UNIVERSIDAD ALAS PERUANAS

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA Y CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUMICA

ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL ACEITE ESENCIAL DE EUCALIPTO (Eucaliptus globulus Labill) SOBRE LOS PRINCIPALES PATGENOS DEL SISTEMA URINARIO

PARA OPTAR EL TTULO PROFESIONAL DE: QUMICO FARMACUTICO

PRESENTADO POR LA BACHILLER : SNCHEZ CHVEZ DAYANA ROSA

ASESOR: Mg. LVAREZ TORRES HECTOR RUBEN

LIMA PER 2012

DEDICATORIA

A Dios

Por darme salud, sabidura y fortaleza en todo momento.

A Mis Padres

Jos Luis Snchez Villarreal, Marlene Silvia Chvez Lpez Por su infinito amor y apoyo incondicional.

A Mi Hermano

Berit Josu Snchez Chvez Por formar parte importante de mi vida.

A Mi abuelita

Mercedes Villarreal Mesa Por su apoyo y confianza.

ii

AGRADECIMIENTOS

A Dios

Por darme la oportunidad de alcanzar mis Metas.

A la Universidad Alas Peruanas

Por la oportunidad de desarrollo que me brind.

A Mis Padres

Por su sacrificio y apoyo a lo largo de m vida.

A Mis Asesores y revisores

Mg Q.F Hector Ruben Alvarez Torres Mg. Karol Sosa Orellana Por su apoyo en el iii

desarrollo de la tesis.

RESUMEN

En la presente investigacin cientfica se realiza una recopilacin de estudios acerca de la actividad antibacteriana del aceite esencial del Eucalyptus globulus Labill, sobre los principales patgenos que colonizan en el tracto urinario como son: Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae y Staphylococcus aureus. Para evaluar la actividad antibacteriana del aceite esencial de eucalipto, se realiz un estudio comparativo de los resultados obtenidos en experimentos concentracin mnima bactericida de aceite esencial de eucalipto. En base a las concentraciones obtenidas en ambas investigaciones cientficas se formul una nueva concentracin alternativa de aceite esencial, la cual posee actividad bactericida y bacteriosttica sobre las bacterias antes referidas. in Vitro de dos investigaciones cientficas, obtenindose as la concentracin mnima inhibitoria y la

iv

ABSTRACT In the present research we made a compilation of studies done on the antibacterial activity of the essential oil of Eucalyptus globulus Labill, on major pathogens that colonize the urinary tract such as Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae and Staphylococcus aureus. To evaluate the antibacterial activity of the essential oil of eucalyptus, a study was conducted comparing the results of two experiments in vitro scientific research, to obtain if the minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration of essential oil of eucalyptus. Based on the concentrations in both scientific research formulated a new alternative concentration of essential oil, which has bactericidal and bacteriostatic activity on bacteria mentioned above.

NDICE

INTRODUCIN....................................................................................................vii CAPTULO I ........................................................................................................1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA........................................................................1 CAPTULO II.........................................................................................................5 MARCO TERICO.................................................................................................5 CAPTULO III......................................................................................................44 METODOLOGA DE LA INVESTIGACIN..............................................................44 CAPTULO IV......................................................................................................46 PRESENTACIN, ANLISIS E INTERPRETACIN DE RESULTADOS......................46 CONCLUSIONES.................................................................................................54 RECOMENDACIONES.........................................................................................55 Referencias Bibliogrficas:................................................................................56 ANEXOS.............................................................................................................59

vi

INTRODUCIN

El Eucalyptus globulus Labill, usualmente conocido como eucalipto comn o blanco; es la especie ms frecuentemente usada de este gnero, a nivel mundial. Aparece de forma natural en el sur de Australia, adems es cultivado en el sur de Europa y en Amrica del sur. En el Per, el ritmo de las plantaciones de eucalipto ha ido creciendo en los ltimos aos, siendo sta una especie forestal con un enorme potencial en la actualidad (lvarez et al., 2000). El eucalipto tiene glndulas que segregan aceites esenciales en sus hojas, los cuales producen su caracterstico olor y poseen componentes que pueden ser diferenciados en productos qumicos de valor teraputico. (lvarez et al., 2000) Es conocido el uso del aceite esencial para tratar enfermedades respiratorias debido a su efecto expectorante y antiinflamatorio (Gisbert 1993) sin embargo el aceite esencial de este recurso natural vegetal tambin posee propiedades antibiticas, antispticas, bactericidas y bacteriostticas sobre agentes que causan infecciones de las vas urinarias. El objetivo de la presente investigacin es compilar informacin acerca de la actividad antibacteriana del aceite esencial de Eucalyptus globulus Labill eucalipto y su accin sobre los principales patgenos del sistema urinario.

vii

CAPTULO I PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

1.1 Descripcin de la realidad problemtica.-

La infeccin del tracto urinario es una de las infecciones ms prevalentes en nuestro medio. Se estima que las infecciones urinarias son causa de aproximadamente 7 millones de visitas a los mdicos, 1 milln de visitas al departamento de emergencia y aproximadamente 100 000 hospitalizaciones al ao. Sumado a esto la prevalencia de uropatgenos resistentes a nosocomiales. 1 Es as que al presente se hace necesaria la bsqueda de nuevos agentes antibacterianos y que mejor que los recursos naturales presentes en la biodiversidad peruana, que poseen propiedades medicinales y ya han sido utilizados por los antiguos pobladores. Tal es el caso del aceite esencial de Eucalyptus globulus Labill Eucalipto; que es usado para tratar enfermedades respiratorias, sin embargo es poco conocida la actividad antibacteriana del aceite de eucalipto sobre bacterias que colonizan las vas urinarias. Es por esta razn que la presente investigacin busca indagar acerca de la actividad antibacteriana del aceite esencial de eucalipto sobre patgenos del sistema urinario. antibiticos, en pacientes con infeccin urinaria ha aumentado en los ltimos aos tanto en las adquiridas en la comunidad como en las

1.2 Delimitacin de la investigacin.-

1.2.1 Delimitacin espacial La presente investigacin se llev a cabo en la ciudad de Lima - Per.

1.2.2 Delimitacin temporal

El trabajo se realiz durante el periodo comprendido entre los meses de Julio a Octubre del 2012.

1.2.3 Delimitacin social

El trabajo est dirigido a toda la poblacin peruana y mundial que se interese por conocer sobre la actividad antimicrobiana del aceite esencial de Eucalyptus globulus Labill eucalipto y su aplicacin en enfermedades del sistema urinario.

1.3 Formulacin del problema.1.3.1 Problema Principal

El aceite esencial de Eucalyptus

globulus Labill eucalipto tiene actividad

antibacteriana sobre los principales patgenos del sistema urinario?

1.4 Objetivo de la investigacin.1.4.1 Objetivo general: Demostrar la actividad antibacteriana del aceite esencial del Eucalyptus eucalipto sobre los principales patgenos del sistema coli, Proteus mirabilis, Klebsiella, y como son: Escherichia

globulus Labill urinario,

Staphylococcus aureus.

1.4.2 Objetivos especficos:

Definir la concentracin mnima inhibitoria (CMI) y concentracin mnima

bactericida (CMB) del aceite esencial de Eucalyptus globulus Labill eucalipto sobre: Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella, y Staphylococcus aureus.

Establecer una Concentracin mnima inhibitoria Alternativa y una para cada microorganismo

Concentracin mnima bactericida Alternativa motivo del estudio.

1.5 Hiptesis de la investigacin.Hiptesis general: El aceite esencial de Eucalyptus globulus Labill. eucalipto podra tener

actividad antibacteriana sobre los principales patgenos de las vas urinarias, como son: Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella, y Staphylococcus aureus. Hiptesis especficas: El aceite de Eucalyptus globulus Labill. eucalipto tendra efecto

antibacteriano al presentar una concentracin mnima inhibitoria (CMI) y una concentracin mnima bactericida (CMB) sobre: Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella, y Staphylococcus aureus. Se conseguira establecer una concentracin mnima inhibitoria alternativa

y una concentracin mnima bactericida alternativa en base a los estudios de investigacin revisados

1.6 Justificacin e importancia de la investigacin.1.6.1 Justificacin

Uno de los problemas que actualmente enfrentan los tratamientos mdicos es la resistencia bacteriana ocasionada por el uso indiscriminado de antimicrobianos, para lo cual los productos de origen vegetal podran proporcionar una alternativa eficaz frente a este problema. Adems es necesario informar a la poblacin acerca de la capacidad antimicrobiana del aceite esencial de Eucalyptus globulus Labill eucalipto sobre los principales agentes infecciosos de las vas urinarias, de manera que perciban a este aceite como una alternativa antimicrobiana urinarias. econmica y factible para el tratamiento de patologas

1.6.2 Importancia

Como futuros profesionales farmacuticos

es nuestra obligacin dar a conocer las

bondades del aceite esencial de Eucaliptus globulus L. a la poblacin en general, de manera que estn advertidos acerca de sus propiedades antibacterianas sobre los principales patgenos de las vas urinarias, as como las precauciones que deben tener presentes en cuanto a su dosificacin y puedan hacer un uso racional y adecuado de dicho aceite para tratar las afecciones urinarias.

