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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEAR PATRICK SIMO CARLOS

MORFOLOGIA DO NERVO ISQUITICO DE RATOS SUBMETIDOS IMOBILIZAO DE PATA

FORTALEZA CEAR 2012

2 PATRICK SIMO CARLOS

MORFOLOGIA DO NERVO ISQUITICO DE RATOS SUBMETIDOS IMOBILIZAO DE PATA

Dissertao apresentada ao Curso de Mestrado Acadmico em Cincias Fisiolgicas do Centro de Cincias da Sade da Universidade Estadual do Cear, como requisito parcial para obteno do grau de Mestre em Cincias Fisiolgicas. rea de Concentrao: Cincias Biolgicas II Orientador: Prof. Dr. Jos Henrique Leal Cardoso

FORTALEZA CEAR 2012

Dados Internacionais de Catalogao na Publicao Universidade Estadual do Cear Biblioteca Central Prof. Antnio Martins Filho

C284m

Carlos, Patrick Simo Morfologia do nervo isquitico de ratos submetidos a imobilizao de patas / Patrick Simo Carlos. 2011. 70 f. : il. color., enc. ; 30 cm. Dissertao (Mestrado) Universidade Estadual do Cear, Centro de Cincias da Sade, Curso de Mestrado Acadmico em Cincias Fisiolgicas, Fortaleza, 2011. rea de Concentrao: Cincias Biolgicas II. Orientao: Prof. Dr. Jos Henrique Leal Cardoso. 1. Imobilizao. 2. Nervo isquitico. 3. Morfologia. I. Ttulo. CDD: 591.4

4 PATRICK SIMO CARLOS

MORFOLOGIA DO NERVO ISQUITICO DE RATOS SUBMETIDOS IMOBILIZAO DE PATA

Dissertao apresentada ao Curso de Mestrado Acadmico em Cincias Fisiolgicas do Centro de Cincias da Sade da Universidade Estadual do Cear, como requisito parcial para obteno do grau de Mestre em Cincias Fisiolgicas. rea de Concentrao: Cincias Biolgicas II Aprovado em 12 / 04 / 2011

BANCA EXAMINADORA

____________________________________________ Prof. Dr. Jos Henrique Leal Cardoso (Orientador) Universidade Estadual do Cear -UECE

____________________________________________ Profa. Dra. Vnia Marilande Ceccatto Universidade Estadual do Cear - UECE

___________________________________________ Profa. Dra. Carolina Madeira Lucci Universidade de Braslia - UNB

minha esposa, Daniele de Arajo Oliveira Carlos, que desde o incio foi minha grande incentivadora e colaboradora para a realizao dessa conquista,

mostrando que, com pacincia, disponibilidade e amor, obstculos so superados e ideais alcanados. Aos meus pais, Simone e Joo, por nunca medirem esforos para dar um ensino de qualidade e por acreditarem que a educao uma das maiores riquezas.

6 AGRADECIMENTOS Deus, por se fazer presente em todas as horas. Aos meus irmos, pelo apoio silencioso e a lembrana permanente de que a msica deve estar presente. Ao Prof. Henrique Leal, meu orientador, pela sensibilidade, a ateno plena, a confiana e a pacincia. Pelas palavras de incentivo, pelas crticas, os elogios e as ricas sugestes. Por me acompanhar, lado a lado, no enfrentamento desse grande desafio, encorajando-me a ser quem sou. Dra. Vnia Marilande Ceccatto, pela motivao e incentivo durante todo perodo do mestrado. Dra. Carolina Madeira Lucci, pela ateno e compreenso prestada ao trabalho. Aos amigos, por incentivarem e acreditarem que eu chegaria aqui. Aos funcionrios do Mestrado, pelo apoio e disponibilidade em ajudar.

Gosto de ser gente porque, inacabado, sei que sou um ser condicionado mas, consciente do inacabamento, sei que posso ir mais alm dele. Paulo Freire

Resumo

Os tecidos do corpo humano passam por constante reorganizao, assim, a maioria dos tecidos sofrem adaptaes s novas demandas. Nesse contexto o objetivo do estudo foi analisar morfologicamente o nervo isquitico de ratos imobilizados. Trata-se de uma pesquisa longitudinal, experimental. Onde foram utilizados 6 animais divididos em GI e GC, cada grupo contendo 3 animais. A imobilizao manteve a pata do animal em extenso por um perodo de 15 dias. A anlise do material se deu atravs de microscopia eletrnica. Os resultados mostraram que houve desintegrao de fibras e o aparecimento de cluster de axnios. Na distribuio de frequncia ocorreu uma diminuio de 17% na faixa de maior dimetro e um aumento de 16% na faixa de menor dimetro. Assim, conclumos que um perodo de imobilizao foi capaz de ativar a plasticidade neural gerando modificaes morfolgicas nas fibras do nervo isquitico.

Palavras chave: Imobilizao. Nervo Isquitico. Morfologia.

Abstract

The human body tissues change constantly, so the majority of them adapt to the new demand. The study objective is the morphological analysis of immobilized rats sciatic nerve. This is an experimental and longitudinal research which took 6 animals dividing them in GI and GC groups. Each group containing 3 animals. The immobilization kept the animals paw in extension for 15 days. The material analysis was done through an electronic microscope. The results presented fiber disintegration and appearance of axons clusters. In the frequency distribution occurred a 17% decrease in the major diameter band and a 16 % increase in the minor diameter band. Afterwards it is clear that an immobilization period is able to activate the neural plasticity generating morphological changes in the sciatic nerve fibers.

Keywords: Immobilization. Sciatic nerve. Morphology.

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LISTA DE ILUSTRAES

Figura 1 a. b. c. Grupo Controle Aumento 10000x Grupo Imobilizado Aumento 15000x Grupo Imobilizado Aumento 12000x

Pgina 32 32 32

Barra de referncia 2m Figura 2 Figura 3 d. e. f. Grupo Controle Aumento 5000x Grupo Imobilizado Aumento 3000x Grupo Imobilizado Aumento 3000x 34 34 34 Dimetro mdio das fibras danificadas 33

Barra de referncia 5m Figura 4 Distribuio de frequncia por faixa de dimetro 35

Figura 5 Distribuio de frequncia por faixa de dimetro, comparativo entre faixas. Figura 5.1 Distribuio de frequncia do GI . Figura 6 rea mdia das fibras do nervo isquitico

35 41 36

Figura A (Citada de Alves 2010) Traado eletrofisiolgico do potencial de ao composto do nervo isquitico GC Figura B (Citada de Alves 2010) Traado eletrofisiolgico do potencial de ao composto do nervo isquitico GI

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LISTA DE ABREVIATURAS

SN SNC SNP GI GC PFA Caco HCl nm m H2O

Sistema Nervoso Sistema Nervoso Central Sistema Nervoso Perifrico Grupo Imobilizado Grupo Controle Paraformaldeido Cacodilato de Sdio cido clordrico nanmetro micrmetro gua

12 SUMRIO 1 Introduo 1.1 Sistema Nervoso 1.2 Morfologia do Sistema Nervoso Perifrico 1.3 Plasticidade Neural 1.4 Imobilizao 2 Relevncia 3 Objetivos 3.1 Objetivo Geral 3.2 Objetivo Especfico 4 Materiais e Mtodos 4.1 Local de Execuo e Tipo de Estudo 4.2 Animais 4.3 Amostra 4.4 Tratamento 4.5 Sacrifcio 4.6 Processamento do Tecido 4.7 Anlise 4.8 Estatstica 5 Resultados 6 Discusso 7 Concluso Referncias Anexo 13 13 19 21 23 26 27 27 27 28 28 28 29 29 29 30 31 31 32 37 44 45 50

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1 Introduo

1.1 Sistema Nervoso

O Sistema Nervoso (SN) o sistema com a maior complexidade dentro do organismo humano. Gerencia a constante manuteno da homeostase, alm disso, encarregado pela gerao dos comportamentos reflexos, comportamento alimentar, sono, viglia, luta, defesa, fuga, comportamentos reprodutivos, dentre vrios (BERNE, 2004; GUYTON, 2002). O SN um tecido originrio de um folheto embrionrio denominado ectoderme, mais precisamente de uma rea diferenciada deste folheto embrionrio, a placa neural. Inicialmente a placa neural contm cerca de 125 mil clulas, que daro origem a um sistema composto por aproximadamente 100 bilhes de neurnios (MOORE, 2004) A placa neural, por volta da 3 semana de gestao, se fecha, formando um tubo longitudinal denominado tubo neural que em sua regio anterior, sofre uma dilatao que dar origem a uma parte fundamental do Sistema Nervoso Central (SNC), o encfalo. Nos pontos de encontro ou fechamento das extremidades da placa neural, no recm formado tubo neural, forma-se a crista neural que d origem a componentes que a neuro-anatomia denomina como elementos perifricos e componentes celulares gliais (MOORE, 2004). O SN pode ser dividido baseando-se tanto em caractersticas funcionais como anatmicas. Do ponto de vista funcional temos o sistema somtico, que atua em todas as relaes que so percebidas por nossa conscincia. E o visceral ou vegetativo que, por sua vez, age de forma inconsciente no controle e na percepo do meio interno e vsceras (SILVERTHORN, 2003). Tanto o somtico quanto o vegetativo, possuem componentes sensitivos e motores. Anatomicamente o SN pode ser dividido em Sistema Nervoso Central

