Aislamiento de Inmunoglobulinas de Suero Porcino, Mediante Cromatografa de Interaccin Hidrofbica: Comparacin de Dos Matrices Cromatogrficas

Vega-Fernndez, M.R, Vzquez-Moreno, L y Ramos-Clamont, G.

Trabajo de tesis de licenciatura de la primera autora, realizada en el rea de Ciencia de los Alimentos Las inmunoglobulinas (Igs) son los elementos bsicos de la respuesta inmunitaria humoral de los organismos vertebrados. Estas glicoprotenas se encuentran en el suero y tejidos tisulares y son producidas por los linfocitos B estimulados (clulas plasmticas) como respuesta a la presencia de un agente extrao especfico. Por lo anterior, las Igs son un componente importante dentro de los mecanismos de defensa contra las enfermedades de origen infeccioso que presentan los animales. En los cerdos, las etapas de mayor susceptibilidad a las infecciones, son las inmediatamente posteriores al nacimiento y el periodo de destete. En porcicultura, el uso de concentrados de Igs para prevenir enfermedades diarricas representa una alternativa al uso de antibiticos. Las preparaciones comerciales de inmunoglobulinas, se aslan a partir de sus fuentes originales a nivel analtico o a escala industrial. En la industria pecuaria se utiliza mucho el calostro deshidratado como fuente de inmunoglobulinas exgenas. Pero los intentos de emplear Igs de la sangre de animales para fortificar alimentos pecuarios son muy pocos. El aislamiento en grandes cantidades de anticuerpos de suero humano o de otros vertebrados se ha venido realizando por mtodos de precipitacin salina o alcohlica o bien por secado del suero o plasma. Ambos mtodos son inespecficos. Los mtodos cromatogrficos tienen la ventaja de ser altamente especficos y las condiciones de operacin se pueden ajustar para evitar la disminucin de la actividad biolgica y para lograr el aislamiento en el menor nmero de pasos posibles. Algunos de los mtodos cromatogrficos utilizados en el CIAD para la purificacin de inmunoglobulinas son: la cromatografa de afinidad, la cromatografa de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) y la cromatografa de interaccin hidrofbica (HIC). Esta ltima promueve la separacin de protenas en base a las interacciones hidrofbicas que se establecen entre ligandos hidrofbicos inmovilizados en una matriz cromatogrfica y las regiones no polares de las superficies proteicas. La adsorcin de las protenas se promueve en presencia de sales en la fase mvil y la elusin se favorece al disminuir o eliminar dicha presencia.

Con el fin de purificar inmunoglobulinas a partir de suero porcino por cromatografa de interaccin hidrofbica, se compar la eficiencia de las matrices cromatogrficas: Sefarosa altamente acetilada (Sefarosa HA) y Novarosa altamente acetilada (Novarosa HA), ambas sintetizadas en el Laboratorio de Bioqumica de protenas de Ciencia de los Alimentos. El suero se obtuvo a partir de la coagulacin de sangre porcina proveniente de la lnea de sacrificio de un Rastro Tipo Inspeccin Federal (TIF) de la ciudad de Hermosillo, Sonora, separndose por decantacin y conservndose a -40 oC hasta su uso. Para la purificacin se empacaron en columnas abiertas 9 ml y 2.6 ml de Sefarosa HA y Novarosa HA respectivamente. Se utiliz el esquema de purificacin establecido en el laboratorio de Bioqumica de Protenas del CIAD. Las columnas se equilibraron con tres volmenes de Na2SO4 pH 7.6 . El suero se aplic a la columna igualando su molaridad a la solucin de equilibrio. La protena no adsorbida se removi con la solucin de equilibrio hasta una lectura espectrofomtrica de 0.020 unidades de adsorbancia a 280 nm. En ambas matrices se probaron concentraciones de sulfato de sodio de 0.5 y 1M. La protena adsorbida se eluy con MOPS 10 mM, pH 7.2. La regeneracin y remocin de material remanente adsorbido a la columna incluy la aplicacin de tres volmenes de guanidina 4M, pH 7.6, 5 volmenes de agua bidestilada y reequilibrio con tres volmenes de sulfato. La capacidad de las matrices se estim aplicando concentraciones discontinuas crecientes de suero a las columnas. Se realizaron 12 corridas para cada tratamiento determinndose que la capacidad de adsorcin de las matrices se vio influenciada por el tipo de matriz y la concentracin de sal utilizada. Sefarosa HA present capacidades de 1.43 y 4 Mg. de protena adsorbida/mg de matriz a concentraciones de 0.5 y 1.0 M de Na2SO4 respectivamente. Mientras que los valores encontrados para Novarosa HA a las mismas condiciones fueron de 2.5 y 1.9 mg de protena/ml de matriz respectivamente. Debido a que los patrones electroforticos de las fracciones de elusin obtenidas en los esquemas de purificacin con Na2SO4 1.0 M muestran contaminacin con albmina, se concluye que la concentracin ms adecuada para promover la adsorcin de Igs es la de 0.5 M. A pesar de que Novarosa HA observ una mayor capacidad de adsorcin, la recuperacin de protena aplicada a las columnas fue mayor al utilizar Sefarosa HA por lo que esta matriz resulta ms idnea para la purificacin de inmunoglobulinas sricas porcinas.