CAPTULO II MARCO TERICO

2.1 Antecedentes de la investigacin.-

Ttulo: Medicina tradicional en el Per: Actividad antimicrobiana in vitro de los aceites esenciales extrados de algunas plantas aromticas. Autor: Libertad Alzamora, Liliana Morales, Lourdes Armas, Gilma Fernndez. Resumen: En la presente investigacin se evalu la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales de 5 plantas usadas en la medicina tradicional peruana entre ellas el Eucaliptus globulus Labilll. El aceite esencial obtenido por destilacin por arrastre de vapor, se enfrent albicans. La determinacin de la actividad antibacteriana se evalu por el mtodo de aromatograma de Durafourd, que consiste en introducir discos con la solucin impregnada de los aceites esenciales sobre el inculo de las bacterias y medir el tamao de inhibicin de crecimiento bacteriano considerndose como actividad nula si el halo de inhibicin era menor o igual a 8 mm. Sensibilidad lmite de 9 a 14 mm, media de 15 a 19 mm y sumamente sensible si era igual o superior a 20mm. Encontrndose que el aceite de Eucalipto tiene una sensibilidad lmite sobre la muestras de Staphylococcus aureus ya que el halo de inhibicin de crecimiento del microorganismo era de 13 mm; y en el caso de Candida albicans se encontr en 14 mm. 2 Por lo descrito en el presente estudio podemos inferir que el aceite esencial de Eucalipto puede ser usado para tratar infecciones urinarias causados por Staphylococcus y tambin causadas por hongos como es el caso de la Candida albicans. a Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus y Candida

Titulo: Evaluacin de la Actividad Antibacteriana in vitro de los Extractos de Caesalpinia spinosa tara y Eucalyptus sp. eucalipto Autor: Liu B. Humberto; Lengua V., Luis Alberto; Len M., Gladis; La Torre D., Carla; Huapaya Y., Jos; Chauca, Jos. Resumen: En el presente estudio se evalu in vitro la actividad antibacteriana de extractos de Caesalpinia spinosa "tara" y Eucalyptus sp. "eucalipto" utilizando cepas bacterianas de Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Klebsiella sp. y Shigella flexneri. Se utiliz como solvente de extraccin una mezcla de alcohol-acetona (1:1) y la actividad biolgica de los extractos obtenidos se evalu mediante la tcnica de difusin en disco. Para evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos vegetales, las cepas bacterianas antes de su utilizacin fueron sembradas previamente en agar Tripticasa de Soya (24 horas antes). Luego se inocularon las cepas en tubos conteniendo 3mI de caldo Tripticasa de Soya, por 2 horas. La densidad bacteriana fue ajustada aproximadamente a 1.5 x 10 8 bacteria/mI usando el tubo N 1 de la escala de Mac Farland (0,5) Usando un hisopo estril se inocularon placas de agar Muller-Hinton con cada cepa evaluada. Simultneamente se prepararon discos de papel de filtro (Whatman 351) estriles a los cuales se les adicion 15mI de los extractos. Todas las pruebas se hicieron por duplicado. Despus, utilizando pinzas estriles se colocaron los discos en la superficie de la placa. Las placas fueron incubadas a 37 C por 22 horas. Luego de ello fueron examinadas para determinar la formacin de halos de inhibicin. El extracto de Eucalyptus sp. "eucalipto" produjo un halo de inhibicin de 10.5 mm sobre Staphylococcus aureus y un halo de 13mm sobre bacillus subtilis. 3 En base a la presente investigacin se asume que el eucalipto presenta antimicrobiana contra Staphylococcus aureus bacteria gran positiva enfermedades de las vas urinarias. actividad

que causa

2.2 Bases tericas.-

A. Infeccin Urinaria.a.1 Definicin: La infeccin urinaria, infeccin de orina, o infeccin del tracto urinario (ITU), es la existencia de grmenes patgenos en la orina por infeccin de la uretra, la vejiga, el rin o la prstata. Los sntomas que acompaan a una infeccin de orina son los que componen el sndrome miccional, teniendo en cuenta que las infecciones de orina tambin pueden ser asintomticas. Desde el punto de vista microbiolgico, cuando se detecta un crecimiento de 10.000 unidades formadoras de colonia por mililitro (ufc/ml) en una muestra de orina bien recogida, puede existir una infeccin urinaria. 4 La gravedad de la infeccin variar de acuerdo a la agresividad que ostente el microorganismo intruso y por supuesto del estado inmunolgico del husped, aunque claro tambin es plausible que el nivel de agresin de la especie exterior que invade sea tan importante que ni siquiera un buen sistema inmunolgico pueda combatirlo. Existen una enorme cantidad de infecciones que afectarn particularmente a cada parte del organismo de un ser humano, en tanto, una de las infecciones bacterianas ms comunes y por las cuales la gente ms consulta y se somete a tratamiento es la infeccin urinaria. Gran parte de las bacterias que la ocasionan vienen del intestino grueso, ingresando en la vejiga de manera ascendente tras un paso inicial por la uretra, colonizando de este modo tanto la regin uretral como la peri uretral. Si bien el aparato urinario posee determinados mecanismos propios como ser el flujo constante de orina que acta por arrastre, para combatir la accin de las bacterias que ingresan, en algunas circunstancias, las bacterias pueden vencer estas duras barreras provocando la inflamacin de la zona, la cual de acuerdo a la magnitud y localizacin que ostente se materializar en los siguientes casos clnicos: prostatitis, bacteriuria asintomtica, cistitis aguda y pielonefritis aguda. Entre las principales causas de este tipo de infeccin se cuentan algn tipo de obstruccin, tales como tumores, clculos o quistes, que dificultan el flujo normal de la 7

orina, la edad, siendo las personas mayores adultas las que ms propensas se muestran a la misma, la predisposicin gentica y la diabetes. En tanto, para una mejor deteccin y diagnstico de la misma, los mdicos solicitarn al paciente que presente la sintomatologa, que se someta a un examen que se denomina urocultivo y que consiste en la toma de una muestra de orina en condiciones especialmente estriles, siendo la mejor la orina de la maana, previa higiene de los genitales. 5

a.2 Clasificacin de las infecciones urinarias.Se clasifican segn el nivel de compromiso clnico y anatmico en: asintomtica (bacteriuria asintomtico) y sintomtica (cistitis y pielonefritis), siendo tambin denominadas como altas y bajas. 6

a.2.1 Infecciones urinarias asintomticas.Se habla de ella cuando existe la presencia de ms de 100.000 colonias de bacterias por milmetro de orina (urocultivo) en ausencia de signos y sntomas de infeccin urinaria. Las bacterias aisladas tienden a ser de baja patogenicidad y son fcilmente eliminadas por los antibiticos; sin embargo, su tratamiento puede condicionar un alto nivel de recurrencia y recolonizacin por cepas ms virulentas que, al eliminar a la flora protectora, incrementaran la oportunidad de adherencias bacterianas como evento preliminar al desarrollo de la infeccin urinaria (IU). Al adherirse las bacterias al tracto urinario se provoca la infeccin. La presencia de cepas bacterianas en la va urinaria no siempre daa el uroepitelio e incluso podran prevenir la invasin de otros grmenes, al funcionar como una forma de profilaxis natural.6

a.2.2 Infeccin urinaria sintomtica.-

Es la presencia de ms de 100.000 colonias de bacterias en 1 ml de orina asociado a sntomas de compromiso del tracto urinario bajo o alto. Es diagnosticada por cualquiera de los siguientes criterios Presencia de uno de los siguientes signos o sntomas: a) Fiebre (> 38C) b) Tenesmo c) Polaquiuria d) Disuria o dolor suprapbico e) Cultivo de orina con >= 105 UFC/mL con no ms de dos especies de organismos. f) PIURIA > 10 leucocitos/mL. g) Visualizacin de microorganismos en la tincin de Gram. h) Dos urocultivos con > 103 UFC/mL del mismo germen. Las infecciones sintomticas las podemos clasificar en dos grupos: infecciones urinarias bajas (cistitis aguda) e infecciones urinarias altas (pielonefritis aguda).

a.2.3 Cistitis.Cuando la vejiga, rgano del aparato urinario en forma de globo que sirve para almacenar y eliminar la orina producida en los riones, se inflama aparece la cistitis siendo entonces la inflamacin de la vejiga urinaria, causada casi siempre por una infeccin producida por grmenes procedentes del aparato digestivo (recto) cuando se ponen en contacto con el aparato urinario. La mayora de las veces, el cuerpo puede deshacerse de estas bacterias cuando se micciona. Sin embargo, algunas veces, las bacterias pueden adherirse a la pared de la uretra o la vejiga o multiplicarse tan rpido que algunas de ellas permanecen en la vejiga. 9

Se caracteriza por la presencia de sndrome miccional: miccin frecuente (polaquiruria), urgente y dolorosa (disuria), sensacin permanente de ganas de orinar (tenesmo) y eliminacin de una pequea cantidad de orina turbia.

a.2.4. Pielonefritis.O infeccin urinaria alta es una infeccin de las vas urinarias que ha alcanzado la pelvis renal, los clices y el parnquima renal.

