ESTRUCTURA DE LOS CIDOS NUCLICOS

Mdelo de la Doble Hlica

Difraccin de Rayos X: ADN-B

J. Watson y F. Crick

Composicin de los cidos nucleicos. Proporciones de las Bases Nitrogenadas: Reglas de Chargaff (1950). El Modelo de la Doble Hlice: Watson y Crick (1953). Alternativas al Modelo de la Doble Hlice. Propiedades fsico-qumicas de los cidos nucleicos. Densidad de los cidos Nucleicos. Desnaturalizacin: Temperatura de Fusin. Absorbancia a 260 nm. Cintica de la Renaturalizacin: Curvas Cot. Hibridacin de los cidos nucleicos. Secuenciacin del ADN: Mtodo Didesoxi y Mtodo Automtico.

COMPOSICIN QUMICA DE LOS CIDOS NUCLEICOS

Miescher en 1871 aisl del ncleo de las clulas de pus una sustancia cida rica en fsforo que llam "nuclena". Un ao ms tarde, en 1872, aisl de la cabeza de los espermas del salmn un compuesto que denomin "protamina" y que result ser una sustancia cida y otra bsica. El nombre de cido nucleico procede del de "nuclena" propuesto por Miescher.

Cuando se realiza la hidrlisis completa de los cidos nucleicos, se obtienen tres tipos de componentes principales:

Azcar, en concreto una pentosa. Bases nitrogenadas: pricas y pirimidnicas. cido fosfrico.

El azcar, en el caso de los cidos desoxirribonucleicos (ADN) es la 2-desoxiD-ribosa y en el caso de los cidos ribonucleicos (ARN) es la D-ribosa.

Pentosas

cido fosfrico

Las bases nitrogenadas que forman parte de los cidos nucleicos son de dos tipos, pricas y pirimidnicas. Las bases pricas derivadas de la purina (fusin de un anillo pirimidnico y uno de imidazol) son la Adenina (6-aminopurina) y la Guanina (2-amino-6-hidroxipurina). Las bases pirimidnicas (derivadas de la pirimidina) son la Timina (2,6-dihidroxi-5-metilpirimidina o tambin llamada 5metiluracilo), Citosina (2-hidroxi-6-aminopirimidina) y Uracilo (2,6dihidroxipirimidina). Las bases nitrogenadas que forman normalmente parte del ADN son: Adenina (A), Guanina (G), Citosina y Timina (T). Las bases nitrogenadas que forman parte de el ARN son: Adenina (A), Guanina (G),

Citosina (C) y Uracilo (U). Por tanto, la Timina es especfica del ADN y el Uracilo es especfico del ARN.

Bases Pricas

Bases Pirimidnicas

Adems de las bases nitrogenadas anteriormente descritas, se han encontrado otras bases nitrogenadas en algunos virus o formando parte de algunos tipos especiales de ARNs. Ejemplos de algunas de estas bases pricas poco corrientes son: Hipoxantina, Xantina, 2-metiladenina, 6-metil-aminopurina. Entre las bases pirimidnicas podramos citar la 5-metilcitosina (propia del ADN) y la 5-hidroximetil citosina (HMC) que sustituye a la citosina en los fagos Tpares. En los ARN transferentes (ARN-t) que intervienen en el proceso de traduccin de protenas se encuentran la Ribotimidina, Dihidrouridina, Seudouridina e Inosina (I). La unin de la base nitrogenada a la pentosa recibe el nombre de nuclesido y se realiza a travs del carbono 1 de la pentosa y los nitrgenos de las posiciones 3 (pirimidinas) o 9 (purinas) de las bases nitrogenadas mediante un enlace de tipo N-glucosdico. La unin del nuclesido con el cido fosfrico se realiza a travs de un enlace de tipo ster entre el grupo OH del carbono 5 de la pentosa y el cido fosfrico, originando un nucletido. Los nucletidos son las unidades o monmeros utilizados para construir largas cadenas de polinucletidos.

Nuclesido = Pentosa + Base nitrogenada. Nucletido = Pentosa + Base nitrogenada + cido fosfrico. Polinucleotido = Nucletido + Nucletido + Nucletido + ....

Nucletido Tanto los nucletidos como los nuclesidos pueden contener como azcar la D-ribosa (ribonucletidos y ribonuclesidos) o la pentosa 2-desoxi-D-ribosa (desoxirribonucletidos y desoxirribonuclesidos). Adems, los nucletidos pueden tener 1, 2 3 grupos fosfato unidos al carbono 5 de la pentosa, existiendo por tanto, nucletidos 5 monofosfato, nucletidos 5 difosfato y nucletidos 5 trifosfato. En algunos casos el cido fosfrico se une a la pentosa por el carbono 3, existiendo nucletidos 3 monofosfato, difosfato o trifosfato segn el nmero de grupos fosfato que posea. La terminologa empleada para referirse a los nuclesidos y nucletidos es la siguiente: Base Nitrogenada Adenina Guanina Citosina Timina Uracilo Nuclesido Adenosina Guanidina Citidina Timidina Uridina Nucletido cido Adenlico cido Guanlico cido Citidlico cido Timidlico cido Uridlico

Los nucletidos se unen entre si para formar largas cadenas de polinucletidos, esta unin entre monmeros nucletidos se realiza mediante enlaces fosfodister entre los carbonos de las posiciones 3 de un nucletido con la 5 del siguiente.

Polinucletido

PROPORCIONES DE LAS BASES NITROGENADAS: REGLAS DE CHARGAFF

Al principio se pensaba que los cidos nucleicos eran la repeticin montona de un tetranucletido, de forma que no tenan variabilidad suficiente para ser la molcula biolgica que almacenara la informacin. Sin embargo, Chargaff (1950) demostr que las proporciones de las bases nitrogenadas eran diferentes en los distintos organismos, aunque seguan algunas reglas. Estas reglas de Chargaff se cumplen en los organismos cuyo material hereditario es ADN de doble hlice y son las siguientes: REGLAS DE CHARGAFF PARA ADN DE DOBLE HLICE

Edwin Chargaff

La proporcin de Adenina (A) es igual a la de Timina (T). A = T . La relacin entre Adenina y Timina es igual a la unidad (A/T = 1). La proporcin de Guanina (G) es igual a la de Citosina (C). G= C. La relacin entre Guanina y Citosina es igual a la unidad ( G/C=1). La proporcin de bases pricas (A+G) es igual a la de las bases pirimidnicas (T+C). (A+G) = (T + C). La relacin entre (A+G) y (T+C) es igual a la unidad (A+G)/(T+C)=1. Sin embargo, la proporcin entre (A+T) y (G+C) era caracterstica de cada organismo, pudiendo tomar por tanto, diferentes valores segn la especie estudiada. Este resultado indicaba que los cidos nucleicos no eran la repeticin montona de un tetranucletido. Exista variabilidad en la composicin de bases nitrogenadas.

En la siguiente tabla se observan las proporciones de las bases nitrogenadas en algunos organismos. Procedencia del ADN Timo de Bovino Esperma de bovino Germen de trigo Saccharomyces Escherichia coli Mycobacterium tuberculosis X174 T3 T5 T7 A 28,2 28,7 27,3 31,3 26,0 15,1 24,3 23,7 30,3 32,4 G 21,5 22,2 22,7 18,7 24,9 34,9 24,5 26,2 19,5 18,3 C 21,2 20,7 16,8 17,1 25,2 35,4 18,2 27,7 19,5 T 27,8 27,3 27,1 32,9 23,9 14,6 32,3 23,5 30,8 32,4 5-Me-C 1,3 1,3 6,0 17,0 HMC

Virus ARN Mosaico del tabaco (TMV) Mosaico amarillo nabo Poliomielitis Encfalo miocarditis del ratn Reovirus Tipo 3 Tumor de las heridas

A 29,8 22,6 28,6 27,3 28,0 31,1

G 25,4 17,2 24,0 23,5 22,3 18,6

C 18,5 38,0 22,0 23,2 22,0 19,1

U 26,3 22,2 25,4 25,9 27,9 31,3

De la observacin de la tabla anterior pueden extraerse las siguientes conclusiones:

Todos los ADN estudiados cumplen la relacin A=T y G=C, excepto el ADN del bacteriofago X174. El ADN de este virus es de una sola hlice. En los virus ARN no se cumple la equimolaridad de las bases excepto en el caso del virus del Tumor de las heridas y de los Reovirus que tienen ARN de doble hlice. En estos virus se cumple que A=U y G=C, adems se cumple que A+G/U+C=1. El fago T2 y los otros fagos T-pares (T4 y T6) en vez de citosina tienen hidroximetil-citosina (HMC). Algunos organismos tiene en su ADN una pequea proporcin de 5metil-citosina (5-Me-C) que sustituye a la citosina.

