UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMDICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUMICO-BIOLGICAS PROGRAMA DE BIOLOGA

MANUAL DE PRCTICAS ENZIMOLOGA

MANUAL DE PRCTICAS DE ENZIMOLOGA COMPILADORES: Principal: Dra. Florinda Jimenez Vega Colaboradores: Dra. Florinda Jimenez Vega Revisado por: Academia de Biologia 2011

Ciudad Jurez, Chihuahua Universidad Autnoma de Ciudad Jurez 2009 p. 22

M. en C. Emilio Clarke Crespo Coordinador de la Academia de Biologa

D. Ph. Antonio de la Mora Covarrubias Coordinador del Programa de Biologa

Dr. Alejandro Martnez Martnez Jefe del Departamento de Ciencias Qumico-Biolgicas

M.C. Hugo Staines Orozco Director del Instituto de Ciencias Biomdicas

Aprobados por la Academia de Biologa, 2011

PRACTICA No. 1

PREPARACION DE SOLUCIONES DE CONCENTRACION DEFINIDA Y SOLUCIONES AMORTIGUADORAS (BUFFERS)

Objetivo El objetivo general de la siguiente practica es el estudiante aprenda a preparar disoluciones en concentraciones definidas en porciento, normalidad, molalidad y molaridad. Materiales NaCl NaOH HCL

Probeta Pipetas Balanza

Papel encerado Placa de agitacin Barras magnticas

Matraces volumtricos Vasos de precipitado Fosfato de Na

Procedimiento

I. Disoluciones de concentracin en peso

A)

Preparacin de 50 mL de una solucin de NaCl al 0.9% (p/v)

Pesar NaCl en la balanza Disolver los X g de NaCl en agua destilada (aprox. 30 mL) Colocar la disolucin de NaCl en un matrz volumtrico de 50 mL y aforar con agua destilada.

B) Preparacin de 50 mL de una disolucin de alcohol etlico al 70% (v/v)

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Con base a la concentracin del alcohol etlico comercial determinar el volmen necesario para tener 35 mL de alcohol etlico. Medir el alcohol en una probeta Colocar el alcohol etlico en un matrz volmetrico de 50 mL y aforar con agua destilada.

II. Disoluciones de Concentracin molar

A) Preparacin de 200 mL una disolucin de NaOH 1 M

Nota: Los cidos y los lcalis son agentes corrosivos. Extreme precauciones para su manejo, evite todo el contacto con la piel y ojos. Encontrar el peso molecular de la sustancia. Determinar los gramos requeridos de NaOH para preparar 200 mL de NaOH 1M. Pese el NaOH requerido y colocaro en un vaso de precipitado de 500 mL para su disolucin con agua destilada (aprox. 150 mL). Colocar la disolucin en un matraz volmetrico de 200 mL y aforar con agua destilada.

B) Preparacin de 100 mL de una disolucin de NaOH 25 mM a partir de la disolucin de NaOH 1M Aplicar la frmula C1 x V1 = C2 x V2 para calcular los mL de NaOH 1 M necesarios para preparar 100 mL de una disolucin de NaOH 25 mM V1= (C2 x V2)/ C1 Donde: C1= Concentracin inicial

V1= Volumen inicial C2= Concentracin final V2= Volumen final

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Medir el volmen requerido de NaOH 1M con una pipeta y colocarlos en un matrz volmetrico de 100 mL y aforar con agua destilada.