14 (SNC) e Sistema Nervoso Perifrico (SNP). O SNC a poro do SN que se localiza no crnio e na medula espinhal (GUYTON, 2002). Dentre suas funes esto: a integrao das atividades corpreas, armazenamento de experincias, controle do ambiente interno, controle de movimentos voluntrios, programao de reflexos da medula espinhal, entre outros (LENT, 2004). O SNP constitudo basicamente por gnglios nervosos e prolongamentos do SNC denominados fibras nervosas. As fibras nervosas se dividem em trs tipos: As Sensitivas ou sensoriais que tem o papel de gerar e transmitir alguns impulsos nervosos dos rgos receptores at ao SNC; As fibras Motoras so responsveis por conduzir o impulso codificado no encfalo, at o rgo efetor e as Mistas so uma juno dos nervos sensitivos e motores ao mesmo tempo (BERNE, 2004; GUYTON, 2002). O SNP gera e transmite impulsos ao SNC, informando-o sobre o estado dos rgos, alm de receber informaes do SNC e transmiti-las a rgos efetores estabelecendo uma interface do meio interno com o meio externo. Duas vias possibilitam essa interface: A via eferente e a via aferente. Na via eferente o impulso nervoso decorrente de uma alterao eltrica gerada no soma neural transmitido ao longo do axnio at o rgo efetor. E na via aferente o impulso gerado nos receptores e transmitido ao SNC (BARROS, 2002). Uma via aferente normalmente possui uma terminao nervosa sensvel ao estmulo que caracteriza a via, um trajeto perifrico, um trajeto central e uma rea de projeo cortical onde neurnios corticais interpretam a informao (LENT, 2004). Quando as informaes sensoriais chegam ao SNC, podem ser imediatamente processadas no local, resultando na elaborao de comandos motores reflexos, bem como, serem retransmitidas para estaes sinpticas mais ceflicas atravs de neurnios de projeo (KANDEL, 2003).

15 Em cada estao de retransmisso dos sistemas sensoriais, o estmulo aferente processado localmente por excitao e inibio, proporcionando diferentes nveis de anlise. Em quase todos os sistemas sensoriais ocorrem inibies sobre os prprios receptores bem como, sobre as vias aferentes, influenciando o nvel de excitabilidade do canal sensorial (LENT, 2004). Cada tipo de receptor est habilitado para informar o SN apenas sobre determinados aspectos ou dimenso do meio ambiente, funcionando como um filtro sensorial e altamente sensvel ao estmulo que lhe adequado. Dentro de cada modalidade sensorial possvel distinguir diversas qualidades, desse modo o sistema sensorial avalia vrios aspectos de uma mesma modalidade (BERNE, 2004). Com a viso, por exemplo: pode-se perceber cores, profundidade, relevos, entre outros. As diferentes modalidades sensoriais enviam as respectivas informaes sensoriais para reas especficas do crtex sensorial e ocorre a constituio completa do meio ambiente (GUYTON, 2002). A principio, ocorre dois tipos de receptores sensoriais: os neurnios sensoriais perifricos que tem em sua extremidade perifrica uma estrutura modificada para a deteco dos estmulos e clulas sensoriais epiteliais associados a um neuro-epitlio. Os receptores sensoriais podem converter os estmulos fsicos e qumicos do ambiente em impulsos eltricos e funcionam como transdutores de energia. Atravs dos prolongamentos perifricos dos neurnios aferentes as informaes sensoriais so conduzidas para o SNC onde sero percebida e interpretada (KANDEL, 2003). Os receptores so classificados em funo de trs critrios: o primeiro de acordo com a sua morfologia. Receptores especiais esto associados a um neuro-epitlio e fazem parte dos rgos dos sentidos especiais como viso, olfao, gustao, audio e equilbrio, todos localizados na cabea. Possuem clulas receptoras especializadas no

16 nervosas, associadas s clulas nervosas propriamente ditas. Receptores gerais ocorrem em todo o corpo, principalmente na pele e so menos complexos na estrutura podendo ser classificados em dois tipos: receptores livres e receptores encapsulados. Estes no possuem clulas sensoriais secundrias (BARROS, 2002; GUYTON, 2002). A segunda funo seria a classificao de acordo com a localizao da fonte estimuladora. Os exteroceptores so localizados na superfcie do corpo, so ativados por estmulos externos ao corpo como luz, som, presso, entre outros. Os proprioceptores esto localizados nos tecidos mais profundos do corpo como msculos, cpsulas articulares, tendes, ligamentos, so ativados por estmulos mecnicos. E os Interoceptores localizados nos vasos e rgos cavitrios do corpo. Baseado neste critrio fcil perceber que os proprioceptores e exteroceptores so responsveis pelas sensaes somticas e os interoceptores, pelas sensaes viscerais. E ainda, as sensaes viscerais, proprioceptivas e interoceptivas so tambm consideradas como profundas e as evocadas pelos exteroceptores de superficiais (BARROS, 2002). E por fim, classifica-se de acordo com o estmulo mais apropriado. Dado que os receptores respondem mais especificamente a determinados estmulos funcionando como filtros seletivos e especficos, os receptores podem ser classificados: fotorreceptores, glicorreceptores, eletrorreceptores, entre vrios (GUYTON, 2002). A gerao de um potencial de ao ocorre quando um estmulo atinge a regio receptora, e gera uma alterao na membrana do receptor semelhante ao de baixa voltagem que neste caso denominado potencial receptor. Se a propagao eletrotnica desta atividade chegar at a zona de gatilho e atingir o limiar para desencadear o potencial de ao, o impulso nervoso ser enviado ao SNC. Como o potencial receptor um fenmeno graduado, quanto maior o estmulo, maior ser a amplitude de sua resposta e

17 maior ser a frequncia de descargas dos potenciais de ao na fibra aferente (BERNE, 2004). A membrana dos diferentes receptores sensoriais possui mecanismos altamente especficos que convertem os estmulos em potencial receptor. Esses estmulos fsicos ou qumicos abrem ou fecham canais inicos especficos causando ou interrompendo fluxos inicos e como consequncia, mudanas temporais no potencial de ao (BARROS, 2002). Alm de qualidade e quantidade dos estmulos, a percepo sensorial resulta tambm em uma definio temporal do estmulo como, por exemplo, a durao e taxa de variao de um determinado estmulo. Finalmente, outro aspecto importante que o sistema sensorial capaz de detectar a origem dos estmulos sensoriais e informar-nos sobre a nossa posio no espao e nos fornecer informaes sobre o nosso mapa corporal (KANDEL, 2003). A durao de uma sensao depende das propriedades do receptor. Se um determinado estmulo persiste por muito tempo, com o tempo ficamos com a sensao de que ele diminui ou desapareceu. Esta propriedade denominada de adaptao. H dois tipos de receptores percebendo no s o aumento na intensidade do estmulo como tambm a sua durao sensorial quanto capacidade de adaptao: Receptores tnicos so aqueles cujo potencial receptor mantido enquanto durar o estmulo e, por conseguinte, so adequados para realizar a anlise de intensidade do estmulo. J os Receptores fsicos ou de adaptao rpida so aqueles que se adaptam rapidamente ao estmulo. Logo, se o estmulo persistir por muito tempo, os potenciais receptores no sero mais gerados, bem como, os potenciais de ao nas fibras aferentes primrias. A sensao detectada de aparente ausncia de estmulo (GUYTON, 2002).

18 Na ausncia de estmulos as clulas do SN, so dotadas de cargas inicas negativas em seu interior, comparando-se com o meio externo, a esse estado d-se o nome de potencial de repouso. A magnitude do potencial de repouso da membrana vria de -40 a -75mv dependendo das caractersticas da clula (SILVERTHORN, 2003; BERNE, 2004). Como vimos anteriormente, as clulas que encontramos no SN tm a capacidade de gerar e transmitir impulsos eltricos ou potenciais de ao. O potencial de ao gerado devido a uma alterao brusca e rpida da diferena de potencial transmembrana (GUYTON, 2002). Essa alterao se d quase sempre pela abertura de canais que permitem a passagem para o interior da clula, atravs da membrana citoplasmtica, de ons dotados de carga positiva, e assim, alterando a diferena de potencial eltrico transmembrana de maneira a positivar o interior da clula. O limiar de voltagem o ponto crtico de voltagem transmembrana que, uma vez atingido, promove a deflagrao do potencial de ao. Uma vez gerado o potencial de ao no soma da clula ou em algum sitio axonal prximo ao receptor sensorial, ele transmitido atravs dos axnios. Igualmente gerao do potencial de ao, a sua transmisso tambm ocorre por uma entrada de ons dotados de cargas positivas no interior do axnio. Assim, ele transmitido ao longo da estrutura at as ramificaes axonais mais perifricas, fazendo com que o estimulo nervoso, ou seja, o potencial de ao gerado se propague com a mesma amplitude inicial. J a transmisso do impulso eltrico de um neurnio para os neurnios seguintes se processa, na maioria dos casos (transmisso sinptica qumica), atravs da reconstituio do potencial de ao no neurnio ps-sinptico e dessa maneira levado at o rgo efetor. A conduo e transmisso do impulso nervoso pode ser atravs das fibras nervosas mielinizadas ou no mielinizadas (HUANG, 2001; BERNE, 2004; SILVERTHORN, 2003).

