Gua de Laboratorio de Bioqumica Pinto, M.

Prctica 3. Extraccin de ADN. Introduccin Los cidos nucleicos constituyen macromolculas fundamentales para las clulas, pues ellas son las encargadas de la transmisin de la informacin gentica de generacin en generacin. El ADN, es la molcula donde se encuentran codificados todos los genes (genoma) que una clula puede expresar, mientras que el ARN se involucra en los procesos de trascripcin y traduccin de la informacin biolgica. En clulas eucariotas, a diferencia de las procariotas, los nucleicos se encuentran compartamentalizados, el ADN se encuentra bsicamente en el ncleo, asociado a histonas, constituyendo nucleoproteinas que conocemos como cromosomas. El ARN se encuentra mayoritariamente en el citoplasma, (ARNr) constituyendo partculas ribonucleoproteicas, los llamados ribosomas. Otros tipos de ARN se encuentran formando ribonucleoprotenas solubles en el citoplasma (ARNm) o prcticamente desprovistos de protenas (ARNt). El contenido de ADN por clula es constante para todas las clulas del mismo organismo mientras que el contenido de ARN vara de acuerdo al tejido y a la condicin fisiolgica de la clula. La extraccin de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son atrados hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolucin y posterior extraccin de la clula. Se empieza por lisar (romper) las clulas mediante la accin de un detergente, vacindose su contenido molecular en una disolucin tampn en la que se disuelve el ADN. En ese momento, el tampn contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, protenas y otras sustancias en menor proporcin. Para separar el ADN de los restos celulares se realiza mediante centrifugacin. Finalmente, para extraer el ADN de esa mezcla de tampn y detergente, se utiliza alcohol fro. Objetivos Efectuar el aislamiento de ADN de muestras celulares. Evidenciar algunas propiedades fsicas de los cidos nucleicos. Preparar una solucin tampn. Pre-laboratorio

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Interprete la funcin que cumple cada uno de los ingredientes contenidos en la solucin tampn. Analice la secuencia de eventos en la extraccin de ADN y explique el fundamento de cada uno de estos.

NOTA: para esta prctica, el estudiante deber organizar con su grupo para traer: un pedacito de hgado o una cebolla, gasa o filtros de papel sobres de Bicarbonato de sodio, sal de mesa y detergente o jabn lquido.

Materiales Material Biolgico: Hgado de pollo o de res, cebolla.

Equipos y Materiales diversos: Centrfuga, nevera

Gasa, papel de filtro, botella de vidrio, cilindro graduado, tubos de ensayo, varillas. Reactivos Solucin Tampn Detergente liquido. Alcohol (Isopropanol o Etanol).

Actividad 1. Preparacin de la solucin Tampn. En un envase de vidrio limpio agregar lo siguiente: - 120 ml de agua, si es posible destilada y si no mineral. - 1,5 g de sal de mesa, preferiblemente pura. - 5 g de bicarbonato de sodio. - 5 ml de detergente lquido.

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Nota. Esta solucin debe mantenerse siempre en fro, antes, durante y despus de la preparacin e incluso mientras se usa. Actividad 2. Extraccin de ADN. - Triturar la muestra en un mortero, hasta hacer una mezcla homognea, sin grumos. - Mezclar en un recipiente limpio 5 ml del triturado celular con 10 ml del tampn fro y agitar vigorosamente durante al menos 2 minutos. Filtrar para separar grumos de mayor tamao - Agregar el filtrado en un tubo de ensayo y agregue unas gotas de detergente, centrifugar a 3000 rpm 10 min - Conserve el sobrenadante en un tubo de ensayo nuevo (cuide no arrastrar el precipitado) - Al tubo con el sobrenadante agregue10 mL de alcohol fro. Se debe dejar escurrir lentamente el alcohol por la cara interna del recipiente, teniendo ste inclinado. El alcohol quedar flotando sobre el tampn. - Introduzca con cuidado una varilla hasta justo debajo de la separacin entre el alcohol y el tampn. Remover la varilla hacia delante y hacia atrs y poco a poco se irn enrollando los fragmentos de mayor tamao de ADN. Pasado un minuto retirar la varilla atravesando la capa de alcohol, as el ADN adherido a la varilla se observara con el aspecto de un copo de algodn mojado o ligeras hebras blanquecinas.