III. Disoluciones de Concentracin Normal

A) Preparacin de HCL 1N

Conocer la concentracin del HCL concentrado comercial. Calcular la cantidad de HCL conc. requerido para preparar 50 mL de HCl 1N. Colocar el agua destilada (aprox. 30 mL) en un vaso de precipitado. Con cuidado agregar poco a poco la cantidad de HCL concentrado requerido. Nota: Siempre se agrega el cido al agua nunca el agua al cido. Agitar en la placa de agitacin Colocar la disolucin en un matrz volumtrico de 50 mL y aforar con agua destilada. Disoluciones de concentracin en peso

A1)

Preparacin de 200 mL de amortiguador de fosfatos 0.2 M (pH 7.0)

Preparar las soluciones stock de fosfato monosdico y fosfato disdico (0.2 M): Disolver 27.6 g (0.2 moles) de fosfato de sodio monobsico monohidratado y aforar a un litro con agua destilada (Solucin X). Disolver 28.4 g (0.2 moles) de fosfato de sodio dibsico y aforar a un litro de con agua destilada (solucin Y). Mezclar cantidades necesarias segn la tabla para preparar 200 mL de amortiguador de fosfatos (0.2 M) pH 7.0

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Cantidades que deben mezclarse de las soluciones X y Y para obtener el pH deseado en el amortiguador de fosfatos. pH requerido 5.8 6.0 6.2 6.4 6.5 6.6 6.8 7.0 7.2 7.5

mL de X 92.0 87.7 81.5 73.5 68.5 62.5 51.0 39.0 28.0 18.0

mL de Y 8.0 12.3 19.5 26.5 31.5 37.5 49.0 61.0 72.0 84..0

Checar el pH de la disolucin resultante y ajustar si es necesario.

Resultados Desarrollar los clculos que realizaron para preparar las soluciones.

Discusin

Bibliografa

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PRACTICA No. 2 CENTRIFUGACIN

Objetivo Conocer el fundamento de la centrifugacin como tcnica bsica en la separacin y separar fracciones de extractos biolgicos variando la Fuerza de Centrifugacin (RFC). Materiales y Reactivos Tubos Eppendorf para microcentrifuga refrigerada de 1.5 mL de capacidad Tubos cnicos para centrifuga clnica de 15 mL de capacidad Tubos para ultracentrifuga de 10 mL de capacidad Pipetas de transferencia desechables

Material biolgico
Extracto de Higado de pollo Procedimiento Centrifugacin bajo condiciones constantes de muestras de diferente origen. 1. Descongelar los homogenados obtenidos por diferentes tratamientos (mortero, perlas de vidrio, sonicacin y homogenizador de tejidos POLYTRON) de higado de pollo. 2. Agitar los homogenizados y colocar 1.2 mL de muestra en tubos de microcentrifuga de 1.5 mL (preparar un tubo del mismo peso para equilibrar los tubos en la centrifuga). 3. Colocar los tubos de centrifuga (previamente marcados) en el rotor de la microcentrifuga refrigerada Eppendorf (cuidando equilibrar todos los tubos correctamente). 4. Colocar la tapa y establecer las condiciones de centrifugacin a 10,000 rpm, durante 5 minutos a 5 C.

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5. 6.

Iniciar la centrifugacin y recuparar el sobrenadante en recipientes limpios y desechar el sedimento. Determinar densidad ptica del sobrenadante a 580 nm. Centrifugacin bajo diferentes condiciones de un extracto biolgico.

1.

Colocar 3 mL de extracto de higado de pollo en tubos cnicos para centrifuga de gabinete Beckman refrigerada. Siguiendo las recomendaciones anteriores, centrifugar esta muestra a 3500 rpm, 10 min y 5C.

2.

Colocar 3 mL (1.5 mL por tubo) de de higado de pollo en tubos (2) para microcentrifuga (Eppendorf). Siguiendo las recomendaciones anteriores centrifugar esta muestra a 15,000 rpm por 10 min a 5C.

3.

Colocar 3 mL de extracto de de higado de pollo en tubos para la ultracentrifuga Beckman refrigerada. Siguiendo las recomendaciones anteriores, centrifugar esta muestra a 30,000 rpm, por 10 min a 5.

4.

Una vez centrifugados los extractos de de higado bajo las diferentes condiciones, recuperar el sobrenadante de la manera anteriormente descrita y medir su densidad ptica a 580 nm utilizando agua destilada como blanco, para calibrar el espectrofotmetro.

5. 6.

