LICENCIATURA EM BIOQUMICA 2 ANO

LABORATRIOS DE BIOFSICA / BIOQUMICA Trabalhos Prticos

ICBAS 2012/2013

PLANO DE AULAS DE LABORATRIOS DE BIOQUMICA E BIOFSICA 2012 2013

TRABALHO

SEMANA Carnaval - 1314 Fev 19-20-21 26-27-28 Fev

TTULO DO TRABALHO PRTICO (Docente)

Simulao do isolamento de uma protena usando o programa ProteinLab (MRA)

Protein Data Bank (PDB) (MS)

Quantificao de protenas por espectrofotometria (MRA)

1 2 3

5 - 6 7 Mar 12 - 13 14 Mar 19 - 20 21 Mar

Produo de protena recombinante (MRA)

Separao e caracterizao de protenas por electroforese (MRA) Frias Pscoa

4 5 6 7

234 Abril 9 - 10 - 11 Abril 16- 17 -18 Abril 23 - 24 25 Abril 30 - 1 -2 Maio 7 - 8 9 Maio

Ensaios imunoqumicos imunoensaio enzimtico (ELISA) e

immunoblotting (MRA)
Purificao de uma protena por cromatografia de afinidade (MRA) Cristalizao de protenas - Estudos de caracterizao estrutural de protenas (MS) Cristalizao de protenas (MS) Cristalizao de protenas (MS) Queima das Fitas Fracionamento celular (MS) Fracionamento celular (MS) Apresentaes dos alunos

8 9 10

14 - 15-16 Maio 21 22 - 23 Maio 28 - 29-30 Maio

Docentes: Prof. Doutora Maria do Rosrio Almeida (MRA); Dr. Maria Strecht (MS)

Trabalho Prtico n1 Simulao do isolamento de uma protena usando o programa ProteinLab

Objectivos:
- Familiarizao com tcnicas de isolamento e caracterizao de protenas e anlise das informaes obtidas em cada uma dessas tcnicas; - Delinear a estratgia de purificao de uma protena em funo de alguns dados iniciais e principalmente em funo dos resultados obtidos em cada uma das etapas cumpridas sucessivamente.

Endereo na web:

www.tlsu.leeds.ac.uk/courses/bioc2060/proteinlab102/Protein2/html

O ProteinLab um programa de simulao do isolamento de protenas concebido pelo Professor Andrew G. Booth da Universidade de Leeds ProteinLab A. G. Booth, School of Biochemistry and Molecular Biology, University of Leeds, 1999.

Introduo
Neste programa -nos dado escolher uma de 20 protenas (1-20) para ser isolada. Relativamente a cada protena so fornecidas informaes relativas temperatura ptima de actividade e ao intervalo de pH em que a protena estvel. A partir desta informao possvel escolher uma das variadas tcnicas disponveis e ir tomando decises sucessivas perante os resultados obtidos. Em cada etapa de purificao pode avaliar-se a eficincia do processo e identificar a protena pela sua actividade enzimtica. So particularmente teis para anlise dos produtos de cada etapa de purificao as tcnicas de electroforese, immunoblotting e anlise bidimensional. A seleco das tcnicas a utilizar implica tambm uma escolha em funo da viabilidade econmica do processo. No decurso do programa possvel ainda obter informaes mais detalhadas sobre as diferentes tcnicas seleccionadas. 3

"Protein Lab", by A.G. Booth, School of Biochemistry and Biotechnology, University of Leeds, Leeds, United Kingdom. Summary of program features: (Note: The description below applies to the versions of "Protein Lab" available for download. The on-line Java version is slightly different.) The program follows an imagined scenario: purification of a protein in a research setting. For background information, as well as an explanation of the concepts needed to effectively use this program, we recommend that students start with the following HELP menu topics: SCENARIO, GETTING STARTED and STRATEGY. Once students understand the general layout of the program, they may begin the actual purification. "Protein Lab" offers the student a chance to purify one of twenty different proteins from a mixture. There is also an option to save an ongoing purification and then later return to the stored material. All of the target proteins are enzymes whose activity may be assayed. The student chooses BEGIN: START FROM THE BEGINNING to select a protein to purify. The program will then provide basic information about the chosen protein, including its pH and temperature stability range. Next, the student chooses the first purification procedure using the SEPARATION menu. There are numerous purification procedures available; the optimal procedure depends on the structural and functional properties of the desired protein. Use the HELP menu to get specific information about each of these procedures, which include Ammonium Sulfate Precipitation, Gel Filtration Chromatography, Ion Exchange Chromatography and others. If a chromatography technique is chosen for separation, the computer generates a chromatogram of A280 vs. fraction number. Following the purification, using a pull-down menu titled FRACTIONS, the fractions can then be assayed for enzyme activity and selected fractions pooled. At any step in the purification, the student may assess his or her progress in one of three ways: by asking for a PROGRESS REPORT (using the HELP menu), by using the ELECTROPHORESIS menu to run a virtual 1-dimensional or 2-dimensional PAGE gel, or by running a PAGE gel and then requesting an IMMUNOBLOT (Western Blot). PROGRESS REPORT includes information on yield, enrichment and efficiency (expressed in person hours). There is no fixed end-point for a given purification, except in the case where the student spends too much virtual money and is "fired". However, the instructor could set some standards for the class in terms of either purity or yield.

Sources of Background Information: Students benefit most from this software when it is preceded by at least one lecture of background material on protein purification. Some useful sources include: Lisa A. Seidman and Cynthia J. Moore, Basic Laboratory Methods for Biotechnology: Textbook and Laboratory Reference, Prentice Hall, 2000 (especially Chapters 23 and 27). Jeanette Mowery and Lisa Seidman, Protein Purification Manual: Purification of galactosidase from E.coli, Madison Area Technical College. (Manuscript in preparation, please contact Jeanette Mowery for an advance copy.) Material from the HELP screens of "Protein Lab" itself. Software: "Protein Lab" by A.J. Booth may be downloaded or used on-line by visiting http://www.booth1.demon.co.uk/archive.

Trabalho Prtico n2

Quantificao de protenas por espectrofotometria

Objectivo
Neste trabalho pretende fazer-se um estudo comparativo de diferentes mtodos de quantificao de protenas baseados na espectroscopia de absoro. Para isso vai proceder-se quantificao de albumina e tripsina em soluo utilizando a absoro a 280 nm e os mtodos do biureto, Lowry e Bradford. Pretende-se ainda, por anlise dos resultados obtidos, verificar os limites de aplicabilidade da tcnica.

