UNIVERSIDAD MILITAR NUEVA GRANADA FACULTAD DE CIENCIAS PROG. DE BIOLOGA APLICADA ASIG. BIOQUMICA PROF.

. Jos Nelson Lombana Snchez.

EXTRACCIN Y ANLISIS CUANTITATIVO: Del ADN por espectrofotometra UV

RESUMEN Solo hay un tipo de clulas que no contienen ADN en sus nucleos, los eritrocitos maduros en humanos, son celulas anucleadas. El cido

acompaan los procesos de purificacin de las molculas de ADN deben ser evitadas al mximo y las nucleasas inhibidas. Se realizo un mtodo de obtencin y purificacin de ADN por extraccin orgnica, desarrollado en 1987, por l. madisen y colaboradores, las muestras resultantes tuvieron baja concentracin y pureza, por lo tanto se presume que estas muestras no podran ser utilizadas en procedimientos

desoxiribonucleico o ADN es la molcula que conserva el cdigo gentico de todas las clulas, ya sea que el organismo es multicelular o unicelular, eucariota o procariota, todos tienen el ADN como transportador de su cdigo gentico. Ahora muchas de las tcnicas de biologa molecular para la extraccin de ADN son ms

posteriores, el metodo podria ser mejorado de acuerdo con nuevas investigaciones en la

avanzadas a tal grado que el conocimiento del cdigo gentico cada vez es ms amplio. Los procedimientos iniciales eran largos y tediosos y podan pasar varios das antes de saber con certeza que se haba logrado obtener ADN en calidad y cantidad suficiente para poder

metodologa. Con la prctica basico se de logra toda comprender extraccin el y

fundamento

purificacin del ADN humano por mtodos de solubilizacin diferencial, y asi se infiere la importancia de desarrollar metodos de obtencion y purificacion de ADN mas eficientes para ser aplicados en trabajos de Genetica Molecular.

manipularlo. Hoy da podemos obtener suficiente ADN de buena calidad en unas horas. Despus de extrado el ADN, debe ser

Palabras clave: obtencin de ADN, purificacin de ADN, espectrofotometra UV INTRODUCCIN El ADN genmico puede obtenerse a partir de cualquier microrganismo, planta, animal en

desnaturalizado y por lo tanto se debe tener mucho cuidado en su remocin, aislamiento y purificacin con el fin de obtener un producto que conserve la identidad e integridad estructural con el ADN de la clula de la cual proviene. El estrs o tensin mecnica o fsico qumica, que

cualquier momento durante su desarrollo y nos ofrece copias moleculares de genes de cada organismo. Este material puede ser empleado para 1

la construccin de bibliotecas, en anlisis de hibridacin y como molde en reacciones de amplificacin y secuenciamiento, entre otras. Los mtodos de aislamiento de cidos nucleicos, sin importar el tipo o procedencia, siguen siempre cuatro etapas bsicas: la lisis de las clulas, la inhibicin de nucleasas, la desproteinizacin y la precipitacin de cidos nucleicos. La diferencia entre cada mtodo radica en el pre-tratamiento que se efecte, lo cual va a depender del origen del material, por otra parte se debe tener en cuenta que el mtodo de purificacin tiene que ser perfectamente compatible con el uso futuro que se le d al ADN o ARN purificado (Giraldo et al, 2010). El ADN puede aislarse mediante ruptura de tejidos y aprovechando las diferencias en las propiedades de los cidos nucleicos, las protenas y dems constituyentes celulares. Tras la lisis celular, se inhibe las nucleasas para que no degraden el material a purificar, para luego desproteinizar la muestra mediante mtodos

cuidadosa para evitar la degradacin como se menciono (Miller et al, 1988). Factores como los iones Ca2+ y Mg2 son importantes para la actividad del las DNAasas .El citrato de sodio presente en las soluciones empleadas para la extraccin y purificacin del ADN, atrapa estos iones e impide, de esta forma, la accin de las enzimas que digieren estas

molculas. Con el fin de eliminar en forma definitiva la actividad de las nucleasas, las etapas de remocin de las protenas deben ser llevadas a cabo tan rpido como sea posible y en fro (Miller et al, 1988). Las nucleoprotenas, son protenas que

aparecen asociadas con los cidos nucleicos de las clulas eucariotas; son insolubles en agua y en soluciones de baja fuerza inica pero solubles en soluciones de alta fuerza inica; propiedad que debe ser tenida en cuenta durante los procesos de extraccin inicial (Miller et al, 1988). La espectrofotometra es un mtodo analtico que utiliza los efectos de la interaccin de las radiaciones electromagnticas con la materia (tomos y molculas) para medir la absorcin o la transmisin de luz por las sustancias. La