19 A funo primordial da mielina o aumento na velocidade de conduo do impulso nervoso. Isto se d pela disposio da mielina em intervalos regulares, alternados com ndulos de Ranvier, transmitindo o impulso entre os ndulos de maneira eletrnica, com recriao do potencial de ao em cada ndulo. Essa forma de conduo do potencial nas fibras mielinizadas chamada de forma saltatria. A constituio da mielina presente no SNP se assemelha, em composio geral, tanto de protenas como lipdios, mielina encontrada no SNC; logo, a mielina do SNP dotada de uma maior quantidade de esfingomielina e glicoprotenas (LIU, 1997; SILVERTHORN, 2003).

1.2 Morfologia do Sistema Nervoso Perifrico

Macroscopicamente, os nervos do SNP apresentam-se como feixes ou fascculos brancos e brilhantes que, por sua vez, so unidos por tecido conjuntivo. Os neurnios no trabalham isolados, mas sim em conjuntos que quando associados formam redes neurais. Como toda clula, o neurnio apresenta uma membrana plasmtica que envolve um citoplasma contendo organelas com diferentes funes e um ncleo onde encontra-se o material gentico. O que diferencia os neurnios das demais clulas sua morfologia adaptada para o processamento de informaes e a variedade dos seus tipos morfolgicos (LENT, 2001). Uma das principais funes do neurnio a capacidade de gerar impulsos eltricos que, por sua vez, funcionam como unidades de informaes que processam informaes a respeito do meio ambiente externo e interno comandando assim aes musculares, ativando glndulas e cdigos complexos que veiculam pensamentos, emoes, e memria no ser humano (GARTNER, 1999).

20 O corpo celular ou pericrio do neurnio contm um ncleo e o citoplasma. O ncleo quase sempre esfrico ou ovide e est localizado no centro, apresentando cromatina dispersa, indicando intensa atividade de sntese, embora neurnios menores geralmente apresente a cromatina heterocondensada. O nuclolo bem visvel (ROMRELL, 1993; GARTNER, 1999). O citoplasma tem sua constituio bastante complexa e ocupa todo o interior da clula nervosa. Nele se encontram protenas dispostas na forma de fibrilas, que compem o citoesqueleto responsvel pela manuteno da forma do neurnio e da mobilizao dos neurnios jovens durante o desenvolvimento, de forma a garantir sua migrao das regies germinativas para stios distantes do organismo embrionrio. O citoesqueleto um dos responsveis por emitir, alongar ou retrair ativamente os prolongamentos dos neurnios, constituindo um sistema de transporte de molculas sinalizadoras, nutrientes, fatores trficos e de vesculas membranosas que se movem do soma at as extremidades dos prolongamentos assim como no sentido oposto (LENT, 2001). No citoplasma encontra-se abundante retculo endoplasmtico rugoso com muitas cisternas paralelas, principalmente em neurnios motores, estas cisternas juntamente com os poliribossomos, aparecem como aglomerados de material basfilo, quando corados com corante bsico, denominados de corpsculos de Nissl (LENT, 2001; GARTNER, 1999; ROMRELL, 1993) Em seces dos nervos perifricos, possvel observar a arquitetura intrincada desse tecido. Os axnios e clulas de Schwann localizam-se em compartimentos endoneurais, que so rodeados pelo perineuro; este por sua vez forma fascculos individuais que so envoltos por tecido fibroso epineural (ORTIZHIDALGO & WELLER, 1997).

21 Dentre os vrios tipos celulares que constituem o SNP as clulas de Schwann, so as principais. Elas so confinadas ao SNP e em situaes normais raramente so vistas no SNC. As clulas de Schwann assumem a funo de mielinizar ou envolver os axnios do SNP, so clulas extremamente lbeis, que exercem um papel fundamental na formao dos nervos, alm de auxiliarem o SNC e o SNP nos processos regenerativos (MIRSKY & JESSEN, 2001).

1.3. Plasticidade Neural

Historicamente, em meados de 1800, a hiptese da neuroplasticidade comeou a ser descrita quando estudo sugeriu (NUDO, 2006) que pores vivas de massa enceflica alteravam suas funes realizando, s vezes, outras e assim contribuindo com a recuperao do rgo. No entanto, por volta de 1906, que o termo plasticidade foi introduzido por um psiquiatra italiano (BERLUCCHI, 2002). Somente em 1948, a hiptese de plasticidade ganha forma semelhante a atual. A idia era que a aplicao de um estmulo proporcionasse dois nveis de mudanas em que a primeira seria uma alterao funcional relativa s peculiaridades inerentes ao SN, gerao e transmisso de impulsos eltricos e a segunda so alteraes permanentes, em sua funo, devido aplicao de estmulos adequados. A isso chamar-se-ia plasticidade neural (KANDEL, 2003). Posteriormente, na dcada de 60, grandes descobertas relacionadas plasticidade neural foram feitas. Pesquisadores postularam que conexes neurais a nvel cortical eram intensificadas e remodeladas pelas experincias (JOHANSSON, 2004; HOLLOWAY, 2003).

22 Na dcada de 80, a viso dos cientistas sobre a capacidade regenerativa do SNC de mamferos adultos comeou a sofrer mudanas, com a pesquisa realizada por Albert Aguayo, que utilizou ratos adultos submetidos transeco do nervo ptico. Aguayo relatou duas importantes concluses: A primeira que os axnios presentes no SNC so capazes de regenerar, desde que estejam em contato com o microambiente do SNP, e a segunda que o microambiente do SNC no favorece o crescimento regenerativo dos axnios centrais (LENT, 2004). Assim, foi somente nas duas ltimas dcadas que vrios relatos de plasticidade foram demonstrados em modelos experimentais e em humanos, permitindo-nos comear a traar os mecanismos implcitos. Os achados sobre neuroplasticidade tm sido observados em vrias formas de anlise (NUDO, 2006). Trabalhos atuais tm relatado a reorganizao neural visando uma maneira que facilite a recuperao da funo. Tal fato vem sendo sugerido e, de uma maneira geral, progressivamente demonstrado, como um objetivo importante da recuperao neural (NUDO, 2006). Sendo o SNP composto principalmente por prolongamentos oriundos do SNC tornase um alvo mais facilmente passvel de leses, tanto pela quantidade existente, como pela sua distribuio anatmica. Assim, quando um axnio no SNP lesado, o neurnio tende reparao, aumentando significativamente a sntese de protenas estruturais, exacerbando todo o potencial das organelas (SUN, 2010). Um exemplo o reticulo endoplasmtico rugoso, que com as leses do respectivo neurnio passa a ter suas cisternas distendidas com os produtos da sntese proteca ou os ribossomos aparentando uma desorganizao (SILVERTHORN, 2003). Concomitantemente com essas ocorrncias, o soma apresenta-se edemaciado, adquirindo a forma arredondada e o ncleo assume uma posio excntrica. Essas

23 alteraes morfolgicas refletem o processo citolgico ligado ao aumento da sntese de protenas (BERNE, 2004). Apesar de todo o esforo do soma na produo de protenas estruturais, os neurnios no so dotados da capacidade de repor apenas as protenas danificadas durante a leso. O que ocorre uma desintegrao de todo o axnio localizado aps a leso (BOOTH, 1982; SANTOS-JUNIOR, 2010). Para os axnios mielnicos, no somente o axnio, mas a mielina tambm sofre desintegrao, chegando ao ponto de uma desenervao do rgo efetor. Contudo, esse esforo na produo de protenas, no em vo; servir para reconstruo do axnio, desde o ponto danificado at o rgo efetor, minimizando os danos que poderiam ser totalmente irreversveis (GUYTON 2002). O incio da regenerao fica bem caracterizado pelo surgimento de brotamentos no coto proximal do axnio. Nesse processo, as clulas de Schwann presentes na poro degenerada do nervo, no s sobrevivem como se multiplicam, formando um cone de crescimento que serve de linha guia que indicar qual o caminho original seguido pelo nervo que antes existia ali. Assim, possvel que, em determinados casos ocorram a reinervao e o novo axnio venha a possuir caractersticas aproximadamente idnticas as do axnio previamente existente. (BERNE, 2004). Contudo, a hiptese de plasticidade neural com suas vias de ao ainda tem muitos pontos a serem esclarecidos.