Introduo
A quantificao de protenas , talvez, uma das tcnicas mais comuns em bioqumica. Em qualquer estudo bioqumico h sempre uma etapa em que necessrio determinar a concentrao de protena de um modo absoluto ou relativo. Para uma quantificao absoluta o mais correcto seria determinar a massa de protena, ou seja, o peso seco da protena na amostra. Isso exigia que fossem retiradas todas as substncias no protecas da amostra, incluindo ies e molculas de gua. Este tipo de determinao para alm de difcil no muito sensvel. A existncia de uma relao linear entre a absorvncia e a concentrao de uma determinada substncia (lei de Lambert-Beer) possibilita a utilizao da espectrofotometria como mtodo de quantificao. Assim, os mtodos mais comuns para determinar a concentrao de protenas so mtodos espectrofotomtricos que usam cromforos intrnsecos, como os anis aromticos de alguns resduos de aminocidos (absorvem a 280 nm) ou as ligaes peptdicas (absorvem a 215 nm), ou

que se baseiam na reaco das protenas com um reagente originando um produto corado ou fluorescente. Nas determinaes espectrofotomtricas o comprimento de onda seleccionado deve

corresponder ao comprimento de onda com absorvncia mxima no sentido de aumentar a sensibilidade e minimizar os erros nas determinaes. muito importante que as solues a serem lidas espectrofotometricamente se encontrem lmpidas, caso contrrio devem ser clarificadas, por exemplo por centrifugao. A escolha de um determinado mtodo para a quantificao de uma protena deve satisfazer alguns requisitos, nomeadamente, especificidade, sensibilidade, preciso e convenincia (isto , deve ser rpido e econmico). Na realidade devem avaliar-se os diferentes parmetros de modo a escolher o mtodo mais adequado aos objectivos a atingir, principalmente no que respeita especificidade e sensibilidade. A sensibilidade sendo um dos factores mais relevantes na escolha do mtodo deve ser optimizada, por exemplo removendo substncias contaminantes por precipitao, antes do doseamento. Outro factor que pode afectar a sensibilidade a solubilidade da protena. Assim, em alguns casos necessrio um passo inicial de solubilizao da protena. A validao de um mtodo feita pela determinao da exactido e preciso desse mtodo. Estes parmetros so determinados atravs da anlise estatstica dos valores obtidos para vrias determinaes numa mesma amostra. Um ensaio exacto um ensaio em que o valor mdio obtido muito prximo do valor real. Num ensaio preciso, a disperso de resultados pequena e o mtodo reprodutvel, com boa resoluo. Nos ensaios bioqumicos a preciso na maior parte dos casos mais importante do que a exactido pois so suficientes as quantificaes relativas. Isso significa que, por exemplo, pode usar-se uma recta de calibrao de concentrao de albumina para a quantificao de uma outra protena. No entanto, quando a determinao da concentrao absoluta importante deve usar-se uma curva de calibrao da prpria protena. Os ensaios devem ser calibrados usando para isso solues de concentrao conhecida, em condies iguais s do ensaio propriamente dito. Para a calibrao usa-se, em geral, uma soluo stock de albumina srica bovina (BSA) a uma concentrao de 10 mg/ml ou uma diluio 1/10 desta soluo. Solues mais diludas perdem protena durante o armazenamento, principalmente por adsoro, devem por isso ser preparadas diariamente. A concentrao exacta da albumina na soluo stock deve ser determinada por leitura de absorvncia a 280 nm usando como coeficiente de extino o valor A2801%= 6.6. A concentrao deve ser verificada periodicamente devido ao decrscimo da concentrao por desnaturao da protena. A calibrao deve incluir pelo menos 5

concentraes diferentes de protena na gama de concentraes em que o mtodo apresenta linearidade. Como as protenas tm composies diferentes em termos de aminocidos o mesmo peso de protena pode ter valores diferentes em diferentes ensaios. Por exemplo, um ensaio que responda relativamente aos anis aromticos vai subestimar o peso de uma protena com poucos aromticos. Assim, as calibraes baseadas em albumina so relativas. Tendo isto em conta um mtodo que se baseie na reaco com as ligaes peptdicas talvez o que deve apresentar menos variaes de protena para protena, podendo ser utilizado quase como um mtodo absoluto.

Alguns aspectos prticos

Volume de amostra: Num ensaio espectrofotomtrico uma amostra tem, em princpio, 3 componentes: a amostra propriamente dita, o solvente e o reagente de cor, em geral, em excesso relativamente amostra. O volume de amostra deve ser sempre o mesmo, isto , o volume final de amostra e solvente tem de ser sempre igual. O volume do reagente de cor deve ser constante para manter a diluio e o volume final. Sendo assim a absorvncia proporcional quantidade de protena na amostra no sendo necessrio calcular a concentrao de protena na amostra de ensaio. Solvente: Para manter as condies dum ensaio, deve usar-se um solvente tamponado e os volumes de amostra no devem exceder 25% do volume de solvente. As substncias tampo e os ies do solvente podem tambm contribuir para o desenvolvimento de cor no ensaio. Em todos os ensaios deve testar-se a influncia do solvente da amostra no mtodo. Ordem de adio: Embora este no seja um factor muito importante sempre mais correcto adicionar o reagente de cor em ltimo lugar. Uma das razes que estes reagentes so menos estveis nas misturas de amostra podendo decompor-se prematuramente.

Alguns mtodos de doseamento de protenas

Absoro de radiao ultravioleta Os resduos de aminocidos aromticos absorvem luz no U.V. a 280 nm e as ligaes peptdicas a 215 nm. Para uma protena solvel, incolor, a medio da absorvncia a qualquer um destes comprimentos d uma medida da concentrao da protena. A principal vantagem deste mtodo o facto de no destruir a amostra, e por isso poder ser utilizado, por exemplo, para monitorizar a 8

eluio de uma protena duma coluna de cromatografia. A sua desvantagem a falta de especificidade muitos tampes comuns e alguns compostos biolgicos (heme, cidos nucleicos, ATP, etc.) absorvem fortemente no U.V., principalmente a 215 nm. Este mtodo particularmente til para determinar a concentrao de protenas puras e com contedo de aromticos conhecido.

Mtodo do biureto Os ies Cu2+, em soluo alcalina, complexam-se com os tomos de azoto das ligaes peptdicas nas protenas dando origem a um complexo de cor prpura. O Cu 2+ mantido em soluo alcalina sob a forma de complexo de tartarato (fig.1).

Figura 1 Complexo de Cu2+ com tartarato em soluo alcalina.

A presena de altas concentraes de ies amnio, que complexam com os ies Cu 2+, ou a presena de agentes redutores (incluindo aucares redutores), que reduzem o Cu 2+ a Cu+ (formando um precipitado cor de laranja) podem interferir no mtodo. Para remover substncias que interferem no mtodo, pode precipitar-se a protena com cido tricloroactico (TCA) e no caso de esta se encontrar ligada a cromforos orgnicos pode fazer-se uma extrao com etanol. A protena precipitada pode ser solubilizada com uma soluo de desoxicolato em NaOH.

Mtodo de Lowry

Este sem dvida o mtodo mais referenciado na literatura. um mtodo muito mais sensvel do que o mtodo do biureto, o que faz com que seja preferido relativamente ao mtodo do biureto, apesar de apresentar maior variabilidade de protena para protena. Tal como o biureto, o mtodo de Lowry baseia-se na complexao da protena com Cu2+ em soluo alcalina. O cobre parece catalisar a reduo, pela tirosina e pelo triptofano, dos anies 9

fosfomolibdato/fosfotungstato do reagente fenlico de Folin adicionado subsequentemente. Esta ltima reaco conduz formao de um composto de cor azul que pode ser medido a 700-750 nm. Muitos compostos interferem com o mtodo nomeadamente, agentes redutores, tiois, fenois e alguns tampes (trietanolamina, Hepes, etc.) conduzindo a intensas coloraes azuis na amostra que serve de branco. Outros compostos tambm interferem aumentando o branco, mas diminuindo a intensidade de cor das amostras (Tris, EDTA, aucares, glicerol). Alguns detergentes neutros e bases alifticas podem causar a precipitao do reagente. Interferncias devidas precipitao de substncias contaminantes ou da protena podem ser obviadas da mesma forma que foi referida para o mtodo do biureto.

Mtodo de Bradford

Este ensaio baseia-se na alterao de cor que ocorre quando o Coomassie Brilliant Blue G250 (Fig. 2) em soluo cida, se liga protena.

Figura 2 Forma no protonada do Coomassie Blue G250.