Igualmente, en la siguiente tabla puede observarse como la proporcin A+T/G+C varia de un organismo a otro. Organismo Escherichia coli Diplococcus pneumoniae Mycobacterium tuberculosis Levadura Paracentrolus lividus (erizo mar) Arenque Rata Hombre Hombre Hombre Tejido Esperma Esperma Mdula sea Timo Hgado Esperma A+T/G+C 1,00 1,59 0,42 1,79 1,85 1,23 1,33 1,52 1,53 1,52

Por tanto, la proporcin A+T/G+C es especfica de cada organismo y como veremos ms adelante cuando hablemos de las propiedades fsico- qumicas

de los cidos nucleicos, dicha proporcin est relacionada con la densidad y la temperatura de fusin.

EL MODELO DE LA DOBLE HLICE: WATSON Y CRICK (1953)

Una vez demostrado que los cidos nucleicos eran los portadores de la informacin gentica, se realizaron muchos esfuerzos encaminados a determinar su estructura con exactitud. Watson y Crick (1953) fueron los primeros investigadores en proponer una estructura para los cidos nucleicos y su labor investigadora se vio recompensada con el Premio Nobel en 1962, Premio Nobel que compartieron con M. H. F. Wilkins y que se les concedi por sus descubrimientos en relacin con la estructura molecular de los cidos nuclecos y su significacin para la transmisin de la informacin en la materia viva.. Para realizar su trabajo emplearon dos tipos de datos ya existentes.

Francis H. C. Circk

James D. Watson

Maurice H. F. Wilkins

Por un lado, utilizaron los datos obtenidos varios aos antes por Chargaff (1950), relativos a la composicin de bases nitrogenadas en el ADN de diferentes organismos. El otro tipo de datos eran los procedentes de estudios de difraccin de rayos X sobre fibras de ADN. Para determinar la estructura tridimensional o disposicin espacial de las molculas de ADN, se hace incidir un haz de rayos X sobre fibras de ADN y se recoge la difraccin de los rayos sobre una pelcula fotogrfica. La pelcula se impresiona en aquellos puntos donde inciden los rayos X, produciendo al revelarse manchas. El ngulo de difraccin presentado por cada una de las manchas en la pelcula suministra informacin sobre la posicin en la molcula de ADN de cada tomo o grupo de tomos.

Mediante esta tcnica de difraccin de rayos X se obtuvieron los siguientes resultados:

Las bases pricas y pirimidnicas se encuentran unas sobre otras, apiladas a lo largo del eje del polinucletido a una distancia de 3,4 . Las bases son estructuras planas orientadas de forma perpendicular al eje (Astbury, 1947). El dimetro del polinucletido es de 20 y est enrollado helicoidalmente alrededor de su eje. Cada 34 se produce una vuelta completa de la hlice.

Existe ms de una cadena polinucleotdica enrollada helicoidalmente (Wilkins et el. 1953, Frankling y Gosling, 1953).

Difraccin de Rayos X: ADN-B

Rosalin Franklin

Basndose en estos dos tipos de datos Watson y Crick propusieron su Modelo de estructura para el ADN conocido con el nombre de Modelo de la Doble Hlice. Las caractersticas del Modelo de la Doble Hlice son las siguientes:

El ADN es una doble hlice enrollada helicoidalmente a derechas (sentido dextrorso). Algo parecido a dos muelles entrelazados. Enrollamiento de tipo plectonmico: para separar las dos hlices es necesario girarlas como si fuera un sacacorchos.

Mdelo de la Doble hlice: ADN-B

J. Watson y F. Crick

Cada hlice es una serie de nucletidos unidos por enlaces fosfodister en los que un grupo fosfato forma un puente entre grupos OH de dos azcares sucesivos (posiciones 3 de un azcar y 5 del siguiente). Las dos hlices se mantienen unidas mediante puentes o enlaces de hidrogeno producidos entre las bases nitrogenadas de cada hlice. Siguiendo los datos de Chargaff (1959), la Adenina de una hlice aparea

con la Timina de la hlice complementaria mediante dos puentes de hidrgeno. Igualmente, la Guanina de una hlice aparea con la Citosina de la complementaria mediante tres puentes de hidrgeno.

Par A-T

Par G-C

Pares A-T y G-C

Las dos hlices por razones de complementaridad de las bases nitrogenadas son antiparalelas, teniendo secuencias de tomos inversas. Una hlice lleva la secuencia 5P 3 OH , mientras que la hlice complementaria sigue la secuencia de tomos 3OH 5P. El dimetro de la doble hlice es de 20 . Las bases nitrogenadas son estructuras planas perpendiculares al eje de la doble hlice y estn apiladas unas sobre otras a una distancia de 3,4 . Cada 10 bases, cada 34 se produce una vuelta completa de la doble hlice (360). Las bases se encuentran en sus configuraciones cetnicas, cumpliendo as las reglas de apareamiento A-T y G-C. La secuencia de bases nitrogenadas puede ser cualquiera, no existe ninguna restriccin.

Adems, la estructura en doble hlice propuesta por Watson y Crick (1953) sugera varas propiedades importantes del material hereditario:

Las reglas de complementaridad de las bases nitrogenadas A-T y G-C sugieren un forma sencilla de replicacin del material hereditario. Esta forma sencilla de replicacin se denomina mtodo Semiconservativo. Cuando el ADN se replica sus dos hlices se separan y cada una de ellas sirve de molde para sintetizar una nueva hlice siguiendo las reglas de apareamiento de las bases nitrogenadas. La mutacin a nivel molecular consistira en un cambio en la secuencia de bases nitrogenadas del ADN. Al no existir ninguna restriccin en la secuencia de bases nitrogenadas, el ADN posea la suficiente variabilidad como para ser el material hereditario. Adems, esta estructura sugera la existencia de algn cdigo que permitiera pasar de la secuencia lineal de bases nitrogenadas en el ADN a la secuencia lineal de aminocidos en las protenas.

ALTERNATIVAS AL MODELO DE LA DOBLE HLICE

El modelo de la Doble Hlice propuesto por Watson y Crick est basado en estudios del ADN en disolucin (hidratado). La denominada forma B ADN-B tiene un mayor inters biolgico ya que es la que presenta el ADN en interaccin con las protenas nucleares. Adems de la forma B, existen otras estructuras posibles que puede presentar el ADN. Algunas de estas alternativas son las siguientes:

ADN-B: ADN en disolucin, 92% de humedad relativa, se encuentra en soluciones con baja fuerza inica se corresponde con el modelo de la Doble Hlice. ADN-A: ADN con 75% de humedad, requiere Na, K o Cs como contraiones, presenta 11 pares de bases por giro completo y 23 de dimetro. Es interesante por presentar una estructura parecida a la de los hbridos ADN-ARN y a las regiones de autoapareamiento ARN-ARN. ADN-C: ADN con 66% de humedad, se obtiene en presencia de iones Li, muestra 9+1/3 pares de bases por giro completo y 19 de dimetro. ADN-Z: doble hlice sinistrorsa (enrollamiento a izquierdas), 12 pares de bases por giro completo, 18 de dimetro, se observa en segmentos de ADN con secuencia alternante de bases pricas y pirimidnicas (GCGCGC), debido a la conformacin alternante de los residuos azcar-fosfato sigue un curso en zig-zag. Requiere una concentracin de cationes superior a la del ADN-B, y teniendo en cuenta que las protenas que interaccionan con el ADN tienen gran cantidad de residuos bsicos sera posible que algunas convirtieran segmentos de ADN-B en ADN-Z. Las posiciones N7 y C8 de la Guanina son ms accesibles.

ADN-A

ADN-B

ADN-Z

ADN-A

ADN-Z

ADN-B

ADN con enrollamiento paranmico: Las dos hlices se pueden separar por traslacin, cada hlice tiene segmentos alternantes dextrorsos y sinistrorsos de unas cinco bases. Uno de los principales problemas del modelo de la doble hlice (ADN-B) es el enrollamiento plectonmico, para separar las dos hlices es necesario girarlas como un sacacorchos, siendo necesario un gran aporte energtico. ADN triple hlice o ADN-H: "In vitro" es posible obtener tramos de triple hlice intercalando oligonucletidos cortos constituidos solamente por

pirimidinas (timinas y citosinas) en el surco mayor de una doble hlice. Este oligonucletido se une a pares de bases A-T y G-C mediante enlaces de hidrgeno tipo Hoogsteen que se establecen entre la T o la C del oligonucletido y los pares A-T y G-C de la doble hlice. No se sabe la funcin biolgica del ADN-H aunque se ha detectado en cromosomas eucariticos.