1.4. Imobilizao

Os tecidos do corpo humano esto em constante reorganizao, assim, a maioria dos tecidos sofrem adaptaes s novas demandas, seja do prprio organismo, interno ou do meio externo (BERNE, 2004).

24 muito comum na prtica clnica utilizar tcnicas de imobilizao como alternativa para reverter quadros patolgicos como fraturas ou entorses. Segundo a literatura pequenos perodos de imobilizao podem ocasionar prejuzos regio imobilizada, sendo os principais, hipotrofia e/ou atrofia muscular (VASCONCELOS, 2010). Como resultado da imobilizao, temos, inicialmente, a perda da massa muscular associada diminuio da fora, consequentemente levando a uma reduo no tamanho do msculo (BOOTH, 1982; FALEMPIN e MOUNIER, 1998), sendo mais acentuada nas primeiras setenta e duas horas, com ndices de 14 a 17%. Tendo decorrido aproximadamente uma semana, o ritmo de perda parece diminuir. A imobilizao causa tambm transtornos em outras partes do organismo, e esses transtornos podem interferir inclusive no metabolismo, limitando temporariamente as atividades cotidianas, diminuindo assim, sua qualidade de vida (SANTOS-JUNIOR, 2010). Dados histolgicos j descrevem diminuio na sntese proteica muscular aps 6 horas de imobilizao (BOOTH, 1987), aumento intenso no volume de tecido conjuntivo aps 2 dias (WELLIAMS e GOLDSPINK, 1984) e hipotrofia de 35% a 45 % aps 7 dias (APPELL, 1986). O msculo o elemento motor do corpo que aciona de forma voluntria ou involuntria os segmentos do corpo. A musculatura estriada de contrao voluntria denominada musculatura esqueltica (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 1999). O msculo esqueltico responsvel aproximadamente por 45% do peso corporal e o maior sistema orgnico do ser humano, sendo um importante tecido na homeostasia bioenergtica, tanto em repouso como em exerccio. O msculo esqueltico representa tambm o principal local de transformao e de armazenamento de energia (SANTOS-JUNIOR, 2010). Segundo a literatura, o msculo, dentre os tecidos biolgicos, o mais mutvel e responde a demandas com adaptaes morfolgicas e/ou funcionais. A funo do msculo

25 esqueltico depende da atividade proprioceptiva intacta, inervao motora, carga mecnica e mobilidade articular (LIEBER, 1992; SILVEIRA, 1994). A imobilizao provoca mudanas a nvel muscular (SANTOS-JUNIOR 2010) e nervoso (ALVES 2010). Uma das possveis mudanas decorrentes da imobilizao a modificao primria do grau da atividade neural sobre o tecido muscular (FALEMPIN e MOUNIER, 1998). Alm do grau de atividade, possvel que haja tambm modificao primria (causada simplesmente pela diminuio do uso) da prpria estrutura morfolgica neural. Como os casos de imobilizao freqentemente se associam a leses traumticas ou outras patologias, faz-se necessrio distinguir o que seja leso neural primria e secundria. Visando dar uma contribuio ao aperfeioamento da prtica clnica teraputica em casos de imobilizao com dano funo do rgo imobilizado, o presente trabalho se prope a averiguar e caracterizar as alteraes morfolgicas primrias no nervo isquitico de ratos com o membro correspondente imobilizado.

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2 Relevncia

Atualmente a prtica clnica utiliza tcnica de imobilizao como alternativa na reverso de quadros patolgicos que vo das entorses fraturas. Logo, pequenos perodos de imobilizao podem gerar prejuzos regio imobilizada, sendo os principais a hipotrofia e/ou atrofia muscular. Modelos experimentais vm dando suporte a pesquisas cientficas no intuito de aprofundar o conhecimento sobre imobilizao. Parte da literatura traz modelos tradicionais que utilizam gesso nas imobilizaes. A imobilizao pelo gesso tem vrias desvantagens, dentre elas, o edema de pata a principal e mais grave, tambm podemos citar a retirada da imobilizao pelo prprio animal, a necessidade de anestesia para o perodo de secagem do gesso, entre outros. Para minimizar os problemas da imobilizao com o gesso, desenvolveu-se no Instituto Superior de Cincias Biomdicas - ISCB da UECE um modelo de imobilizao feita com esparadrapo onde preserva-se melhor a integridade do animal. Essa prtica tem demonstrado uma perspectiva bem real com resultados relevantes. Contudo, ainda no foi descrito na literatura a anlise, do ponto de vista morfolgico, dos nervos de modelos imobilizados com esparadrapo. Assim, esse trabalho, alm da sua relevante contribuio das alteraes morfolgicas primrias de um nervo perifrico pela imobilizao, tem outra contribuio mpar que tambm para o entendimento dos acontecimentos inerentes a este modelo de imobilizao com esparadrapo, contribuindo para uma possvel aplicabilidade em humanos.

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3 Objetivos

3.1 Objetivo Geral:

- Caracterizar e analisar as alteraes morfolgicas do nervo isquitico de membro imobilizado de ratos.

3.2 Objetivos Especficos:

- Apresentar o comportamento morfolgico do nervo isquitico, proporcionado pela imobilizao; - Pesquisar e analisar a distribuio das frequncias referente aos dimetros dos axnios do nervo isquitico; - Pesquisar e analisar a rea mdia das fibras do nervo isquitico.

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4 Materiais e Mtodos

4.1 Local da Execuo e Tipo de Estudo

O trabalho foi desenvolvido nas dependncias do Instituto Superior de Cincias Biomdicas da Universidades Estadual do Cear-UECE, Fortaleza-Cear e na

Universidade de Braslia UNB Braslia, no perodo de 01/03/2009 a 30/08/2011. Trata-se de uma pesquisa longitudinal de cunho experimental.

4.2 Animais

Esse trabalho foi aprovado pelo Comit de tica para o Uso de Animais Ceua/Uece sob nmero de protocolo 10244987-2. Para tal pesquisa foram utilizados ratos Winstar machos (Ratus norvegicus) 180 a 220g com 4 semanas de vida, provenientes do Biotrio Central da Universidade Federal do Cear (UFC) e mantidos no Centro de Aclimatao do Instituto Superior de Cincias Biomdicas da Universidade Estadual do Cear, com ciclo de 12h claro por 12h escuro, acesso ad libitum a gua e rao e temperatura de 24 2C.

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4.3 Amostra

A amostra foi composta por 6 animais divididos em 2 grupos: Grupo Imobilizado n=3 (GI), Grupo Controle n=3 (GC).

4.4 Tratamento

O tratamento de imobilizao foi baseada em (SANTOS-JUNIOR, 2010), que utilizou esparadrapo imobilizando uma pata de cada animal. Essa imobilizao manteve a articulao do joelho em extenso e o tornozelo em flexo plantar por um perodo de 15 dias. importante relatar que o acesso gua e rao dos animais imobilizados no foram prejudicados. O GC no recebeu imobilizao na pata.

4.5 Sacrifcio

Aps 15 dias consecutivos de imobilizao os animais foram anestesiados com Cetamina (60mg/Kg) e Xilasina (8mg/Kg) e perfundidos com soluo salina primeiramente e posteriormente com paraformaldeido (PFA) 4%.

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4.6 Processamento do Tecido

Aps a perfuso o nervo isquitico foi dissecado e retirado, aproximadamente 1cm de tecido da poro distal, sendo imediatamente imersa na soluo Karnovsky modificada, composta por 2% de PFA, 2,5% de Glutaraldeido em tampo Cacodilato de Sdio (Caco) 0,1M pH 7,4, durante 3h em temperatura ambiente. Posteriormente o material foi lavado, trs vezes, em Caco durante 5 minutos cada lavagem. Na Ps-fixao o tecido foi imerso em Tetrxido de smio 1% junto com Ferricianeto de K+ClCa 5mM, durante uma hora em ambiente escuro. Aps essa etapa o material foi lavado com dois banhos de Caco 0,1M e dois banhos de gua, cinco minutos cada. A contrastao foi feita in bloc(antes do corte) com Acetato de Uranila no mnimo duas horas em ambiente escuro. Aps a contrastao do material, o mesmo foi lavado trs vezes em gua destilada e foi desidratado em banhos de acetona 30%, 50%, 70%, 90%, trinta minutos em cada e 100% trs banhos de dez minutos cada. Aps a desidratao o tecido foi imerso em uma soluo contendo acetona e resina Spurr-s inicialmente em uma proporo de 2 medidas de acetona para 1 de resina, durante seis horas no mnimo, depois, 1:1, 1:2 e finalmente resina pura com a tampa do ependof aberta para eliminar qualquer vestgio de acetona, permanecendo somente resina. Durante o processo para emblocar teve-se o cuidado de posicionar o material para a obteno de cortes transversais do nervo, assim o material emblocado permaneceu 72h na estufa a 65 para a polimerizao da resina. C Ocorrendo a polimerizao da resina, foi retirado o excesso de resina com gilete apresentando o formato de pirmide. O bloco estando piramidado foi encaminhado para o corte semi-fino (3m) em navalha de vidro e posterior corte em navalha de diamante com

31 espessura de 70nm, o qual colocado em telinhas de cobre pr tratadas em cido clordrico (HCl) 1M, H2O e Etanol. Aps a colocao dos cortes nas telinhas, o material foi analisado no Microscpio Eletrnico de Transmisso JEOL JEM 1011.