B. Principales microorganismos asociados a infeccin urinaria.-

Los microorganismos implicados en la infeccin urinaria no han cambiado de forma significativa en los ltimas dos dcadas, permaneciendo la E. Coli como el principal patgeno. Ms del 95% de las infecciones del tracto urinario son causadas por una nica especie bacteriana. Los microorganismos responsables de la infeccin urinaria sintomtica y asintomtica son los mismos. La Escherichia coli se encuentra en el 80% de los casos, seguido en frecuencia por el Proteus mirabilis (4%), Klebsiella (4%), Enterobacter (3%), Staphylococcus saprophyticus (2%) y Streptococcos del grupo B (1%). Algunas bacterias gram positivas tambin han sido asociadas con patologa del tracto urinario, aunque de forma menos frecuente, como el Staphylococcus aureus 6

b.1 Escherichia Coli.-

10

Escherichia coli es el patgeno oportunista aislado con ms frecuencia en las infecciones del tracto urinario, forma parte de la familia Enterobacteriaceae , est integrada por bacilos Gram negativos no esporulados, mviles con flagelos pertricos o inmviles, aerobios-anaerobios facultativos, capaces de crecer en agar MacConkey y en medios simples con o sin agregado de NaCl, fermentadores y oxidativos en medios con glucosa u otros carbohidratos, catalasa positivos, oxidasa negativos, reductores de nitratos a nitritos, y poseedores de una proporcin G+C de 39 a 59% en su DNA. La E. coli posee caractersticas que la hacen muy virulenta para el tracto urinario, como son la presencia de pilio fimbrias tipo I que se unen a la manosa de las clulas epiteliales y que favorece su adherencia al uroepitelio, antgeno K que protege a las bacterias de la fagocitosis por los leucocitos, hemolisina que favorece la invasin tisular y daa el epitelio tubular, la resistencia antimicrobiana a la actividad bactericida del suero y aerobactina que permite a la bacteria acumular hierro para su replicacin.7

Figura n1 Escherichia Coli. b.2 Proteus Mirabilis -

11

Proteus mirabilis es una bacteria Gram-negativa, facultativamente anaerbico. Proteus mirabilis causa el 90% de todas las infecciones por Proteus. 8 Es una bacteria rodeada de flagelos en todo su cuerpo (peritrica) por lo que es extremadamente mvil y por lo tanto capaz de diseminarse rpidamente por todo el rbol urinario. Es adems intensamente uresica, forma amonio de urea a alta velocidad, en 2 horas un inoculo de 10 UFC/ml de Proteus puede elevar el pH urinario a un valor cercano a 8.0, ello ocasiona en la va urinaria precipitacin de estruvita (fosfato amnico magnsico) y de apatita (fosfato clcico) y de ah la pronta aparicin de litiasis, que ocurre en vejiga, prstata y rin.Posee adems, fimbrias de adherencia y tiene tendencia a adherirse mejor a las clulas renales . Otros factores de virulencia son la hemolisina (la mayor parte de aislados de pielonefritis son hemolticos. La hemolisina Hpm A de Proteus factor citotxico que facilita la invasin renal de Proteus. ha sido postulada como el

. Figura n2 Proteus mirabilis Finalmente, infecciones Proteus produce En una metalo proteasa que reconoce y activa la por motivos que

inmunoglobulina A1 y A2. Por estos motivos Proteus mirabilis es ms frecuente en hospitalarias. infecciones comunitarias, desconocemos pero atribuimos a su adherencia al prepucio, es ms frecuente en lactantes varones.

12

Esta bacteria al ser sembrada en un agar para identificacin microbiana, sus colonias toman forma de ondas, que son fciles de identificar. 8 b.3. Klebsiella.Se la asla frecuentemente de materias fecales del hombre y los animales, pero tambin de aguas, vegetales y alimentos. Son bacilos Gram negativos inmviles, a menudo capsulados. La cpsula es de naturaleza polisacrida. Se trata de patgenos oportunistas, que pueden provocar diversos cuadros clnicos en el hombre: infecciones urinarias, bacteriemias, neumonas, infecciones hepatobiliares, etc. Un porcentaje elevado de aislamientos de Klebsiella, particularmente aquellos de infecciones nosocomiales, contienen plsmidos de resistencia a los antibiticos. Puede ser resistencia a betalactmicos, aminoglucsidos, etc. Klebsiella expresa su virulencia urinaria por sus fimbrias de tipo 1 .Se asume que hasta el 75% de Klebsiellas urinarias expresan esta propiedad . 7

Figura n3 Klebsiella sp. La presencia de cpsula es sin embargo, el factor ms importante de virulencia Presenta diferentes variantes qumicos del polisacrido capsular que permiten distinguir hasta 70 serotipos . De los factores de virulencia que se le atribuyen a

13

Klebsiella , el polisacrido capsular es de los ms importantes ya que impide la accin de los anticuerpos (anti-O), importante mecanismo defensivo de la infeccin urinaria por bacilos gram negativos.8 b.5Staphylococcus aureus.Las infecciones urinarias por Staphylococcus aureus son poco habituales en la poblacin general y con frecuencia son secundarias a bacteriemias originadas en focos distantes (como la endocarditis). No obstante, los pacientes con sondas permanentes pueden presentar infecciones ascendentes del tracto urinario por S. aureus. 7

Figura n aureus. C. Otros microorganismos patgenos.-

4: Staphylococcus

Los hongos son una parte de la poblacin microbiana que puede contribuir como uropatgenos fngicos en las ITU. En los ltimos decenios las IU fngicas por Candida levadura gnero ha aumentado considerablemente. La salud del tracto urinario es estril as, la presencia de levaduras del gnero Candida en la orina implica una variedad de situaciones clnicas). Candiduria se puede demostrar como IU sintomticas o asintomticas, la incidencia de las infecciones del tracto urinario causadas por levaduras es cuatro veces ms comn en mujeres que en hombres. Adems, los resultados de diferentes estudios han indicado que las IU en las mujeres son muy comunes 9

14

D. Eucalyptus globulus Labill.d.1 Clasificacin taxonmica.- 10 El Eucalyptus globulus Labill presenta la siguiente clasificacin taxonmica segn Adolph Engler modificado por Soukoup J. Reino: Vegetal Divisin: Angiospermae Clase: Dycotyledoneae Sub-clase: Archyclamideae Orden: Myrtales Familia: Myrtaceae Gnero: Eucalyptus Especie: Eucalyptus globulus Nombre cientfico: Eucalyptus globulus Labill. Nombre comn: Eucalipto blanco, Eucalipto comn o eucalipto azul

15

Figura n 5 Eucalyptus globulus L. d.2 Descripcin botnica.d.2.1Tronco: Derecho, pero poco redondo, muy grueso, hasta ms de 2m de dimetro, y con tendencia a experimentar una torsin espiral. d.2.2 Corteza: Primero de color blanquecina, plateado azulado - pruinosa, lisa, luego, de color gris o pardo griscea, lisa, que se desprende en grandes tiras longitudinales, retorcidas y deflecadas, que se mantienen colgando algn tiempo en los rboles. d.2.3 Raz: El sistema radical est constituido por una raz pivotante, que en terrenos sueltos puede alcanzar los 50 cm. de profundidad, en el primer ao ,creciendo despus ms lentamente. Las races laterales, que en un principio son poco desarrolladas, despus

16

se extienden superficialmente, a veces a grandes distancias de su fuste. En suelos poco profundos todas las races, se adaptan hacindose someras.

d.2.4 Hojas: Las hojas juveniles son opuestas, ssiles, de base cordada, de color gris-azulado, de 8-15 cm de longitud y 4-8 cm de anchura. Las adultas alternas, pecioladas, con la base cuneada, linear-lanceoladas, de 15-25 cm de longitud, con el pice acuminado. La textura es algo coricea y son de color verde oscuro, con la nerviacin marcada 11 Las hojas adultas contiene aceite esencial en una concentracin entre 1,5 - 3,5% en caso de Eucalyptus globulus. Este aceite se encuentra ubicado en los espacios o cavidades esquizgenos , los cuales se forman gracias a que las clulas se separan por disolucin de la laminilla media y por dilatacin de los espacios intercelulares. Esta secrecin es merocrina.
11

Figura N 6 Espacios o cavidades esquizogenas que contienen aceite esencial de Eucalipto.

17

Figura N 7 Imagen por Micrografa de electrones de la cavidad secretora de la hoja de Eucalipto El contenido de aceite esencial tiene un pico mximo en las hojas basales de los brotes, mientras que el contenido cineol aumenta con la edad de las hojas y alcanza su mximo en las hojas adultas de tallos ya lignificados. 12

d.2.5 Flores: Flores axilares, solitarias o en grupos de 2-3, de hasta 3 cm de dimetro, con numerosos estambres de color blanco. Florece en Septiembre-Octubre. d.2.6 Fruto: Fruto en cpsula campaniforme de color glauco y cubierta de un polvo blanquecino, de 1.4-2.4 cm de dimetro. Las semillas del eucalipto goma azul son relativamente grandes para un eucalipto. Hay entre 18 y 320 semillas por gramo de semillas y hollejo o alrededor de 460 semillas limpias por gramo. Las cpsulas liberan las semillas inmediatamente al alcanzar la madurez y las semillas son dispersadas por el viento. La distancia de dispersin calculada en base a una altura de 40 m con unos vientos de 10 km por hora, fue de solamente 20 m 3

