Anda di halaman 1dari 8

ISOLASI PLASMID DAN ELEKTROFORESIS (Laporan Praktikum Rekayasa Genetika)

Oleh: MUTI DIANDA SARI BTK/P051114021

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI SEKOLAH PASCASARJANA IPB INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2012

PENDAHULUAN Latar Belakang Setiap organisme memiliki DNA yang terletak dalam inti sel atau nukleus yang disebut sebaga DNA kromosomal, betigu pula bakteri. Selain DNA kromosomal, bakteri juga memiliki DNA ekstrakromosomal. Plasmid merupakan DNA ekstrakromosomal yang berbeda karakternya dengan DNA kromosomal. Bentuk plasmid adalah sirkuler double helix dengan ukuran 1 kb sampai lebih dari 200 kb. Beberapa jenis plasmid juga memberikan keuntungan bagi inangnya yaitu resisten terhadap antibiotic atau racun, mendegradasi komponen senyawa organik, retriksi dan modifikasi enzim (Sobti dan Suparna, 2009). Beberapa karakteristik dari plasmid adalah dapat bereplikasi secara terpisah dari DNA kromosomal, dapat ditransfer ke bakteri lain, dan memiliki ORI (Origin of replication). Plasmid banyak digunakan untuk perbanyakan jumlah DNA tertentu sehingga bisa mengekspresikan gen tertentu. Alasan utama pengunaan plasmid ini adalah karena plasmid berukuran kecil, memiliki peta restriksi yang dapat dipotong menggunakan enzim restriksi sehingga memudahkan penyisipan gen DNA ke dalam vektor plasmid, adanya marker sehingga dapat diketahui apakah gen insert masuk atau tidak, memiliki copy number yang tinggi, dan mudah dimodifikasi sesuai dengan tujuan tertentu (Lodish et. al.). Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, misalnya gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya, maka

molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Sehingga elektroforesis dapat memisahkan DNA berdasarkan ukuran panjangnya (Yuwono 2005). Spektrofotometri sinar UV digunakan untuk mengukur tingkat kemurnian DNA hasil isolasi. Spektrofotometri merupakan metode analisis yang didasarkan pada absorpsi radiasi electromagnet dengan panjang gelombang 260 nm dan elekroforesis gel agarosa yang telah diwarnai dengan etidium bromide di atas lampu UV dengan membandingkan dengan DNA standar. Keuntungan utama pemilihan metode spektrofotometri bahwa metode ini memberikan metode sangat sederhana untuk menetapkan kuantitas zat yang sangat kecil (Sagitha, 2010). Tujuan Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengisolasi plasmid yang terdapat dalam bakteri E. coli dan mengetahui konsentrasi plasmid hasil isolasi.

METODOLOGI Waktu dan Tempat Praktikum ini dilakukan di Laboratorium Biorin Pusat Antar Universitas Institut Pertanian Bogor pada tanggal 22 Februari 2012 dan 29 Februari 2012. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini antara lain centrifuge, tabung erlenmeyer, oven, vortex, microcentrifuge, spektrofotometer, cuvet, timbangan digital, cetakan gel dan sisir (tray), vacuum, dan transluminator UV. Bahan-bahan yang digunakan untuk praktikum ini antara lain isolat bakteri E.coli, sol I, sol II, sol III, Buffer TAE, es, PCI (fenol kloroform, isoamilalkohol), etanol 70%, etanol absolut, d2H2O, gel agarose, etidium bromide (EtBr), loading dye dan marker lamda. Cara Kerja a. Isolasi Plasmid Isolasi plasmid dilakukan dengan cara mengambil 1,5 ml kultur bakteri E.coli yang telah tumbuh di media DHS selama 12 jam ke dalam tube, kemudian dilakukan sentrifugasi 10.000 rpm selama 2 menit pada suhu 4 oC agar sel bakteri E.coli terpisah dari media. Setelah di sentrifugasi maka akan terbentuk 2 fraksi yaitu supernatant (cairan) dan pellet (endapan). Supernatant dibuang. Pellet berupa sel-sel bakteri diresuspensi dengan menambahkan 150 l solution I berupa Tris EDTA dan di homogenkan dengan vortex. Setelah itu ditambahkan 200 l solution II berupa SDS dan NaOH yang berfungsi untuk melisis sel,

kemudian di bulak-balik 7-8 kali dan didiamkan dalam suhu ruangan selama 5 menit. Jika larutan terbentuk lendir menandakan bahwa lisis sel telah terjadi. Ditambahkan lagi solution III berupa Natrium asetat sebanyak 250 l untuk menetralisir atau mengembalikan pH larutan, di bulak balik 7-8 kali dan didiamkan di dalam es selama 10 menit. Larutan sel bakteri kemudian disentrifugasi 10.000 rpm pada suhu 4 oC selama 15 menit. Setelah disentrifugasi maka terbentuk lagi 2 fraksi, fraksi supernatant dan pellet. Supernatan diambil dan dimasukkan ke dalam tube baru sekitar 600 ml dan ditambahkan dengan PCI sebanyak 1x volume kemudian divortex untuk homegenisasi. Setelah homogen dilakukan sentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 oC. Tujuan sentrifugasi ini adalah untuk memisahkan protein. Setelah sentrifugasi selesai akan terdapat 3 lapisan. Lapisan atas yaitu supernatan, lapisan tengah berupa endapan protein yang berwarna putih dan lapisan bawah berupa PCI. Kemudian larutan bagian atas diambil jangan sampai menyentuh lapisan tengah (diambil 500 l), dimasukkan ke tube baru dan ditambahkan dengan etanol absolut sebanyak 2 x volume supernatan yang didapatkan (jika diambil supernatan 500 l maka ditambahkan etanol 1000 l) lalu dibolak balik perlahan. Kemudian diinkubasi pada suhu 20
o