4.7

Anlise

Em uma primeira fase foi feito uma anlise subjetiva atravs da comparao das imagens organizadas em pranchetas. Para essa comparao buscou-se organizar as imagens que apresentassem o mesmo aumento e/ou a mesma barra de calibrao. Posteriormente foi feito uma anlise objetiva, escolhendo aleatoriamente 100 axnios mielnicos do GC e 200 axnios mielnicos do GI, onde foi medido o dimetro e rea. Para essa anlise foi utilizado o software Image J.

4.8 Estatstica

Na anlise estatstica foi feito a distribuio de frequncia, normalizada pelo percentual, o dimetro mdio e rea mdia das fibras. Considerou-se o intervalo de confiana de 95% e o teste utilizado foi o teste t pareado. Para a essa anlise utilizamos o Software Graf Ped Prism 5.0

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5 Resultados

Foi observado nas fibras nervosas dos animais tratados sinais de degenerao. Na Fig 1 b notamos fragmentao da mielina (setas) e na Fig 1. c temos associado fragmentao uma deformao parcial ou total da fibra (setas). Assim, podemos classificar em dois tipos: as fibras que apresentaram a mielina fragmentada (Fig 1. b) e as que apareceram com deformao (Fig 1.c).
Figura 1 (a, b, c) a b

Figura 1. Imagens em microscopia eletrnica de transmisso, aumentos de 10000x (a) 15000x (b) e 12000 (c) As figuras acima mostram o GC (a) e GI (b, c). Barra de 2m

33 A Figura 2 mostra que as fibras com fragmentao representam a maioria, tendo seu dimetro entre 6 e 8m. J as fibras que apresentaram deformao esto com dimetro entre 5 e 6m. No apresentando diferena estatisticamente significante entre os dimetros das fibras fragmentadas e deformadas.

Figura 2. Dimetro mdio das fibras que apresentaram algum tipo de alterao morfolgica. Mdia erro padro.

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Figura 3 (d, e, f) d e

Figura 3. Imagens em microscopia eletrnica de transmisso, aumentos de 5000x (d, e) e 3000x (f) As figuras acima mostram o GC (d) e GI (.e, f). Barra de 5m.

Nas Figura 3.e e f possvel notar um agrupamento de fibras nervosas de menor dimetro prximas uma das outras (setas em verde), formato altamente sugestivo de cluster palavra da lngua inglesa utilizada na microscopia eletrnica para designar agrupameto de clulas em regenerao.

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Figura 4 Distribuio de frequncia por faixa de dimetro. Faixa de 1 a 4,9 temos as fibras nervosas de menor calibre, 5 a7,9 mdio calibre e 8 a 11 as fibras de grande calibre. Normalizado pelo percentual.

Figura 5 Distribuio de frequncia por faixa de dimetro, comparativo entre faixas, Normalizado pelo percentual.

Nas figuras 4 e 5 temos a distribuio de frequncia do GC e do GI. Na figura 4 o GC tem uma distribuio similar normal (Gaussiana), diferente da distribuio do GI. Na figura 5 observamos um aumento na faixa que vai de 1 a 4,9 de 16% no GI e uma reduo de 17% na faixa de maior dimetro no GI.

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Figura 6. rea mdia das fibras do nervo isquitico. Teste t pareado. Asterisco igual a p 0,001

Analisando a rea mdia das fibras podemos observar que os animais que foram submetidos a tratamento apresentam uma menor rea mdia das fibras. Comparando com o GC apresenta diferena estatstica significante.

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6 Discusso
A existncia do homem at os dias atuais se reporta aos incansveis processos adaptativos sofridos desde os nossos ancestrais, onde suas preocupaes giravam em torno do cassar, pescar, coletar e abrigar-se em local seguro, esses eram comportamentos essenciais para a sobrevivncia. No s proporcionavam a sobrevivncia da espcie como tambm serviam de estmulos para adaptaes orgnicas relevantes na posterioridade (DARWIN, 1973). Adaptaes como o aumento do dimetro da fibra muscular ou da densidade ssea no tiveram tanto destaque como as adaptaes do SN. Percebemos isso quando observamos a filogenia da mente humana: Passando do controle motor com a praxia fina, para a descoberta, manipulao e utilizao de instrumentos como a pedra bruta e pedra polida, materiais como metais, enfim, todas essas mudanas foram diretamente estimuladas pela nessecidade de sobrevivncia, culminando em processos adaptativos do SN (RIBAS, 2006). Hoje, aps o nascimento de um humano, seus tecidos sofrem incontveis processos adaptativos. Algumas j pr-progamadas em seu material gentico e outras oriundas de estmulos do meio externo (BERNE, 2004). Contudo, a adaptao fica a mercer da plasticidade do tecido estimulado. s vezes, as adaptaes so precedidas de degeneraes. Degeneraes comumente encontradas na poro distal do SNP em casos de leses (DIAS, 2000). A imobilizao proporciona adaptaes musculares e sinais de degenerao nas fibras nervosas dos animais tratados caracterizado pela fragmentao total ou parcial da fibra. As decries no que diz repeito fragmentao das fibras nervosas est bem relatada na literatura (BERNE, 2004; CORRA 2005; MURINSON, 2005; IDE, 1996;

38 LUNDBORG, 1993; GUTMANN e HOLUBAR 1950; SUNDDERLAND, 1945; SEDDON, 1972). Logo, em nosso estudo observamos uma degenarao pouco descrita na literatura no havendo compatibilidade fidedigna com as caracteristicas j bem relatadas. As principais classificaes aceitas baseiam-se principalmente em Sundderland (1945) e Seddon (1972). Seddon classifica os diversos tipos de leso de nervos perifricos como neurapraxia, axniotmese e neurotmese. Na neuropraxia h apenas um dano discreto do nervo com perda transitria da condutividade, nas suas fibras motoras e o prognstico bom. Na axniotmese tem-se uma leso em nvel axonal, mas no h dano na formao estrutural do nervo em si. E por fim, a neurotmese est ligada leso traumtica, os nervos so seccionados, rompidos ou destrudos, o prognstico ruim. Sundderland, classifica as leses de nervos perifricos em 5 graus: leses de primeiro grau h o bloqueio da conduo nervosa por um determinado perodo de tempo mantendo a integridade estrutural do nervo; na leses de segundo grau ocorrem a seco axonal completa sem a interrupo da lmina basal. A leso de terceiro grau, vista quando se observa a seco axonal e endoneural. Na leso de quarto grau, em que ocorre a seco axonal, endoneural e perineural e a de quinto grau, na qual se tem a seco axonal completa. Alves 2010, demostrou condutividade nervosa aps periodo de imobilizao, logo no pode ser classificado como neuropraxia. A classificao de axoniotimese tambem no, porque na axoniotmese tem-se uma leso a nvel axonal sem dano estrutural e no presente estudo foi observado dano na estrutura como um todo. A neurotmese est ligada a leses traumticas, fato que no faz parte da nossa metodologia. Assim a classificao de Seddon no se adequa ao nosso estudo.

39 Os 5 graus da classificao de Sundderland fazem referncia a classificao de Seddon, onde o grau I corresponde a neuropraxia, os graus II, III e IV correspondem a axoniotmese e o grau V corresponde a neurotmese. A maioria das leses nervosas, referentes a essas classsificaes, so presentes em estudos onde ocorrem doenas neuro-degenerativas e/ou leses mecnicas. Assim, temos um padro de degenerao carente de estudos. Esse padro caracterizado por fissuras na mielina sem alterao axonal, tal fissura ora parcial ora total podendo haver os dois tipos na mesma fibra. Alm das fissuras mielnicas temos em algumas imagens desintegrao total da fibra, onde uma nica fibra apresenta-se em pedaos. E como visto por Alves (2010) a condutividade presente. A fragmentao observada em nosso estudo foi dividida em dois grupos, o primeiro estaria associada a uma deformao parcial (Fig 1 b) e o segundo seria a desintegrao total da fibras (Fig 1 c). Essa degenerao neural foi observada em uma faixa de 5 a 8m de dimetro, sendo, possivelmente, um processo degenerativo em fase inicial, na respectiva faixa, pois muitos axnios selecionados para serem analisados, no foram, por conta da morfologia invivel para essa anlise (Fig 2). Assim, esses axnios analisados que apresentavam algum grau de degenerao no esto sendo utilizados para suas funes. Alves (2010) ao analizar, a nvel eletrofisiolgico, o nervo isquitico de ratos submetidos a imobilizao de pata, relata algumas mudanas, como a diminuio no padro de utilizao das fibras que formam a primeira componente do potencial de ao composto esto bem evidentes. Vale ressaltar que nosso dados esto coerentes com os achados de Alves (2010) e ambos corroboram com dados disponveis na literatura. Esses dados da literatura j mostravam que periodos de imobilizao promovem mudanas no complexo nervo-msculo, mas eles mediram e

