UNIVERSIDAD AUTNOMA DE NUEVO LEN

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

LICENCIADO EN BIOTECNOLOGA GENMICA CURSO DE INGENIERA GENTICA Nombre del estudiante: Teodoro Ivn Rivera Gonzlez Fecha: Lunes 11 de Febrero del 2013 Nmero de lista 27

RBRICA DE EVALUACIN
PUNTOS FORMATO OBJETIVO FUNDAMENTO MATERIALES Y EQUIPOS PROCEDIMIENTO RESULTADOS RECOMENDACIONES Y CONCLUSIONES BIBLIOGRAFA TOTAL 10 10 15 10 20 20 10 5 100 PUNTOS ACREDITADOS

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LICENCIADO EN BIOTECNOLOGA GENMICA CURSO DE INGENIERA GENTICA TTULO DE LA PRCTICA EXTRACCIN DE DNA PLASMIDICO DE Escherichia coli DH5-pTopoGlu MEDIANTE LISIS ALCALINA
Fecha

11/02/13

Elaborado por: TEODORO IVAN RIVERA GONZALEZ

Pginas

OBJETIVO Extraer DNA plasmdico a partir de Escherichia coli DH5, empleando la tcnica de lisis alcalina. FUNDAMENTO El genoma bacteriano se organiza en un nico cromosoma circular con un solo origen de replicacin. Las bacterias pueden contener informacin gentica adicional en forma de plsmidos. Los plsmidos son molculas circulares de DNA extracromosmico que se replican de forma autnoma, a partir de su propio origen de replicacin. La informacin gentica que portan los plsmidos no es generalmente vital para la supervivencia celular. No obstante, dicha informacin puede resultar imprescindible en determinadas circunstancias ambientales, los plsmidos portadores de genes de resistencia a antibiticos. Las bacterias pueden llegar a tener un gran nmero de copias de un mismo plsmido (plsmidos multicopia), facilitando enormemente la purificacin. Hay distintos procedimientos para la purificacin de DNA plasmdico, aunque todos incluyen los tres pasos siguientes: 1. Crecimiento de las bacterias en un medio selectivo de aquellas que llevan el plsmido. 2. Lisis de las bacterias para la liberacin del plsmido 3. Purificacin del DNA plasmdico. El mtodo de lisis alcalina es muy utilizado debido a su simplicidad, bajo coste y reproductibilidad. Uno de los mtodos ms utilizados es el de desnaturalizacin alcalina en presencia del detergente duodecil sulfato de sodio (SDS). Este mtodo, se basa en las diferencias con respecto a la forma y tiempo de desnaturalizacin y renaturalizacin del ADN de plsmido versus el ADN cromosomal. Los plsmidos al tener un tamao menor, pueden ser separados fcilmente de las molculas de ADN cromosomal que son grandes y precipitan ms rpidamente. El primer paso consiste en crear un ambiente osmtico hostil para la bacteria y lograr as su lisis y consecuente liberacin del material gentico. Para ello, las bacterias son puestas en contacto con una solucin de alta concentracin de sales, glucosa y cido etilendiamino tetractico (EDTA) (solucin I). Este ltimo es un agente quelante de calcio (el calcio es un in estabilizador de las membranas bacterianas). Posteriormente se agrega una solucin (solucin II) con una alta concentracin de SDS e hidrxido de sodio (NaOH): en condiciones alcalinas (pH 11) el ADN se desnaturaliza. Sin embargo, el ADN cromosomal al no ser tan compacto se desnaturaliza ms rpidamente que el ADN de plsmido. Cuando a esta solucin se le agrega Acetato de Amonio (solucin III), el ADN desnaturalizado (cromosomal) forma un agregado junto con el SDS y las protenas bacterianas, el cual precipita, mientras que el ADN del plsmido se mantiene en solucin. La separacin de la fraccin soluble de la insoluble se logra mediante centrifugacin. Finalmente, el ADN del plsmido es concentrado por precipitacin con Isopropanol a temperatura ambiente.
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LICENCIADO EN BIOTECNOLOGA GENMICA CURSO DE INGENIERA GENTICA Para el anlisis de DNA un mtodo empleado es la electroforesis en geles de agarosa, la electroforesis es el movimiento de partculas cargadas en un campo elctrico. Los cidos nucleicos estn cargados de forma negativa debido a su esqueleto de grupos fosfato. Por lo tanto, en una electroforesis, los cidos nucleicos migrarn hacia el polo positivo, es decir, el nodo. La agarosa puede ser utilizada como soporte para la corrida electrofortica. La agarosa es un polisacrido extrado de algas marinas que tiene la propiedad de mantenerse en estado slido a temperatura ambiente pero que a altas temperaturas se torna lquida. Esta caracterstica permite una fcil preparacin de una matriz porosa para ser usada en electroforesis: simplemente se pesa la cantidad de agarosa requerida, se disuelve en un amortiguador adecuado, se calienta y se chorrea sobre un molde particular. Una ventaja que posee la agarosa sobre la acrilamida es que no es un compuesto txico y adems permite el anlisis de cidos nucleicos con pesos moleculares muy variados. Sin embargo, su poder de resolucin es menor que el de los geles de poliacrilamida. La concentracin de agarosa tpicamente utilizada para electroforesis est entre el 0.5 % y el 2%. La concentracin a usar se escoge segn el tamao del cido nucleico a analizar. Esto porque la concentracin de agarosa define el tamao de los poros de la matriz, a mayor concentracin, menor el tamao de los poros y viceversa. Durante la electroforesis, los cidos nuclicos lineales con un alto peso molecular migrarn al nodo ms lentamente que los cidos nuclicos lineales con un menor peso molecular. La razn de esto es que los cidos nuclicos de alto peso tardan ms tiempo en atravesar los poros de agarosa. En el caso de cidos nuclicos no linealizados, como plsmidos circulares en conformacin nativa, la migracin no solo depender del peso molecular sino tambin de otros aspectos como el grado de superenrrollamiento que ste posea. MATERIALES Y EQUIPOS Equipos Agitador Vortex Autoclave Campana bacteriolgica Congelador de -20C Incubadora a 37C, con agitacin Juego de micropipetas (100l y 1000l) Equipos para electroforesis (accesorios, fuente de poder, cmaras horizontales) Materiales Gradillas de plstico Guantes desechables Hieleras Mechero Cajs de plstico para guardar tubos con muestras Tubos de ensayo 16 x 150 Contenedores para desechos de material fsico y contenedor para desechos de material qumico