C selama 30 menit. Larutan

supernatan dan etanol kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4C hingga terbentuk pelet. Supernatan dibuang, pelet yang terbentuk ditambahkan dengan etanol 70 % sebanyak 1000 l yang berfungsi untuk menghilangkan garam-garam. Kemudian disentrifugasi kembali dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4C. Supernatan yang terbentuk dibuang dan pelet yang dihasilkan dikeringkan dengan divaccum agar etanol menguap. Pelet kering berisi dengan RNA dan plasmid yang akan diisolasi. Pelet yang terbentuk di tambahkan aquabidestilata (ddH2O) sebanyak 20 l dan RNAse 0.2 x volume awal lalu diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37C dan dilanjutkan dengan inkubasi di suhu 70C selama 10 menit. Untuk mengetahui kualitas DNA plasmid yang diisolasi yang berhubungan dengan

tingkat kemurnian plasmid terhadap kontaminan protein maka dapat dilihat dari perbandingan dari absorbansi suspensi plasmid pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. b. Elektroforesis : Pengecekan Hasil Isolasi Metode yang digunakan untuk memeriksa hasil isolasi ialah elektroforesis. Pertama dipersiapkan elektroforesis gel, yaitu dilarutkan 1% agarose ke dalam 40 mL buffer TAE 1x. Kemudian larutan dipanaskan hingga mendidih dengan asumsi bahwa larutan telah homogen. Larutan didinginkan dan dicetak dalam cetakan. Setelah gel terbentuk (beku), dikeluarkan dari cetakan dan dipindahkan ke dalam eletroforator. Dimasukkan marker 10 ng pada sumur 1, marker 30 ng pada sumur 2, marker 50 ng pada sumur 3, dan sampel DNA plasmid pada sumur-sumur berikutnya. Elektroforesis selama 30 menit pada 100 volt.

HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi Plasmid Dalam proses mengisolasi plasmid dari suatu bakteri ada tiga tahap penting yang dilakukan yaitu lisis membran sel bakteri, ekstraksi DNA, dan pengendapan DNA. Proses lisis diawali dengan adanya pemberian solution II yang berisi SDS + NaOH dimana SDS (sodium dodesil sulphate) merupakan detergen yang berperan untuk melarutkan lipid yang ada di dalam membran sel. NaOH adalah larutan basa yang berfungsi untuk mendenaturasi DNA. Proses lisis ditandai dengan terbentuknya lendir. Setelah itu larutan disentrifugasi untuk diambil supernatan yang berupa larutan suspensi. Pada larutan suspensi sebelum ekstraksi terdapat senyawa-senyawa DNA plasmid, RNA, protein, dan komponen lipid. Penambahan PCI (Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol) berfungsi untuk mengekstraksi larutan suspensi untuk mempurifikasi kontaminan protein yang tersisa. Dengan penambahan PCI maka terbenntuk 3 fase yaitu yang pertama fase aquos adalah fase air yang paling atas, pada fase ini masih ada plasmid tetapi sudah terpurifikasi. Fase putih yang berada di tengah yaitu berisi protein yang terdenaturasi, kemudian fase PCI yang berada paling bawah. Fase aquos diambil kemudian dilakukan presipitasi alkohol dengan menambahkan etanol absolut untuk memisahkan DNA dari larutan sehingga di dapat DNA dalam bentuk solid (pelet). Pelet tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan etanol 70% dan disentrifugasi untuk mendapatkan pelet. Kemudian ditambahkan Rnase untuk menghilangkan sisa-sisa RNA dan mendapatkan DNA yang murni.

Elektroforesis Proses elektroforesis adalah analisis menggunakan gel agarose untuk menandakan kuantitas DNA yang telah di isolasi. DNA penanda kuantitas yang digunakan adalah DNA lambda 10 ng, 30 ng, dan 50 ng. Elektroforesis dilakukan sampai penanda menjauhi sumuran. Untuk kuantifikasi, jarak migrasi yang ditempuh tidak perlu terlalu jauh dan untuk menganalisis bentuk DNA. Berikut adalah foto dari hasil elektroforesis tersebut :

1 10

2 11

3 12

4 13

Gambar. Cek Analisis isolasi Plasmid dengan Elektroforesis Gel Agarose.sumur 1 = Konsentrasi DNA standart 10 ng, 2 = Konsentrasi DNA standart 30 ng, 3 = Konsentrasi DNA standart 50 ng, 3-13 = Konsentrasi plasmid E. coli ng/L pada tiap kelompok Gambar tersebut diatas menunjukkan hasil running dari plasmid-plasmid yang telah di isolasi. Terlihat pada gambar di atas plasmid yang berhasil migrasi hanya pada sumur 4, 8, 9, 10 dan 12. Sedangkan pada sumur 1, 2 dan 3 merupakan kontrol yang diisi dengan marker lambda masing-masing 10 ng, 30 ng dan 50 ng. Pada sumur 5, 6,7, 11 dan 13 tidak ada pita yang terlihat, hal ini terjadi mungkin karena kesalahan dalam memasukkan DNA ke dalam sumur gel. Hal ini mengakibatkan DNA hilang karena terlarut. Selain itu, kemungkinan kesalahan terjadi pada saat isolasi plasmid, dimana pada saat isolasi tidak berhasil mengisolasikan plasmid DNA.