40 avaliaram parmetros diferentes da funo neural (APPELL 1990, COUTINHO 2004, FERREIRA 2004, BOOTH 1982). A hiptese de leso nervosa, ao invs da hiptese de adaptao, poderia ser cogitada nessas circustncias, no entanto, essa hiptese anulada pelo surgimento de clusters, em concomitncia com a desintegrao (Fig. 3 e) (setas vermelhas). Sendo assim, a degenerao se justifica pela necessidade de novo padro funcional do membro imobilizado e no por uma leso ocorrida durante o processo fsico de imobilizao. O novo padro funcional supra citado, refere-se principalmente as inmeras alteraes ocorridas na musculatura esqueltica (APPELL 1990). A distribuio Gaussiana apresentada na Fig. 4 GC j era esperado para o GC e Mazzerm (2006) confirma que os animais que no so submetidos a tratamento tendem a manter uma distribuio normal das fibras nervosas, diferentemente dos tratados. J no GI Fig. 5 fica claro uma redistribuio dos dimetros das fibras no GI onde apresentou uma reduo de 17% na faixa de maior dimetro. Ao se comparar o traado eletrofisiolgico dos animais submetidos a imobilizao (Fig. B de ALVES 2010) com a distribuio de frequncia apenas no GI (Fig 5.1 desta dissertao), observamos uma compatibilidade. A primeira componente, dotada principalmente de fibras com maior dimetro apresentou diminuio. E em nossos achados, observamos reduo nas fibras com essas caractersticas.

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Figura 5.1 Distribuio de frequncia apenas do GI, por faixa de dimetro. Faixa de 1 a 4,9 temos as fibras nervosas de menor calibre, 5 a7,9 mdio calibre e 8 a 11 as fibras de grande calibre. Normalizado pelo percentual.

Figura A Traado eletrofisiolgico do potencial de ao composto do nervo isquitico do GC.(A). Essa figura foi retirada do trabalho de ALVES 2010.

Figura B Traado eletrofisiolgico do potencial de ao composto do nervo isquitico do GI.(B). Essa figura foi retirada do trabalho de ALVES 2010.

encial de ao composto de ALVES, 2010.

42 Ainda no comparativo entre a Fig. B (ALVES, 2010) com a Fig. 5.1. percebemos tambm uma corroborao dos resultados da segunda componente da Fig. B (ALVES, 2010) com o aumento de 16% na faixa de menor dimetro da Fig. 5.1. para esses resultados trs fatores foram fundamentais: o primeiro est no surgimento de clusters os quais provocam um aumento na quantidade de fibras que compem a segunda componente. O segundo fator a possvel reduo da bainha de mielina proporcionando uma mudana na faixa de distribuio. E por fim, diminuio da rea mdia das fibras dos animais tratados, que apresentou resultado estatisticamente menor que o GC. A segunda componente do potencial de ao composto, dotada principalmente de fibras sensitivas (BERNE, 2004). Assim, observamos um aumento da quantidade de fibras sensitivas e uma possvel reduo do limiar dessas fibras, caracterizando assim mudanas eletrofisiolgicas (ALVES, 2010) e morfolgicas em busca de um novo ponto de homeostase. Todas essas alteraes nervosas mantm uma relao direta com a musculatura esqueltica. Segundo Falempin (1998) um provvel gatilho inicial para as mudanas posterior imobilizao a alterao do grau da atividade neural sobre o tecido muscular. Para Seki (2001a, 2001b) a mudana na estrutura proteca da musculatura esqueltica analizada aps trs semanas de imobilizao articular, tm estreita relao com as modificaes na modulao do limiar dos motoneurnios do referido msculo. Sugere-se ainda que estas alteraes nos motoneurnios devam ter incio muito antes do final de trs semanas de imobilizao. Lima (2007) observou que apenas sete dias de imobilizao foi o suficiente para promover importantes adaptaes de sarcmero e alteraes na morfometria e mecnica da musculatura esqueltica de ratos. E na mesma linha de curtos perodos de imobilizao Chingui (2008), estudando alteraes qumicas e metablicas, mostrou que ocorrem mudanas a nvel muscular como o contedo de glicognio, o percentual de hidratao do

43 msculo, a concentrao de DNA, a concentrao de protenas totais e o peso muscular. Essas mudanas foram observadas at o terceiro dia de imobilizao ficando evidente que apenas um dia possvel observar alteraes meteblicas. Tendo em vista que houve degenerao e regenerao em resposta mera imobilizao, sem acometimento simultneo de outra patologia, e dada a rapidez das alteraes musculares na ausncia de movimentao, acredita-se que a imobilizao, ao provocar adaptaes no tecido muscular esqueltico gera novas demandas nervosa. Assim, de forma aferente, a plasticidade neural possivelmente provocou modificaes morfolgicas nas fibras do nervo isquitico, atendendo a nova demanda. Assim temos duas linhas de processos que foram evidenciadas nesse trabalho. A primeira est intimamente ligada degenerao e a outra se reporta regenerao. Sugere-se que a juno dessas duas linhas culminou na adaptao. Como adaptao definida literalmente como Processo que permite torna-se mais apto a sobreviver no ambiente (AURLIO, 2008), no presente caso resta demonstrar os componentes adaptativos do processo. Assim, os achados supracitados so sugestivos de plasticidade neural com brotamento colateral, uma adaptao neural ao novo padro funcional.

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7 CONCLUSO

Com esse trabalho foi possvel concluir que a imobilizao foi suficiente para que o tecido nervoso perifrico sofresse alteraes. Concluiu-se tambm que, como houve, em resposta imobilizao, degenerao e regenerao com caracterstica de cluster axonal, um processo de reparao, o processo como um todo pode ser caracterizado como um processo adaptivo, de plasticidade neuronal, portanto. Concluiu-se ainda que o perodo de imobilizao relativamente curto ao qual os animais foram submetidos foi o suficiente para que o tecido nervoso perifrico sofresse adaptaes, diminuindo a quantidade de fibras com maior dimetro e aumentando as fibras com menor dimetro.

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50 ANEXO ANEXO A-

Limb immobilization alters functional electrophysiological parameters of sciatic nerve


J.S.M. Alves1, J.H. Leal-Cardoso1, P.S. Carlos1, C. M. Lucci, S. N. Bo 3, V.M. Ceccato1and R. Barbosa2 1 Instituto Superior de Cincias Biomdicas, Universidade Estadual do Cear, Fortaleza, CE, Brasil 2 Mestrado em Bioprospeco Molecular, Universidade Regional do Cariri, Crato, CE, Brasil
3

Instituto de cincias Biolgicas, Universidade de Braslia, Braslia, DF, Brasil

Key words: Immobilization; Sciatic nerve; Compound action potential; Conduction velocity; Rheobase; Chronaxy. Acknowledgments We are thankful to Doctor Daniel Weinreich for the orthographic revision. Research supported by CNPq, CAPES and FUNCAP. Address for correspondence: J.H. Leal-Cardoso Instituto Superior de Cincias Biomdicas Universidade Estadual do Cear Av. Paranjana, 1700 Campus Itaperi 60740-000 Fortaleza, CE, Brasil Tel: +55-85-3101-9810 E-mail: lealcard@yahoo.com

51 Abstract Immobilization used in clinical practice to treat orthopedic and traumatological problems, cause changes in muscle but it is not known whether changes also occur in nerve. We therefore investigated the effects of immobilization on excitability and compound action potential (CAP) of the rat sciatic nerve. Fourteen days after immobilizations of the right leg of adult Wistar rats, rats were euthanized and right sciatic nerves were dissected, mounted in a moist chamber. Nerves were stimulated at a baseline frequency of 0.2 Hz and, tested for 2 min periods with at 20, 50 and 100 Hz. Immobilization significantly altered nerve excitability: rheobase and chronaxy changed from 3.13 0.05 V and 52.31 1.95 s (N = 15), respectively, (controls) to 2.84 0.06 V and 59.71 2.79 s (N = 13). Immobilization decreased the amplitude of first CAP wave (from 7.03 0.50 mV (control) to 4.92 0.49 mV) but increased second CAP wave (from 3.15 0.52 mV (control) to 4.87 0.51 mV (N = 15)). Immobilization also changed the conduction velocity of the first CAP wave (from 93.63 7.49 m/s (control) to 79.14 5.59 m/s) but not the conduction velocity of the second CAP wave. Increases in frequency of stimulation caused a decrease in CAP amplitudes but immobilization did not change the frequency-induced amplitude depression for the first and second wave. At the electron microscopy inspection, the morphological structure of sciatic nerves of immobilized limbs showed an axonal degeneration. This alteration was predominantly a defragmentation of the myelin sheet and loss of integrity of the respective axon. In conclusion, here we have demonstrated that long-lasting leg immobilizations can induce alterations in nerve function.