Microcentrifuga pHmetro Refrigerador Microondas o plancha de calentamiento Bao de agua termostatazo y con agitacin Maquina de hielo Transiluminador

Contenedores para desechos de material biolgico Puntillas para micropipetas (azules y amarillas) Tubos Eppendorf de 1.5ml y 2ml Papel Secante Hielo en escarcha Contenedores de Tincin de geles Vasos y probetas de Vidrio

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Material biolgico, soluciones, medios de cultivo y reactivos Escherichia coli DH5-pTopoGlu Solucin amortiguadora de lisis (Tris-Cl 25mM, EDTA 10mM y 50mM pH=8) (solucin para resuspensin celular, Solucin I). Medio LB Agua miliQ Ampicilina 25mg/ml (100l/ml) NaOH 10N Solucin Neutralizante Acetato de Amonio 7.5M SDS al 10% pH= 7.8 (Solucin III) Solucin Alcalina de Lisis (Solucin II) (NaOH Etanol al 70% 0.2N y SDS al 1%) Solucin amortiguadora de Tris-EDTA 1X (TE 1X Isopropanol pH= 8) Colorante Gel RED (Buffer 3) Agarosa al 0.8% Marcador de Peso Molecular (PM DNA Ladder) Buffer de Corrimiento TBE 1X PROCEDIMIENTO Etapa de Preparacin de Clulas 1. Escherichia coli DH5, plsmido pTOPO Glu. 2. Crecer las clulas bacterianas en 4ml en medio LB (ampicilina 100g/mL), por 16 horas a 37C a 250rpm. 3. Recolectar 3ml de los cultivos de bacterias por medio de dos centrifugaciones sucesivas (centrifugar a 14,000 rpm por 5 minutos). 4. Guardar el paquete celular a -20C para su posterior uso. Etapa de Aislamiento de DNA plasmdico (Antes de la Lisis) 5. Preparacin de Solucin II (solucin fresca). En un tubo nuevo estril, agregar 880l agua MiliQ. Agregar 100l SDS 10% (Concentracin final 1%). Agregar 20l NaOH 2N (Concentracin final 0.2N). Mezclar por inversin. Homogenizacin y lisis 6. Lisis con Solucin I Descongelar el paquete celular. Resuspender en 200l de Solucin I (Tris-Cl 25mM, EDTA 10mM y glucosa 50mM pH 8). Pipetear hasta homogenizar. Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos. 7. Lisis con Solucin II Agregar 400l de Solucin II (NaOH 0.2N y SDS al 1%) al tubo que contiene Paquete Celular-Solucin I (invertir para mezclar). Realizar 5 minutos de incubacin a 0C.
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Purificacin con Solucin III 8. Agregar 300l de Acetato de Amonio (7.5 M pH= 7.8) (Solucin III). 9. Invertir suavemente y dejar incubar 10 minutos a 0C. Separacin 10. Centrifugar 10 minutos a 14,000 rpm. Precipitacin de ADNg (Separacin de Fases) 11. Tomar la fase acuosa (sin tocar el precipitado) con una puntilla amarilla. 12. Transferir el sobrenadante (fase acuosa) a un tubo nuevo. Precipitacin de ADN plasmdico 13. Agregar 650l de Isopropanol. 14. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente. 15. Centrifugar 10 minutos a 14,000 rpm. Lavado 16. Decantar. 17. Lavar la pastilla con 500l de Etanol al 70%. 18. Centrifugar por 3 minutos a 14,000 rpm. Resuspender 19. Decantar y dejar secar la pastilla, invertir en una servilleta. 20. Resuspender en 20l de Buffer TE 1X. Cuantificacin del DNA 21. Correr la muestra de DNA plasmdico (5l) en una cmara de electroforesis con gel de agarosa al 0.8 % con buffer de corrimiento TBE 1X, a 100 Volts, 85 miliamperes por 80 minutos. 22. Interpretar el peso molecular de DNA plasmdico de E.coli DH5 en base al marcador de peso molecular Hyper Ladder I (BIOLINE). Notas aclaratorias: Evitar la oxidacin del Fenol porque puede provocar hidrlisis de enlaces fosfodister y entrecruzamiento de las cadenas de DNAp, usar hidroxiquinolena al 0.1% como antioxidante. El fenol tiene una estabilidad de 1 mes a 40C y se debe evitar exponer a la luz solar. La separacin de fases se realiza por centrifugacin a 40C. En caso de presentarse una interfase grande centrifugar ms tiempo o a ms revoluciones por minuto. Si existe fenol en la fase acuosa extraer con ter saturado con agua. Precauciones: Todas las puntillas y tubos deben ser previamente esterilizados, utilizar guantes de ltex durante el proceso, evitar hablar y moverse abruptamente, no inhalar el fenol pues puede causar irritacin en vas respiratorias. Agitar las muestras suavemente por inversin para evitar dao mecnico. Evitar contacto fsico con sustancias desconocidas.
