BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR I Mtodos instrumentais de anlise para o estudo de clulas e tecidos - Microscopia

Objectivos: Listar e descrever as ferramentas de estudo da clula Definir e analisar a metodologia usada na: -Microscopia ptica e electrnica; -Microscopia de fluorescncia; -Microscopia de contraste de fase; -Microscopia confocal; Microscopia Electrnica de Transmisso e de Varrimento. Listar e descrever a preparao do material biolgico para a microscopia ptica e electrnica

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Poder de resoluo

Microscopia depende de: - tcnicas de preparao das amostras biolgicas - poder de resoluo dos microscpios

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Algumas descobertas importantes na histria da microscopia
1611 - Kepler sugere maneiras de construir 1 microsc composto

1683 - Leeuwenhoek visualiza pela 1x uma bactria 1879 - Flemming descreve o comportamento dos cromossomas na mitose de cl animais. 1881 - Retzius, Cajal e outros desenvolvem tcnicas de colorao e lanaram os fundamentos da anatomia microscpia 1882 a 1899 Klebs e Pasteur utilizando variados corantes identificam importantes agentes patognicos. 1886 Zeiss constroi uma srie de lentes q permite revelar estruturas nos limites tericos da luz visvel

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Algumas descobertas importantes na hist histria da microscopia 1898 Golgi descreve pela 1x o aparelho de Golgi depois da colorao das clulas com nitrato de prata 1932 Zernicke inventa o microscpio de contraste de fase Estes 2 microsc permitem que clulas vivas no coradas sejam vistas em detalhe pela 1 vez 1981 Allen e Inou aperfeioam o microscpio ptico de contraste com sistema de vdeo avanado 1988 Microscpios confocais de varredura comerciais passam a ser amplamente utilizados

COMO ESTUDAR AS CLULAS MICROSCOPIA Detalhes revelados pelo microscpio ptico O limite mximo de resoluo de 1 microscpio ptico determinado pelo comprimento de onda da luz visvel, q varia de 0,4 m (violeta) a 0,7 m (vermelho).

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Detalhes revelados pelo microscpio ptico Limite de resoluo o limite de separao pelo qual 2 objectos podem ser distinguidos.

Limite de resoluo depende de: - comprimento de onda da luz () - abertura numrica do sistema de lentes (an)

COMO ESTUDAR AS CLULAS MICROSCOPIA Detalhes revelados pelo microscpio ptico

A abertura numrica a capacidade do sistema de lentes recolher a luz. - lentes secas - an no pode ser maior que 1 - lentes de imerso an pode chegar a 1,4 Qto > a an > a resoluo e > a luminosidade.

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Preparao do material biolgico para a microscopia ptica Fixao

A fixao

imobiliza, mata e preserva e endurece as clulas. torna-as permeveis aos corantes e produz uma ligao cruzada entre as suas macromolculas, permitindo que estas permaneam estabilizadas nas suas posies naturais

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Preparao do material biolgico para a microscopia ptica Fixao Procedimentos antigos usavam cidos e solventes orgnicos como o lcool. Diferentes poderes de penetrao usados em combinaes. Actualmente usam-se os aldedos (formaldedo e glutaraldedo) que formam ligaes covalentes com os grupos amino-livres das protenas produzindo ligaes cruzadas. Qualquer tratamento usado na fixao pode alterar a estrutura da clula ou das suas molculas uma alternativa o congelamento rpido. Vantagens- protenas bem preservadas Desvantagens- estrutura fina da clula destruda pelos cristais de gelo O tecido congelado seccionado com um criostato (micrtomo mantido numa cmara a T)

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Preparao do material biolgico para a microscopia ptica Embebio

Mesmo aps a fixao os tecidos so macios e frgeis e ceras MO precisam de ser embebidos em resinas, ME 1 na forma lquida de seguida na forma slida (por esfriamento ou polimerizao).

O material biolgico embebido seccionado com um micrtomo/ultramicrtomo

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Preparao do material biolgico para a microscopia ptica Embebio

O micrtomo um aparelho com uma lmina metlica afiada As seces: - de 1 a 10 m de espessura,

- colocadas sobre a superfcie plana de uma lmina de vidro

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Preparao do material biolgico para a microscopia ptica Colorao

Depois de fixado e seccionado, o material biolgico tem que ser corado para poder ser observado ao microscpio.

Uma vez que que os corantes tm diferentes afinidades e poderes de penetrao tm que ser utilizadas em combinaes.

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Preparao do material biolgico para a microscopia ptica Colorao H uma relativa falta de especificidade dos corantes a nvel molecular que tem levado ao desenvolvimento de procedimentos de colorao mais selectivos e racionais, particularmente a mtodos que revelem protenas especficas ou outras macromolculas na clula. Assim algumas enzimas podem ser localizadas nas clulas atravs da sua actividade cataltica. Regies mais sensveis fluorocromos podem ser avaliadas atravs de

COMO ESTUDAR AS CLULAS MICROSCOPIA Microscopia de Fluorescncia

Molculas fluorescentes absorvem luz a 1 determinado e emite um + longo, visualizado atravs de 1 filtro contra um fundo escuro

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Os fluorocromos so detectados em microsc de fluorescncia q difere dos normais por ter uma luz + potente q passa por 2 conjuntos filtros:

O 1 permite a passagem de q excitem determinados fluorocromos

O 2 permite passagem de emitidos qdo o corante fluoresce

COMO ESTUDAR AS CLULAS MICROSCOPIA Microscopia de Fluorescncia

A fluoresceina emite fluorescncia verde qdo excitada com luz azul A rodamina vermelha amarel/verde

