Anda di halaman 1dari 8

1

TEKNIK ISOLASI DNA BENIH TANAMAN TEH (Camellia sinensis L.)

Oleh: GATI WINDIASTIKA, SP. MP (Calon Pengawas Benih Tanaman) Balai Besar Perbenihan dan Proteksi Tanaman Perkebunan Surabaya

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan tumbuhan terdapat di dalam inti sel dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria dan kloroplast. Sehingga penyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi asalnya. DNA genome inti (nuclear DNA genome) berasal dari inti sel, DNA genom mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal dari mitokondria serta DNA genom kloroplast berasal dari kloroplast. Perbedaan diantara ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orang tua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Sehingga pada dasarnya isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai sumber (semua sel yang mempunyai inti), antara lain organ manusia (darah, rambut dan tulang); organ tanaman (semaian, daun, kotiledon, biji, akar, batang, buah, endosperm, embrio, kalus, dan pollen); dan organ hewan (darah putih, hepar, sisik, ekor). Pada individu yang sama, DNA yang diperoleh dari berbagai sumber akan memiliki jenis, jumlah dan ukuran yang sama. Pada isolasi DNA dari tanaman, kesulitan utama adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan pada beberapa tanaman kontaminasi sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat. Selain itu DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali

terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder lainnya seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid. Sehingga pada tanaman dengan kandungan polisakarida dan metabolit sekunder tinggi perlu dilakukan modifikasi pada saat ekstraksi DNA. Keberadaan polisakarida dan senyawa metabolit sekunder dalam sel tanaman sering menyulitkan dalam isolasi asam nukleat. Struktur polisakarida yang mirip dengan asam nukleat menyebabkan polisakarida dapat mengendap bersama asam nukleat. Adanya polisakarida dalam tanaman ditandai dengan kekentalan pada hasil isolasi DNA. Penambahan senyawa pereduksi seperti -mercaptoethanol dan dithiothreitol (DTT) dapat mencegah oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat. Metabolit sekunder dan polisakarida juga dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya DNA tidak sensitive oleh enzim retriksi dan dapat mengganggu proses amplifikasi DNA dengan PCR akibat penghambatan aktivitas taq polymerase. Oleh karena itu diperlukan suatu teknik isolasi DNA genom tanaman yang tepat sehingga diperoleh kualitas DNA yang baik bagi proses amplifikasi PCR. A. TAHAPAN ISOLASI DNA Ada 5 (lima) tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: 1. Isolasi jaringan Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan. 2. Pelisisan dinding dan membran sel Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan cara penggerusan (homogenasi), sentrifugasi dengan kecepatan lebih dari 10.000 rpm atau dengan menggunakan larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi. Inti sel harus dilisiskan, karena substansi gen yang diinginkan ada didalamnya. Penambahan larutan pelisis sel ini bertujuan untuk melisiskan sel yang tidak mengandung DNA agar sel yang mengandung inti sel dapat diisolasi atau dipisahkan dari komponen-komponen sel lainnya yang tidak berfungsi. 3. Pengekstraksian dalam larutan Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak. 4. Purifikasi Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstrak dari zat-zat lainnya. Pada larutan tersebut kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 65C. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur. Penambahan RNAse berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh.

5. Presipitasi Tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas.

B. KOMPONEN EKSTRAKSI DNA DAN PENGARUHNYA Pada umumnya isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan buffer ekstraksi Cetyltrimetil Ammonium Bromide (CTAB) atau Sodium Dodecyl Sulfat (SDS). Berikut ini komponen dari buffer ekstraksi yang sering digunakan untuk isolasi DNA:

Tabel 1. Komponen Ekstraksi DNA dan Pengaruhnya KOMPONEN SIFAT Bovin Serum Albumin Absorben (BSA) polyfenol Cetyltrimetil Amonnium Bromide (CTAB) Chloroform-Isoamyl Alkohol (CIA) Cyanide Dietylditiocarbamic acid (DIECA) Dietylpyrocarbonate, Bentonite, Spermine, Spermidine Ethylene Diamine Tetraacetate (EDTA) Garam (NH4+, Na+, NaOAc, NaCl, NHOAc) Inhibitor fenoloksidase Poliamin Detergen kationik PENGARUH Denaturasi enzim degradatif

Merusak membran sel, mendenaturasi protein, membentuk kompleks dengan DNA, menghambat aktivitas nuklease Ekstraksi protein Melindungi dari enzim oksidase logam berat
2+

Mengkelat Cu Melindungi dari RNAse mencegah oksidasi metabolit sekunder dengan cara mengikat senyawa fenolik. Mengkelat kation (Mg), menghambat enzim yg mengandung logam (nuklease, DNAse) Presipitasi alkohol

KOMPONEN Hidroksikuinolin, Glukosa, Cystein, merkaptoethanol, Glutation, Na S O ,