Triple hlice: pirimidinas

Triple hlice: purinas

Triple Hlice

ADN cuadruplexo: "In vitro" se han obtenido cuartetos de Guanina (ADN cuadruplexo) unidas mediante enlaces tipo Hoogsteen, empleando polinucletidos que solamente contienen Guanina (G). Los extremos de los cromosomas eucariticos (telmeros) tienen una estructura especial con un extremo 3' OH de cadena sencilla (monocatenario) en el que se repite muchas veces en tandem una secuencia rica en Guaninas. Se piensa que el ADN cuadruplexo telomrico servira para proteger los extremos cromosmicos de la degradacin enzimtica. Ejemplo de secuencia telomrica rica en guaninas (G): 5P TTGGGTTGGGGTTGGGG...............TTGGGG 3'OH

Cuartetos de Guanina Adems, de las alternativas anteriormente citadas es necesario tener en cuenta que no todos los organismos vivos tienen como material hereditario ADN de doble hlice, algunos virus tienen ADN de hlice sencilla, ARN de una y de doble hlice.

Palndromos: plegamiento o apareamiento de una hlice consigo misma. El palndromo tambin es una figura gramatical que se lee igual en los dos sentidos, por ejemplo: DABALE ARROZ A LA ZORRA EL ABAD. Existe ADN palindrmico de hlice sencilla y de hlice doble. En el palndromo de doble cadena la secuencia de bases se lee igual en direccin 5 P 3OH en ambas cadenas.

Secuencias palindrmicas

Palndromos en ADN de una y doble hlice

Existen algunos virus cuyos cidos nucleicos son de una sola hlice: el ADN de los fagos X174 y M13 es circular de hlice sencilla, sin embargo, se ha comprobado que una pequea parte resiste la accin de enzimas que digieren especficamente ADN de hlice sencilla. Por tanto, estas regiones resistentes de ADN presentan complementaridad interna o autoapareamiento, formando ADN duplex o doble hlice, teniendo secuencias palndrmicas. Una situacin semejante se ha observado en el ARN de hlice sencilla del bacteriofago MS2 (3569 ribonucleotidos y tres genes). En este caso, el gen de la protena de la cubierta del virus presenta segmentos que tienen complementaridad interna (autoapareamiento) que se pliegan sobre si mismos formando horquillas (regiones de ARN de doble hlice).

ARN Fago MS2: protena de la cpside

El ARN transferente (ARN-t) que transporta los aminocidos y el ARN ribosmico (ARN-r) que intervienen en el proceso de traduccin, son cidos ribonucleicos de una sola hlice y tambin presentan autoapareamiento.

Esquema ARN-transferente

Esquema ARN-ribosmico de Tetrahymena

PROPIEDADES FSICO-QUMICAS DE LOS CIDOS NUCLEICOS

Las principales propiedades fsico-qumicas de los cidos nucleicos que vamos a considerar son las siguientes:

Densidad de los cidos nucleicos. Desnaturalizacin de los cidos nucleicos: Temperatura de fusin (Tm). Absorbancia a 260 nm. Cintica de Renaturalizacin: Curvas Cot. Hibridacin de los cidos nucleicos.

DENSIDAD DE LOS CIDOS NUCLEICOS

Densidad: existe una relacin lineal entre el contenido en G+C y la densidad del ADN determinada en un gradiente de densidad. A mayor contenido en G+C mayor densidad posee el ADN.

Cuanto mayor es el contenido en (G+C) mayor es la densidad.

Meselson y col. (1957) desarrollaron una tcnica de centrifugacin en gradiente de densidad. Cuando se centrifuga a alta velocidad un solucin densa (saturada) de un soluto de bajo peso molecular (ClCs 7,7 M, sucrosa, etc.) se produce un equilibrio entre dos fuerzas opuestas, la de difusin del soluto y la fuerza de sedimentacin, como consecuencia se produce un gradiente de densidad que aumenta en la direccin de la fuerza centrifuga (aumenta a medida que avanzamos hacia el fondo del tubo de centrifuga). Si aadimos al centrifugar una molcula de ADN, est migrar hacia el fondo del tubo hasta llegar al punto en que la densidad del soluto de bajo peso molecular (la densidad del ClCs) coincide con la densidad del ADN centrifugado (densidad de flotacin). Posteriormente, es posible aislar las molculas de ADN de diferente densidad practicando un orificio en el fondo del tubo y sacando varias fracciones diferentes. Tambin es posible pinchar el tubo con una jeringa, justo en la posicin de la banda y extraer el ADN contenido de esa zona del tubo.

Centrifugacin en gradiente de CsCl

Basndose en mltiples estudios de la densidad de los ADNs de diferentes organismos y de su composicin en bases nitrogenadas, se ha establecido una frmula emprica que relaciona la densidad de flotacin () con el contenido en G+C expresado en moles por ciento. Est frmula es la siguiente: = 1,660 + 0,00098(G+C).

DESNATURALIZACIN: TEMPERATURA DE FUSIN

Desnaturalizacin: la proporcin A+T/C+G est relacionada en primer lugar con la estabilidad de la molcula de ADN de doble hlice. Cuanto mayor es el contenido en G+C de una molcula, mayor cantidad de pares G-C presentar, como consecuencia tendr una mayor cantidad de triples enlaces y, por consiguiente, ser necesario suministrar una mayor cantidad de energa a esa doble hlice para separar sus dos hebras (desnaturalizacin o fusin del ADN). Cuanto mayor es el contenido en G+C mayor cantidad de calor que hay que suministrar a un ADN de doble hlice para desnaturalizarlo. La temperatura de fusin (Tm) necesaria para desnaturalizar la mitad del ADN de una mezcla (punto medio de la reaccin ADN doble hlice ADN hlice sencilla) esta directamente relacionada con el contenido en G+C, a mayor contenido en G+C mayor temperatura de fusin (Tm).

Relacin entre el contenido en (G+C) y Tm

Curvas de desnaturalizacin de diferentes ADNs

ABSORBANCIA A 260 nm
Absorbancia a 2.600 : El estado fsico de los cidos nucleicos est relacionado con su capacidad de absorcin de la luz ultravioleta (UV) a 2.600 . El menor grado de absorcin se produce en estado de doble hlice, la absorcin aumenta cuando se produce la desnaturalizacin pasando a estado de hlice sencilla (efecto hipercrmico, aumento de la absorbancia) y, por

ltimo, si degradamos este ADN de hlice sencilla a nivel de nucletidos libres, de nuevo aumenta la absorbancia.

Esquema efecto hipercrmico Por tanto, la absorbancia a 2.600 se puede utilizar como una medida del estado fsico de la molcula de ADN. Las curvas de fusin tienen forma de S observndose un aumento brusco de la absorbancia al llegar a una temperatura determinada, la temperatura de fusin.

CINTICA DE RENATURALIZACIN: CURVAS CoT

Velocidad de renaturalizacin: la velocidad de renaturalizacin del ADN de un organismo est relacionada con su complejidad. Lacomplejidad se define como la suma del nmero de nucleotidos que tiene cada tipo de secuencia sin tener en cuenta el nmero de veces que esta repetida. El ADN de los virus y las bacterias en su mayora slo tiene secuencias que estn una sola vez en el genoma (secuencias nicas). Sin embargo, los organismo ms complejos, como los eucariontes, presentan distintos tipos de secuencias en su genoma. Los eucariontes tienen secuencias nicas (SU), secuencias de bajo nmero de copias (SBNC, 2-10 copias), secuencias repetidas (SR, alrededor de 102 copias) y altamente repetidas (SAR, 103 a 106 copias). Tipo de Secuencia A (SU) B (SU) C (SBNC) D (SBNC) E (SR) F (SAR) G (SAR) Complejidad N de repeticiones 1 1 4 6 200 10.000 1.000.000 N de nucletidos 5.700 7.530 3.720 4.350 500 300 200 22.300

Si imaginamos un organismo eucarionte con los tipos de secuencias indicados en la tabla anterior, su complejidad sera la suma del nmero de nucletidos de cada tipo de secuencia (22.300) sin tener en cuenta el nmero de veces que est repetida cada una de ellas. No es difcil imaginar que la velocidad de renaturalizacin del ADN (paso de dos hlices sencillas a una doble hlice) este relacionada con el nmero de veces que esta repetida una determinada secuencia. Supongamos que tenemos dos organismos hipotticos distintos, ambos con la misma cantidad de ADN (1.000.000 de pares de nucletidos). El organismo A posee 1.000 secuencias nicas diferentes, cada una con una longitud media de 1.000 nucletidos. El organismo B tiene una secuencia de 100 nucletidos de longitud que est repetida 10.000 veces. Si extraemos el ADN de estos dos organismos por separado, lo desnaturalizamos y las piezas de ADN desnaturalizado de cada organismo se ponen en condiciones de renaturalizar (tamao uniforme de los fragmentos de ADN, entre 250 y 450 pb, temperatura, condiciones inicas, etc), es evidente que el ADN del organismo B renaturalizar mucho antes, ms rpidamente, que el del organismo A, ya que es mucho ms probable que la secuencia que est repetida 10.000 veces encuentre otra complementaria en el medio de reaccin para formar la doble hlice.