Imagem de FISH com fluorescein e rodamina

As 2 cores so vistas separada/ alternando conjuntos de filtros

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Qdo se fixa 1a cl

de Contraste

de Fase

ela perde alguns componentes ou so simples/ distorcidos

a forma + correcta de examinar as clulas seria quando estas ainda estivessem vivas, sem as fixar ou congelar. Qdo a luz atravessa 1a cl viva a fase do alterado de acordo com o ndice de refraco da cl. A luz ao passar atravs do ncleo retardada e deslocada em relao luz que atravessam reas + delgadas. O microsc de contraste de fase explora os efeitos da interferncia qdo estes 2 conjuntos de ondas se recombinam, criando uma imagem da estrutura da clula

COMO ESTUDAR AS CLULAS MICROSCOPIA Microscopia de Contraste de Fase

As partes coradas da cl Reduzem a amplitude e A imagem colorida da cl vista

A luz q passa atravs de 1a cl no corada sofre pouca alterao de amplitude e os detalhes das estruturas no se conseguem ver

COMO ESTUDAR AS CLULAS MICROSCOPIA Microscopia Confucal

Para a microscopia ptica 1 tecido tem q ser cortado em seces q, qto + fina a seco + ntida a imagem. Neste processo a informao 3D perdida. Com o Mic confucal de varrimento a partir de 1a srie de seces tiradas em s profundidades e armazenadas em computador fcil reconstruir a imagem 3D
o Mic confucal de varrimento para o microscopista o que o CAT scanner para o radiologista. Ambos fornecem imagens seccionadas detalhadas do interior de uma estrutura intacta.

Gastrula Drosophila mic convencional e de fluorescnc confucal

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Electr Microscopia Electrnica de Transmisso (TEM) Microscope TEM Transmissiom Electron Microscope Teorica/ tem 1a resoluo 10 000x > q o MO e 1 poder de resoluo - 1 Na prtica tem 1a resoluo 100x > q o MO e 1 poder de resoluo 20 Porqu? Devido a problemas na preparao da amostra Contraste e Danos causados pela radiao

No TEM os electres atravessam a amostra para formar a imagem

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Algumas descobertas importantes na hist electr histria da microscopia electrnica
1897 J. Thompson anuncia a existncia de partculas carregadas va/ + tarde denominadas electres 1931 Ruska et al constrem o 1 TEM 1935 Knoll demonstra a viabilidade do mic electrnico de varredura 1939 - Siemens produz o 1 TEM para fins comerciais 1945 Porter, Claude e Fullam, usam o TEM para examinar clula em cultura depois de fixadas e contrastadas com OsO4 1948 Pease e Baker, preparam seces de mat biolgico de 0,1 a 0,2 m 1952 Palade, Porter e Sjstrand desenvolvem mtodos de fixao e corte q possibilitam pela 1x a visualizao de vrias estruturas intracelulares

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Algumas descobertas importantes na hist electr histria da microscopia electrnica
1953 Porter e Blum desenvolvem o 1 ultramicrtomo 1956 Glauert et al propem a resina epoxi araldite como agente de incluso. 1961 Luft introduz a resina Epon 1957 Robertson descreve a estrutura trilaminar da membrana celular vista pela 1x no TEM 1959 Singer usa anticorpos acopolados ferratina para detectar molculas da clula 1965 Cambridge instruments produz o 1 microscpio de varrimento 1968 De Rosier e Klug descrevem tcnicas para a reconstituio de estruturas 3D a partir de micrografias electrnicas

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Preparao do material biolgico para a microscopia electrnica Fixa Fixao 1 com gluteraldedo que faz com que as molculas de protenas faam ligaes covalente/ cruzadas com os seus vizinhos 2 com tetrxido de smio q se liga e estabiliza as bicamadas lipdicas assim como as protenas Desidrata Desidratao Como a amostra exposta ao vcuo mto forte no pode ser analisada viva, com H2O, feita a desidratao numa srie crescente de alcois

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Preparao do material biolgico para a microscopia electrnica Embebi Embebio Feita com uma resina q se polimeriza formando 1 bloco slido de plstico Corte Cortes ultrafinos (na ordem dos 50 a 100nm de espessura) feitos num ultramicrtomo e colocados numa grelha Contrasta Contrastao Feito com sais de metais pesados como o urnio e o chumbo

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Preparao do material biolgico para a microscopia electrnica

mitocndria vacolo

nuclolo

ribossomas

Golgi RE

COMO ESTUDAR AS CLULAS MICROSCOPIA Microscopia Electr Electrnica de Varrimento

Seces finas obtidos por TEM so pedaos bidimensionais de tecidos e no transmitem de imediato a organizao 3D dos componentes celulares

Este conseguido usando o microscpio electrnico de varrimento, q num aparelho <, + simples e + barato do q um TEM.

Utiliza os electres q so dispersos ou emitidos da superfcie da amostra podem ser examinadas e a resoluo atingvel no mto alta

somente caractersticas da superfcie

macrfago

COMO ESTUDAR AS CLULAS MICROSCOPIA Microscopia Electr Electrnica de Varrimento

A amostra

fixada, desidratada e coberta com uma camada fina de metal pesado de seguida varrida por um feixe de electres.

Clio do ouvido interno do boi

A quantidade de electres emitidos medido para controlar a intensidade de um 2 feixe, q se move em sincronia com o 1 e forma a imagem num cran. Como a imagem tem brilhos e sombras d 1a aparncia 3D.