2 2 5

SIFAT Agen pereduksi

Dithiothreitol, Asam askorbat Isoamil alkohol

PENGARUH Menghambat proses oksidasi, melindungi DNA dari quinone, disulfit, peroxidase, polyphenoloksidase, mencegah pencoklatan oleh polifenolik Membantu pemisahan fase, menurunkan jumlah material kontaminan yang terikut pada fase cair dan interfase serta membantu menurunkan busa Presipitasi kompleks CTAB-DNA, sering digunakan untuk presipitasi pertama, tetapi tidak untuk tahap akhir karena cenderung mengendapkan garam dibanding ethanol Menghilangkan lipid dan pada tahap akhir ekstraksi membantu menghilangkan sisa fenol Menstabilkan inti
+

Isopropanol

Kloroform

Na/K NH pH Phenol Phenol dan kloroform (1:1) Polyvinilpirolidon (PVP),

Garam

Absorben polyfenol

Melindungi dari H Penghambat enzim degradative Pendenaturasi protein Deproteinasi lebih efektif jika digunakan 2 macam pelarut organik Mengurangi efek polifenol, quinon, tanin Mendigest protein Merusak membran sel, mendenaturasi protein, menghambat aktivitas nuklease Menjaga pH

Proteinase K Enzim Sodium Dodecyl Sulfat Detergent anionik (SDS) Tris Buffer

C. PROSEDUR ISOLASI DNA Sampel tanaman yang akan digunakan untuk proses isolasi DNA berasal dari daun tanaman teh yang terletak pada bagian kedua (Gambar 1). Sampel daun dipetik lalu dimasukkan ke dalam plastik, diberi label dan siap untuk digunakan. Sampel yang digunakan sebaiknya dalam bentuk segar. Namun, apabila kondisi tidak memungkinkan, maka dapat digunakan sampel tanaman yang telah dibekukan atau dikeringkan. Adapun tahapan isolasi DNA daun tanaman teh dengan menggunakan Dneasy Plant Mini Kit produksi Qiagen adalah sebagai berikut: 1. Helai daun muda tanaman teh dibersihkan dari tulang daun kemudian dipotongpotong dengan ukuran 1x1 cm dan ditimbang sebanyak 0,2 gram (Gambar 2).

Gambar 1. Bagian Tanaman Teh yang Digunakan Sebagai Sampel Isolasi DNA

2. Potongan daun dimasukkan dalam mortar dan ditambahkan nitrogen cair hingga seluruh daun terendam. Selanjutnya daun teh ditumbuk secepatnya hingga halus. Penumbukan dilakukan bersamaan dengan adanya nitrogen cair dalam mortar (Gambar 3). Apabila selama berlangsungnya proses penumbukan nitrogen cair habis dan daun teh masih belum halus, maka perlu ditambahkan nitrogen cair agar daun teh dapat tertumbuk halus (Gambar 4).

Gambar 2. Persiapan Sampel Daun Teh

Gambar 3. Penumbukan Sampel Daun Teh Pada Mortar dengan Penambahan Nitrogen Cair

3. Hasil tumbukan diambil setengah bagian dan dimasukkan ke dalam ependorf cup 1,5 ml yang sudah berisi 400 l buffer AP1 dengan menggunakan spatula (Gambar 5). Buffer AP1 pada ependorf cup 1,5 ml sudah disiapkan sebelum penumbukan, sehingga pada saat daun telah halus secepat mungkin dimasukkan dalam buffer untuk mencegah oksidasi akibat menguapnya nitrogen cair. Kemudian dikocok menggunakan tangan (tapping) hingga semua partikel daun tercampur merata dengan Buffer AP1.

4. Selanjutnya

ditambahkan

RNase

sebanyak

(100

mg/mL)

untuk

menghilangkan kontaminan RNA agar dihasilkan DNA bebas RNA (Gambar 6), kemudian divortex secepatnya (Gambar 7). 5. Larutan diinkubasikan pada suhu 65oC selama 10 menit, posisi ependorf cup dibolak balik atau diinvert. 6. Selanjutnya ditambahkan 130 l buffer AP2 dan dihomogenkan dengan cara insersi atau dibolak-balik, setelah itu secepatnya homogenan diinkubasikan pada pecahan es batu selama 5 menit. 7. Homogenan disentrifuse selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm hingga diperoleh supernatant (letak ependorf cup harus seimbang).