Las curvas de renaturalizacin o curvas Cot, de organismos que carecen de secuencias repetidas como virus y bacterias, tienen forma de S, tienen un slo punto de inflexin o punto medio de la reaccin. Todas las secuencias son nicas y tienen la misma probabilidad de encontrar a su complementaria para formar la doble hlice.

Curvas Cot de virus y bacterias

Curvas Cot de un eucarionte

Las curvas Cot de organismos eucariontes con diferentes tipos de secuencias, poseen varios puntos de inflexin. Cada uno de ellos correspondiente a un tipo de secuencias (nicas, moderadamente repetidas, y altamente repetidas). Como en el caso de las curvas de fusin, tambin se utiliza como medida el punto medio de la reaccin de renaturalizacin, es decir, el Cot o tiempo al que se ha reasociado la mitad del ADN. El Cot es directamente proporcional a la complejidad del ADN del organismo. Valores de Cot bajos (10 -4 a 10-1) corresponden a secuencias altamente repetidas, valores de Cot comprendidos entre 10 y 102 corresponden a secuencias moderadamente repetidas y las secuencias nicas o de bajo nmero de copias dan lugar a valores de Cot altos (mayores de 103) .

HIBRIDACIN DE LOS CIDOS NUCLEICOS

Las tcnicas de desnaturalizacin y posterior renaturalizacin se utilizan para conseguir la hibridacin de cidos nucleicos, es decir, una vez separadas las dos hebras del ADN doble hlice, es posible volver a formar una doble hlice con una hebra de ADN que sea complementaria (hibridacin de ADN con ADN) o volver a formar una doble hlice con un segmento de ARN que contenga la secuencia complementaria (hibridacin de ADN con ARN). Endonucleasas de restriccin Las tcnicas de hibridacin (desnaturalizacin y posterior renaturalizacin) permiten, por ejemplo, identificar el gen que ha dado lugar a un determinado ARN-mensajero. Si se asla un mensajero determinado en una clula, es posible hibridar este ARN con el ADN de la clula previamente fragmentado mediante el uso de endonucleasas de restriccin. Las endonucleasas de restriccin de tipo II son enzimas que reconocen secuencias cortas de ADN (de 4 a 6 pares de bases) de tipo palindrmico y

cortan por el interior de la secuencia diana a la misma altura en las dos hlices de ADN (corte simtrico) o a distinto nivel en cada hlice (corte asimtrico).

Eco RI

Hae III

Dichas endonucleasas de restriccin fueron descubiertas por Werner Arber, Hamilton O. Smith y Daniel Nathans en la bacteria E.coli , trabajos por los que recibieron el premio Nobel. Estas enzimas forman parte del sistema de defensa (sistema de modificacin-restriccin) de las bacterias frente a la entrada de ADN exgeno en su interior. Existen cientos de endonucleasas diferentes que reconocen distintas secuencias cortas de tipo palndrmico. En la siguiente tabla se indican algunas de las endonucleasas ms frecuentes: Secuencia que reconoce (5' 3') y lugar de corte () 5' GAATTC 3' (asimtrico) 5' CCTGG 3' (asimtrico) 5' GGCC 3' (simtrico) 5' GTPiPu AC 3' (simtrico) 5' AAGCTT 3' (asimtrico) 5' GTTAAC 3' (simtrico) 5' CCGG 3' (asimtrico) 5' CGPuPiCG 3' (simtrico)

Endonucleasa de restriccin Eco RI Eco RII Hae III Hin dII Hin dIII Hpa I Hpa II Ava I

Bacteria de la que procede Escherichia coli Escherichia coli Haemophilus aegyptus Haemophilus influenzae Haemophilus influenzae Haemophilus parainfluenzae Haemophilus parainfluenzae Anabaena variabilis

La utilizacin de diferentes endonucleasas y la separacin por tamaos de los fragmentos producidos mediante electroforesis permite construir lo que se denomina Mapas de restriccin.

Cuando el ADN de un organismo eucarionte se fragmenta con una endonucleasa de restriccin, se producen cientos de miles o incluso hasta millones de fragmentos. Dichos fragmentos se separan por tamaos mediante electroforesis en geles de agarosa, una vez se parados por tamaos se transfieren los fragmentos a una membrana de nylon en condiciones desnaturalizantes y de forma que permanezcan en la misma posicin. Los fragmentos desnaturalizados y pegados a la membrana se pueden renaturalizar o hibridar utilizando una segmento de ADN o de ARN (habitualmente denominado sonda) marcado radiactivamente. Dicha sonda, hibridar solamente con aquellos fragmentos de ADN que contengan la secuencia complementaria. La tcnica que permite transferir los fragmentos de ADN desnaturalizados a una membrana de nylon y posteriormente hibridar con una sonda de ADN marcada se denomina Tcnica Southern (hibridacin ADNADN), cuando la hibridacin se realiza con una sonda de ARN marcada se denomina Northern (hibridacin ADN-ARN). El empleo combinado de endonucleasas de restriccin y de diferentes sondas de ADN de secuencia nica marcadas permite obtenerPolimorfismos para Longitudes de Fragmentos de Restriccin (RFLPs), muy utilizados en la construccin de mapas de ligamiento. Hibridacin "in situ" Las tcnicas de hibridacin "in situ" permiten localizar un segmento concreto de ADN (por ejemplo un gen) en una posicin determinada de un cromosoma eucaritico. Es posible obtener preparaciones citolgicas de cromosomas en metafase mittica o en otras fases del ciclo, desnaturalizar el ADN de los cromosomas en la propia preparacin citolgica y posteriormente hibridar con la pieza de ADN deseada marcada. Actualmente, el marcaje suele ser de tipo fluorescente, denominndose dicha tcnica Hibridacin "in situ" mediante fluorescencia (abreviadamente FISH). Tambin, es posible marcar todo el ADN de un genomio o juego de cromosomas completo y realizar una Hibridacin "in situ" Genmica (abreviadamente GISH) que permite averiguar si los cromosomas de un determinado genomio estn presentes. Otra aplicacin, consiste en detectar determinados cromosomas o regiones cromosmicas concretas utilizando sondas o piezas de ADN marcadas mediante fluorescencia y procedentes solamente del cromosoma deseado, de esta manera, se obtiene lo que se denomina Pintura Cromosmica.

FISH trigo (Triticum intermedium)

GISH: Hbrido (Liliaceae)

Pintura Pintura cromosmica cromosmica (humanos) (ratn)

SECUENCIACIN DEL ADN: MTODO DIDESOXI Y MTODO AUTOMTICO El anlisis ms detallado de la estructura del ADN consiste en averiguar la secuencia de nucletidos. A lo largo del tiempo se han desarrollado diferentes mtodos para obtener la secuencia de nucletidos del ADN, sin embargo, actualmente los mtodos ms utilizados son el de secuenciacin automtica y el mtodo enzimtico de terminacin de cadena de Sanger tambin conocido por el mtodo didesoxi. Mtodo enzimtico de terminacin de cadena o mtodo didesoxi de Sanger Para obtener la secuencia de bases nitrogenadas de un segmento de ADN por el mtodo enzimtico de terminacin de cadena, se necesitan los siguientes compuestos:

El ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar. Para poder secuenciar un segmento de ADN, previamente se necesita tener gran cantidad de ese fragmento, y por tanto, hay que clonarlo en un vector apropiado. Adems, debe estar en estado de hlice sencilla. Un enzima que replique el ADN, normalmente la ADN Polimerasa I del bacteriofago T4. La ADN Polimersa I del fago T4 emplea como molde ADN de hlice sencilla y siguiendo las reglas de complementaridad de las bases nitrogenadas va aadiendo nucletidos a partir de un cebador o "primer". Un cebador o "primer" que suele ser un oligonucletido corto de alrededor de 20 bases de longitud necesario para que la ADN polimerasa I comience a aadir nucletidos por el extremo 3' OH. Este cebador debe poseer una secuencia de bases complementaria a la del fragmento de ADN que se desea secuenciar. Debido a que la secuencia de nucletidos del segmento que se quiere secuenciar es desconocida, se emplea un "primer" con secuencia complementaria al vector empleado para clonar el fragmento de ADN, adems, este cebador procede de una regin del vector muy cercana al punto de insercin del ADN problema cuya secuencia se conoce. El "primer" utilizado suele marcarse radiactivamente. Los cuatro nucletidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A veces en vez de marcar radiactivamente el cebador, se marca

radiactivamente uno de los cuatro nucletidos trifosfato en cada reaccin. Por ltimo, se necesitan nucletidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). Los nucletidos didesoxi son nucletidos modificados que han perdido el grupo hidroxilo de la posicin 3' de la desoxirribosa. Estos nucletidos pueden incorporarse a la cadena de ADN naciente, pero no es posible que se una a ellos ningn otro nucletido por el extremo 3'. Por tanto, una vez incorporado un nucletido didesoxi se termina la sntesis de la cadena de ADN.