Key words: Immobilization; Sciatic nerve; Compound action potential; Conduction velocity; Rheobase; Chronaxy.

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Introduction Peripheral nerves are frequent targets of traumatic injuries, such as crushing, compression, stretching, avulsion and partial or full section, resulting in impaired nerve impulse transmission and reduction or loss of sensation and motor function in the innervated area. The magnitude of changes to the nerve function depends upon the nature of the injury, timing, type and diameter of the affected nerve fibers (1,2). Traumatic injuries lead to partial or total disability of memberlimb that removes the patient from their usual activities for long periods of time (3). As a part of the healing process neuromuscular plasticity develops. As an important component of the neural basis of control of movement, plasticity also occurs as a result of alterations of functional use of neuromuscular body components, within the normal range of function (3). Traumatic injuries and their treatments can frequently lead to long lasting limb immobilization. Since the control of movement and associated neuromuscular plasticity depends on the continued response of the nervous system activity, neuromuscular plasticity is expected to occur with simple immobilization. Indeed, it is already documented that long lasting body immobilization causes skeletal muscle atrophy (4,5) and it would be predicted that functional alterations to nerve are likely to occur. It is also known that innervations is critical for the functional and structural integrity of muscle (6,7), with nerve function degeneration causing loss of muscle weight and ability to generate muscle force (8,9). Thus, since simple immobilization may cause a negative plasticity in nerve, it is important to elucidate whether functional alterations occur in nerve as a result of simple immobilization. If they do occur, it is important to elucidate the underlying mechanism in order to understand the contribution of negative plasticity on nerve due to immobilization in traumatic injury healing process.

53 Few studies exist in the literature that assesses immobilization-induced alteration of physiological and morphological parameters of the sciatic nerve. Since long lasting limb immobilization is frequent in clinical practice, the objective of the present study was to elucidate whether immobilization induces alterations of electrophysiological parameters related to excitability of peripheral nerves and the mechanism. In the present work, we examined whether immobilization of the right hind paw of the rat for 14 days would alter electrophysiological and morphological properties of the sciatic nerve. We found that this experimental condition alters the excitability of this nerve as demonstrated by modifications of rheobase, chronaxie and various parameters of the compound nerve action potential and induces axonal and myelin sheet degeneration (CAP).

Materials and methods

Dissection, tissue preparation and immobilization protocol Male Wistar rats (Rattusnorvegicus, 180-200g) were used. All animals were in compliance with the Guide for Care and Use of Laboratory Animals, published by U.S. National Institutes of Health (NIH publication 27-89, revised 1996; http://www.nap.edu) to minimize the suffering. All procedures described here were analyzed, and received the approval of the Ethics Committee for Animal Use at the State University of Ceara, project number n 08351783-9. Immobilization was performed using the method described by Santos-Junior et al., 2010 (10). Briefly, the rats were first anesthetized with ketamine 60 mg/kg and xylazine 8 mg/kg of body weight intraperitoneally. A control group received no immobilization and another group underwent immobilization of right hind leg (immobilized group) using

54 waterproof tap wrapped around the pelvis, hip, knee and ankle in order to achieve full leg immobilization. At the end of treatment (14 days immobilization), the rats were sacrificed by cerebral concussion and the right sciatic nerve (SN) was dissected. The tissues were then immediately placed in Petri dishes containing refrigerated Locke solution. Afterwards, nerves were mounted in a moist chamber and used the same day of dissection for recording of compound action potential. Petri dish and moist chamber contained modified Lockes solution, whose composition was (in mM): NaCl 140, KCl 5.6, MgCl2 1.2, CaCl 2.2, Tris (hydroxymethyl-aminomethane) 10 and glucose 10. The pH of the Locke solution was 7.4. The experiments were performed at room temperature (18-22 C), and all salts were purchased from the Sigma Chemical (St. Louis, MO, USA) or Reagen (Rio de Janeiro, Brazil) and were of analytical grade.

Electrophysiological recording The sciatic nerve (SN) was stimulated and evoked CAP was recorded as described by Lima-Accioly et al. (2006) (11). Briefly, the SN was mounted in a moist chamber and one of its ends was stimulated with electrical pulses at a frequency of 0.2 Hz (baseline frequency). A 100 s, 40 V pulse was delivered by a stimulus isolation unit (Model

SIU4678, Grass Instruments Co., Quincy, MA, USA) connected to a stimulator (Model S48, Grass Instruments Co., Quincy, MA, EUA). Evoked CAPs were recorded with platinum electrodes placed 4-5 cm from the stimulation electrodes. The recording electrodes were connected to an oscilloscope (Model 547, Tektronix, Inc., Portland , OR, USA) through a high input impedance amplifier (model AM 01/UECE) specially configured and produced in the laboratory to meet the needs of the research. Digidata 1200 acquisition of computer hardware (Axon Instruments, Inc., Union City, USA) and AxoScope software (Axon) were

55 used for data capture and analysis. In order to measure conduction velocity of a given CAP wave we divided the distance between the stimulating and recording electrodes by the time elapsed between the initiation of the stimulus and the time when the positive peak of that wave was reached. Strength-duration curves with constant-voltage square waves were used to determine rheobase and chronaxy (12). Rheobase was measured as the threshold stimulus voltage for an active response with a long-duration pulse (1000 s) and chronaxy as the pulse-width corresponding to twice the rheobase. Nerves were first stimulated at 0.2 Hz for 120 min, a time period sufficient achieve stable recording, then the measurements of CAP parameters were done. Nerves that

showed no change in CAP amplitude during the last 30 min were included in the study. Subsequently, we recorded CAPs evoked at 20, 50 and 100 Hz. Each stimulation period lasted two min; with 5 min intervals of 0.2 Hz stimulation.

Methodology Preparation for TEM The animal was anesthetized and perfused with 4% paraformaldehyde. After perfusion the distal sciatic nerve was dissected and fixed in Karnovsky for 3h, at room temperature. Post-fixation was done with osmium tetroxide 1% during one hour in the dark.The contrast was made "in bloc" and the tissue was dehydrated in bathwith increasing acetone concentration. After dehydration the tissue was embedded in Spurr-s resin. Inorder to cut tissue slices 70nmthick, a diamond knife was used and imager visualization and analysis was done in TEM JEOL JEM 1011.

Statistics Results are presented as the mean +s.e. of mean, with (n) indicating the number of experiments. Values were analysed using Students t test, or ANOVA followed by a contrast

56 test, or a non-parametric test, as appropriate. Results were considered significant at p < 0.05.

RESULTS

Electrophysiological alterations The 14 days immobilization of right hind leg affected body weight and the mass of the right soleus and gasctrocnemius muscles. The body weight for control and immobilized groups were 370.3 7.20 g and 297.3 14.55 g, respectively. The soleus of control and immobilized groups were 0.18 0.004 g and 0.11 0.006 g, respectively. The gastrocnemius of control and immobilized groups were 2.24 0.133 g and 1.60 0.100 g, respectively. All these alterations were statistically significant (P < 0.05, for each group, unpaired Students t test, N = 15). Immobilization significantly (P < 0.05, for each group, unpaired Students t test, N = 15) increased nerve chronaxy and decreased rheobase, the electrophysiological parameters more directly related to excitability, from the control values, 52.31 1.95 s (Figure 1C) and 3.13 0.05 V (Figure 1D), respectively, to 59.71 2.79 s and 2.84 0.06 V. Since excitability was altered by immobilization, we examined whether immobilization affected the CAP. Typically, under our stimulation and recording conditions, CAPs consisted of two distinct components or waves (Figure 1A). A 3rd component wave was frequently observed at the end of the stabilization period, but often it diminished in amplitude progressively becoming indistinguishable from baseline noise during this period (Leal-Cardoso et al., 2010). In the present study, we only analyzed the first two waves of the CAP.

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We analyzed the effect of immobilization on CAP conduction velocities and amplitudes in preparations stimulated at a baseline frequency and with higher frequencies. Immobilization significantly (P<0.05) decreased the conduction velocity of the first wave (Fig. 1E, ANOVA) but had no significant affect on the conduction velocity of the second wave (Fig. 1F, ANOVA). The amplitude of the CAP waves were differentially affected by immobilization: the first component was significantly (P < 0.05, ANOVA) decreased (Fig 1G) while the amplitude of the second component was significantly enhanced (Fig 1H, ANOVA). The amplitudes and the conduction velocities of the first and second CAP waves were also analyzed for the effect of frequency (0.2 100 Hz) on the parameter value. Concerning both waves, under the same experimental condition (immobilized, for example), a tendency (without reaching statistical significance, ANOVA) to decreases in conduction velocity (Fig 1E and 1F) and amplitude (Fig 1G and 1H) with increasing frequency was observed. The size of the decreases in amplitude s and velocity of the first and second CAP components with increasing frequency (0.2 100 Hz) in control and in immobilized animals were also analyzed and depicted in Table 1. Comparing the size of the decrease in velocity with that in amplitude, for the first and second components, proportionally, with increase in frequency the size of the decrease was larger for the amplitude than for the frequency (95 % confidence interval), independent of the condition. Comparing the size of the decrease inside a given parameter for different conditions, the decrease in amplitude and conduction velocity for the first component were proportionately larger (without reaching statistical significance, however) in animals with a limb immobilized as compared to controls (Table 1). Concerning the second component, the alteration of conduction velocity with increase in frequency was proportionally the same in control and in immobilized condition; for the

58 alterations of amplitudes, the decrease in amplitudes with increase in frequency was smaller in immobilized than in controls (Table 1).