qumicos como solventes orgnicos, detergentes no inicos o por mtodos enzimticos como las proteasas (Giraldo et al, 2010). El cido desoxirribonucleico ADN es el material gentico de las clulas eucariotas cuya

manipulacin y anlisis es imprescindible para el estudio de las bases moleculares mtodos en las

espectrofotometra es por tanto los mtodos cuantitativos de anlisis qumico que utilizan la luz para medir la concentracin de las sustancias qumicas. Se conocen como mtodos

enfermedades,

diversos

moleculares

permiten extraer ADN desde virus hasta clulas humanas. Para extraer el ADN se requiere aislar protenas, polisacridos y lpidos, adems el material utilizado en el proceso de extraccin debe estar libre de DNAasa asociado a manipulacin 2

espectrofotomtricos y, segn sea la radiacin utilizada, como espectrofotometra de absorcin visible (colorimetra), ultravioleta, infrarroja. La espectrofotometra bioqumica para es de gran utilidad en

identificar compuestos por su

espectro de absorcin, conocer la concentracin de un compuesto en una disolucin, as como en anlisis cuantitativos de protenas para la

minutos, tambin se descarto el sobrenadante. Por ltimo, se re suspendi el precipitado de cada tubo con 1,5mL de High TE, preparado con EDTA 40mM, Tris-HCl 100mM, con un pH 8,0. Extraccin fenol-cloroformo Al re suspendido anterior de cada tubo, se le

determinacin de cidos nucleicos incluyendo ADN, ARN y enzimas (Skoog y West, 1992). MATERIALES Y MTODOS rea de estudio Este trabajo se llevo a cabo en la sede de Cajic Cundinamarca de la Universidad Militar Nueva Granada UMNG, en el laboratorio de bioqumica. Se trabajaron varias partes: Material biolgico El tejido que se tomo como fuente para aislamiento del ADN fue sangre fresca, de procedencia humana. Se recolecto una muestra de sangre total, y por consiguiente se realizo la extraccin orgnica y purificacin de ADN segn el mtodo de L. Madisen y colaboradores,

aadi 4mL de fenol (OH) y 4mL de solucin cloroformo-alcohol isoamlico y se homogeniz suavemente; se centrifug durante 5 minutos a 2000rpm, y las fases acuosas superiores fueron transferidas a otro tubo. Se repiti la extraccin fenlica, y las nuevas fases acuosas fueron transferidas junto con las anteriores. Precipitacin del DNA Se tomo una fraccin de 3mL de la fase acuosa total anterior, a esta se le aadi 0,5mL de CH3COONH4 4M y 4,5mL de CH3CH(OH)CH3 a bajas temperaturas (-20C aprox). Por ltimo, a la solucin de ADN precipitado se transfiri a otro tubo con 0,5mL de Low TE, preparado con EDTA

desarrollado en 1987. Extraccin del ADN Lisis de glbulos La muestra de sangre se reparti a dos tubos de centrifuga con 2mL cada uno, a continuacin, se preparo un buffer 1:1 lisador de glbulos rojos con 2mL NH4Cl 0,155M, y 2mL Tris-HCl 0,17M, a un pH de 7,65 y se agreg un total de 4mL a cada tubo, donde posteriormente se centrifugaron a 2000rpm durante 10 minutos, y l sobrenadante fue

1mM, Tris-HCl 100 mM, a un pH 8.0. Pureza y cuantificacin Con la muestra obtenida de ADN, se realizaron lecturas en el espectrofotmetro con Absorbancia a 260nm y a 280nm espectro de luz ultravioleta. La estimacin de la pureza de la muestra de ADN se obtuvo con la relacin de DO (densidad ptica) a 260 y a 280 nm.

descartado. Al precipitado de cada tubo se le aadi 10mL de solucin NaCl al 0,85%, se homogeniz y se centrifug a 2000rpm durante 10 3

La cuantificacin de ADN se hizo con la lectura a 260nm, donde 1 unidad de Absorbancia a 260nm es igual 50g/mL

que la solucin Tris regule el caldo y mantenga el pH en un valor fijo. En la extraccin se logra la desproteinizacion, por accin del fenol y el cloroformo, que son desnaturalizadores activos de protenas que le