Breve descripcin del mtodo enzimtico de terminacin de cadena

En primer lugar, deben realizarse en cuatro tubos diferentes, cuatro mezclas de reaccin. Cada mezcla de reaccin contiene los cuatro nucletidos trifosfato (dATP, dCTP, de dTTP y dGTP), ADN polimerasa I, un cebador marcado radiactivamente y un nucletido dideoxi, por ejemplo ddATP, a una concentracin baja. El nucletido didesoxi utilizado (ddATP en este ejemplo) competir con su homlogo (dATP) por incorporarse a la cadena de ADN que se est sintetizando, produciendo la terminacin de la sntesis en el momento y lugar donde se incorpora. Por este sistema, en cada mezcla de reaccin se producen una serie de molculas de ADN de nueva sntesis de diferente longitud que terminan todas en el mismo nucletido y marcadas todas radiactivamente por el extremo 5' (todas contienen en el extremo 5' el cebador utilizado).

Los fragmentos de ADN de nueva sntesis obtenidos en cada mezcla de reaccin se separan por tamaos mediante electroforesis en geles verticales de acrilamida muy finos (0,5 mm de espesor) y de gran longitud (cerca de 50 cm) que permiten distinguir fragmentos de ADN que se diferencian en un solo nucletido.Los productos de cada una de las cuatro mezclas de reaccin se insertan en cuatro calles o carriles diferentes del gel. Una vez terminada la electroforesis, el gel se pone en contacto con una pelcula fotogrfica de autorradiografa. La aparicin de una banda en una posicin concreta de la autorradiografa en una de las cuatro calles nos indica que en ese punto de la secuencia del ADN de nueva sntesis (complementario al ADN molde) est la base correspondiente al nucletido didesoxi utilizado en la mezcla de reaccin correspondiente.

Esquema de las electroforesis de las reacciones de secuenciacin

Autorradiograf a

Teniendo en cuenta que el ADN de nueva sntesis crece en la direccin 5' 3', si comenzamos a leer el gel por los fragmentos de menor tamao (extremo 5') y avanzamos aumentando el tamao de los fragmentos (hacia 3'), obtendremos la secuencia del ADN de nueva sntesis en la direccin 5' 3'.

Breve descripcin del mtodo automtico de secuenciacin

La principal diferencia entre mtodo enzimtico de terminacin de cadena y el mtodo automtico de secuenciacin radica, en primer lugar en el tipo de marcaje. En el mtodo automtico en vez de radiactividad se utiliza fluorescencia y lo habitual es realizar cuatro mezclas de reaccin, cada una con nucletido trifosfato (dTTP) marcado con un fluorocromo distinto. Este sistema permite automatizar el proceso de manera que es posible leer al mismo tiempo los ADNs de nueva sntesis producto de las cuatro mezclas de reaccin. La segunda diferencia radica en el sistema de deteccin de los fragmentos de ADN. La deteccin del tipo de fluorescencia correspondiente a cada reaccin se lleva a cabo al mismo tiempo que la electroforesis, de manera que los fragmentos de ADN de menor tamao que ya han sido detectados se dejan escapar del gel, permitiendo este sistema aumentar el nmero de nucletidos que se pueden determinar en cada electroforesis y, por consiguiente, en cada secuenciacin.

El siguiente esquema representa de forma abreviada el mtodo automtico de secuenciacin.

Esquema del mtodo automtico de secuenciacin

En la siguiente figura se muestra un ejemplo de una secuencia obtenida por el mtodo automtico de secuenciacin. Cuando aparece la letra N significa que no ha sido posible determinar el nucletido existente en esa posicin de la secuencia.

Secuencia obtenida por mtodos automticos

http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Estruadn/estruadn.htm

INTRODUCCIN La clave para resolver uno de los grandes misterios de la vida, el secreto de la herencia biolgica, sera descubierta en el ao de 1953 por dos cientficos de la Universidad de Cambridge. A partir de indicios obtenidos de fuentes extraordinariamente diversas, estos investigadores lograron finalmente ensamblar la singular estructura molecular del ADN (cido desoxirribonucleico), base fundamental de la herencia. Su hoy conocida modelo de doble Hlice (espiral) abri el camino de las investigaciones del cdigo gentico complejo sistema qumico por medio del cual el ADN controla y dirige el proceso de la sntesis protenica. La labor de Watson y Crick sera la culminacin de largos aos de exploracin cientfica sobre la naturaleza de la herencia biolgica. La senda que habra de conducir al descubrimiento de la doble hlice comenz en un apartado monasterio, casi 100 aos antes. Fue all donde el fraile agustino y cientfico austriaco Gregor Mendel, el "padre de la gentica" se sirvi por vez primera de las matemticas y de pruebas sistemticas para explicar la razn por la que determinadas caractersticas se transmiten del progenitor a su descendencia, pero lo ms importante que Mendel demostr es que la herencia biolgica se hallaba de hecho regulada por una serie bien definida de probabilidades matemticas. A comienzos de la dcada de los cuarenta, despes de la realizacin de numerosas investigaciones sobre la funcin del ADN, al fin se lleg a determinacin de que el ADN era en realidad un elemento crucial dentro del proceso gentico.y con esto el ADN forma parte clave de la herencia, de los organismos Una vez identificada la funcin del ADN, dio comienzo una febril investigacin de su composicin qumica. Se saba ya que las molculas del ADN constituyen largas cadenas de compuestos orgnicos denominados nucletidos y que cada eslabn nucletido contiene un azcar, un fosfato, y una de estas cuatro bases nitrogenadas: adenina (A), tiamina (T), guanina (G) o citosina (C),no obstante, faltaba todava determinar cmo se combinaban ests substancias para crear una molcula de ADN, tarea que asumieron varios laboratorios europeos y estadounidenses. A comienzos de 1953 tanto en Londres como en Cambridge estaba claro que el ADN sera una doble hlice, como lo haban establecido Watson y Crick , los grupos fosfatos formaran, por su cara externa, la estructura de sostn y los nucletidos miraran hacia el centro. An faltaba por comprender cmo se unen los nucletidos y determinan la especificidad biolgica. Watson y Crick se esforzaron por enlazar los nucletidos en el centro de la molcula. Se imaginaron primero cada nucletido al frente de otro igual: adenina con adenina etc. Dado que las purinas tienen un doble anillo y las pirimidinas uno simple, algunos segmentos seran anchos y otros estrechos. Ello no coincida con el suave contorno del ADN. Ms an, Chargaff haba descubierto que siempre adenina y timina se encuentran en el ncleo celular en igual cantidad y lo mismo suceda entre guanina y citosina. Al enlazar estos elementos en la molcula de ADN la explicacin salta a la vista, al combinarse adenina con timina en ciertas posiciones la forma y las distancias son las mismas que al combinar guanina con citosina, lo que hace posible que ambas combinaciones existan sin tensiones al interior de la doble hlice. Slo esas combinaciones existen: adenina con timina y guanina con citosina lo que lleva a concebir las cadenas como complementarias: una es la base de la otra. Ello permite imaginar de inmediato la multiplicacin celular y la herencia. LOS ACIDOS NUCLEICOS Los cidos Nucleicos son, molculas muy complejas que producen las clulas vivas y los virus. Reciben este nombre porque fueron aisladas por primera vez del ncleo de clulas vivas. Sin embargo, ciertos cidos nucleicos no se encuentran en el ncleo de la clula, sino en el citoplasma celular. Los cidos nucleicos tienen al menos dos funciones: transmitir las caractersticas hereditarias de una generacin a la siguiente y dirigir la sntesis de protenas especficas. El modo en que los cidos nucleicos realizan estas funciones es el objetivo de algunas de las ms prometedoras e intensas investigaciones actuales. Los cidos nucleicos son las sustancias fundamentales de los seres vivos, y se cree que aparecieron hace unos 3.000 millones de aos, cuando surgieron en la Tierra las formas de vida ms elementales. Los investigadores han aceptado que el origen del cdigo gentico que portan estas molculas es muy cercano en el tiempo al origen de la vida en la Tierra. Los bioqumicos han conseguido descifrarlo, es decir, determinar la forma en que la secuencia de los cidos nucleicos dicta la estructura de las protenas.