Morphological alterations

At the electron microscopy inspection, the morphological structure of sciatic nerves of immobilized limbs showed an axonal degeneration. This alteration was predominantly a defragmentation of the myelin sheet and loss of integrity of the respective axon. This degeneration inflicted predominantly the axons with the largest diameter (Fig 2). An increase in the number of small and medium size diameter axons was observed (Fig 3). A large number of these small and medium size diameter axons showed a cluster organization suggestive of regenerative process (Fig 4).

Discussion The major discovery of the present study is that immobilization causes alterations of the excitability and of the morphological structure of a peripheral nerve of the non mobilized limb. It is already reported that long last immobilization causes decrease of functional performance and atrophy of muscles of the non mobilized limb (4,5,10), but no studies were available to functional and morphological nerve parameters. Surprisingly and contradictorily to what is expected based on analogy with skeletal muscle, an stimulatory effect on a basic parameter to measure excitability, the rheobase, was found. This adds relevance to the data here presented. Not less surprising was the pattern of the axonal and myelinic degeneration, affecting predominantly the axons with the largest diameters, and of the regeneration,which was characterized by the appearance of clusters of axons with medium size diameter. To the best of our knowledge, this is the first time that this is reported.

59 In order to diminish the scars and ulcerations of the non mobilized limb we developed adaptations of the immobilization procedures (4,5,10). To assure that our method was able to promote the expected effects on muscles, we weighed the gastrocnemius and the soleus muscle. Both underwent a significant decrease in muscle mass. We also measured body weight, which was decreased. These data agree with the literature (4,5) and assure that the nerve alterations were really obtained in a situation of appropriate limb immobilization. Concerning the decrease in rheobase value, which shows an increase in excitability, it may result from alterations of several factors related to active or passive properties of the axons. It may result from leakage conductivity and membrane time constant, geometric factors and voltage-dependent sodium conductance alterations (12). Geometric factors are believed not to play a role, since all procedures related to the nerve placement and chamber preparation for recording are the same in control and experimental condition. Little can be advanced about the contribution of the other factors for this increase in excitability. One aspect of this decrease in rheobase, however, deserves consideration: it is simultaneous with an increase in chronaxy. If this rheobase diminution was caused only by primary alteration of active factors related inward Na current, without membrane time

constant modification, then a decrease in voltage threshold for firing would imply alterations in rheobase and chronaxy in the same direction, it is to say, decrease for both values in the present case. This did not occur suggesting that a primary increase in membrane time constant occurred. It is the membrane resistance or membrane capacitance which determines the membrane time constant (13,14). Therefore one of these parameters or both are likely to be altered in immobilization.It is known that axonal myelination decreases membrane capacitance (12). Electron microscopy data showed that demylination occurred and gave support to the hypothesis of a primary increase in membrane capacitance.

60 Immobilization had a depressive effect on both the amplitude and the conduction velocity of the first CAP component, yet on the second component it caused increase in amplitude and did not affect conduction velocity. It is difficult to analyze the causes of modifications of first and second component with the data available. This is because modifications in CAP component waves may result from modifications at the level of individual axons, like the dV/dt of intracellular axonal action potentials, and from action potential population parameters, like the synchronization of intracellular axonal action potentials on the nerve (15, 16). At the first interpretation of electrophysilogical data, it is tempting to conclude that lack of mobilization acted with different mechanisms in the two components, so as to promote nearly opposite effects. This hypothesis was supported by electron microscopy data. The myelin degeneration affected predominantly the axons with the largest diameter, which explains the decrease in velocity and amplitude of the first wave of the action potential. The increase in the number of small and medium size diameter axons partially due cluster organization suggestive of regenerative process (Fig 3) explains the increase in amplitude of second component without alteration of conduction velocity. Based on the velocity of conduction and on classifications of mammalian nerve fibers (22), for the two components rat CAP of sciatic nerve we suggest that the first consists of contribution of A and A/ fibers (30120 m/s) and the second component consists of A fibers (1530 m/s) (17, 18 and 19). This would lead to the conclusion that, regarding myelinated fibers, immobilization affects predominantly and depressively A and A fibers. We cannot exclude the possibility that an alternative mechanism might have contributed to the increase in second component amplitude. It is the fact that the contribution of an action potential of a given axon to any component depends on its conduction velocity. Therefore, with a decrease in conduction velocity proportionally uniform for all axons, the first component only loses contribution. The second component, however,

61 whilst likely also losing, probably wins the contribution of the axons which previously contributed to the first component with the lowest velocity of conduction and underwent further decrease in velocity. It is documented that stimulations at frequencies 50 Hz and lasting minutes cause a decrease in action potential amplitude and conduction velocity. This depressive effect has been attributed to reversible micro-alterations of the structure of the node of Ranvier (20). Since we observed degeneration at electron microscopy, we investigated whether depressive effect on CAP parameters by stimulation at high frequency was amplified. Our data here, in accordance with the literature, showed a depressive effect on CAP. The depressive effect on velocity of conduction seemed to be more pronounced on immobilization, since at 100 Hz velocity of the first and second CAP component decayed more in this condition than in control (Table 1). To the velocity of conduction, however, the sizes of the decrease at 100 Hz was larger for the first and smaller for second component. We have no explanation for that so far. In conclusion, here we have demonstrated that long lasting immobilizations have depressive effect on nerve function. The data here presented suggest various facts and raises several questions with clinical implications. This study shows that not only the muscles but, at least in rats, the nerve function deteriorates with long lasting immobilizations. This brings the question whether the same happens in humans and, if it does, how to stimulate the nerve and not only muscles to achieve good nerve preservation.

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65

TABLE AND FIGURE LEGENDS

Table 1. Comparing amplitude and velocity of the first component for control versus immobilized in different frequency. Data are reported expressed as absolute values percentage (%) 0,2 Hz compared whit 100 Hz . With 95% confidence interval for %

decrese and mean of absolute value at 0.2 Hz (n=15 per group).

Figure 1. Effect of immobilization on compound action potential (CAP) parameters. Panels show: A and B, representative CAP tracings in control (A) and immobilization (B) conditions; C and D, chronaxy (C) and rheobase (D) in control and immobilized rats. E, F, G and H panels show: velocity of conduction of first (E) and second (F) components and positive amplitude of first (G) and second components (G) of CAP at different frequencies in control and immobilized rats. Data are reported as meanS.E.M. (n=15 per group). * indicates P<0.05 ANOVA followed by Bonferroni's post-hoc test.

Figure 2 (frame 2). Immobilization-induced degeneration of myelin sheet of large diameter axons of the sciatic nerve. A, control axons; B, axons of nerve of immobilized limb of rat. The arrows in B show axons with the myelin sheet undergoing degeneration.

Figure 3-Freuquency distribution of fibers diameters. Measurement done one 130 and 120 fibers in control experimental condition respective. D,diameter; C, control; I, immobilized.

66 Figure 4 (frame 5). Regeneration of myelin sheet of axons of the sciatic nerve of immobilized limb of rat. A, control axons; B, axons of nerve of immobilized limb of rat. The arrows in B show axons with the myelin sheet undergoing regeneration. Observe the pattern of cluster for regenerating axons.

67

Figure 1.

68

fig 2: imagens degenerao

fig 3: grfico da distribuio de frequncia " em anexo PPT"

fig:4 imagens regenerao

69

Table 1. Control Group Decrease 95% Mean SEM observed at confidence of Absolute 100 Hz interval for Value at 0.2 Hz (in % of % decrease value at 0.2 Hz) (CD100)
*

Parameter

Mean * SEM of Absolute Value at 0.2 Hz

Immobilized Group Decrease 95% observed at confidence 100 Hz interval for % decrease (in % of value at 0.2 Hz) (ID100) 13.62 30.55 30.94 40.73 18.50 24.79 28.76 39.15

Diference in decrease from immobilized to control observed at 100 Hz (ID100-CD100)

Velocity 1st Component (m/s) Amplitude 1st Component (mV) Velocity 2nd Component (m/s) Amplitude 2nd Component (mV) * 13 N 15

93.63 7.49

16.94%

12.61 21.26 23.40 34.19 14.63 19.97 31.92 43.84

79.14 5.59

22.08%

5.15

6.98 0.49

28.79%

4.60 0.45

35.84%

7.04

32.46 1.55

17.30%

32.85 2.00

21.64%

4.35

3.25 0.30

37.88%

4.91 0.69

33.95%

-3.93