Gambar 4. Sampel Daun Teh yang Telah Gambar 5. Hasil Tumbukan Daun Teh Ditumbuk dan Siap DigunaDimasukkan Ke Dalam kan Untuk Isolasi DNA Ependorf Cup 1,5 ml

Gambar 6. Penambahan Rnase

Gambar 7. Larutan Divortex

8. Supernatan (bagian berwarna bening) diambil dengan menggunakan mikropipet secara hati-hati dan dimasukkan dalam QIA shreadder (warna ungu). 9. Supernatan - QIA Shredder disentrifuse kembali pada 13.000 rpm selama 2 menit, untuk menyaring pengotor DNA pada supernatant dengan filter QIA Shredder. Kemudian filter QIA Shredder warna ungu dibuang. 10. Selanjutnya ditambahkan buffer AP3 sebanyak 1,5 kali volume filtrat yang dihasilkan dari saringan supernatant. Misal volume filtrat yang dihasilkan dari saringan supernatant 400 l (volume awal) x 1,5 = 600 l. Jadi total volume filtrat

+ buffer AP3 = 1.000 l. Pencampuran dilakukan dengan cara pipetting (Gambar 8). 11. Kemudian diambil 600 l dari campuran (1.000 l) dan dimasukkan ke dalam tube Dneasy (warna putih) selanjutnya disentrifuse selama 1 menit dengan kecepatan 8.000 rpm. Tube DNeasy tidak akan cukup untuk menampung semua, maka dilakukan secara bertahap misalnya terlebih dahulu diambil sebanyak 600 l, kemudian ditambahkan sisanya. Selanjutnya larutan disentrifuse selama 1 menit dengan kecepatan 8.000 rpm. Perlakuan ini berfungsi agar DNA tersaring dalam filter. Filtrat dibuang karena filtrat tidak lagi mengandung DNA. Selanjutnya dimasukkan lagi sisanya dari volume total, kemudian disentrifusi pada 8.000 rpm selama 1 menit. Filtrat juga dibuang. 12. Pada tube Dneasy ditambahkan 500 l buffer AW dan disentrifusi pada 13.000 rpm selama 2 menit. Filtrat dibuang kembali dan disentrifuge lagi supaya tuntas. Buffer AW berfungsi mencuci sisa-sisa campuran cairan yang berada pada filter agar DNA benar-benar bersih. 13. Cup bagian bawah (yang berisi buffer AW dan pengotor dibuang dan diganti dengan cup baru (ependorf cup 1,5 ml) yang berfungsi sebagai penampung DNA yang akan diluruhkan dari filter. 14. Pada bagian tengah filter Dneasy (warna putih) ditambahkan 100 l buffer AE (pH: 7,6-8,5) kemudian dibiarkan selama 5 menit.

Gambar 8. Homogenasi Dengan Cara Pipetting

Gambar 9. Hasil Akhir Isolasi DNA

15. Selanjutnya larutan pada DNeasy disentrifuse pada 8.000 rpm selama 1 menit. FILTRAT YANG DIHASILKAN JANGAN DIBUANG. Buffer AE berfungsi meluruhkan DNA dari filter dan melindung DNA dari kerusakan atau degradasi. 16. Kemudian ditambahkan lagi 50 l buffer AE (pH: 7,6-8,5) pada bagian tengah filter Dneasy dan dibiarkan selama 5 menit. Selanjutnya larutan pada DNeasy disentrifuse kembali pada 8.000 rpm selama 1 menit.

17. Filtrat yang dihasilkan merupakan hasil dari isolasi DNA tanaman teh. Pemberian buffer AE secara bertahap bertujuan untuk menjamin semua DNA yang terjerap dalam filter dapat luruh ke dalam ependorf cup 1,5 ml. 18. DNA dapat disimpan pada refrigerator dengan suhu 20oC untuk jangka panjang atau siap digunakan sebagai bahan amplifikasi dalam reaksi PCR (Gambar 9).

DAFTAR PUSTAKA Arumingtyas, EL. 2011. Isolasi DNA dan RAPD. Disampaikan pada Pelatihan Analisis DNA Fingerprinting Tanaman dengan Metode RAPD Tanggal 4-6 Juli 2011. Laboratorium Sentral Ilmu Hayati Universitas Brawijaya. Malang. p.1-12. Fauziah, L. 2010. Isolasi DNA. Available on http://miss-purplepharmacy.blogspot. com/2010/01/isolasi-dna.html. Diakses tanggal 15 Februari 2012. Mustahib. 2012. Isolasi DNA metode Kitchen Preparation. Available on http:// biologi.blogsome.com/2012/02/11/isolasi-dna-metode-kitchen-preparation/. Diakses tanggal 22 Februari 2012. Qiagen. 2010. RNeasy Mini Handbook. www.qiagen.com. pp.79. Rizqy. 2011. Isolasi DNA. Available on http://duniasains-rizqy.blogspot.com/2011/ 11/isolasi-dna.html. Diakses tanggal 15 Februari 2012. Wane. 2011. Pengertian DNA dan Isolasi DNA kromosom, Isolasi DNA plasmid, Isolasi RNA Available on http://wanenoor.blogspot.com/2011/06/ pengertiandna-dan-isolasi-dna-kromosom.html. Diakses tanggal 15 Februari 2012.