Reportar los resultados en un cuadro comparativo entre el mtodo de centrifugacin y la densidad ptica a 580 nm. Calcular las unidades de RFC gravitacionales alcanzadas para cada caso, de acuerdo al nomograma que se anexa.

Resultados Conclusiones Bibliografa

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PRACTICA No. 3

DETERMINACIN DE PROTENAS MEDIANTE LA TECNICA DE BRADFORD

Por medio de la siguiente prctica el alumno ser capaz de elaborar una curva de calibracin para cuantificar la concentracin de una protena. Materiales Reactivo de Bradford Disolver 100 mg de Coomassie B-Blue G-250 en 50 mL de etanol por agitacin con un magneto, cuando este perfectamente disuelto adicionar 100 mL de ac.fosfrico 85% y aforar a un 1Lt CUIDADO!!! (cido + agua) Filtrar con papel (Listo para ser empleado). Almacenar a temperatura ambiente. Agua Albmina Celdas para luz visible Procedimiento Elaboracin de curva patrn 1. A partir de una alcuota de protena de aproximadamente 4 mg/mL (C1), realizar las diluciones necesarias para tener alcuotas de 500 uL con las siguientes concentraciones (0.2, 0.4, 0.6, 0.8,1.0, 1.2, 1.4 mg/mL) Conc (mg/mL) C2 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Microlitros Microlitros alcuota 4 agua mg/ml V1 Volumen final 500 L V2

2. Para la cuantificacin, se realizara, cada determinacin por duplicado. 3. Marcar para cada concentracin 2 tubos
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4. Adicionar 100 L de la protena de cada una de las concentraciones conocidas 5. Incluir un par de tubos sin muestra, intercambiar por agua (ser el control) 6. Adicionar 1 mL de reactivo 7. Incubar por 5 minutos a temperatura ambiente 8. Determinar absorbancia a 595 nm 9. Graficar la concentracin de protena (mg/mL) en el eje X y lectura de absorbancia (595nm) eje Y. 10. Utilizando el programa Excel, realizar una regresin lineal de los datos y determinar la curva estndar para cuantificar. Informacin Adicional Verificar que el material empleado se encuentre perfectamente limpio ya que concentraciones muy bajas de detergentes pueden interferir en la reaccin. Sustancias compatibles con Bradford NaCl, MgCl, KCl, (NH4)2SO4, Etanol Sustancias incompatibles con Bradford: Tris 2 M, Ac. Actico, 2Mercaptoetanol 1 M, Sacarosa 1 M, Glicerol 99 %, EDTA 0.1 M, Triton X-100 0.1 %, SDS 1 %, Hemosol 0.1 %

Resultados y Discusin Bibliografa

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PRACTICA No. 4

ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES SDS-PAGE

Objetivo Conocer los principios y aplicaciones de la electroforesis.

Materiales Soluciones protecas Marcadores de peso molecular Fuente de poder Cmara de electroforesis Puntas de micropipeta Papel absorbente Soluc. Azul de Coomasie (tincin) (tabla anexa) Soluc. PAGE-SDS (Tabla anexa)

Procedimiento Preparacin del gel de corrimiento (10%) 1. La preparacin del gel de separacin se efecta de acuerdo a la tabla anexa 2. Una vez polimerizado en el portagel, lavarlo y eliminar el exceso de agua usando tiras de papel Whatman. 3. Preparar el gel de concentracin (stacking gel) de acuerdo a la tabla anexa. 4. Una vez llena la cmara, colocar el peine evitando la formacin de burbujas.
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5. Una vez polimerizado el gel, lavarlo con agua destilada y llenarlo con buffer de corrimiento (running buffer). 6. Resuspender la buffer muestra en proporcin 1:4 (si es necesario agregar ms azul de bromofenol y glicerol). 7. Colocar las muestras y marcadores de peso molecular en los carriles correspondientes. 8. Fijar las condiciones de corrimiento en 60 V hasta que entre la muestra al gel de separacin, una vez dentro, cambiar a 100-120 V (2 h) y vigilar que las muestras no salgan del gel. 9. Desprender cuidadosamente el gel de los vidrios dividir el gel. 10. Teir el gel utilizando Coomassie Blue, de acuerdo al protocolo anexo. 11. Calcular el peso molecular de las protenas problema.