A forma protonada do Coomassie Blue tem uma cor laranja plido. O corante liga-se fortemente s protenas, atravs de interaces hidrofbicas e interaces com grupos da protena carregados positivamente. Nestas condies a protonao suprimida e observa-se a cor azul . Este mtodo bastante rpido e simples no sofrendo interferncias de tampes, sais, agentes redutores, etc. No entanto bases fortes causam falsos positivos e os detergentes aninicos (ex. dodecil sulfato de sdio SDS, desoxicolato) tambm interferem. As protenas insolveis podem ser solubilizadas com um detergente no inico como o Triton X-100. A amostra no se deve 10

encontrar num tampo muito forte pois isso impede a protonao do corante aparecendo a cor azul na ausncia da protena.

Parte experimental - Materiais e mtodos

1. Mtodo do biureto Reagentes: 1) Reagente de cor (j preparado):
(Dissolver 1,5 g de Cu SO4.5H2O e 6g de tartarato de Na.4H2O em 500 ml de gua destilada. A esta soluo adicionar 300 ml de soluo de NaOH (10%), seguida de 200 ml de gua destilada. A soluo estvel temperatura ambiente durante meses. A decomposio do reagente indicada pela presena de cor laranja devido ao precipitado de ies Cu+. Se necessrio pode adicionar-se iodeto de potssio como preservativo da soluo (1g/L)).

2) Soluo stock de protena 70 mg/ml (j preparada).

Mtodo 1. A partir de uma soluo stock de protena (BSA) 70 mg/ml, prepare vrias diluies dessa protena (em microtubos), de acordo com a tabela seguinte:

Conc.final (mg/ml) Vol. Soluo stock 70 mg/ml (L) Vol. H2O at 1 ml (L)

70

50

30

25

20

15

10

1000

714

428

357

286

214

143

286

572

643

714

786

857

1000

2. Pipete 0.2 ml de cada uma das solues anteriores para 2 tubos de ensaio (altos). Marque os tubos. 11

3. Adicione 2.3 ml de reagente de cor ( fornecido aos alunos j pronto). 4. Aquea 5 min a 80C (ou deixe temperatura ambiente 2h), arrefea rapidamente e deixe temperatura ambiente 10 min. 5. Ler a absorvncia a 540 nm.

Nota: 1 mg de protena deve dar 0.1 de absorvncia. A cor estvel durante vrios dias nas solues se estas forem conservadas no escuro.

2. Absoro no ultra-violeta Reagentes: 1) Solues stock de protenas 1,41 mg/ml.

Mtodo: 1. Prepare 9 microtubos com 0.2 ml de H2O.

2. Acerte o zero de absorvncia a 280 nm, com gua, no espectrofotmetro. 3. Leia a absorvncia da soluo stock ( use ~1 mL). Solues stock (SI (gamaglobulina) e SII (albumina)) 4. Retire 800 uL da soluo que usou para ler e adicione a um dos microtubos com 200 uL de H2O . Agite e leia a OD . 5. Repita o passo anterior para as 8 diluies seguintes. (No esquea de medir a OD antes depassar diluio seguinte. 6. Mea a OD de cada soluo antes de fazer a diluio seguinte:

Conc.final (mg/ml) Vol. Soluo stock 1,4 mg/ml (L) Vol. H2O at 1 ml (L)

1.4

1.12

0.90

0.71

0.57

0.45

0.36

.19

1000

800

800

800

800

800

800

800

200

200

200

200

200

200

200

12

7. Fazer as leituras de absorvncia para as diluies de SI e para as diluies de SII. Medir a absorvncia das amostras usando gua como branco. ( 1 mg/ml protena d A280 1 )

3. Mtodo de Bradford ensaio em microplaca Reagentes: Reagente de cor comercial (Bio-Rad Protein assay).
(Alternativamente pode fazer-se: a) Dissolver 100 mg de Serva Blue G em 50 ml de etanol. Diluir a soluo a 500 ml com H 2O. A concentrao do corante numa soluo stock fresca deve ser ajustada com 10% de etanol (v/v) para dar A 550 1.18 na mistura a+b. Isto assegura a consistncia dos diferentes stocks de corante. b) cido fosfrico 17% (cido comercial diludo 1/5). As solues a e b so misturadas em partes iguais no dia da utilizao. As solues a e b so estveis durante meses temperatura ambiente.)

Mtodo 1. A partir de uma soluo stock de albumina e de uma soluo stock de gamaglobulina com concentrao aproximada de 1,4 mg/ml (cada) preparar uma srie de diluies (em microtubos) para cada protena de acordo com a tabela seguinte:

Conc.final (g/ml) Vol. Soluo stock 1.4 mg/ml (L) Vol. H2O at 0.5 ml (L)

1400

1000

750

500

250

200

150

100

50

100

72

54

36

18

14

11

28

46

64

82

86

89

93

96

100

2. Usar o reagente de cor (Bio-Rad) 1:4 em H2O. 3. Adicionar 1 mL de reagente Bio-Rad Protein Assay diludo 1:4 a cada uma das 20 cuvetes (por protena). 4. Pipetar 20uL de cada diluio para cada uma das cuvetes (duplicados). 5. Misturar e ler a absorvncia a 595 nm (A595). A cor estvel durante cerca de 30 min, aps os quais o complexo protena-corante comea a precipitar 13

4. Mtodo de Lowry

Reagentes: 1) Reagente de Cobre Alcalino (j preparado)

a) 1% CuSO4.5H2O b) 1% NaK tartarato.4H2O (As solues a) e b) so estveis temperatura ambiente durante meses.) c) 2% Na2CO3 em 0.1 M NaOH. No dia da utilizao misturam-se as solues a) e b) em partes iguais e depois dilui-se com 98 volumes de c), para formar o solvente Reagente de Cobre Alcalino.

2) Reagente de Folin-Ciocalteau (j preparado)

d) reagente comercial de Folin-Ciocalteau (tungstato de sdio, molibdato de sdio, cido fosfrico, cido cloridrico). (A soluo d) estvel a 4C durante meses.) Diluir d) em partes iguais com gua no dia de utilizao para formar o reagente de cor.(Reagente de Folin-Ciocalteau)

Mtodo

1.

A partir de uma soluo stock de protena de concentrao 500g/ml preparar vrias diluies (em tubos de ensaio curtos) de acordo com a tabela seguinte:

Conc.final (g/ml) Vol. Soluo stock 500 g/ml (L) Vol. H2O at 2.5 ml (L)

500

200

100

50

25

10

2.5

2500

1000

500

250

125

50

25

12.5

1500

2000 2250 2375 2450 2475 2487 2495 2500

1.

Pipetar 1 ml de cada uma das solues anteriores para tubos de ensaio (curtos).

2. Adicionar 3ml de Reagente de cobre alcalino. 3. Deixar repousar 10 min. 4. Adicionar 0.3 ml de Reagente de Folin-Ciocalteau e misturar imediatamente. 5. Deixar repousar temperatura ambiente 1h, protegido da luz, e ler a absorvncia a 750 nm (ou alternativamente a 550 nm)

14

Nota: A cor estvel durante vrias horas. O pico de absoro largo e a linearidade pode ser alargada se as leituras forem efectuadas a 550 nm.

BIBLIOGRAFIA: - D. A. Harris & C. L. Bashford: Spectrophotometry & spectrofluorimetry a pratical approach IRL Press, 1987. (Captulo 3- Spectrophotometric assays) - David Freifelder: Physical Biochemistry, W. H. Freeman & Company, New York, 199 .