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Gel de Agarosa al 0.8% en el cual se muestran los resultados obtenidos mediante la Electroforesis, en la que se pueden apreciar los patrones de bandeos (5l por muestra) utilizando DNAp de la bacteria Escherichia coli DH5. En la imagen se puede apreciar el corrimiento electrofortico de las muestras del DNAp extrado de Eschericia coli DH5 por el mtodo de lisis alcalina, en la parte superior de la imagen se muestran los carriles correspondientes a las muestras 1 6 y el marcador molecular que se implemento (DNA Ladder PROMEGA) el cual abarca de 10,000pb a 200pb.
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LICENCIADO EN BIOTECNOLOGA GENMICA CURSO DE INGENIERA GENTICA Las muestras 2 y 3 mostraron tres bandas idnticas, las primeras dos se encuentran con un peso por encima de los 10,000pb, (comparndolas con el marcador) cabe mencionar que el control muestra dos bandas por encima de los 10,000pb pero debido a que no existe una diferencia muy significativa en el peso molecular, no se llegan a diferenciar una de la otra. Por ultimo la tercera banda muestra un peso molecular aproximado a los 4,000pb, segn la comparacin realizada contra el marcador. Con respecto a las muestras de los carriles 1, 4, 5 y 6 (carril correspondiente al equipo al que pertenezco) estas no presentaron bandas sobre los 10,000pb lo que podra referirse a que el DNAp no se logro aislar, esto se puede deber a diferentes factores. Uno de ellos podra ser el hecho de que la muestra de E.coli al momento de ser cultivada, est pudo haber perdido la muestra de plsmido que contena. El segundo factor podra referirse a la preparacin de la solucin de lisis (solucin II) la cual podra no haber tenido las concentraciones adecuadas para su implementacin en la prctica, lo cual pudo haber afectado en la alcalinidad de est, y as daar al DNA debido a que est es muy sensible a la alta alcalinidad. Y el ultimo factor seria debido a la contaminacin de la muestra con DNAsas, esto puede deberse a que al momento en que se estaba realizando la practica, est no se llevo a cabo bajo los cuidados necesarios. En nuestro caso, dado que es un DNA circular obtendremos una imagen en la que se observarn ms de una banda. Ello se debe a que el DNA circular puede estar relajado o superenrollado. El superenrollado migra con mayor rapidez que el relajado y el relajado a su vez dado que es un DNA circular migra un poco ms lento que un DNA de igual tamao pero lineal. La razn de todo ello es fcil de comprender si se tiene en cuenta que, por ejemplo, la molcula de DNA superenrollado es ms compacta que la misma molcula relajada y por tanto puede penetrar ms fcilmente a travs de la trama de la agarosa. Aparte de las formas mencionadas tambin se observan con cierta frecuencia formas enlazadas o dimricas del plsmido (2). Por ello se llegan a obtener distintos tamaos de bandas, debido a que avanzan a distinta velocidad en el gel. No obstante en la parte inferior del gel se observan los residuos como protenas, carbohidratos, RNA (debido a que no se utilizo RNAsa) o molculas de menor tamao que corrieron casi hasta el final del gel. RECOMENDACIONES Uso adecuado de las micropipetas para agregar el volumen ms exacto posible en cada paso. Mantener un rea limpia con todos los reactivos, materiales y equipos que se requieren para ejecutar la prctica. Esterilizacin de puntillas y tubos, as como uso de guantes de ltex. Extraer adecuadamente la fase acuosa (DNAp) de la interfase y la fase orgnica, paso fundamental en la extraccin de cidos nuclicos. Al abrir los tubos Eppendorf evitar tocar el extremo de la tapa que da hacia adentro del tubo para evitar contaminacin por DNAsas. Hablar y moverse lo menos posible durante el protocolo.