Determinacin de la aparente masa molecular de las protenas 1. Mida la distancia total del principio al fin del gel de corrido 2. Mida la distancia del origen a cada uno de los estndares de peso molecular 3. Mida la distancia de la protena desconocida (X) 4. Para cada banda calcula la movilidad relativa: a / total, b / total Ejemplo a = 0.5cm, total = 4.9cm. 0.5/4.9 = 0.1 5. Calcular el logaritmo del peso molecular de cada estndar 6. Hacer una grafica del log pM contra la movilidad relativa de los estndares 7. Localizar la movilidad relativa de la protena de la protena desconocida, extrapolando el log PM correspondiente y calcular el antiligaritmo.

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Log MW Movilidad

Resultados y Discusin Bibliografa

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ANEXO
Preparacin del Gel y Reactivos para la Electroforesis en Geles de SDS-Poliacrilamida (SDS-PAGE) (Laemmli)

A) Acrilamida/Bis (30% T, 2.67%C) Acrilamida 146.0 g NN 4.0 g Bismetilenacrilamida 500 mL de agua destilada. Filtrar, guardar a 4C en la obscuridad. Vida media 30 das. B) 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 Tris base 54.45 g Agua destilada 150 mL Ajustar el pH 8.8 con HCl 1.0 N. Aforar a 300 mL con agua destilada. Almacenar a 4 C C) 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 Tris base 6.0 g Agua destilada 60 mL Ajustar el pH 6.8 con HCl 1.0 N. Aforar a 100 mL con agua destilada y almacenar a 4C.

D) 10% (w/v) SDS Disolver 10 g de SDS en agua destilada, agitar suavemente y aforar a 100 mL E) 10% (w/v) Persulfato de Amonio 100 mg de sulfato de amonio. Adicionar 1 mL de agua destilada, preparar en el momento. F) Buffer de corrimiento (5x), 25 mM Tris, 192 mM Glicina, 1% de SDS, pH 8.3 Tris base 45.0 g Glicina 216 .0 g SDS 15.0 g No incluir el SDS cuando se requiera hacer corrimiento bajo condiciones nativas (PAGE).
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Aforar a 3 L con agua destilada. No ajustar el pH con acido o base. Almacenar a 4C. Calentar a 37C antes de usar en caso de precipitacin.

G) Sample Buffer Agua destilada 0.5 M Tris-HCl pH 6.8 Glicerol 10 % SDS 0.5 (w/v) azul de bromofenol en agua

4.4 mL 1.0 mL 0.8 mL 1.6 mL 0.2 mL 8.0 mL

Diluir la muestra por lo menos 1:4 con el sample buffer. *Si el gel fuese en condiciones desnaturalizantesy reductoras, se debera adicionar 0.4 mL al sample buffer de beta-mercaptoetanol y posteriormente de diluir 1:4 habra que calentar las muestras a 95 C por 4 min. *Cuando son condiciones nativas (PAGE) omitir SDS, H) Preparacin de PAGE-SDS 10% Volmenes requeridos para dos placas del sistema Mini-Gel BioRad MR Gel Separador (Separating) (10 mL) Agua destilada 1.5 M Tris-HCl pH 8.8 Acrilamida 10 % SDS Persulfato de amonio 10% Temed 4.0 mL 2.5 mL 3.3 mL 0.1 mL 0.1 mL 0.004 mL

Gel Concentrador (Stacking) (4mL) Agua destilada 0.5 M Tris-HCl pH 6.8 Acrilamida 10 % SDS Persulfato de amonio Temed 2.7 mL 0.5 mL 0.67 mL 0.04 mL 0.10 mL 0.004 mL

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Tincin de Geles de Poliacrilamida por Coomassie Blue

Soluciones Coomassie Coomassie Blue-R250 al 0.1% Disolver 0.1 g en solucin de desteido, dejar a temperatura ambiente hasta el siguiente da, agregar el agua. Filtrar siempre antes de su uso. Solucin A Solucin de fijado / desteido (Metanol 50%, Ac. Actico 10%)

Procedimiento 1. 2. 3. 4. Sumergir el gel por 10 minutos en solucin A. Teir con la solucin de Coomassie. Desteir con la solucin A hasta que se observen las bandas. Enjuagar con agua destilada.