Trabalho Prtico n3

Isolamento de transtirretina recombinante produzida em E. coli Separao de protenas por cromatografia

Introduo Produo de protenas recombinantes em microorganismos
A necessidade de obter grandes quantidades de protena para diferentes fins levou ao desenvolvimento de sistemas de produo de protenas in vivo. As protenas produzidas em sistemas heterlogos podem ser utilizadas para fins teraputicos e farmacolgicos como o caso da hormona de crescimento, da insulina ou da vitamina da Hepatite B ou com objectivos industriais, por exemplo enzimas usadas na produo de detergentes ou na rea alimentar para a produo de aucar e de queijo. A escolha de um determinado sistema de produo depende principalmente das caractersticas da protena e do fim a que se destina. A bactria E. coli o sistema de produo in vivo mais comum embora as leveduras, em particular Saccharomyces

cerevisiae, Pichia pastoris e Kluyveromyces lactis, sejam cada vez mais utilizadas.
A expresso em E. coli o sistema apropriado sempre que possvel obter a protena na forma solvel, em grande quantidade e com a estrutura correcta e consequentemente protena funcional. Quando as protenas requerem modificaes ps-traduo tais como glicosilao e fosforilao necessrio recorrer a sistemas de expresso eucariotas.

15

Em qualquer sistema a estratgia bsica passa pela clonagem do gene correspondente num vector de expresso e a transformao das bactrias com esse vector. Quando se pretende produo de uma grande quantidade de protena pode utilizar-se um fermentador para crescer o microorganismo (bactria ou levedura). O vector de expresso em geral um plasmdio no qual deve ser clonado o cDNA do gene eucariota que se pretende expressar. Os vectores de expresso para alm da origem de replicao e de marcas de seleco (por exemplo resistncia a antibiticos) possuem tambm promotores regulveis que quando induzidos possibilitam a produo de uma grande quantidade de mRNA do gene clonado. Um dos sistemas mais comuns envolve o promotor da T7 RNA polimerase. O gene especfico clonado sob o controle deste promotor. O gene transcrio e depois traduzido por induo da expresso da T7 RNA

polimerase. O gene da polimerase por sua vez controlado pelo promotor lac que indutvel pelo IPTG (isopropiltiogalactosido). Se por um lado se deseja uma expresso elevada da protena alvo, por outro a sobre-expresso de protena no citoplasma pode conduzir formao de agregados insolveis de protena designados por corpos de incluso (inclusion bodies). A protena em corpos de incluso fcil de purificar por ser maioritria nestas partculas e por estas serem isoladas por centrifugao. No entanto os processos de desnaturao para solubilizar a protena podem no permitir uma renaturao perfeita da protena no se obtendo uma protena funcional. Para obviar estes problemas podem usar-se vectores de expresso que inserem sinais de secreo da protena para o meio ou para o espao periplsmico. Aps produo da protena no citoplasma ou no espao periplsmico, torna-se necessrio separar a protena de interesse das protenas bacterianas. Este processo de isolamento passa na maior parte dos casos por uma cromatografia.

Separao de protenas por cromatografia A separao em cromatografia baseia-se na distribuio das substncias a analisar por duas fases: fase estacionria (meio cromatogrfico ou adsorvente) e fase mvel (ou eluente). As molculas com tendncia a ficarem na fase estacionria movem-se atravs do sistema a uma velocidade menor do que as que tm maior afinidade para a fase mvel. A forma mais comum de cromatografia a cromatografia em coluna. A fase estacionria empacotada numa coluna atravs da qual a fase mvel ou eluente se desloca. A amostra a ser separada aplicada na extremidade superior da coluna e os diferentes componentes da amostra migram a diferentes velocidades, sendo detectados e recolhidos na outra extremidade. Existem diferentes tipos de cromatografia que permitem a separao de protenas de acordo com diferentes propriedades: 16

- forma e tamanho filtrao em gel; carga efectiva e distribuio de carga superfcie - troca inica; hidrofobicidade cromatografia de fase inversa; ligao de metais cromatografia de ies metlicos imobilizados; grupos tiol expostos cromatografia covalente; afinidades bioespecficas de ligandos, inibidores, receptores, anticorpos -

cromatografia de afinidade. Em cada uma das tcnicas referidas as protenas so separadas predominantemente em funo de uma caracterstica, mas a separao no completamente independente das outras.

Cromatografia de troca inica

Na cromatografia de troca inica a separao depende da ligao competitiva de diferentes ies (protenas ou ies salinos) com a mesma carga a um meio cromatogrfico de carga oposta, o trocador inico. A interaco entre as protenas e o trocador inico depende de vrios factores: carga efectiva, distribuio de carga superfcie da protena, fora inica e natureza dos ies no solvente, pH e outros aditivos como por exemplo solventes orgnicos. Os trocadores inicos consistem numa matriz substituida com grupos positivos e so trocadores de anies ou com grupos negativos e so trocadores de caties. Os grupos funcionais mais comuns so as aminas nos trocadores aninicos e os cidos carboxlicos nos trocadores catinicos. As condies de pH condicionam a carga do trocador inico e da protena podendo ser utilizadas para influenciar o processo de troca inica. As protenas so molculas anfotricas contendo sua superfcie grupos carregados positiva e negativamente. A carga efectiva da protena depende da sua composio em amino cidos e do pH do meio. O pH ao qual o nmero de cargas positivas da protena igual ao de cargas negativas designado ponto isoelctrico (pI). A pH superior ao seu pI a protena encontra-se carregada negativamente; a pH inferior ao seu pI a protena encontra-se carregada positivamente. A fora inica do eluente outro dos factores que condicionam a eluio das protenas na cromatografia de troca inica. A uma concentrao relativamente baixa de ies competitivos, a ligao das protenas ocorre atravs de mltiplas interaces de carga entre os vrios grupos da protena e um nmero correspondente de cargas no trocador inico. A concentraes mais elevadas dos ies competidores as protenas comeam a ser deslocadas do trocador inico por 17

ordem da sua fora de ligao, sendo as mais fracamente ligadas as primeiras a eluir. A escolha da fase estacionria e da fase mvel a utilizar depende das protenas a eluir, isto , dos seus pI, solubilidade e estabilidade. A eluio pode ser isocrtica, descontnua ou de gradiente sendo esta ltima a que permite melhores separaes entre os vrios componentes de uma amostra devido ao poder crescente de eluio do meio.

TRABALHO PRTICO Produo de transtirretina recombinante em E. coli e seu isolamento por cromatografia de troca inica
A transtirretina (TTR) uma protena plasmtica que transporta hormonas da tiroide (em particular, tiroxina) e tambm vitamina A (retinol) atravs da formao de um complexo com a protena de ligao do retinol RBP (retinol binding protein). A protena tem massa molecular de cerca de 55 000 Da sendo constituda por quatro subunidades idnticas de cerca de 14 000 Da cada. O seu ponto isoelctrico aproximadamente 5.5. A TTR tem sido associada a diferentes formas de amiloidose hereditria em particular polineuropatia amiloidtica familiar (PAF) vulgarmente conhecida por doena dos pzinhos. Assim, dada a sua importncia biolgica e a associao doena, tornou-se de extrema importncia o conhecimento da estrutura e funo da protena. Para estes estudos necessria uma quantidade relativamente grande de protena que no plasma humano existe apenas numa concentrao de 20-30 mg por 100 mL. Por este motivo estabeleceu-se um sistema de produo de TTR em E. coli usando o vector de expresso pET3a (INVITROGEN). O cDNA da TTR foi clonado neste vector sendo a sua produo induzida pela adio de IPTG cultura de E. coli. A protena produzida mantem-se no citoplasma na sua forma solvel e recuperada aps lise das bactrias. A TTR em seguida isolada por cromatografia de troca inica em DEAE-celulose (fig. 1) que entre pH 2 e 9 se encontra carregada positivamente comportando-se como trocadora de anies. Nesta cromatografia vamos usar um sistema de tampo glicina-acetato sendo a protena eluida por aumento da fora inica do eluente.