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CONCLUSIONES Se logro obtener DNAp de Escherichia coli DH5 mediante la implementacin de la tcnica de lisis alcalina, sin embargo a pesar de ser un mtodo fcil y estandarizado llega a proveer muy poca cantidad de DNAp, esto se demuestra con los resultados obtenidos, los cuales de 6 muestras solo 2 llegaron a tener DNAp. Sin embargo la extraccin se llevo a cabo siguiendo las medidas apropiadas lo que permiti que estas dos muestras dieran resultados positivos. Hay que mencionar que la extraccin del DNAp tiene que realizarse con mucho cuidado, esto con el fin de evitar la contaminacin de las muestras por las DNAsas y as evitar la degradacin del DNA.

BIBLIOGRAFIA 1. Puerta B., Concepcin y Urea P., Claudia P. 2005. Prcticas de biologa molecular. Espaa: Pontificia Universidad Javeriana. 31-32. 2. Gentica Molecular Humana. 2012. http://www.ucm.es/info/biomol3/practicas/guiones/guion%20GenHu.pdf. [09 de Febrero del 2013]. Pg. 6. 3. Padilla Pea Carmen, Diez Dapena Jess. Electroforesis de cidos nucleicos en geles de agarosa. Aislamiento y caracterizacin electrofortica de DNA plasmdico. [En lnea]. [9 de Febrero del 2013]. Disponible en la Web: http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biolmol/pdfs/17%20ELECTROFORESIS%20ACS%20NUCLEICOS%20GELES%20AGAROSA. pdf 4. Birnboim, H.C., Doly, J. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Research, 7, 15131523.

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