Las dos clases de cidos nucleicos son el cido desoxirribonucleico (ADN) y el cido ribonucleico (ARN). Tanto la molcula de ARN como la molcula de ADN tienen una estructura de forma helicoidal. Su peso molecular es del orden de millones. A las cadenas se les unen una gran cantidad de molculas ms pequeas (grupos laterales) de cuatro tipos diferentes. La secuencia de estas molculas a lo largo de la cadena determina el cdigo de cada cido nucleico particular. A su vez, este cdigo indica a la clula cmo reproducir un duplicado de s misma o las protenas que necesita para su supervivencia. Los organismos vivos son sistemas complejos. Cientos de miles de proteinas existen dentro de cada uno de nosotros para ayudarnos a desarrollar nuestras funciones cotidianas. Estas protenas son producidas localmente, armadas pieza por pieza con especificaciones exactas. Se requiere una enorme cantidad de informacin para manejar correctamente este complejo sistema. Esta informacin, detallando la estructura especfica de las protenas dentro de nuestros cuerpos, est guardada en un conjunto de molculas llamado cidos nucleicos.

Estos cidos nucleicos son molculas muy grandes que tienen dos partes principales. La columna vertebral del cido nucleico est formada de molculas alternadas de azcar y de fosfato que estn unidas en una larga cadena, tal como est representada abajo: LOS NUCLETIDOS Los eslabones estructurales de los cidos nucleicos son los nucletidos, que son compuestos que derivan de la unin entre una base nitrogenada, una pentosa y el cido fosfrico (fosfato). Las bases nitrogenadas pueden ser de dos tipos, segn su origen: La purina (bases pricas): Adenina (A) y Guanina (G). La pirimidina (bases pirimidnicas): Citosina (C), Uracilo (U) y Timina (T).

Los nuclesidos se forman mediante la unin de una base con una pentosa (ribosa o desoxirribosa). El carbono 1 de la pentosa se une a un tomo de nitrgeno de la base nitrogenada por medio de un enlace N-glucosdico.

En funcin de la pentosa a la que se une la base nitrogenada, los nuclesidos se agruparn en: Ribonuclesidos (que contienen ribosa) y Desoxirribonuclesidos (que tienen 2-desoxirribosa).

Los desoxirribonuclesidos monofosfato de adenina, guanina, citosina y timina forman parte del ADN. Los ribonuclesidos monofosfato de adenina, guanina, citosina y uracilo forman parte del ARN. Los nucletidos que constituyen los cidos nucleicos (ADN y ARN), se encuentran unidos formando

enlaces fosfodister entre el grupo 5' hidroxilo de un nucletido y el grupo 3' hidroxilo del siguiente. En un polinucletido se distinguen:

Un esqueleto covalente fosfato-azcar-fosfato-azcar..., con un extremo 5' con el grupo fosfato, y un extremo 3' hidroxilo. Las bases nitrogenadas que salen de los carbonos 1' de las pentosas Los nucletidos, adems de servir como precursores de la sntesis de los cidos nucleicos, cumplen distintas funciones, entre las que se destacan: Transportadores de energa: los nuclesidos-trifosfato son molculas que contienen energa. Esta puede ser liberada al hidrolizarse los enlaces fosfodister (enlaces de alta energa). En la clula, numerosas reacciones de sntesis son posibles si se les suministra energa. Otras reacciones desprenden energa, la cual se conserva mediante la formacin de estos enlaces, para que no se disipe en forma de calor. Posteriormente esta energa podr ser utilizada para la sntesis o la realizacin de cualquier trabajo celular. Mensajeros intracelulares: algunos ribonucletido de adenina, con un fosfato que se une a los carbonos 3' y 5' de la ribosa, por lo que se forma un fosfodister cclico.Interviene como mensajero qumico intracelular al desencadenar reacciones metablicas, como respuesta a la llegada de ciertas seales (hormonas) a la membrana. Coenzimas de oxido-reductasas: Presentan dos formas, oxidada y reducida. Las ms comunes son las derivadas de nicotinamida y adenina (NAD y NADP), los derivados de la flavina (FAD y FMN) y el coenzima A (CoA) EL ADN Estructura del ADN El ADN, definido como un Acidos Nuclicos,es una gran molcula formadas por la repeticin de una molcula unidad que es el nucletido. De acuerdo con el modelo de Watson y Crick, el ADN es una doble hlice, dextrgira, con las bases dirigidas hacia el centro, perpendiculares al eje de la molcula y un esqueleto exterior de azcar-fosfato a lo largo de los lados de la hlice (que acta protegiendo a las bases del medio ambiente). Las hebras que la conforman son complementarias y antiparalelas, cada hebra esta hecha de un azcar unido covalentemente a un fosfato que a su vez se une a otro azcar y as sucesivamente, cada hebra de ADN puede contener miles o millones de estas uniones azcar-fosfato.

Las hebras se dicen complementarias porque las bases de cada cadena se aparean de forma complementaria, Adenina con Timina (A-T) y Guanina con Citosina (C-G). Y antiparalelas porque una cadena est colocada en posicin 5'- 3' y la complementaria en posicin 3'- 5'. Una molcula de ADN consiste en dos hebras que se encuentran arrolladas una alrededor de la otra formando una doble hlice. Las bases de las dos hebras se disponen en manera tal que cuando en una de ellas hay una adenina en la enfrentada hay timina y, cuando hay guanina en la otra hay citosina. Esto satisface la regla de Chargaff en manera tal que: la cantidad de adenina = a la cantidad de timina (A = T) la cantidad de guanina = a la cantidad de citosina (G = C) Cada base prica o pirimidinica establece puentes de hidrgeno con su complementaria, uniendo as las dos cadenas La separacin entre los pares de bases adyacentes es de 3,4 (0,34nm). La hlice completa una vuelta cada 10 pares de bases , es decir cada 34 (3,4nm) El dimetro de la hlice es de 20 (2.0nm) De acuerdo con el modelo descrito por Watson y Crick, el ADN parece ser una molcula con estructura fija, pero no lo es, se modifica en funcin con su composicin de bases o con la interaccin con protenas. La doble hlice es capaz de adoptar muchas formas y de interactuar de muchas maneras con otras molculas presentes en la clula Direccionalidad: la cadena de uniones azcar-fosfato (la "columna vertebral" , backbone en ingls) est construda en manera tal que posee una polaridad, esto es, que el fosfato en el carbono 5' de la desoxirribosa se une al 3' de la siguiente desoxirribosa. En este caso se dice que tiene una direccin 5' a 3'. Se han descrito tres formas estructurales del ADN: El ADN B, dextrgira, que corresponde con el modelo de Watson y Crick.

El ADN A, en el que los pares de bases estn desplazados hacia el exterior respecto al eje de la hlice

El ADN Z , levgira, que tiene un esqueleto ms irregular con un solo surco que discurre en forma de Z. Est generada por ciertas secuencias alternantes de purinas y pirimidinas.

EL ADN COMO PORTADOR DE LA INFORMACIN GENTICA La moderna ciencia de la Gentica se origin cuando Gregor Mendel descubri que las caractersticas hereditarias estaban determinadas por unidades hereditarias que se transmitan de una generacin a la siguiente de manera uniforme y predecible. Se inici en este momento (finales s.XIX) una carrera