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CH2 CH3 - O - CH2 - CH2 N

+

Cl-

CH2 CH3

Figura 1 Estrutura do grupo funcional da DEAE celulose dietilaminoetil - celulose

Parte experimental
I. Produo de TTR recombinante em E. coli Material Stock de bactrias BL21pLysS transformadas com pTTR-ET3a. Meio LB (Luria-Bertani): 10 g bactotriptona, 5 g de extracto de levedura, 5 g de NaCl por litro. Autoclavar. Soluo de Glucose a 20% (autoclavar) Soluo de IPTG 1M (esterilizar por filtrao). Ampicilina 50 mg/ml (esterilizar por filtrao). Soluo de lise 50 mM Tris, 2 mM EDTA, 2 mM PMSF, 0.1% Triton X-100 pH 7.5.

Mtodo 1. Inocular 5 mL de meio LB com ampicilina com uma colnia de E. coli BL21pLysS transformada com pTTR ET3a. 2. Crescer a cultura durante a noite a 37C num incubador com agitao. 3. Inocular 250 mL de meio LB com ampicilina + gucose com os 5 mL de pr-cultura crescida durante a noite e crescer a cultura at esta atingir OD600=0.6-0.8. 4. Induzir a produo de TTR por adio de 100 L de IPTG 1M. Guardar uma alquota de 500 L para anlise posterior. 5. Crescer a cultura durante mais cerca de 3 4 h a 37C. Ao fim deste tempo retirar uma aliquota de 500 L 6. Recolher as clulas por centrifugao a 4000 rpm durante 10 min. 19

7. Desprezar o meio de cultura. 8. Ressuspender o pellet em 25 mL de soluo de lise. 9. Congelar o lisado a 70C e descongelar. 10. Repetir o passo anterior. 11. Sonicar o lisado 10 s. 12. Centrifugar a 10 000 rpm durante 15 min. 13. Guardar o sobrenadante (retirar uma aliquota de 500 L). 14. Dialisar o sobrenadante em tampo de glicina-acetato 1X durante a noite.

II. Purificao da transtirretina recombinante por cromatografia de troca inica 1. Ler a OD280nm do sobrenadante dializado. 2. Guardar uma aliquota de 200 L. 3. Retirar o excesso de tampo da DEAE-celulose e equilibrar o sobrenadante contendo a transtirretina, aps dilise, com a resina durante cerca de uma hora, em agitao. 4. Aplicar a resina a uma coluna de cromatografia. Deixar empacotar a coluna. Recolher uma alquota de 200 L do que no ligou resina. Lavar extensamente com tampo inicial at a OD280 nm ser bastante baixa (0.0..) 5. Eluir a transtirretina com tampo final recolhendo fraces de ~2 mL. Ler a OD 280 nm e registar. Guardar uma alquota de 200 L da fraco com OD mais elevada. 6. Juntar as fraes de mais alta densidade ptica e dialisar contra H 2O. 7. As aliquotas recolhidas nas diferentes fases do trabalho sero analisadas no trabalho seguinte.

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Trabalho Prtico n4 Separao e caracterizao de protenas por electroforese e

Immunoblotting
Objectivos
O objectivo geral do trabalho a analise de protenas por electroforese em sistema nativo (PAGE) e sistema desnaturante (SDS-PAGE) e identificao por Immunoblotting. Em particular, pretende-se estudar o processo de produo e isolamento de transtirretina recombinante realizado na aula anterior, por anlise das fraces recolhidas em diferentes fases do processo.

Introduo

Electroforese A maioria das macromolculas biolgicas possui carga elctrica, sofrendo por isso a influncia de campos elctricos. Existem essencialmente duas respostas aplicao de um campo elctrico: a orientao das partculas, no caso da existncia apenas de uma distribuio assimtrica de carga ou a migrao, no caso de essas partculas possurem uma carga elctrica efectiva. Designa-se por electroforese a migrao de partculas electricamente carregadas, num determinado meio, sob a influncia de um campo elctrico. Os meios de suporte para electroforese podem ser variados, como por exemplo, acetato de celulose, gel de agarose e gel de poliacrilamida. Na electroforese as macromolculas so submetidas aco da fora elctrica, na origem do seu movimento, mas tambm de uma fora de viscosidade, em oposio a esse movimento, sendo atingida uma velocidade de migrao constante quando a fora elctrica equilibrada pela viscosidade. Por isso a mobilidade electrofortica das macromolculas (entendida como sendo a velocidade por unidade de campo elctrico) depende tambm da sua forma e massa electroforese em sistema nativo PAGE (polyacrilamide gel electrophoresis). Em condies experimentais que eliminem a influencia de diferenas na forma e na carga elctrica entre as partculas, ser possvel obter informao acerca da sua massa molecular. Este o fundamento de uma tcnica corrente de separao (e caracterizao) de protenas pelo tamanho, a electroforese em gel de poliacrilamida na presena de dodecilsulfato de sdio (SDS) SDS-PAGE. O SDS um detergente aninico que desnatura as protenas formando com elas, independentemente da sua forma inicial, um complexo cilindrico. Alm disso, a maioria das 21

protenas liga aproximadamente a mesma quantidade de detergente por unidade de massa, adquirindo assim uma carga negativa proporcional sua massa. A eficincia deste processo ainda aumentada pelo tratamento prvio da amostra de protenas pelo calor na presena de SDS e tambm de -mercaptoetanol (um agente redutor). A amostra tratada deste modo colocada no gel e submetida a um gradiente de potencial elctrico. Em resposta, as protenas movem-se atravs do gel com uma velocidade que depende essencialmente da sua massa. De um modo geral prefervel utilizar um gel descontnuo, constitudo por duas partes: uma primeira de trama mais larga e onde se d o empacotamento das protenas stacking gel, e uma segunda onde ocorre a resoluo dos componentes da amostra running gel. As bandas das protenas so reveladas no fim da experincia com um corante. A sua massa molecular determinada por comparao com a migrao de protenas padro, verificando-se que existe uma relao linear entre o logaritmo da massa molecular e a distncia percorrida.

Curva de titulao isoelctrica

A determinao da curva de titulao isoelctrica uma tcnica bidimensional. Numa primeira fase faz-se uma focagem isoelectrica do gel de poliacrilamida, sem amostra, para que se estabelea um gradiente de pH determinado pela distribuio de anflitos ( cidos poliaminados de baixo pm com diferentes pI) no gel. Numa segunda fase, aplica-se a amostra numa linha perpendicular ao gradiente de pH estabelecido e faz-se uma electroforese. A

protena vai migrar para um e outro lado da linha de aplicao da amostra de acordo com a sua carga em cada ponto. A curva de titulao vai cruzar a linha de aplicao da amostra no ponto correspondente ao pI da protena.

Immunoblotting

O immunoblotting combina a resoluo da electroforese com a especificidade da deteco imunoqumica. Basicamente, a tcnica consiste na separao de protenas, antignios, por electroforese em gel de poliacrilamida, seguida da transferncia electrofortica das protenas do gel para uma membrana de suporte, fazendo assim a rplica das protenas separadas no gel. A localizao do antignio determinada usando anticorpos especficos que so marcados com compostos fluorescentes, radioactivamente ou acoplados a uma enzima envolvida numa reao com produo de uma substncia corada (Figura 2).

