Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA

rekombinan. Plasmid banyak sekali digunakan dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah dalam penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler (tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti, 2006). Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan sebagai wahana (vektor) kloning, antara lain adalah : a). plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan dimanipulasi; b). DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia; c). mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi; d). mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi; e). mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang membawa gen tertentu (Brock, et al., 1994). Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu tahap kultivasi dan harvesting, tahap lisis dan tahap pemurnian DNA plasmid. Kultivasi yaitu memberikam kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. Lisis (pemecahan dinding sel), membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya Restriksi Enzim restriksi endonuklease (enzim restriksi) mengenali urutan nukleotida spesifik dan memotong DNA pada posisi di antara atau di luar sekuen yang dikenalinya tersebut. Enzim ini telah ditemukan lebih dari 30 tahun yang lalu sehubungan dengan fenomena pemotongan yang spesifik terhadap bakteri inang dan modifikasi oleh virus bakteri. Bakteri pada mulanya tahan terhadap infeksi virus karena bakteri memiliki sistem pertahanan dengan merusak molekul DNA asing yang masuk ke dalam selnya. Enzim restriksi yang berhasil dimurnikan pertama kali adalah EcoRI dan EcoRII dari Escherichia coli, dan HindII dan HindIII dari Haemophilis influenza. Enzim-enzim tersebut diketahui memotong

DNA pada urutan basa tertentu yang spesifik, yang menghasilkan fragmen-fragmen seukuran gen yang dapat disambungkan kembali. Para peneliti dengan cepat segera mengetahui bahwa enzim restriksi merupakan alat biologis baru yang dapat digunakan untuk mempelajari organisasi, fungsi, dan ekspresi gen. Enzim restriksi melindungi bakteri dari infeksi virus. Enzim ini berperan dalam sistem imun pada mikroorganisme. Jika bakteri E. coli yang tidak memiliki enzim restriksi diinfeksi virus, maka sebagian besar partikel virus mampu menyebabkan infeksi. Namun, jika bakteri E. coli memiliki enzim restriksi, kemungkinan infeksi virus akan menurun. Enzim restriksi biasanya terdapat dalam kombinasi dengan enzim pemodifikasi lain yang melindungi DNA-nya sendiri dari pemotongan, misalnya DNA-metil transferase (dnmt). Dnmt akan memetilasi basa DNA pada tiap untai sehingga sekuen yang dikenali oleh enzim restriksi tidak akan terpotong. Secara umum, enzim restriksi dapat dibedakan ke dalam 3 tipe, berdasarkan pada komposisi sub unit, posisi pemotongan, spesifisitas sekuen DNA, dan perlu tidaknya kofaktor. Enzim-enzim tipe I merupakan enzim yang kompleks, multisubunit, kombinasi antara restriksi dan pemodifikasi yang memotong DNA pada area random yang jauh dari sisi pengenalan. Enzim tipe I secara biokimia mungkin banyak berfungsi di dalam sel, tetapi mereka kurang menguntungkan untuk digunakan dalam percobaan di laboratorium. Enzim tipe II memotong DNA pada posisi tertentu yang dekat atau berada di antara sekuen yang dikenalnya. Enzim tipe II menghasilkan fragmen-fragmen tertentu dengan pola pita-pita yang spesifik pada gel agarosa. Enzim tipe inilah yang dipakai untuk berbagai percobaan dalam analisis DNA dan kloning gen. Enzim tipe III juga merupakan kombinasi restriksi dan enzim pemodifikasi. Enzim ini memotong DNA di luar sekuen yang dikenal dan memerlukan 2 sekuen yang sama pada orientasi yang berlawanan pada untai DNA yang sama untuk dapat memotong. Enzim-enzim ini jarang menghasilkan potongan yang sempurna. Ada beberapa faktor kunci yang harus diperhatikan untuk melakukan pemotongan dengan enzim restriksi (enzyme digestion). Di antaranya adalah: gunakan jumlah DNA, enzim, dan buffer yang benar dalam volume reaksi total yang sesuai. Satu unit enzim restriksi akan memotong 1 ug DNA secara sempurna dalam 50 ul reaksi selama 1 jam. Rasio enzim : DNA : volume reaksi ini dapat digunakan sebagai pedoman dalam menentukan reaksi. Meskipun demikian, sebagian besar peneliti mengikuti pedoman umum reaksi digesti di mana 10 kali over-digesti direkomendasikan untuk mengatasi

variasi dalam sumber, jumlah dan kemurnian DNA. DNA harus terbebas dari kontaminan seperti fenol, kloroform, alkohol, EDTA, deterjen (SDS) atau garam yang berlebih. Metilasi DNA dapat mengakibatkan penghambatan digesti dengan enzim tertentu. DNA plasmid superkoil dan DNA yang terikat gel agarose pada umumnya memerlukan lebih dari 1 unit/ug untuk dapat terpotong sempurna. Enzim restriksi merupakan enzim yang tidak stabil. Oleh karena itu, sebaiknya disimpan pada suhu -20C untuk sebagian besar enzim. Beberapa enzim perlu disimpan pada -70C. Enzim ini harus tetap disimpan di dalam es ketika dikeluarkan dari freezer dan harus selalu menjadi komponen yang ditambahkan terakhir pada campuran reaksi. Selain stabilitas, harga enzim restriksi pun mahal. Campur reaksi dengan baik dengan cara pemipetan atau menggoyang tabung reaksi. Sentrifus dengan cepat selama beberapa detik jika ada cairan yang menempel di dinding tabung. Untuk menghentikan reaksi enzim, dapat dilakukan penambahan stopper reagent yang mengandung SDS-EDTA. Pemetaan Plasmid Menurut Brown (1991) dan Glick and Pasternak (1994), dalam menyusun peta restriksi harus dilakukan suatu rangkaian digesti restriksi. Jumlah dan ukuran fragmen yang dihasilkan oleh tiap-tiap endonuklease restriksi harus ditentukan dengan elektroforesis gel, kemudian dibandingkan dengan ukuran marka. Hasil yang didapat harus didukung oleh hasil rangkaian digesti ganda, yaitu DNA dipotong dengan dua enzim restriksi secara bersamaan. Pembandingan hasil digesti tunggal dan digesti ganda akan memungkinkan pemetaan banyak tempat restriksi.

Daftar pustaka
Brock, T. D., Michael T. Madigan, john M. Martinko and Paker. 1994. Biology of microorganisms. Prentice Hall.

Brown, T.A. 1991. Pengantar Kloning Gena (terjemahan). Yayasan Essentia Medica. Glick, B.R. and J.J. Pasternak. 1994. Molekuler Biotechnology, Principles and applications of Recombinan DNA. ASM Press. Washinton D.C
Suharsono dan Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, IPB