18

d.3 Origen.Sus masas naturales, estn limitadas, a la costa meridional de Australia: en los Estados de Nueva Gales del Sur y Victoria (en las zonas ms fras, viviendo entre los 37 y los 39 de latitud), principalmente en los montes Otways y Gippsland; y costas oriental y meridional de Tasmania, entre los 41 y 43 de latitud Sur. 11 d.4 Habitad.El Eucalyptus globulus Labill viene a conformar una fuente de riqueza forestal debido a su crecimiento precoz y a su adaptacin a toda clase de suelo y clima en especial a la serrana del pas En el Per actualmente se cuenta con 536,530 hectreas de eucalipto. Se estima que existe actualmente 150,000 hectreas de estas plantaciones que estn en edad de explotacin, de las cuales 51,000 se encuentran ubicadas en Cusco, 28,000 en Apurmac y 27,000 en Junn.13 Para lograr un desarrollo ptimo requiere de: Altitud: 500-1500 m.s.n.m Rgimen de lluvias: invierno o verano Estacin seca: 3 meses no rigurosa Temperatura: Media mxima del mes ms clido: 18-23 C Media minina del mes de frio: 4-12 C

Se desarrolla en un suelo areno- arcilloso

d.5 Metodologa de colecta.El mejor momento es por la maana, antes del medioda y en da siempre soleado. Si lo hacemos muy temprano por la maana el roco puede llegar a estropear las plantas

19

debido a la humedad, factor muy desfavorable para su conservacin .Adems por la maana temprano observaremos tienen las flores cadas, en estado de letargo , no estando sus propiedades al 100 % .Tampoco es recomendable recolectarlas al medio da , especialmente con plantas aromticas ya que a esa hora el calor es excesivo y muchos de los aceites esenciales se volatilizan. Tampoco es aconsejable recolectarlas en la tarde o a la cada del sol ya que las plantas estn adormecidas quedando inhibida su actividad productora. Podemos pues resumir que la mejor hora para recolectar en general las plantas medicinales es entre las 10 y las 11 de la maana y en da soleado, hora en que encontraremos con toda probabilidad las plantas al 100%.Si recolectamos en da nublado las propiedades son menores, tardando mas en secarse y teniendo ms humedad. E.- Aceite esencial de eucalipto.e.1 Mtodos de obtencin del aceite esencial de eucalipto.Los aceites esenciales fluidos supercrticos 14 La tcnica de obtencin por arrastre de vapor se utiliza a nivel industrial debido a su alto rendimiento, la pureza del aceite obtenido y porque no requiere tecnologa sofisticada (Martnez, 2001). pueden extraerse mediante varios mtodos: expresin,

destilacin con vapor de agua, extraccin con solventes voltiles, enflorado y con

e.2 Destilacin por arrastre de vapor.Es una tcnica que sirve fundamentalmente para separar sustancias insolubles en agua y literalmente voltiles, de otros productos no voltiles mezclados con ellas. El comportamiento de la destilacin de un sistema de dos fases miscibles, donde cada lquido ejerce su propia presin de vapor y la suma de ambas es de la presin de operacin, y son independientes de las cantidades relativas de la mezcla. Estos hechos constituyen la base para la purificacin de sustancias por el arrastre de una corriente de vapor. Existen varios compuestos orgnicos de punto de ebullicin

20

relativamente alto que con agua co-destilan en una cantidad en peso lo suficientemente grande para ser destilados con cierta rapidez por debajo del punto de ebullicin del agua. Esto se debe a sus pesos moleculares relativamente elevados comparados con las del agua. 11

Figura 8. Esquema del equipo de extraccin

e.2.1 Descripcin del proceso: A continuacin se describir el proceso al que debe ser sometido la droga antes de colocarla en el aparato de destilacin. e.2.1.1 Recoleccin Las plantas destinadas a la obtencin de aceites esenciales, se recolectan en primavera, entre las 10 y 11 de la maana y en da soleado.

21

e.2.1.2. Recepcin e Inspeccin Las plantas deben ser revisadas morfolgicamente, de tal modo que no se encuentre otro tipo eucalipto. e.2.1.3. Pesado Luego de la inspeccin se pesa el material vegetal e.2.1.4. Oreado Con la finalidad de eliminar el agua presente en las plantas cortadas y as aumentar la eficiencia de la operacin de destilacin; se realiza un oreado de las mismas a la sombra, sobre catres con tejido de polipropileno, preferentemente bajo techo en lugares ventilados. Las plantas no se deben dejar en arrumes por que se generan hongos, los que transfieren un olor terroso, mohoso al aceite. e.2.1.5 Pesado 2 Luego del oreado se pesa la matera prima para calcular el rendimiento de extraccin y prdida de agua con el oreado. e.2.1.6. Destilacin Se introduce en el destilador la cantidad requerida de material vegetal teniendo la precaucin de que el material no quede muy suelto por que aumenta el consumo de energa, ni tampoco muy apretado por que disminuye el rendimiento del aceite. Luego se hace pasar por medio de la masa vegetal vapor de agua, que va llevando con sigo los compuestos voltiles que conforman los aceites esenciales, a la salida del sistema de destilacin se encuentra un serpentn refrigerante que hace que la mezcla de vapor de agua y aceite esencial pasen de estado gaseoso a lquido.

22

Luego de esto se encuentra un separador de las dos fracciones, y por medio de la diferencia de densidad, estas se separan en el hidrolato y el aceite esencial. Con este procedimiento se obtienen lo que se conoce como aceite esencial crudo.

e.2.5. Refinamiento Para limpiar el aceite de impurezas se vierte el destilado poco a poco, utilizando un embudo provisto de filtro de papel. Cuando el producto obtenido no rene toda la finura requerida, es necesario refinar o depurar el aceite. Para ello hay que redestilar el producto al vaco utilizando lcali para eliminar aldehdos y alcohol de baja concentracin para eliminar terpenos, compuestos que le otorgan olor o sabor desagradable al aceite esencial. Este proceso a la vez concentra el contenido de componentes importantes como el mentol y el cineol. Bruneton J. menciona que con el refinamiento del aceite esencial de eucalipto, el contenido de limoneno y p-cimeno pueden doblarse; y el aromadendreno, el globulol, el transpinocarveol y aldehdos desaparecen en los aceites rectificados, perdindose un 6% del aceite crudo. Las fracciones eliminadas pueden ser vendidas a otras industrias que consumen estos productos.
11

e.3. Mtodos Fundamentales de Anlisis de Aceites Esenciales 11 e.3.1. Determinaciones Fsicas Aspecto Color Olor ndice de refraccin Desviacin ptica (poder rotatorio)

23

Solubilidad en mezclas alcohol-agua (alcoholes rebajados)

e.3.2. Determinaciones Qumicas ndices de saponificacin : 8.9 - 20 ndice de yodo: menor a 0,7 Tcnicas cromatografas: cromatografa liquida TLC, cromatografa Lquida de alta resolucin HPLC Mtodos espectroscpicos: ultravioleta UV,infrarojo IR, cromatografa de gases asociado a masas GC-MS E.2 Composicin Fisicoqumica del Aceite. Formula: C10H18O Peso molecular: 154.24 g/mol Densidad: 0.910 0.93 g/ml Solubilidad en agua: insoluble Solubilidad en etanol: 1:8 a 20C Temperatura de ebullicin aproximada: 177C Color: amarillo claro Olor: penetrante Rotacin ptica: +5 a -9 ndice de refraccin: 1.463- 1.466

24

E.3 Composicin qumica.a) 1,8 cineol (eucaliptol) Es el constituyente principal del aceite esencial, con una proporcin de 70 - 95%. El eucaliptol (1,8 - Cineol), es un aceite blanco, olor, alcanforado, monoterpenoide monociclico, peso molecular 154, densidad 0.921-0.923, ebulle a 176 C, ndice de refraccin 1.456, insoluble en agua, soluble en alcohol, cloroformo, ter; es irritante, expectorante, antisptico y antibitico contra, E. coli y S. aureus 15

Figura n 9 Estructura del 1,8 cineol

25

Figura n10 Estructura tridimensional de 1,8 cineol

b) Pineno: Es un terpeno, de dos ismeros de pineno. Se encuentra aproximadamente 7.16 % de pineno en el aceite esencial de la hoja de Eucalyptus globulus Labill y 1.10 % de b-pineno. El -pineno es lquido, punto de ebullicin 155C, densidad 0.8592, ndice de refraccin 1.4664, insoluble en agua, soluble en alcohol, cloroformo.15

Figura n11 Estructura de - Pineno:

c) Terpinenos: Los terpinenos son un grupo de ismeros de hidrocarburos que se clasifican como terpenos.El aceite de eucalipto contiene aproximadamente 0.11 % de -Terpineno y 1.16 % de -Terpineno

26

Figura n12 Estructura de ismeros de terpineno d) -Terpinol: Se encuentra en una concentracin aproximada de 0.14%

Figura n13 Estructura de -Terpinol

e) Mirceno: Mirceno o -mirceno, es un compuesto orgnico oleofnico natural. Se clasifica como un hidrocarburo, pero con ms precisin como un monoterpeno .Se encuentra en una concentracin de 1,25%

27

Figura n14 Estructura de Mirceno

f) Butiraldehido: Sustancia oxigenada 16

CH3-CH2-CH2-CHO
Figura n15 Estructura de Butiraldehido

g) Valeraldehido: Sustancia oxigenada 16

CH -CH -CH -CH -CHO 3 2 2 2

Figura n16 Estructura de Valeraldehido

28

Las principales exigencias en el mercado medicinal son un elevado contenido de cineol y la ausencia de cantidades apreciables de felandreno y aldehdos.9