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Fig. 2 Deteco de protenas por immunoblotting. As protenas separadas em SDS-PAGE so transferidas para uma membrana e detectadas pela utilizao de um anticorpo especfico marcado (de Biochemistry, L. Stryer, 5th ed., 2004)

TRABALHO PRTICO:

A transtirretina uma protena tetramrica constituda por quatro subunidades idnticas de massa molecular aproximadamente 14 000 Da. O seu ponto isoelctrico ~ 5.5. Neste trabalho vamos analisar diferentes fraces recolhidas em diferentes fases do processo de isolamento da protena recombinante para verificar a produo no sistema bacteriano usado e o processo de purificao. As mesmas amostras sero analisadas por electroforese em sistema nativo descontnuo (PAGE) e por electroforese em sistema desnaturante (SDS-PAGE). Os geis obtidos sero corados por Coomassie Blue. Realizaremos tambm transferncia electroforctica das protenas de gel de SDS-PAGE para posterior identificao da protena com um anticorpo especfico (Immunoblotting).

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PARTE EXPERIMENTAL:

A Electroforese em gel de poliacrilamida em sistema nativo (PAGE)

Material Mtodo 1 - Para um gel de 1.5 mm prepare: Soluo de acrilamida stock Soluo tampo de electroforese 5X: H2O TEMED APS 10% 5.4 mL 4 mL 9.6 mL 20 L 1000 L Acrilamida: 29,2% acrilamida, 0,8% bis-acrilamida Soluo tampo de electroforese 5X : 1 M glicina, 0,65 M acetato de sdio, pH 8.6 Para 500 mL: 37,54 g glicina , 26,6 g acetato de sdio Ajustar o pH at 8,6 com NaOH. 10% Persulfato de amnio Soluo de amostra: azul de bromofenol em 50% glicerol

2 Preparao das amostras: Tampo de amostra H2O (L) ( 50% glicerol + bromoph) (L) 0 0 15 15 10 10 10 10

Amostra

Volume de amostra (L) 30 30 15 15

1- Antes do IPTG 2- Depois do IPTG 3 - Lisado 4 - Pico

3 Aplicar 30 de cada amostra nos poos do gel. 4 - A electroforese decorre a 15-20 mA em tampo de electroforese 1X. 5 - Corar o gel com azul de Coomassie e descorar com o descorante apropriado 6 - Corar o gel em soluo corante com Coomassie blue durante cerca de 30 min a 1h e descorar o gel em soluo descorante.

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B Electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE)

Material Soluo de acrilamida: 29.2% acrilamida, 0.8% N,N-bisacrilamida (a mesma do gel nativo). Tampo do gel resolvente: 1.5 M Tris/HCl, pH 8.8. Tampo do gel de empacotamento: 0.5 M Tris/HCl, pH 6.8. Tampo de amostra (4X): 0.25 M Tris/HCl, pH 6.8, 8% SDS, 40% glicerol, 20% mercaptoetanol. SDS 10%. Tampo de electroforese: 0.025M Tris/HCl, pH 8.3, 0.192 M glicina, 0.1% SDS. Persulfato de amnio 10%. TEMED Corante e descorante - os mesmos que se usaram para a electroforese anterior.

Mtodo

1 - Preparar o molde para polimerizar o gel. 2 - Num matrs, preparar a soluo para o gel resolvente: 5 ml de soluo de acrilamida 2.5 ml de tampo do gel resolvente 100 l de SDS 10% 2.5 ml de H2O 100 l de persulfato de amnio 5 l TEMED Aplicar a soluo no molde com uma pipeta Pasteur at cerca de 1.5 cm do topo. Aplicar um pouco de gua de modo a cobrir a soluo inicial. Deixar o gel polimerizar.

3 - Preparar a soluo para o gel de empacotamento:

1 mL de soluo de acrilamida 1.250 mL de tampo do gel de empacotamento 50 l de SDS 10% 2.5ml de H2O 100 l de persulfato de amnio 10% 4 l de TEMED Remover a gua que cobre o gel resolvente, colocar o pente e aplicar o gel de empacotamento. Deixar polimerizar, lavar os poos com gua.

4 - Preparar as amostras: 25

Amostra 1- Antes do IPTG 2- Depois do IPTG 3 Lisado 4 Pico

Volume de amostra (L) 30 30 15 15

H2O (L) 0 0 15 15

Tampo de amostra (SB 4X) (L) 10 10 10 10

5 - Ferver as amostras 2 min. Centrifugar as amostras. 6 - Aplicar 30 L de cada amostra nos poos. Aplicar, em paralelo, uma amostra com padres de peso molecular. Iniciar a electroforese, aplicando uma corrente de 30 mA at as amostras atingirem o gel resolvente e de 40 mA at ao fim da electroforese. 7 Cortar o gel a meio. Uma das partes do gel retirada para immunoblotting e a outra para corar. 8 - Corar e descorar o gel. Registar a distncia que cada protena migrou e calcular o seu peso molecular a partir da curva de calibrao construda a partir dos padres de peso molecular.

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C - Immunoblotting

1 - Transferncia electrofortica de geis de poliacrilamida com SDS

Solues Tampo de transferncia (39 mM glicina; 48 mM Tris, 0.0375 SDS; 20% metanol) 1 L: 2.93 g glicina 5.81 g Tris 0.375 g SDS 200 ml metanol Mtodo - Equilibrar o gel e a membrana de nitrocelulose em tampo de transferncia durante cerca de 15 min. - Molhar 6 folhas de papel de filtro 3 MM com o mesmo tampo. - Preparar a cassete de transferncia colocando as folhas de papel 3MM molhadas no ctodo e sobrepor a membrana de nitrocelulose por cima. Sobrepor o gel de poliacrilamida previamente equilibrado em tampp de transferncia e colocar mais 6 folhas de papel 3 MM por cima. (Nota: Ao colocar o gel em cima da membrana deve ter-se o cuidado de evitar que se formem bolhas entre o gel e a membrana). - A transferncia deve ocorrer durante cerca de 1 hora a 0.8 mA/cm 2.

2 Revelao com anticorpo

Solues: - PBS (phosphate buffered saline), pH 7.3 - 5% de leite em p em PBS - 0.1% Tween-20 em PBS - Soluo de cloronaftol : 5 mg p-cloronaftol/ml metanol - Soluo de revelao (para 6 ml): 5 ml PBS 1 ml soluo de cloronaftol 2 l H2O2 Nota: a soluo de revelao extempornea. O cloronaftol carcinognico pelo que deve ter-se o mximo de cuidado ao manusear a soluo de revelao.

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Mtodo:

- Bloquear a membrana em soluo de leite em p a 5% durante 45 min a 37C. - Lavar a membrana com 1x com PBS. - Incubar a membrana com um anticorpo anti transtirretina humana produzido em coelho (rabbit

anti-human TTR), diludo 1:1000 em PBS, 1h a 37C

- Lava-se a membrana com : - PBS, 10 min; - 0.1% TW -PBS 10 min, duas vezes; - PBS 10 min.

- Incubar a membrana com anticorpo produzido em carneiro contra imunoglobulinas de coelho acoplado peroxidase (sheep anti-rabbit immunoglobulins peroxidase conjugate). Usar uma diluio de 1:5000 em PBS. Incubar 1 h a 37C. - Colocar a membrana em soluo de revelao e agitar at a cor aparecer. - Parar a reaco com gua.

