del ltimo lavado, remueva cuidadosamente todo el fluido excedente golpeando las tiras sobre papel absorbente antes del paso siguiente. Por favor tenga en cuenta que un lavado incompleto o ineficiente dar como resultado una mala precisin y un fondo elevado. Formacin del complejo inmune Agregue 100 l del anticuerpo conjugado con la peroxidasa a cada pocillo. Cubra los pocillos con una cubierta autoadhesiva. Incube por 1 hora a temperatura ambiente en un agitador de microplacas (la velocidad recomendada es de 900 rpm). Despus de la incubacin repita el lavado como se describi anteriormente. Generacin del color 1. Dispense 100 l de solucin de TMB a todos los pocillos. 2. Incube por 15 minutos a temperatura ambiente (15-30 C) manteniendo la placa fuera de la luz y sin agitar. 3. Despus de 15 minutos de incubacin detenga la reaccin enzimtica agregando 100 l de solucin bloqueadora a todos los pocillos. Lectura de la placa 1. Lleve el lector de microplacas ELISA a cero usando el blanco sustrato en el pocillo A1. 2. Mida la absorbancia a 450 nm. Se recomienda la lectura de longitud de onda dual usando 620 nm o 690 nm como referencia pero no es obligatorio. La absorbancia debe ser leda dentro de 20 minutos de completado el ensayo.

8. PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO

La confiabilidad de los resultados depender de la estricta adhesin al procedimiento descrito. Distribucin sugerida para la placa del ensayo (incluido solo como gua). 1 A B C D E F G H C0 C1 C2 C3 C4 C5 L1 L2 2 C0 C1 C2 C3 C4 C5 L1 L2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

9. CLCULO DE RESULTADOS
Curva de titulacin COMPRUEBE EN LOS INSERTOS EN LAS CAJAS DE CADA LOTE LOS VALORES EXACTOS DE LOS CALIBRADORES Y CONTROLES La cantidad de TSH en la muestra del paciente se calcula a partir de una curva estndar calibrada contra la Preparacin de Referencia 1st ISNS para Cribaje Neonatal de tirotropina fenilalanina y 17-alfahidroxy-progesterona en muestras de sangre. La curva estndar puede cambiar entre lotes distintos. La etiqueta en el lote de calibradores que estn en uso debe ser consultada para saber cules valores de calibracin usar en los clculos. Los valores de TSH estn expresados en unidades de sangre total. Para conversin de unidades use la siguiente relacin: IU/ml sangre = IU/ml suero / 2.2 1 Calcule el promedio de las absorbancias en duplicado para todos los calibradores, referencias y pacientes.

Preparacin de la muestra: 1. Todos los reactivos y muestras deben ser equilibrados a temperatura ambiente antes de usar. 2. Seleccione el nmero necesario de tiras de microplaca y colquelas en el sostn de tiras considerando el nmero de calibradores, controles L1-L2 y muestras que sern examinadas. Se recomienda realizar la curva estndar en duplicado.

Neonatal TSH Screening ELISA / E-GP-MZ-003 / 03-10

3 4

Dibuje un grfico semi-log como sigue: ORDENADAS: densidad ptica medida para cada calibrador ABSCISA: concentracin de cada calibrador (escala decimal logartmica) Trace los valores de la densidad ptica de las muestras en la curva D.O. = f (concentracin C) Lea en la abscisa el valor de concentracin

Concentracin TSH (IU/ml) 28.9 31.2 44.8

Desviacin Estndar 3.9 2.6 3.7

CV (%) 13.4 8.3 8.2

Los resultados de un ensayo tpico se muestran ms abajo. Esta curva es slo una ilustracin y no debe ser usada para calcular resultados de pacientes. Se puede usar una curva de ajuste tipo spline cubica con extremos sujetos para calcular los resultados. La concentracin mxima que puede ser informada est limitada por las caractersticas de rendimiento lineal del fotmetro usado. Si el valor de la DO del calibrador ms alto est por sobre el rango del fotmetro, este calibrador debe ser omitido del trazo en la curva del calibrador. Del mismo modo, cualquier muestra que tenga valores por sobre el rango del lector de microplacas, simplemente debe ser informada como mayor que el calibrador ms alto aceptado. Calibrador o Control CAL 0 CAL 1 CAL 2 CAL 3 CAL 4 CAL 5 Promedio CONTROL 1 3.7 CONTROL 2 47.8 (3.0 4.4) Concentracin TSH (IU/ml) 0 6.1 10.5 16.0 74 150 Rango Aceptable 0.047 Absorbancia (450-630 nm) 0,008 0,130 0,408 0,767 1,443 3,513

Entre ensayos La imprecisin entre ensayos ha sido comprobada realizando 9 ensayos separados con 3 muestras conteniendo distintas cantidades de TSH, cada muestra ha sido examinada en triplicado. Concentracin TSH (IU/ml) 6.9 19.5 38.2 c. Recuperacin Las recuperaciones se realizaron usando muestras del Programa de Control de Calidad de Centers for Disease Control and Prevention (Alanta, Georgia, USA). Muestra Valor objetivo (IU/ml) Valor obtenido (IU/ml sangre) 12.8 18.7 39.2 102 93 98 Recuperacin (%)

Desviacin Estndar 0.5 1.1 1.7

CV (%) 7.2 5.6 4.4

Valor objetivo (IU/ml sangre) por HCR 50 % 12.5 20.0 40.0

811 812

25 40 80

(38.2 57.3)

1.086

813

d. Reactividad cruzada

10. RANGO NORMAL SUGERIDO

Recin Nacidos 0-5 das: menos de 10 IU/ml. El rango normal de TSH en recin nacidos de trmino de 0-5 das de edad ha sido ampliamente establecido por otros y por nosotros mismos en nuestro ensayo TSH Neonatal ELISA. El rango normal y cut-off sugerido es solo una gua. Cada laboratorio debe establecer lmites y rango basado en el desempeo del ensayo en su laboratorio y con las caractersticas demogrficas de su poblacin.