E.4.-Propiedades atribuidas al aceite esencial. Entre las propiedades del aceite de Eucalipto se encuentran: Analgsico, antirreumtico, antiinflamatorio, antisptico, antiespasmdico, antiviral, bactericida, cicatrizante, descongestivo, desodorante, depurativo, diurtico, expectorante, febrfugo, hipoglucmico, insecticida, rubefaciente, estimulante y vermfugo.17 Particularmente eficaz con la gripe, infecciones de garganta, tos, condiciones catarrales, sinusitis, asma y tuberculosis. El aceite esencial podra ser antisptico respiratorio, antihelmntico, balsmico, expectorante e hipoglicmico. Puede menguar los efectos dolorosos de las migraas y se dice que es til en el tratamiento de la escarlatina, la disentera, las fiebres tifoideas, la difteria y la malaria, as como con la varicela. Acta bien en el sistema genito-urinario; til con problemas tales como cistitis y la diarrea. Parece disolver los clculos biliares, y se ha empleado en el tratamiento de la nefritis, la gonorrea y la diabetes. Se dice que es eficaz contra las hemorragias. Puede causar algn alivio al reumatismo, y se ha afirmado su eficiencia a este efecto en combinacin con limn y junpero. Es posible que tambin resulte til en trastornos y molestias musculares de carcter general y con las neuralgias (dolores nerviosos), as como con la piorrea. Aparentemente til en erupciones cono el herpes y eficaz con las quemaduras, se dice que previene el desarrollo bacteriano y la subsiguiente formacin de pus, contribuyendo a la formacin de un nuevo tejido. Tambin parece obrar bien ante cortes, heridas, ulceras y condiciones inflamatorias

29

Parece disolver los clculos biliares, y se ha empleado en el tratamiento de la nefritis, la gonorrea y la diabetes. Se dice que es eficaz contra las hemorragias. Puede causar algn alivio al reumatismo, y se ha afirmado su eficiencia a este efecto en combinacin con limn y junpero. 17

e.5 Actividad antibacteriana.Se ha postulado que la actividad antibacteriana se debe a que en el interior de la clula microbiana, el aceite esencial oxida gradualmente el oxgeno proveniente del medio ambiente, producindose metabolitos txicos tales como el in superxido y el perxido de hidrgeno los cuales desnaturalizan la membrana citoplasmtica, aminocidos y protenas causando letalidad de los microorganismos (Villar, 1999 y Fife et al, 1998). El 1,8 cineol es capaz de inducir la produccin de compuestos txicos de O2 acta sobre la membrana citoplasmtica, especficamente a nivel de la coenzima a, uniendo los grupos sulfidrilos libres entre coenzimas formando enlaces disulfuros, que impiden su normal funcionamiento en los procesos de xido reduccin y en la produccin de energa requerida para el transporte activo de nutrientes hacia el interior de la clula (Valsecia, 1999) 18

F. Mtodos para determinar la actividad antibacteriana

La actividad de los antimicrobianos (antibiticos y quimioterpicos) debe ser evaluada in vitro para obtener la informacin que permitir decir si un microorganismo es susceptible o resistente a determinado producto.

Dos son los procedimientos empleados para conocer sta informacin, el mtodo del tubo dilucin y el del disco difusin en agar, a ste ltimo se le denomina: antibiograma.

30

La actividad antimicrobiana in vitro determina a. La potencia de un agente antibacteriano en solucin b. Su concentracin en los lquidos del cuerpo o en los tejidos c. La sensibilidad de un microorganismo a concentraciones conocidas del medicamento 19

F.1 Medicin de la actividad antimicrobiana Esta se determina mediante los mtodos de dilucin o difusin, utilizando un microorganismo estndar y una cantidad conocida del antimicrobiano. Para ello se utilizan las pruebas de dilucin en tubos y el mtodo de difusin. Prueba de dilucin: En ste ensayo se incorporan cantidades conocidas de antimicrobianos en medios lquidos, se inoculan despus con las bacterias en prueba y se incuban. El punto final se toma cuando la cantidad de sustancias antimicrobiana es capaz de inhibir el crecimiento o de matar a las bacterias en prueba. Se obtiene un resultado cuantitativo, destacando dos caractersticas importantes: La Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) que se define como la mnima concentracin de antimicrobiano (en g/mL) que inhibe el crecimiento visible de un microorganismo despus de 24 horas de incubacin a 37C. La CMI se ha establecido como "gold Standard" frente a otros mtodos que evalan susceptibilidad antimicrobiana; adems de confirmar resistencias inusuales, da respuestas definitivas cuando el resultado obtenido por otros mtodos es indeterminado.

31

- La Concentracin Mnima Bactericida (CMB), se define como la mnima concentracin de antimicrobiano que elimina a ms del 99,9% de los microorganismos viables despus de un tiempo determinado de incubacin (generalmente 24 horas) Mtodo de difusin Preparacin del inculo. La tcnica del antibiograma slo es aplicable a especies bacterianas en cultivo puro. Por ello previamente se proceder, si es preciso, a hacer un aislamiento en placa. 19

G. Farmacologa experimental del aceite esencial de eucalipto.-

G.1 Estudio de la Universidad Catlica de Santa Mara- 2005: 10 Un estudio llevado a cabo en la universidad Catlica de Santa Mara, evalu el efecto in vitro del Eucalyptus globulus Labill (eucalipto) sobre Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri ,Proteus vulgaris Pseudomona aeruginosa. Para el presente estudio se utilizaron hojas de Eucalyptus globulus Labill (eucalipto), las cuales fueron recolectadas manualmente (3.600 gramos) , a las 9 am en las tierras de cultivo de la avenida paisajista Socabaya, en el departamento de Arequipa. Luego se procedi a colocarlas en una bolsa de papel para evitar su deterioro y para una mejor conservacin, se les limpio adecuadamente para desechar impurezas; luego las hojas se trasladaron a una habitacin con buena ventilacin y temperatura ambiente sin exponerlas a la luz directa, y se procedi a colocarlas sobe un papel sin sobreponerlas, este mtodo se desarrolla hasta la sequedad completa de la hoja. El material desecado se procedi a triturar en un mortero, seguidamente se peso las hojas, para la posterior extraccin del aceite (500 gramos)

32

El material vegetal se someti al mtodo de destilacin por arrastre de vapor, obtenindose un rendimiento de 0,55 %. El aceite esencial obtenido se almaceno en frasco de vidrio mbar, para el respectivo anlisis fsico qumico. Para el anlisis microbiolgico las cepas estndar ATCC fueron: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 , Klebsiella pneumoniae 10031 ,Proteus vulgaris ATCC 13315 ,Shigella flexneri Pseudomona aeruginosa Goyeneche en la ciudad de Arequipa ATCC y ATCC 12022

ATCC 27853, las cuales se obtuvieron en el Hospital

Determinacin de la concentracin mnima inhibitoria: Se realizo por el mtodo de dilucin en caldo. En primer lugar se preparo el diluyente al 1%, para lo cual se agrego 4,950 ul de agua destilada y se les agrega 50 ul del dimetil sulfoxido (diluyente puro). A continuacin se prepara la solucin madre, utilizando como diluyente del aceite de eucalipto al dimetilsulfoxido al 1%. Se obtiene la solucin madre en una proporcin de 1:4, es decir 1 ml de aceite esencial y 4ml de diluyente al 1%, despus se enrasa con agua destilada a 10 ml en una fiola y se procede a enrasar. Se toma separadamente las colonias anteriormente incubadas en placas petri , para posteriormente ser diluidas en 5ml de caldo peptonado hasta alcanzar la turbidez equivalente a 0.5 de Mac Farland, si la turbidez es mayor se le agrega mas caldo y si la turbidez es menor se le agrega mas colonias hasta que se equivalente a la escala de Mac Farland (Tubo n5) A continuacin se prepara 6 series de 12 tubos estriles , y se les agrega a todos los tubos 1ml de caldo peptona , al primer tubo de cada serie se le agrega 1,0 ml de solucin madre del aceite esencial de Eucalyptus globulus Labill, se agita bien el tubo y seguidamente se extrae 1,0 ml para luego ser agregado al segundo tubo, agitar bien y as sucesivamente a los dems tubos hasta el tubo n 10 del que se

33

desecha 1,0 ml, luego se agregan 0,1 ml del inoculo a cada tubo. Inculo de cada bacteria. El tubo n11 se tomo como control positivo y n12 el control negativo. Todas las series se incuban a 37 C por 24 horas .Transcurrido el tiempo de incubacin se apreciara la turbidez del contenido de los tubo para as poder observar el punto de ruptura, que es el tubo lipidiado y el tubo turbio. Se considera la CIM a la cantidad que se encuentra en el tubo que no presenta turbidez. Luego de determinar la concentracin mnima inhibitoria se procedi a sembrar a todos los tubos que no presentaron turbidez en Agar Muller Hilton, seguidamente se lleva a la estufa a una temperatura de 37 por 48 horas, pasado el tiempo se observar en cul de los tubos sembrados no hubo crecimiento siendo la cantidad mnima bactericida (CMB) entre el tubo que no hubo crecimiento y en el que si hubo crecimiento.