Curva de titulao isoelctrica

Material Soluo de acrilamida: 29.1% acrilamida, 0.9% bisacrilamida. Persulfato de amnio 40%. Anflitos 3.5-10 Soluo do nodo: H3PO4 1 M. Soluo do ctodo: NaOH 1M. Soluo fixadora: 3.5% cido sulfosaliclico, 11.5% cido tricloroactico (TCA). Corante: 0.115% Coomassie blue R-250. Descorante: 10% cido actico, 30% etanol. Tina para focagem isoelctrica. Alimentador de corrente

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Mtodo

1 - Preparar a cassete do gel com uma folha de Gel-Bond, qual o gel vai ficar aderente.

Preparar a soluo do gel: 6.8 ml de acrilamida 1.2 ml de anflitos H2O at 20 ml 20 l de persulfato de amnio 40% 3.4 l de TEMED 2 - Depois do gel ter polimerizado faz-se uma pr-focagem a potncia constante de 12 W durante 50 min. 3 - Cortam-se as pores do gel que contm os electrodos e roda-se o gel 90. Colocam-se novas tiras de electrodo e paralelamente a estas, a amostra no meio do gel. 4 - A electroforese decorre a voltagem constante de 600 V durante 45 min. 5 - Fixa-se o gel em soluo fixadora 40 min. Lava-se em descorante 10 min. Cora-se o gel a 60C 30 min e descora-se em descorante.

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Trabalho Prtico n5 ENSAIOS IMUNOQUMICOS - Imunoensaio enzimtico (ELISA) e immunoblotting na deteco e quantificao de transtirretina

Introduo
Os ensaios imunoqumicos baseiam-se na interaco de um anticorpo com um antignio. Um anticorpo uma protena sintetizada por um animal em resposta presena de uma substncia estranha, que pode ser uma protena, polissacrido ou cido nucleico, e que se designa por antignio. Os animais tm uma gama de clulas produtoras de anticorpos, cada uma delas

produzindo um anticorpo com uma determinada especificidade. Um antignio actua estimulando a proliferao de algumas dessas clulas produtoras de imunoglobulinas. Assim, os anticorpos que reconhecem uma protena particular podem ser obtidos, por exemplo, injectando essa protena num coelho duas vezes consecutivas com intervalos de 3 semanas. Algumas semanas mais tarde recolhe-se sangue do coelho imunizado e centrifuga-se. O soro obtido chamado antisoro e em geral contem o anticorpo para o antignio que induziu a sua sntese. O anticorpo, ou imunoglobulina, ento purificado. Estes anticorpos so chamados policlonais pois so produtos de muitas populaes de clulas diferentes produtoras de anticorpos e diferem apenas na especificidade e afinidade para o antignio. Os anticorpos reconhecem regies relativamente pequenas de um antignio designadas por eptopes. Os eptopes de um antignio proteco podem ser formados por uma sequncia linear de resduos de aminocidos ou por sequncias no contguas que se encontram enroladas e prximas na estrutura tridimensional superfcie do antignio. Isso permite que os anticorpos reconheam protenas relacionadas, com eptopes semelhantes, no entanto, isso no implica uma relao funcional entre essas protenas. Esta tambm a base molecular das reaces cruzadas (reaces com antignios para os quais o anticorpo no foi produzido especficamente). A interaco de um anticorpo com um antignio baseia-se em ligaes no covalentes ocorrendo o complexo em equlibrio com o antignio e o anticorpo livres. Estas interaces no covalentes incluem ligaes de hidrognio, foras de van der Waals, interaces hidrofbicas e electrostcticas entre tomos das cadeias laterais dos aminocidos e tomos das cadeia principal. Os anticorpos podem distinguir protenas muito semelhantes podendo ser usados para detectar e 30

quantificar uma protena ou outro antignio. Pequenas alteraes na estrutura do antignio so suficientes para para afectar a fora da interaco antignio - anticorpo.

A - IMUNOENSAIO ENZIMTICO - ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) deteco e quantificao de transtirretina

O imunoensaio enzimtico (ELISA) um ensaio de ligao que tem como base a reaco antignio-anticorpo e tem acoplada uma reaco enzimtica como marcador. Os imunoensaios em fase slida podem ser realizados de diferentes formas sendo designados como ELISA directo ou ELISA de sandwich (Fig.1). No ELISA directo o antignio imobilizado numa microplaca, suporte polimrico com capacidade para adsorver protenas. Depois de remover o excesso de amostra adiciona-se o anticorpo especfico para o antignio que se pretende detectar, para que se forme o complexo antignio-anticorpo. Depois de retirar o excesso de anticorpo, o que no se ligou especficamente, adiciona-se um anticorpo secundrio capaz de se ligar ao anticorpo primrio e que est acoplado a uma enzima, em geral a peroxidase. Depois de se retirar o excesso de anticorpo adiciona-se o substracto (incolor) para a enzima que aps reaco dever originar um produto corado que ser quantifcado

espectrofotometricamente. A quantidade de produto ser proporcional quantidade de antignio na soluo teste. Alternativamente pode realizar-se o ELISA de sandwich em que o primeiro passo a imobilizao de um anticorpo (anticorpo de captura) para o antignio que se pretende detectar. Em seguida adiciona-se a soluo teste que dever conter o antignio. Depois de retirar o excesso adiciona-se um segundo anticorpo para esse antignio, que tenha sido produzido num organismo diferente do anticorpo de captura. O passo seguinte a adio de um anticorpo secundrio acoplado a uma enzima A deteco ento feita de modo semelhante ao ELISA directo. Estes ensaios, extremamente sensveis, so capazes de detectar menos de um nanograma de protena.

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Fig.1 - ELISA mtodo directo e de sandwich.(de Biochemistry, L. Stryer, 5th ed., 2004).

Deteco e quantificao de transtirretina por ELISA

A transtirretina uma protena que existe no plasma a uma concentrao de cerca de 0.2- 0.3 mg/ml. O anticorpo anti-transtirretina (TTR) usado neste trabalho um anticorpo comercial preparado a partir de um antisoro de coelhos imunizados com TTR humana pura. O soro foi deslipidado e a fraco imunoglobulinica especificidade deste anticorpo foi separada por cromatografia de troca inica. A testada por diferentes tcnicas incluindo

depois

imunoelectroforese. A concentrao do anticorpo foi determinada por densidade ptica a 280nm. O segundo anticorpo tambm um anticorpo policlonal produzido em carneiros imunizados com imunoglobulinas de coelho e que foi ligado covalentemente a uma peroxidase. Como substractos para esta enzima usamos o perxido de hidrognio sendo o cromognio o ABTS (2,2azino-di-(3-ethylbenzothialzoline sulphonate)). O produto da reaco, de cor verde, quantificado por leitura de densidade ptica a 405 nm.