La reactividad cruzada del TSH Neonatal ELISA de Gamma ha sido calculada en una base peso/peso. No se ha identificado ninguna otra sustancia que interfiera. Hormona Peptdica TSH TSH hLH hCG Reactividad cruzada (%) 100 234 1 < 0.05

11. CONTROL DE CALIDAD

Los controles internos (L1-L2) incluidos en el kit deben ser controlados rutinariamente para comprobar si las concentraciones medidas se mantienen dentro de los valores establecidos. Estos controles proveen de valiosa informacin con respecto a si el kit esta funcionando de acuerdo a las especificaciones del fabricante.

13. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

El cribaje de Neonatal TSH Screening ELISA es un mtodo de deteccin para medir la concentracin de TSH en muestras de sangre de recin nacidos. Resultados elevados no constituyen por s mismos un diagnstico de hipotiroidismo primario congnito pero indican la necesidad de seguir estudiando al recin nacido del que se ha recibido una muestra presuntamente positiva. Para asegurar resultados exactos y confiables asegrese de que todos los discos con muestras de sangre estn sumergidos en la solucin de extraccin durante el periodo de incubacin. Se recomienda adherirse estrictamente al protocolo para obtener resultados confiables. Cualquier modificacin o cambio hecho al kit o el procedimiento del ensayo estarn bajo la responsabilidad del usuario. Este ensayo se debe realizar con muestras de sangre seca tomados exclusivamente con un papel filtro Wathman #903. No use sangre de cordn. La concentracin de TSH puede ser afectada por variaciones demogrficas, peso del nio, edad, prematuridad y si son gemelos. Los laboratorios deben tener en cuenta todos estos factores.

12. DESEMPEO DEL ENSAYO

a. Sensibilidad La sensibilidad se define como la concentracin mnima de TSH que puede ser distinguida estadsticamente del calibrador 0. Esta concentracin es 1.3 IU/ml. b. Precisin Dentro del Ensayo La imprecisin dentro del ensayo ha sido comprobada usando 3 muestras conteniendo distintas cantidades de TSH en 20 replicados. -

Neonatal TSH Screening ELISA / E-GP-MZ-003 / 03-10

15. BIBLIOGRAPHY - BIBLIOGRAFA

1. Spaulding S.W. and Utiger R.D. The thyroid: Physiology, Hyperthyroidism, Hypothyroidism, and the Painful Thyroid. In Endocrinology and Metabolism, P. Felig et al. (Eds) McGraw Hill (1981). 2. Kapein, E.M. et al. Thyroxin metabolism in the low thyroxin state of critical nonthyroidal illness, J. Endocr. Metab, 53 : 764-771 (1981). 3. Committee of the American Thyroid Association. Recommandations for congenital hypothyroidism, M. Pediatr., 89 : 692-693 (1976). 4. Fisher, D.A. Neonatal Thyroid Screening, Pediatric Clinics of North America, 25, 423-430 (1978). 5. Dussalt, J.H. et al. Preliminary report an a mass screening program for neonatal hypothyroidism. J. Pediatr., 86 : 670-674 (1975). 6. Fisher, D.A. Pediatric Aspects : The Thyroid, 4th Ed., S.C. Werner. et al. (Eds) Harper and Row, Hagerstown, p-947 (1978). 7. Fisher, D.A. et al. Screening for congenital hypothyroidism : Results of screening one million North American Infants. J. Pediatr., 94 : 700-705 (1979). 8. Travis, J.C. et al. Methods of quality control and clinical evaluation of a commercial thyroxin and thyrotropin assay for use in neonates. Clinical Chemistry, 25 : 735-740 (1979). 9. Travis, J.C. Fundamentals of RIA and other ligand assays, Scientific Newsletters, Inc.Anaheim (1979). 10. Van Vliet, J.C. Neonatal hypothyroidism : treatment and outcome. Thyroid 9 : 79-84 (1999). 11. Den Ouden, A.L. et al. The relation between neonatal thyroxine level and neurodevelopmental outcome at age 5 and 9 years in a national cohort of very preterm and/or very low birth weight infants. Pediatr. Res. 39 : 142-145 (1996). 12. LaFranchi, S. Congenital hypothyroidism : etiologies, diagnosis and management. Thyroid 9 : 735-740 (1999). 13. Fisher, D.A. Hypothyroxinemia in premature infants : is thyroxine treatment necessary ? Thyroid 9 : 715-720 (1999). 14. Waller ; D.K. et al. Risk factors for congenital hypothyroidism : an investigation of infants birth weight, ethnicity, and gender in California, 1990-1998. Teratology 62 : 36-41 (2000).

Neonatal TSH Screening ELISA / E-GP-MZ-003 / 03-10