RESULTADOS Y DISCUSIN Las muestras para extraccin de ADN, deben seguir un procedimiento bsico, tales son lisis de las clulas, la inhibicin de nucleasas, la

suprimen la solubilidad en la preparacin, y por lo tanto las precipita. Ya que el fenol y el NaCl agregado, como solucin salina amortiguadora, no se mezclan, con la centrifugacin de la suspensin se logro separarlas, permaneciendo el DNA y el RNA en la solucin dentro de la fase acuosa de arriba y la protena presente como un precipitado. La fase acuosa se retiro del tubo con el fin de seguir sometiendo a ciclos repetidos de agitacin con fenol, y centrifugacin para as terminar toda la protena de la solucin. En la etapa final de la extraccin de ADN, este est en solucin, y es soluble en el buffer, entonces este se hizo insoluble mediante la adicin de alcohol isoproplico, al hacer esto, el ADN se hace visible en la solucin como una sustancia blanca delgado. A pesar de que cuando el ADN es insoluble se lo puede aislar tambin de los componentes celulares restantes, este no es "servible". Despus de aislarlo, se elimino el alcohol, y el ADN se devolvi a una solucin buffer Low TE, para ser utilizado, e igual que el High TE lo mantiene a un pH fijo, ya la concentracin de EDTA es menor, ya que no es necesario por la usencia casi total de proteasas o nucleasas que afecten el pH. . En la tabla 1 se pueden observar los datos obtenidos con respecto a las Absorbancias a 260nm y a 280nm de las muestras y el blanco Low 4

desproteinizacin y la precipitacin de cidos nucleicos. En la lisis, se logro la ruptura de las clulas, y se logro mediante el uso de una solucin buffer que contena solucin Tris y EDTA. La accin de este buffer se basa en desestabilizar la membrana mediante la eliminacin de cationes divalentes tales como el calcio y el magnesio, dado que estos ayudan a mantener la integridad de la membrana celular, entonces el EDTA se une a estos cationes con este fin. Y con la solucin Tris se mantiene el pH del buffer en un punto estable, por lo general a 8,0, y adems interactua con los lipopolisacaridos con el fin de desestabilizar la membrana aun mas. Con el NaCl se consigui producir el estallido de los ncleos para que queden libres las fibras de cromatina. Con la adicin del High TE, se mantiene el pH en un valor fijo, debido a que el ADN es sensible al pH, y este puede variar porque cuando las clulas se rompen, su ADN y contenido se vierten en el buffer, y en el contenido celular pueden haber fragmentos de ARN y protenas que puede tener un gran impacto en el pH, por lo que es importante

TE, y con su resta se obtuvo la Absorbancia total y real. Tabla 1. Absorbancias a 260nm y 280nm Absorbancia Muestra 260nm 280nm 1,088 1,078 Absorbancia Absorbancia blanco (Low TOTAL TE) 0,550 0,538 0,012 1.066

pruebas la muestra seria inservible por la misma contaminacin proteica. Esta falencia se puede observar en el porcentaje de error hallado ya que lo que se obtuvo corresponde casi solo al 30% de una alta pureza.

Entonces se puede inferir que la cuantificacin tendr un error casi del 70%, ya que se obtuvo un poco ms de la mitad de 50 Ya que los valores de la relacin de DO, para que la muestra de ADN fuera pura, deban ser alrededor de 1,8, el valor que en la prctica se obtuvo fue de 0,504 un valor mucho menor con respecto al que deba ser. Cuando da valores menores esto indica que la muestra posiblemente aun estaba contaminada con protenas que no fueron bien removidas en el proceso de extraccin con fenol-cloroformo. Luego de agregar fenol se considerara una homogenizacin mas prolongada de la que se realizo para tener mas accin con el solvente orgnico, adems de la centrifugacin, con el fin de obtener una mejor precipitacin de protenas, adema la solucin cloroformo y alcohol isoamilico debera ser agregada despus de la serie de extraccin solo con fenol y centrifugacin, para que as la solucin de cloroformo-alcohol isoamilico pueda eliminar los excesos de fenol, junto con una buena homogenizacin y centrifugacin. Por lo que se consideraria que el error y la mejora deberia de ser en este paso ya que el valor tan bajo del DO, se debe a contaminaciones proteicas, lo que en realidad impide las correctas lecturas 5 BIBLIOGRAFA
Cox M, Nelson D. 2009 Lehninger Principios de

, que es lo leido

por una unidad de Absorbancia.

Absorbancia 260nm

1 Abs 50 g/mL

0.538 Abs 26.9 g/mL

Bioquimica. 5 edicion. Editorial Omega. Barcelona, Espaa. Giraldo G. A, Loango N, Meja C. M. 2010. Laboratorio de Bioqumica: una visin prctica. Facultad de Ciencias Bsicas. Universidad del Quindo. 151-152p Miller S. A, Dykes D. D, Polesky H. F. 1988. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acid Res, 16:1215. Skoog D. A, West J. F. 1992. Qumica Analtica. Editorial Mc Graw Hill, Mxico. 120p

espectrofotomtricas, y si se quisiese usar en otras