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Parte Experimental
Materiais e reagentes

Microplacas para imunoensaio Pipetas automticas Soluo de transtirretina humana Anticorpo anti-transtirretina produzido em coelho Anticorpo conjugado anti-imunoglobulina de coelho-peroxidase Tampo de adsoro placa (coating): 15 mM Na2CO3 (1,59 g/L), 35 mM NaHCO3 (2,93 g/L), pH 9.5 Tampo de bloqueamento da placa: 5% de leite em p em PBS PBS: 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1.4 mM KH2PO4, pH 7.3. Tampo de lavagem: PBS, 0.05% Tween-20 Soluo de substracto: 1 ml de tampo citrato-fosfato ( 56.5 mM cido ctrico, 66.7 mM Na2HPO4), 0.5 ml de soluo de ABTS (2,2azino-di-(3-ethylbenzothialzoline sulphonate)) 2%, 10 L de H2O2 para um volume total de 10 mL

Mtodo

1- Preparar as amostras com o antignio para aplicar na microplaca. Preparar vrias diluies de transtirretina em tampo de adsoro (coating)para estabelecer uma curva padro. Aplicar 100 l de cada diluio por poo. Num dos poos aplicar apenas 100 l de coating (branco). Aplicar as amostras a analisar em tampo de coating. 2- Aplicar 100 l por poo, tanto as amostras como as diferentes diluies devem ser aplicadas em duplicado. Incubar 1h a 37C ou durante a noite a 4C. 3- Retirar o excesso e lavar os poos 1 vez com PBS. 4- Bloquear os poos com 100 l de soluo de bloqueamento, 30 min a 37C. 5 - Retirar o excesso e lavar a placa com PBS, PBS-TW e PBS respectivamente.. 6 - Adicionar 100 l do anticorpo anti-transtirretina (produzido em coelho), diluido 1: 5000 a cada poo e incubar 45-60 min a 37C. 9 - Retirar o excesso e lavar os poos. 10 - Adicionar 100 l de anti- Ig coelho conjugado com peroxidase diludo 1:5000. 11 - Adicionar 100 l/poo de soluo de substracto incubar 10-15 min temperatura ambiente. 12 - Parar a reaco com 50l/poo de H2SO4 2M. 13- Ler a densidade ptica a 405 nm, em cada poo, num leitor de placas.

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Trabalho Prtico n6

Purificao da transtirretina recombinante por cromatografia de afinidade

Introduo

Cromatografia de afinidade
A cromatografia de afinidade baseia-se principalmente na actividade biolgica das protenas, mais precisamente em interaces especficas que estas possam estabelecer com outras molculas. Estas interaces podem ser de natureza electrosttica, hidrofbica, foras de van der Waals e/ou ligaes de hidrognio. Um processo de purificao por afinidade requer a existncia de um ligando bioespecfico que possa ser ligado covalentemente a uma matriz cromatogrfica. As amostras so aplicadas em condies que favorecem a ligao especfica ao ligando. As substncias de interesse so consequentemente ligadas ao ligando enquanto as substncias que no se ligam so lavadas da coluna. O ligando imobilizado deve manter a sua actividade especfica para a molcula alvo e aps lavagem do material no ligado a ligao entre o ligando e a molcula alvo deve poder ser revertida para que as molculas ligadas possam ser eludas na sua forma activa. Para a recuperao das molculas de interesse, eluio da molcula alvo do meio de afinidade, necessrio reverter a interaco, quer especificamente usando um ligando competitivo quer no especificamente, por alterao do pH, fora inica ou polaridade. Em seguida apresentam-se algumas interaces biolgicas tpicas que podem ser usadas neste tipo de cromatografia:

Enzimas - anlogos dos substratos, inibidores, cofactores Anticorpos - antignios, vrus, clulas Lectinas - polissacridos, glicoprotenas, receptores da superfcie celular, clulas cidos nucleicos - sequencias de bases complementares, histonas, polimerases de acidos nucleicos, protenas de ligao aos cidos nucleicos. Hormonas, Vitaminas - receptores, protenas transportadoras Glutationa - glutationa -S-transferase ou protenas de fuso com GST 34

Ies metlicos - protenas de fuso com poly(His), protenas nativas com resduos de histidina, cistena e/ou triptofano na sua superfcie.

A cromatografia de afinidade pode tambm ser utilizada para remover um contaminante especfico. A grande selectividade da cromatografia de afinidade torna possvel que muitas separaes sejam conseguidas num s passo de purificao. como por exemplo o isolamento de anticorpos monoclonais ou de protenas de fuso. Acoplamento de um ligando atravs de grupos amina primrios

A Sepharose NHS-activada permite o acoplamento covalente de ligandos que contm grupos amino primrios (uma das formas mais comuns de acoplamento). A matriz baseia-se num gel de agarose altamente cross-linked com braos de espaamento (spacer-arms) de 10 tomos (cido 6aminobenzoico) activada por N-hydroxisuccinimida. A adsoro no especfica de protenas a esta matriz muito baixa devido grande hidrofilicidade da base da matriz. A matriz estvel a pH alto permitindo o acoplamento especfico e lavagens fortes do ligando no adsorvido. Os ligandos contendo grupos amina ligam-se rpida e facilmente por ataque nucleoflico da ligao ester para originar uma ligao amida muito estvel permitindo a utilizao de pHs muito altos, at 13, o que faz com que esta tcnica seja muito utilizada para sistemas que exigem esta gama de pH (fig. 1).

Fig. 1 Acoplamento de um ligando a Sepharose NHS-activada

35

A Sepharose CNBr activada tem caractersticas semelhantes Sepharose NHS-activada. O CNBr reage com os grupos hidroxilo da Sepharose para formar esteres de cianato (fig. 2).

Fig. 2 Activao pelo CNBr e acoplamento matriz activada.

Protenas, pptidos e aminocidos podem ser acoplados Sepharose CNBr-activada em condies moderadas atravs dos grupos amino primrios ou de grupos nucleoflicos semelhantes. Os grupos activados reagem com grupos amino primrios no ligando para formar ligaes de isoureia.. A reao de acoplamento espontnea e no requer condies especiais em termos qumicos ou de equipamento. A ligao matriz atravs de vrios pontos assegura que o ligando no vai hidrolizar facilmente da matriz.

Trabalho prtico
Neste trabalho prtico pretende-se preparar uma coluna para cromatografia de afinidade que permita purificar a transtirretina produzida em bactrias. Para isso vai-se acoplar um anticorpo produzido em coelho contra a transtirretina humana a uma coluna de Sepharose NHS-activada (HiTrap NHS-activated affinity column Amersham Biosciences) de acordo com as instrues do fornecedor. Em seguida vai-se aplicar uma soluo de TTR produzida em E. coli e isolada por cromatografia de troca inica em DEAE-celulose. Lava-se a coluna com tampo fosfato a pH 7.4 (PBS - phosphate buffer saline). A TTR ligada coluna ser depois eludo por diminuio do pH (tampo glicina pH 2.7). A eluio dever ser monitorizada por leitura da densidade ptica das fraces. A eficincia do mtodo deve depois ser confirmada por anlise das fraces por electroforese em SDS-PAGE.

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Procedimento 1. A coluna HiTrap fornecida j se encontra acoplada com um anticorpo anti TTR produzido em coelho (rabbit anti-human transthyretin immunoglobulins - Dako). 2. Equilibre a coluna com PBS. 3. Aplique 1 mL da soluo de TTR produzida em bactria e isolada por cromatografia de troca inica (DEAE-celulose) coluna de afinidade com uma seringa, lentamente tentando no ultrapassar um fluxo de 1 mL / min. 4. Lave a coluna com cerca de 5 10 mL de PBS, ou at que a densidade ptica a 280 nm seja muito baixa). 5. Elua a TTR com soluo tampo de glicina-HCl 0.1 M pH 2.7. Para minimizar o tempo de exposio da protena ao pH cido deve recolher as fraces da coluna de cerca de 1 mL para tubos contendo cerca de 100 L de tampo Tris 1 M pH 8.5. Elua a TTR com cerca de 4-5 mL de tampo glicina pH 2.7. Verifique a eluio por leitura da OD a 280 nm ou por fluorescncia. 6. Equilibre a coluna novamente com PBS (cerca de 5 mL). Analise as fraces obtidas por electroforese de SDS-PAGE.

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