34

Figura n 17: Determinacin de la concentracin mnima inhibitoria y concentracin mnima bactericida para cada cepa en estudio

TABLA N1

35

Actividad antimicrobiana del aceite esencial de E. globulus expresada como Concentracin mnima inhibitoria (CMI) y concentracin mnima bactericida (CMB)

ACEITE DE EUCALIPTO MICROORGANISMO CMI E. coli ATCC 25922 Proteus mirabilis ATCC 13315 Klebsiella pneumonia ATCC 10031 S. aureus ATCC 25923 2,91 3,13 5,81 6,25 5,81 5,81 (mg/ml) CMB 6,25 6,25

36

Fuente: Gutierrez Valdivia Ranulfo .Mamani Roman Wilmar. Efecto in vitro del Eucaliptus globulus Labill (eucalipto) sobre Sthapylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Shigella flexneri aeruginosa , Universidad Catlica Santa Mara . Arequipa-2005 y Pseudomona

F.2 Estudio de la Universidad de Montenegro-2011: Un estudio llevado a cabo en la Universidad de Montenegro-Serbia evalu la

actividad antimicrobiana del aceite esencial de Eucalyptus Globulus Labil contra 17 microorganismos, incluyendo bacterias que causan intoxicacin alimentaria y deterioro humano. En un principio las hojas fueron recogidas desde un punto nico. Las hojas fueron secadas al aire en la sombra a temperatura ambiente y se almacenaron en bolsas de papel de doble capa en una habitacin, protegido de la luz directa, hasta anlisis adicional. La identidad de la planta de especmenes fue confirmada en el Departamento de Biologa, de la Universidad de Montenegro El agua inicial contenido en las hojas de hierba se encontr que era de 12,7% (w / w el material vegetal se moli en un molino de caf y, despus permanecieron en una bolsa de polipropileno con cierre hermtico y se almacen compuestos voltiles. Luego el material vegetal (20 g) se someti a hidrodestilacin en un aparato Clevenger durante 2 h segn la Farmacopea IV Yugoslava. El aceite obtenido se sec sobre sulfato de sodio anhidro, se midi y se verti en recipientes hermticamente cerrados de vidrio oscuro, luego se almacen en un a 8 C durante un mximo de 3 das antes de utilizarse, con el fin de evitar las prdidas de los

37

congelador a -4 C hasta que se analizaron por Cromatografa de gases-acoplada a espectroscopia de masas (GC-MS) Con el fin de evaluar la actividad antimicrobiana del aceite esencial de E. globulus, se utilizaron: como cepas de referencia Staphylococcus aureus ATCC 5923, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC , y Candida albicans ATCC ; adems el aislado de, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Streptococcus pyogenes, Morganella morganii, Providencia stuartii, Enterobacter cloacae, Acinetobacter baumannii, Citrobacter freundii,y Salmonella infantis

Determinacin de la CMI y CMB.Para determinar la concentracin mnima inhibitoria (CMI) y la mnima bactericida concentracin (CMB) se utiliz el mtodo de micro dilucin en caldo Yu et al. (2004). Todas las pruebas se realizaron en caldo Mueller Hinton suplementado con Tween 80 a una concentracin final de 0,5% (v / v). Brevemente, diluciones dobles seriadas del aceite se prepararon en una placa de microtitulacin de 96 pocillos que oscil entre 0,09 mg / ml a 25,00 mg / ml. Se aadieron para cada pocillo10 uL de solucin indicadora resazurina (preparada por disolucin de un comprimido de 270-mg en 40 ml de agua destilada estril) y 30 uL de caldo Mueller Hinton Finalmente, 10 uL de suspensin bacteriana (10 6UFC / ml) se aadi a cada pocillo para lograr una concentracin de 10 4 CFU / ml. Dos columnas en cada placa se utilizaron como controles: una columna con un antibitico de amplio espectro como control positivo (amykacine), y una columna que contiene metanol como un control negativo.

38

Las placas fueron envueltas sin apretar con papel film para que las bacterias no se deshidraten. El plateado se prepararon por triplicado, y luego fueron colocados en una incubadora a 37 C durante 18-24 horas. El cambio de color se evalu entonces visualmente. La concentracin ms baja a la que el cambio de color ocurri fue tomada como el valor CMI. El promedio de 3 valores se calcul para proporcionar el CMI y CMB.

La CMI se define como la concentracin ms baja del aceite esencial en que el microorganismo no demuestra el crecimiento visible. El crecimiento de microorganismos se indica mediante turbidez. La CMB se defini completamente muerto. Para evaluar la actividad antimicrobiana de Candida Albicans, se prepararon soluciones madre en agua para nistatina y en metanol para aceite. La dilucin final fue preparado en medio RPMI 1640,
3

como la

concentracin ms baja del aceite esencial en que el microorganismo se incub

ajustado

pH

7,0

con

0.165M

morpholenepropane-tampn de cido sulfnico, en el intervalo de 0,09 mg / ml a 25 mg / ml y el tamao del inculo de 10 incubaron en el aire ambiente a 35 C. La CMI se determino visualmente despus de 48 h de incubacin, como la CFU / ml. La Bandejas de microdilucin se

concentracin ms baja del medicamento que no caus ningn crecimiento detectable. Finalmente se hallo el promedio de 3 valores y se logro calcular el CMI y la CMB para el aceite de prueba.

39

TABLA N2 Actividad antimicrobiana del aceite esencial de E. globulus expresada como Concentracin mnima inhibitoria (CMI) y concentracin mnima bactericida (CMB)

40

| MICROORGANISMO

ACEITE DE EUCALIPTO (mg/ml) CMI CMB 0.09 1.57 6.25 0.18

E. coli ATCC 25922 Proteus mirabilis klebsiella pneumoniae Staphylococcus aureus ATCC 25923 C. albicans ATCC 10231 Enterobacteria

0.09 0.36 1.57 0.09

0.36 0.72

0.36 0.72

41

Fuente: Damjanovic-Vratnica, B. Efecto antimicrobiano de los aceites esenciales aislados de

Eucalyptus globulus Labill. desde Montenegro. En: Revista Checa de Ciencias de la Alimentacin UZEI. Repblica Checa. Biblioteca Agrcola y Alimentaria, Instituto de Economa Agrcola y de la Informacin. Volumen 28 (3)

Podemos apreciar que la concentracin mnima inhibitoria CMI oscil entre 0,09 mg / ml y 1,57 mg / ml, con la menor actividad para klebsiella pneumoniae (1,57 mg / ml), mientras que la actividad ms alta se observ contra S. aureus, E. coli, y S. pyogenes (0,09 mg / ml). El CBM ms bajo fue de 0,09 mg / ml para E. coli y S. pyogenes, mientras k. pneumoniae tuvo el mayor MBC de 6,25 mg / ml. Estos resultados confirman el uso potencial del aceite esencial del Eucalyptus globulus L. en la infecciosas.
20

industria

farmacutica, el cual puede ser til como agente

antimicrobiano natural para el tratamiento de numerosas las enfermedades

G. Toxicologa del aceite esencial de eucalipto.El aceite esencial no es txico. Sin embargo, altas dosis del aceite son irritantes producen convulsin, delirio, dificultad respiratoria, gastroenteritis y hematuria Los datos sobre las muertes causadas por el consumo de aceite de eucalipto en los seres humanos no son compatibles, se ha producido casos de muerte despus de el consumo de tan slo 4-5 ml, mientras que otras personas se han enfermado y se han recuperado despus de consumir 120-220 ml de aceite. Basado en estudios con roedores, la administracin oral DL50 (la dosis por va oral consumida que es letal para el 50% de los animales) para el aceite de eucalipto es muy alta 4.44g/kg por kilogramo de peso (BW) para ratas y la DL50 es menor cuando slo se utiliza 1,8-cineol 2.48g/kg (BW) para las ratas. La DL50 por va cutnea para los conejos es mayor que 5g/kg BW.

42

El aceite por va subcutnea en ratones hembras gestantes (135 mg/kg) durante la organognesis (6-15 das) no provoca embriotoxicidad ni fetotoxicidad. 21 El aceite de eucalipto no se cree que es teratognico o que pueda a contaminar la leche. Sin embargo, algunos estudios han indicado que el citronelal y felandreno, que se puede encontrar en algunos Eucalyptus spp. , son dbiles mutagenicos . La. Food and Drug Administration de los EE.UU ha aprobado el uso de aceite de eucalipto y 1,8-cineol (eucaliptol) para el consumo humano. El Consejo de Europa tambin ha aprobado el uso del aceite como aditivo para la alimentacin humana (a un nivel de 15 ppm). En Francia, las infusiones de E. globulus hojas pueden ser registrados como productos para el tratamiento de afecciones bronquiales benignas humanos sin estudios toxicolgicos.22 2.3 Definicin de trminos bsicos Inoculacin: La inoculacin o siembra es poner en contacto los microorganismos o la muestra Bacteriolgica con los medios de cultivo. Urocultivo: Siembra de un medio de cultivo con una pequea cantidad de orina extrada aspticamente. Tenesmo: deseo continuo, doloroso e ineficaz de orinar Polaquiuria: Frecuencia exagerada de las micciones que no coincide necesariamente con el aumento del volumen total de orina Disuria: Expulsin difcil, dolorosa e incompleta de la orina. Fimbrias: Conjunto de filamentos o apndices filiformes cortos que rodean algunas bacterias gramnegativas. Actividad uresica: Capacidad de aumentar el PH Citotxico: Que posee la capacidad de destruir clulas, como la que poseen los macrfagos o los linfocitos K.