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PRACTICA No. 5

COMPORTAMIENTO CINTICO DE LA CATALASA

Objetivo Conocer los principios sobre el funcionamiento de una enzima y su actividad cataltica

Materiales Mortero Hoja vegetal Fosfato de potasio Peroxido de Hidrgeno Celdas de cuarzo Espectrofotmetro

Procedimiento 1. Coloque una hoja en el mortero adicionando 2 mL de la solucin de fosfato de potasio 0.1 M pH 7.4 (frio). 2. Homogenizar 3. Centrifuge a 10 000 x rpm durante 5 minutos 4. Recupere la fraccin sobrenadante 5. Inicie sus mediciones 6. Calibrar con un blanco de Fosfato de potasio 7. Establecer la cintica, bajo las siguientes condiciones: 8. Concentracin de sustrato variable y enzima constante a. Concentracin de enzima variable y sustrato constante
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a) Sustrato 18.75 L 37.5 L 75 L 100 L 150 L 300 L Enzima 10 L 10 L 10 L 10 L 10 L 10 L

b) Sustrato 75 L 75 L 75 L 75 L 75 L 75 L Enzima 5 L 10 L 20 L 40 L 80 L 160 L

9. Para cada uno de los casos, se adicionar un volumen de amortiguador de fosfato de potasio constante de 875 L 10. Posteriormente se adicionar el sustrato y enzima mezclando rpidamente con ayuda de un parafilm 11. Determinar su cintica a 240 nm, Resultados y Discusin Bibliografa

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PRACTICA No. 6

CRISTALIZACIN DE LISOZIMA
Objetivo Conocer los principios para la cristalizacin de protenas puras

Materiales Placas de 24 pozos Plastilina Cubreobjetos siliconizados Aire comprimido Vaselina o silicn en grasa

Soluciones Lizosima 20mM en Acetato de sodio pH 4.6 NaCl 12% en acetato de sodio 20 mM Acetato de sodio 20 mM pH 4.0, 4.6 y 5.0

Procedimiento 1. Con ayuda de una jeringa colocar silicon en el borde de la placa, evitando derramar material dentro del vaso precipitante. 2. Realizar un screening con variaciones de la solucin precipitante conteniendo una concentracin de sales de 2, 4, 6, 8 y 10%.

Acetato de Sodio 20mM pH 4.0 + NaCl 2 % Acetato de Sodio 20mM pH 4.6 +

Acetato de Sodio 20mM pH 4.0 + NaCl 4 % Acetato de Sodio 20mM pH 4.6 +

Acetato de Sodio 20mM pH 4.0 + NaCl 6 % Acetato de Sodio 20mM pH 4.6 +

Acetato de Sodio 20mM pH 4.0 + NaCl 8 % Acetato de Sodio 20mM pH 4.6 +

Acetato de Sodio 20mM pH 4.0 + NaCl 10 % Acetato de Sodio 20mM pH 4.6 +

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NaCl 2 % Acetato de Sodio 20mM pH 5.0 + NaCl 2 %