43

Febrfugo: Propiedad de una sustancia o planta medicinal que sirve para hacer bajar la fiebre.

Rubefaciente: Que provoca el enrojecimiento de la piel o de las mucosas con las que entra en contacto, en especial a travs de la dilatacin de los capilares.

Antihelmntico: Dcese del frmaco que es capaz de expulsar o matar los gusanos intestinales. Tambin se denomina vermfugo.

CAPTULO III METODOLOGA DE LA INVESTIGACIN

3.1 Diseo de la investigacin.3.1.1 Tipo de investigacin: Este trabajo informacin. Es del tipo esencial Descriptiva, porque est orientada a evaluar los efectos del aceite es una investigacin Pura ya que parte de un marco terico y

permanece en l, su finalidad es formular nuevas teoras mediante la recoleccin de

sobre un determinado grupo de bacterias y describir la concentracin

inhibitoria y bactericida.

3.1.2 Mtodo: Inductivo, recoleccin de informacin

3.2 Poblacin y muestreo de la investigacin.Marco poblacional: Planta de Eucalyptus globulus Labill Eucalipto

44

3.3 Variables e indicadores.Variable independiente: Variable n 1: Concentracin mnima inhibitoria (CMI) Variable n 2: Concentracin mnima bactericida (CMB)

Indicadores: mg/ml

3.4 Tcnicas e instrumentos de recoleccin de datos.3.4.1 Tcnicas: Recopilacin de datos. 3.4.2 Instrumentos: Compilacin y revisin de fuentes primarias de informacin: tesis, monografas; para establecer posteriores conclusiones.

45

CAPTULO IV PRESENTACIN, ANLISIS E INTERPRETACIN DE RESULTADOS 4.1 Resultados.TABLA N 3 Comparacin de la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) y la Concentracin Mnima Bactericida (CMB) del aceite esencial de Eucalyptus globulus Labyll frente a la bacteria Escherichia coli. ACTIVIDAD DEL ACEITE DE EUCALIPTO FRENTE Echerichia coli CMI (mg/ml) Estudio de la Universidad Catlica De Santa Mara 2005 Estudio de la Universidad de Montenegro 2011 Concentracin Alternativa 0.09 2.95 0.09 3.17 5.81 6.25 CMB (mg/ml)

INVESTIGACIONES

En el presente cuadro podemos observar que la determinacin de la concentracin mnima inhibitoria (CMI) para Escherichia Coli segn el estudio de la U.C.S.M fue de 5.81 mg/ml y segn la U. Montenegro fue de 0.09 mg/ml, por lo tanto podemos inferir que la cantidad mnima de aceite esencial que se necesita para inhibir el crecimiento de esta bacteria es entre 0.09 y 5.81, es decir un promedio de 2.95 mg/ml.

46

Por lo cual en base a los resultados de estas investigaciones nos permitimos plantear una concentracin alternativa de 2.95 mg/ml de aceite esencial, que posee efecto bacteriosttico sobre E.coli. En cuanto a la concentracin mnima bactericida (CMB) para Escherichia coli fue de 6.25 mg/ ml segn la U.C.S.M y 0.09 mg/ ml segn la U. Montenegro, es decir que se necesita un promedio de 3.17 mg/ml (concentracin alternativa) de aceite esencial para matar al 99.9 % de Escherichia coli. TABLA N 4 Comparacin de la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) y la Concentracin Mnima Bactericida (CMB) del aceite esencial de Eucalyptus globulus Labyll frente a la bacteria Proteus mirabilis. ACTIVIDAD DEL ACEITE DE EUCALIPTO FRENTE A Proteus mirabilis CMI (mg/ml) Estudio de la Universidad Catlica De Santa Mara 2005 Estudio de la Universidad de Montenegro 2011 Concentracin alternativa 0.36 3.08 1.57 3.91 5.81 6.25 CMB mg/ml

INVESTIGACIONES

La concentracin mnima inhibitoria (CMI) para Proteus fue de 5.81 mg/ml segn el estudio de la U.C.S.M y 0.36 segn el estudio de la U. Montenegro. El resultado de estas investigaciones nos permite postular una concentracin alternativa de 3.08 mg/ml de aceite esencial que posee efecto bacteriosttico sobre Proteus.

47

Adems la concentracin mnima bactericida (CMB) para Proteus fue de 6.25 mg/ml segn el estudio de la U.C.S.M y 1.57 mg/ml segn el estudio de la U. Montenegro, resultando un promedio de 3.91 mg/ml de aceite esencial que posee efecto bactericida sobre Proteus.

TABLA N 5 Comparacin de la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) y la Concentracin Mnima Bactericida (CMB) del aceite esencial de Eucalyptus globulus Labyll frente a la bacteria Klebsiella pneumoniae ACTIVIDAD DEL ACEITE DE EUCALIPTO FRENTE Klebsiella pneumoniae CMI (mg/ml) Estudio de la Universidad Catlica De Santa Mara 2005 Estudio de la Universidad de Montenegro 2011 Concentracin alternativa 3.69 6.25 1.57 6.25 5.81 CMB mg/ml 6.25

INVESTIGACIONES

48

En el caso de Klebsiella p. la concentracin mnima inhibitoria (CMI) fue de 5.81 mg/ml segn el estudio de la U.C.S.M y 1.57 mg/ml segn el estudio de la U. Montenegro, obteniendo como promedio una concentracin alternativa de 3.69 mg/ml de aceite esencial de eucalipto con actividad bacteriosttica sobre klebsiella. Tambin se determino la concentracin mnima bactericida (CMB) que fue de 6,25 mg/ml segn el estudio de la U.C.S.M y 6,25 mg/ml segn el estudio de la U. Montenegro, demostrando que ambos estudios presentan similitud en cuanto a la dosis bactericida, necesaria para matar a Klebsiella.

TABLA N 6 Comparacin de la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) y la Concentracin Mnima Bactericida (CMB) del aceite esencial de Eucalyptus globulus Labyll frente a la bacteria Staphylococcus aureus

49

INVESTIGACIONES

ACTIVIDAD DEL ACEITE DE EUCALIPTO FRENTE Staphylococcus aureus CMI (mg/ml) CMB mg/ml 3.13

Estudio de la Universidad Catlica De Santa Mara 2005 Estudio de la Universidad de Montenegro 2011 Concentracin alternativa

2.91

0.09

0.18

1.50

1.66

50

Asimismo la concentracin mnima inhibitoria (CMI) para Staphylococcus aureus fue de 2.91 mg/ml segn la U.C.S.M y 0.09 mg/ml segn la U. Montenegro, es as que se plantea una concentracin alternativa 1.5 mg/ ml de aceite esencial que es capaz de inhibir el crecimiento de Staphylococcus aureus. En cuanto a la concentracin mnima Bactericida (CMB) para Staphylococcus aureus fue de 3.13 mg/ml segn la U.C.S.M y 0.18 mg/ml segn la U. Montenegro, es as que obtenemos un promedio de 1.66 mg/ ml( concentracin alternativa ) ml de aceite esencial que es capaz de matar el 99.9% de Staphylococcus aureus.

Grafico n 1 Concentracin mnima inhibitoria del aceite esencial (CMI) Eucaliptus globulus Labyll eucalipto sobre los microorganismos en estudio

51

6
C oncentra cionm inim a inhibitoria(m /m g l)

5.81

5.81

5.81

5 4 3 2 1 0 0.09
E .coli

2.95

3.08

3.69 2.91 1.57 1.5 0.09

0.36
Proteus K iella lebs

S ureus .a

B cteria a s

U.C .M .S

U.Monteneg ro

C .Alternativa

En el presente grafico se establecen las concentraciones mnima inhibitoria del aceite esencial de Eucaliptus globulus Labyll Eucalipto sobre los microorganismos en estudio , obtenidas en investigaciones realizadas por 2 universidades de referencia , adems se muestra la concentracin mnima inhibitoria alternativa que propone el presente trabajo de investigacin.

Grafico n 2 Concentracin mnima bactericida del aceite esencial (CMB) Eucaliptus globulus Labyll eucalipto sobre los microorganismos en estudio

52

Concentracion m inim bactericida(m /m a g l)

7 6 5 4 3 2 1 0

6.25

6.25

6.25

3.91 3.17 1.57 0.09

E.coli P roteus K lebsiella

3.13 1.66 0.18

S .aureus

B acterias

U.C .M .S

U.Monteneg ro

C .Alternativa

En el grafico se observa las concentraciones mnima bactericida del aceite esencial de Eucaliptus globulus Labyll Eucalipto sobre los microorganismos en estudio, resultados obtenidos a partir de estudios realizados en 2 universidades de referencia, as mismo se indica la concentracin mnima bactericida alternativa que propone nuestro trabajo de investigacin .

53

CONCLUSIONES

Se logr demostrar la actividad Eucalipto

antibacteriana del aceite esencial del sobre los principales patgenos del sobre: Escherichia coli, Proteus

Eucalyptus globulus Labill

sistema urinario, al presentar una concentracin mnima inhibitoria (CMI) y concentracin mnima bactericida (CMB) mirabilis, Klebsiella pneumoniae y Staphylococcus aureus.

En base a los resultados desarrollado en dos experimentos in vitro , se proponer en promedio estadstico, una Concentracin Alternativa

logr estudio.

Inhibitoria y una Concentracin Alternativa Bactericida para cada bacteria en

Siendo para E. Coli la Concentracin Mnima Inhibitoria Alternativa de 2,95

mg/ml, y su Concentracin Mnima Bactericida de 3,17 mg/ml Para Proteus mirabilis la Concentracin Mnima Inhibitoria Alternativa fue de 3,08 mg/ml , y la Concentracin Mnima Bactericida de 3,91 mg/ml En el caso de Klebsiella pneumoniae la Concentracin Mnima Inhibitoria Alternativa fue de 3,69 mg/ml, y la Concentracin Mnima Bactericida de 6,25 mg/ml , y para Staphylococcus aureus la Concentracin Mnima Inhibitoria Alternativa de 1,5 mg/ml y la Concentracin Mnima Bactericida de 1,66 mg/ml., de aceite esencial de eucalipto.

54

RECOMENDACIONES

En base a los resultados antes expuestos, se propone

utilizar una

concentracin de 6mg /ml de aceite esencial de eucalipto, ya que a esta concentracin se consigue un efecto bactericida y bacteriosttico sobre los principales patgenos de las vas urinarias, como son: Escherichia Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae y Staphylococcus aureus. Se recomienda incluir el aceite esencial de eucalipto en la forma farmacutica de cpsulas blandas para el tratamiento de infecciones urinarias Esta dosis teraputica podra ser administrada en dos tomas de 3 ml de aceite esencial, cada doce horas y tendra que ser complementada con estudios de biodisponibilidad. coli,

55

Referencias Bibliogrficas:

1.- Carranza Marco A. R., Rodrguez H Diana., Daz F Jess. Etiologa y resistencia bacteriana de las infecciones urinarias. Revista Sociedad Peruana Medicina Interna 2003.Volumen 16(04) .Pg. 6 - 10 2.- Libertad Alzamora, Liliana Morales, Lourdes Armas, Gilma Fernndez .Medicina tradicional en el Per: Actividad antimicrobiana in vitro de los aceites esenciales extrados de algunas plantas aromticas. Revista: Anales de la facultad de Medicina. Universidad Mayor de San Marcos. Volumen 62(02) Pg. 156-161 3.-.Liu B. Humberto; Lengua V., Luis Alberto; Len M., Gladis; La Torre D., Carla; Huapaya Y., Jos; Chauca, Jos. Evaluacin de la Actividad Antibacteriana in vitro de los Extractos de Caesalpinia spinosa tara y Eucalyptus sp. eucalipto. 4.- Blasco Loureiro, C. Souto Moure, M.A. Marchena Fernndez. Infecciones del tracto urinario. Pautas de tratamiento emprico de la infeccin no complicada segn los datos de sensibilidad antimicrobiana de un rea de salud. Farmacia de Atencin Primaria, Volumen 4(1). Pg.:20-23 5.- Manual Profam: Infecciones urinarias: 2005:251-255 6.- Cervantes Byron, Vera Lenin. Infecciones bacterianas en el tracto genito urinario en mujeres embarazadas del hospital Verdi Cevallos Balda de la ciudad de PortoviejoEcuador en el periodo Abril Septiembre del 2011 7.-Valdevenito S. Juan Pablo. Infeccin urinaria recurrente en la mujer. Rev. Chilena Infectologia. 2008; Volumen 25(4): Pag.268-276. 8.- Muder RR, Brennen C, Rihs JD et al. Isolation of Staphylococcus Aureus from the Urinary Tract: Association of Isolation with Symptomatic Urinary Tract Infection and Subsequent Staphylococcal Bacteremia. Clinical Infectious Diseases 2006 Volumen 42(1).Pag.46-50.

56

9.- Payam Behzadi , Behzadi Elham , Yazdanbod Hodjjat , Roghiyyeh Aghapour , Mahboubeh Akbari Cheshmeh , y Djaafar Salehian Omran . Infecciones del tracto urinario asociadas con Candida albicans. En: Maedica. EEUU. 10.- Gutierrez Valdivia Ranulfo .Mamani Roman Wilmar. Efecto in vitro del Eucaliptus globulus Labill (eucalipto) sobre Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Shigella flexneri y Pseudomona aeruginosa, Universidad Catlica Santa Mara. Arequipa-2005 11.- CIDEU .Centro de investigacin y documentacin del eucalipto. Universidad de Huelva .2006 12.- Len Q. Aleida .Robles B. Amanda. Estudio de prefactibilidad para la instalacin de una planta extractora de aceites esenciales. Universidad Tcnica del Norte. IbarraEcuador. 2009. 13.-Frei Fernndez E. Alexander. Estudio de pre factibilidad para la produccin y Comercializacin de papel a partir de eucalipto. Pontificia Universidad Catlica del Per .Facultad de Ciencias e Ingeniera .2008.

14.- Moreno Jeancarlos, Lpez Gabriel , Siche Ral . Modelacin y optimizacin del
proceso de extraccin de aceite esencial de eucalipto (Eucalyptus globulus) Universidad Nacional de Trujillo Facultad de CC. Agropecuarias. 2010.

15-Carmen Mara Navas Segura. Obtencin de tinturas del rizoma de Zarzaparrilla (Smilax domingensis Willd) y de las hojas de Eucalipto (Eucalyptus globulus labill) por percolacin y maceracin dinmica a escala laboratorio en funcin de las condiciones de operacin y actividad antibacteriana de la tintura obtenida con mayor rendimiento extractivo. 16.-Lopez Villar Martha, Villavicencio Vargas Oscar. Manual de Fitoqumica. Instituto de Medicina Tradicional IMLT .Rev. Essalud. 2009. pg. 176-178. 17.- Manuel Lezaeta Acharan. Medicina Natural. Remedios al alcance de todos. Editorial Pax Mxico 2008.

57

18.- Rolando Quert lvarez. Aceites Esenciales De Eucalipto. Revista Cubana Farmacia Volumen 35 (1)2009. Pag.29-35. 19.- Horna Quintana, Gertrudis, Silva Diaz, Mara, Vicente Taboada, William et al. Concentracin mnima inhibitoria y concentracin mnima bactericida de Ciprofloxacina en bacterias uropatgenas aisladas en el Instituto Nacional de Enfermedades Neoplsicas. Revista Mdica Herediana 2005.Volumen16 (1), pag.39-45. 20.- Damjanovic-Vratnica, B. Efecto antimicrobiano de los aceites esenciales aislados de Eucalyptus globulus Labill. desde Montenegro. En: Revista Checa de Ciencias de la Alimentacin UZEI. Repblica Checa. Biblioteca Agrcola y Alimentaria, Instituto de Economa Agrcola y de la Informacin. Volumen 28 (3) Pag. 277-284. 21.- Ochoa Pacheco a, Rossana Gonzlez Barrios y, Viso Gurovich F. Las reacciones adversas de las plantas medicinales y sus interacciones con medicamentos. MEDISAN 2006; 10(4). 22.-Universidad de Cornell. Departamento de ciencia animal. Plantas medicinales para ganadera .2008 .

58

ANEXOS

MATRIZ DE CONSISTENCIA

TTULO: Actividad antibacteriana del aceite esencial del Eucaliptus globulus Labill sobre los principales patgenos del sistema urinario

TIPO DE INVESTIGACIN: Pura-descriptiva

PRESENTADO POR: Dayana Rosa Snchez Chvez

PROBLEMA GENERAL

OBJETIVO GENERAL

HIPTESIS GENERAL

VARIABLES

Variables : El aceite esencial de Demostrar la actividad El aceite esencial de Eucaliptus eucalipto, actividad sobre los globulus L antibacteriana tiene aceite principales Labill patgenos sistema urinario. esencial antibacteriana Eucaliptus del Eucaliptus globulus del Labill. eucalipto Concentracin mnima inhibitoria (CM) Concentracin mnima bactericida (CMB)

globulus podra tener actividad eucalipto antibacteriana sobre del patgenos de las vas urinarias

patgenos del sistema sobre los principales los principales urinario?

59

PROBLEMAS ESPECIFICOS Cul inhibitoria es (CMI) y

OBJETIVOS ESPECIFICOS la Definir la inhibitoria (CMI) la El

HIPOTESIS ESPECIFICAS aceite de globulus eucalipto al una y Planta de Eucalyptus globulus Labill. eucalipto Marco Poblacional:

concentracin concentracin aceite

mnima concentracin mnima Eucalyptus y Labill.

mnima concentracin mnima podra tener un efecto (CMB) antibacteriano de del aceite esencial de presentar eucalipto inhibitoria (CMI) del mnima (CMB) principales patgenos sistema urinario. del

bactericida (CMB ) del bactericida esencial Eucaliptus globulus Labill Eucalyptus eucalipto principales sobre los Labill patgenos

globulus concentracin mnima concentracin bactericida sobre los

patgenos sobre los principales una sistema urinario.

del sistema urinario?

60

Cul inhibitoria mnima (CMB) para

sera (CMI)

la Establecer mnima Concentracin y mnima

una Se podra establecer una concentracin inhibitoria y una inhibitoria mnima y una alternativa

concentracin

bactericida Alternativa ms cada mnima

adecuada Concentracin

concentracin

bactericida bactericida para cada base a los estudios de investigacin revisados

microorganismo estudio?

en Alternativa para cada bacteria en estudio en microorganismo motivo del estudio.

61