NaCl 4 % Acetato de Sodio 20mM pH 5.0 + NaCl 4 %

NaCl 6 % Acetato de Sodio 20mM pH 5.0 + NaCl 6 %

NaCl 8 % Acetato de Sodio 20mM pH 5.0 + NaCl 8 %

NaCl 10 % Acetato de Sodio 20mM pH 5.0 + NaCl 10 %

3. Aplicar 1 mL de solucin precipitante conteniendo las concentraciones preestablecidas en cada pozo. 4. Colocar el el cubreobjetos limpio 3 gotas conteniendo 2L, 2L y 1L de la protena y adicionar 1L, 1L y 2 L de la solucin precipitante. 5. Invertir el cubreobjeto conteniendo 3 gotas de 3L cada una sobre el pozo de la placa previamente engrasado procurando que selle perfectamente. 6. Repetir todas las condiciones planeadas en el esquema. 7. Incubar a temperatura ambiente y vigilar el crecimiento de los cristales por microscopia. 8. Reportar sus observaciones 9. Describa en que consiste el mtodo de difraccin de un cristal por rayos X, en el cual usted me describa el seguimiento que debera de realizar a su muestra una vez obtenido el cristal.

Resultados y Discusin Bibliografa

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PRACTICA No. 7

PURIFICACIN DE LISOZIMA DE HUEVO BASADA EN EL CAMBIO DE FUERZA INICA EN LOS AMORTIGUADORES

Objetivo El alumno ser capaz de aplicar los conocimientos bsicos para la purificacin de enzimas con actividad biolgica. Materiales Bradford Glicina-NaOH 0.1M pH 10.0 Glicina-NaOH 0.1M pH 10.0 + NaCl 0.5M Matriz de intercambio catinico Procedimiento 1. Separar la clara del huevo 2. 3. 4. 5. Filtrarla a travs de tela para fibra cruda o gasa de poro fino (*) La clara diluirla con 200mL de amortiguador Glicina-NaOH 0.1M pH 10.0 Homogeneizar bien y filtrar nuevamente para eliminar partculas slidas (*) Pasar esta solucin a flujo lento a travs de una columna de intercambio catinico (10 a 20 mL matriz) previamente equilibrada con amortiguador Glicina-NaOH 0.1M pH 10.0 (*) 6. Lave la matriz con amortiguador Glicina-NaOH 0.1M pH 10.0. hasta que ya no se detecte concentracin de protena (*) 7. Lave la matriz con amortiguador Glicina-NaOH 0.1M pH 10.0 con NaCl 0.5M. hasta que ya no se detecte concentracin de protena (*) 8. Determine actividad contra lisozima y concentracin de protena en todas las fracciones colectadas. Resultados y Discusin Bibliografa

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PRACTICA No. 8

DETERMINACIN DE ACTIVIDAD DE LISOZIMA

Objetivo Evaluar la actividad enzimtica de la lizosima purificada en el laboratorio Materiales Micrococcus luteus Amortiguador de fosfatos 50mM pH 6.5 Espectofotmetro Procedimiento 1. 2. 3. 4. En un tubo de ensaye, adicionar 100uL de protena purificada Adicionar 1mL de solucin de M. Luteus (0.25 mg/mL) preparada en amortiguador de fosfatos Incubar a 37C por 1hora Medir absorbancia a 540 nm

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PRACTICA No. 9

USO DE LA BIOINFORMTICA PARA EL ANLISIS DE SECUENCIAS

Objetivo Aplicacin del uso de las herramientas bioinformticas accesibles en el Internet para el estudio de protenas y los genes que las codifican.

Materiales Secuencias: AAS65790, NP_003113, Q39837, BAA99079, NP_035564 Procedimiento 1. Elija 3 secuencias de las proporcionadas 2. Busque la secuencia que le fue asignada a travs de su nmero de acceso del banco de datos NCBI. 3. Asigne identidad a la secuencia. 4. Determine i. Peso molecular ii. Punto isoelctrico iii. Contenido de aminocidos iv. Mencione en que ORF se localiza v. Describa que tipo de estructura secundaria presenta 5. Determine el sitio de corte del pptido seal (si es que se presenta). 6. Seleccione 3 secuencias similares a nivel de protena y alinee por Clustal. i. Calcule el porciento de similitud entre ellas. ii. Muestre su rbol filogentico.

Resultados y Discusin Bibliografa

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