cientfica cuyo objeto primordial era solucionar dos problemas, en principio muy distintos, pero, como se vio ms tarde, muy relacionados entre s. El primer problema fue el de identificar exactamente el material gentico, su localizacin y su naturaleza qumica. El desarrollo de esta lnea de investigacin ha dado lugar a una rama de la Gentica denominada Gentica Molecular. El segundo problema consista en descubrir el modo en que se transmiten y se heredan de generacin en generacin las manifestaciones de ese material hereditario, es decir, los caracteres biolgicos. Se cre as otra rama de la Gentica llamada en honor de Mendel Gentica Mendeliana. En cuanto al primer problema, un paso previo a iniciar la bsqueda e identificacin del material gentico consiste en establecer los requisitos que debe cumplir. Se establecen 4 requisitos generales que se espera que cumpla el material gentico: Que se replique exactamente antes de la duplicacin celular. Que su estructura sea lo suficientemente estable para que los cambios hereditarios (mutaciones) slo se produzcan raramente. Que pueda llevar cualquier tipo de informacin biolgica necesaria. Que transmita la informacin a la clula. Por otra parte, eran ya conocidos los acontecimientos que ocurran en las clulas durante la mitosis y la meiosis. Los protagonistas de ambos procesos son, sin duda alguna, los cromosomas y la atencin de los cientficos se dirigi hacia ellos por las siguientes razones: Se duplican con precisin y se dividen con exactitud en la mitosis proporcionando a cada clula un juego completo de cromosomas. Su comportamiento durante la meiosis concuerda con lo que se debe esperar de la herencia, que se debe a las contribuciones de ambos progenitores. El entrecruzamiento que sufren durante la meiosis suministra una fuente importante para la variabilidad que se observa entre los individuos de una misma especie. Adems existen pruebas considerables de que las aberraciones cromosmicas pueden estar asociadas a la herencia de caractersticas especficas. Pareca evidente, por tanto, que el material gentico haba que buscarlo en los cromosomas. A finales del s.XIX se consigui aislar el compuesto que forma los cromosomas y result ser una sustancia desconocida hasta entonces que se llam ADN. Las investigaciones sobre la estructura del ADN llegaron a su culminacin en 1953 con la publicacin del modelo de doble hlice de Watson y Crick. Con todos los datos que se tenan, el ADN pareca cumplir totalmente los requisitos para ser el material hereditario, slo faltaba conseguir una prueba concluyente que identificara definitivamente el ADN con el material gentico. Esta evidencia se tuvo a partir de las investigaciones de Avery, McLeod y McCarty sobre transformacin bacteriana, al demostrar que extractos de ADN de un determinado tipo de bacterias patgenas, cuando se aada a otro tipo de bacterias genticamente distintas e inofensivas, provocaba su transformacin, es decir, las bacterias que captaban los extractos de ADN adquiran caractersticas genticas de las bacterias donantes y se volvan patgenas. Otra prueba de que el ADN es el material gentico se obtuvo a raz de los experimentos de Hershey y Chase con virus bacterifagos y la bacteria Escherichia coli. Marcaron con istopos radiactivos los componentes del virus, las protenas con 35S y el ADN con 32P. Despus de la infeccin observaron que en el interior de la bacteria slo apareca fsforo marcado, pero no azufre, lo que demostraba que el material gentico del virus era el ADN, mientras que las protenas de la cpside carecan de informacin gentica y ni siquiera penetraban en la bacteria. En el momento en que se identific el material gentico, era preciso definir las "unidades hereditarias" de las que habl Mendel desconociendo su naturaleza. Actualmente se denominan genes y se pueden definir como segmentos de ADN que contienen la informacin necesaria para, mediante transcripcin y

traduccin, sintetizar una protena. Son las unidades estructurales y funcionales de la herencia, transmitidas de padres a hijos a travs de los gametos y regulan la manifestacin de los caracteres heredables. Se dice que un gen se expresa cuando se descodifica, es decir, cuando se transcribe y se traduce y origina la protena que codifica. Los genes de los procariotas son unidades continuas, o sea, que un segmento de ADN contiene toda la informacin necesaria para la sntesis de una protena; sin embargo, los genes de los organismos eucariotas se encuentran fragmentados: cada gen consta de una serie de secuencias que codifican fragmentos de la protena (exones) separadas por otras secuencias, ms o menos largas, que no codifican ninguna cadena peptdica (intrones). Se calcula que casi el 90% del total de ADN no codifica secuencia proteica alguna y formaran lo que algunos autores llaman "chatarra gentica". Adems, tanto en procariotas como en eucariotas, existen secuencias que no se transcriben, pero que desempean un papel fundamental en la regulacin de la expresin gnica, pues constituyen seales que indican el inicio o el final del gen que se va a transcribir. REPLICACIN DEL ADN La necesidad de que el material gentico se autoduplique exactamente es la primera exigencia que debe cumplir. Ya en el modelo de Watson y Crick se planteaba la posibilidad de que las hebras de la doble hlice se separaran y cada una sirviera de matriz para formar la cadena complementaria. Este proceso recibi el nombre de replicacin. Tal y como se haba descrito hasta ese momento deba ser semiconservativo, es decir, cada doble hlice de ADN resultante slo llevaba una de las dos hebras del ADN original, mientras que la complementaria era de nueva formacin. Esto se demostr concluyentemente con los experimentos de Meselson y Stahl: cultivaron bacterias E.coli en un medio que contena como nica fuente de nitrgeno cloruro amnico marcado con 15N hasta que lleg un momento en que el ADN slo presentaba en sus bases nitrogenadas 15N. Posteriormente cambiaron el medio de cultivo por otro con 14N normal. Las bacterias de la primera generacin presentaban en su ADN 14N y 15N en igual cantidad. El proceso de replicacin es similar tanto en los organismos procariotas como en los eucariotas, pero es en los primeros donde ms se conocen los detalles; en concreto la ms estudiada es la replicacin en E.coli. Es un proceso complejo en el que intervienen ms de 50 protenas distintas agrupadas en complejos multienzimticos. El enzima principal se denomina ADN -polimerasa y para que acte es necesario que existan en el medio iones Mg2+ y una mezcla de 4 desoxirribonucletidos-trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP). Es suficiente con que falte uno de los cuatro para que no acte la ADN -polimerasa. Bsicamente este enzima realiza dos funciones: Recorre las hebras del molde y selecciona en cada momento el desoxirribonucletido-trifosfato que tenga la base complementaria (G-C, A-T). Una vez localizado, la ADN -polimerasa cataliza su hidrlisis separando un grupo pirofosfato (P-P) y uniendo el resto (desoxirribonucletido-monofosfato) a la cadena de ADN que se est formando mediante un enlace fosfodister. La energa necesaria para esta unin se obtiene de la hidrlisis del grupo pirofosfato. sta es la funcin polimerizadora de la ADN -polimerasa. La ADN -polimerasa es tambin autocorrectora ya que despus de unir cada nucletido comprueba si se han producido errores antes de incorporar el nucletido siguiente. Si detecta un error, elimina el ltimo nucletido colocado y lo sustituye por el correcto. Sin embargo la ADN -polimerasa debe resolver dos problemas relacionados con su actividad cataltica: La ADN -polimerasa es capaz de ir leyendo las hebras que actan de molde en sentido 3'--5' y va sintetizando la nueva cadena en sentido 5'--3'. Esta ltima hebra recibe el nombre de hebra conductora. Sin embargo, la hebra molde complementaria discurre en sentido antiparalelo, es decir, 5'--3' y la ADN polimerasa es incapaz de leerla en ese sentido. Para solucionar este problema, la ADN -polimerasa sintetiza pequeos fragmentos de ADN llamados fragmentos de Okazaki que crecen en sentido 5'--3' igual que la hebra conductora y ms tarde se unen para formar la hebra completa, que en este caso se llama hebra retardada porque se sintetiza ms lentamente. Otro problema que plantea la actividad cataltica del ADN -polimerasa es que es incapaz de iniciar por s sola la sntesis de una nueva cadena de ADN y necesita un corto fragmento de ARN, llamado ARNcebador, que acte como iniciador de las rplicas y que se elimina posteriormente del ADN formado. En resumen, el proceso completo de la replicacin del ADN en E.coli es el siguiente:

El paso previo para que pueda actuar el ADN -polimerasa es el desenrrollamiento y apertura de la doble hlice de ADN. La separacin de las cadenas comienza en puntos concretos llamados puntos de iniciacin. A partir de ellos se van separando las dos hebras de ADN formando la llamada burbuja de replicacin. Los dos extremos de la burbuja por donde continua la separacin reciben el nombre de horquillas de replicacin. La sntesis de las cadenas complementarias comienza con la sntesis del ARN cebador que es una corta cadena de ARN con una secuencia complementaria de una de las porciones de las hebras del ADN y frente a la cual se coloca. En la hebra que tiene el sentido 3'--5' la ADN -polimerasa va colocando nucletido tras nucletido a continuacin del ARN cebador. Esta hebra complementaria que va creciendo en sentido 5'--3' es la hebra conductora. En la hebra opuesta del ADN original no se puede realizar el mismo proceso porque discurre en sentido 5'--3'. Por tanto, a continuacin del ARN cebador se coloca un fragmento de Okazaki y, despus de ste, un nuevo ARN cebador seguido de otro fragmento de Okazaki. En este momento acta una ribonucleasa que elimina el ARN cebador que est entre dos fragmentos de Okazaki. El hueco que queda es rellenado por la ADN-polimerasa. El proceso continuara con la colocacin de un nuevo ARN cebador, otro fragmento de Okazaki, eliminacin del ARN cebador y llenado del hueco por la ADN -polimerasa. Y as sucesivamente. La hebra que se sintetiza de esta manera es la retardada y crece en sentido 3'--5'. La replicacin llevada a cabo por la ADN -polimerasa es un proceso muy exacto, sobre todo por su actividad autocorrectora. Sin embargo, an as se produce un error de apareamiento de bases por cada 107 pares de bases. En una bacteria esto podra resultar suficiente debido a que su cromosoma slo posee 3103 pares de bases. Sin embargo en el ADN humano existen 3109 pares de bases y durante el desarrollo embrionario, a partir del zigoto el ADN humano se duplica 1015 veces, por lo que la informacin gentica pronto se perdera. Para aumentar ms todava la perfeccin de la replicacin del ADN existe un complejo enzimtico que detecta el nucletido mal emparejado, lo elimina y regenera la secuencia correcta. De este modo se logra alcanzar una perfeccin de un error cada 1010 pares de bases. Este proceso se conoce con el nombre de correccin postreplicativa. TRANSCRIPCIN Otra de las exigencias que debe cumplir el material gentico es que sea capaz de transmitir la informacin que contiene al resto de la clula. Como el material gentico es ADN y ste se encuentra en los cromosomas, dentro del ncleo, debe existir una molcula que transporte esta informacin desde el ncleo hasta el citoplasma atravesando la envoltura nuclear. Esta molcula es el ARNm. Adems, a partir del ADN tambin deben sintetizarse los restantes tipos de ARN. El proceso de sntesis de ARN a partir del ADN se denomina transcripcin gentica. El enzima encargado de llevar a cabo este proceso la ARNpolimerasa que cataliza la unin de los ribonucletidos-trifosfato (ATP, GTP, CTP y UTP) segn una secuencia determinada; para ello utiliza como molde o patrn una de las dos cadenas del segmento de ADN (un gen) que se va a transcribir. La secuencia de ARN transcrito es complementaria de una de las dos cadenas del gen salvo por el hecho de que la base complementaria de la A es el U. La energa necesaria para la unin de los ribonucletidos se obtiene de la hidrlisis de los ribonucletidos-trifosfato que liberan un grupo pirofosfato. Es, por tanto, semejante a lo que ocurre en la duplicacin del ADN. La trascripcin vara en algunos detalles en los organismos procariotas y eucariotas. a) TRANSCRIPCIN EN PROCARIOTAS: Slo existe un tipo de ARN-polimerasa que cataliza la sntesis de todos los ARN. En el caso del ARNm, su sntesis transcurre en 4 etapas: - Iniciacin: En todos los genes hay una secuencia caracterstica denominada promotor que indica dnde debe empezar la sntesis del ARNm y cul de las dos hebras del ADN debe ser transcrita. - Elongacin: Despus de unirse al promotor, la ARN-polimerasa se acopla a una de las cadenas del ADN y desenrolla aproximadamente una vuelta de hlice, con lo que queda al descubierto la hebra de ADN que actuar como patrn. El enzima se desplaza por la hebra patrn de ADN en sentido 3'--5', mientras que la cadena de ARNm se va formando en sentido 5'--3' conforme se aaden nucletidos. A medida que el enzima se desplaza, el ADN recupera su configuracin inicial de doble hlice. - Terminacin: La ARN-polimerasa sigue aadiendo ribonucletidos hasta que se encuentra con la seal de terminacin, lo que marca el final de la sntesis del ARN, cuya cadena recin formada se libera

en forma de una sola hebra, aunque en algunos casos, cuando presenta secuencias autocomplementarias, adopta estructura secundaria. - Maduracin: En los procariotas los genes son continuos, no tienen intrones, por lo que las molculas de ARNm no necesitan ningn tipo de transformacin previa a la traduccin por los ribosomas. Sin embargo, los ARNt y ARNr no se sintetizan como tales, sino que provienen de molculas de ARN, llamado ARN trascrito primario, que precisan un proceso de maduracin. b) TRANSCRIPCIN EN EUCARIOTAS: Presenta dos diferencias fundamentales respecto a la de procariotas: (1) los genes estn fragmentados, poseen intrones y exones, por lo que todos los ARN necesitan un proceso de maduracin a partir del ARN transcrito primario, y (2) existen tres clases de ARNpolimerasa diferentes, cada una de las cuales cataliza la sntesis de un ARN distinto. La que sintetiza el ARNm es la ARN-polimerasa II. La sntesis de ARNm en eucariotas transcurre tambin en 4 fases: - Iniciacin: El promotor est formado por una secuencia de T y A, llamada TATA box, que es reconocida por la ARN-polimerasa II. - Elongacin: La diferencia con los procariotas es que, cuando se han trascrito unas 30 bases del gen, al ARNm se le aade en el extremo 5' una caperuza formada por una guanosn-trifosfato metilada (metil-GTP). Mientras tanto, la cadena de ARNm continua creciendo (en sentido 5'--3') a unos 30 nucletidos por segundo, transcribindose tanto los exones como los intrones. - Terminacin: Cuando la ARN-polimerasa II transcribe la secuencia de finalizacin, la trascripcin termina y acta otro enzima que aade en el extremo 3' del ARNm una cola de poli-A formada por unos 150-200 ribonucletidos de A. - Maduracin: Los ARNm transcritos primarios contienen secuencias intercaladas (las que corresponden a los intrones) que no codifican ningn pptido, por lo que deben ser eliminadas. Esto se realiza mediante cortes entre los intrones y los exones: los primeros se enrollan en lazos y se eliminan, mientras que los segundos se empalman y forman una molcula de ARNm que contiene los nucletidos necesarios para sintetizar la protena. EL CDIGO GENTICO El moderno concepto de informacin gentica establece que un gen es un fragmento de ADN que contiene la informacin necesaria para la sntesis de una protena. Dado que la informacin gentica est contenida en secuencias de bases nitrogenadas, es preciso transformar esta informacin en cadenas de aminocidos para formar las protenas. Los cidos nucleicos estn formados por 4 clases de nucletidos mientras que las protenas estn formadas por 20 aminocidos. Es necesario establecer una correlacin entre las bases y los aminocidos para averiguar de qu modo la informacin contenida en el ADN es capaz de ordenar la sntesis de una determinada protena. Si a cada aminocido correspondiese un solo nucletido entonces slo se podran codificar 4 aminocidos. Si fuesen dos nucletidos los que codifican un aminocido, las posibles combinaciones seran 42=16 y tampoco seran suficientes. Las combinaciones de 3 nucletidos son 43=64 con lo que es posible codificar los 20 aminocidos y sobraran cdigos. Se puede imaginar segn esto el ADN formado por una sucesin de grupos de 3 nucletidos, llamados tripletes, correspondiente cada uno a un aminocido. Este planteamiento terico ha sido demostrado experimentalmente y, efectivamente, el cdigo de cada aminocido est contenido en un triplete o en varios de nucletidos del ADN. Este cdigo que asocia a cada aminocido un grupo de 3 nucletidos se denomina cdigo gentico. Se considera que es degenerado porque existen ms tripletes que aminocidos hay para codificar, y universal ya que sin apenas variaciones es utilizado por todos los seres vivos, aunque con la excepcin de las mitocondrias, que utilizan un cdigo gentico ligeramente diferente para traducir la informacin contenida en sus pequeos cromosomas circulares. En este punto de las investigaciones, el siguiente problema era establecer qu triplete corresponda a cada aminocido. Esto se logr gracias a un enzima descubierto en 1955 por Severo Ochoa, la polinucletido-fosforilasa, que cataliza la sntesis de polinucletidos. Esta sntesis se puede realizar en presencia de cualquiera de los nucletidos-fosfato que forman los cidos nucleicos. Si en el medio de la

reaccin slo existen, por ejemplo, nucletidos de U, el enzima sintetiza un cido nucleico con U como nica base nitrogenada (poli-U). Con este enzima y la bacteria E.coli Niremberg consigui empezar a descifrar el cdigo gentico; usando poli-U como ARNm la bacteria sintetizaba protenas formadas nicamente por el aminocido fenilalanina (Phe), por lo que su cdigo deba ser forzosamente UUU. Del mismo modo se estableci que el cdigo de la Pro era CCC, el de la Lys AAA y el de la Gly GGG. Para tripletes con bases nitrogenadas distintas el proceso es mucho ms complicado, pero finalmente se ha llegado a establecer el cdigo gentico completo, sabindose actualmente el significado de los 64 tripletes. TRADUCCIN GENTICA Es el proceso mediante el cual se sintetiza una protena a partir de un ARNm que, previamente, se ha transcrito en un gen del ADN. Tiene lugar en los ribosomas, por tanto en el seno del citoplasma. Para que la informacin contenida en la secuencia de bases del ARNm sea traducida a una secuencia de aminocidos de una protena debe existir una molcula intermediaria que solucione dos problemas: (1) para que cada aminocido se coloque en su triplete correspondiente del ARNm es preciso que dicho triplete sea descodificado, y (2) el tamao molecular de un triplete de nucletidos es mucho mayor que el de un aminocido. Esta molcula intermediaria es el ARNt y su funcionamiento durante la traduccin se debe fundamentalmente a su estructura secundaria en forma de hoja de trbol. Se presenta doblado dispuesto en 4 brazos formados por dobles cadenas de ARN enfrentadas y unidas por sus bases por puentes de Hidrgeno, y tres bucles en los extremos de estos brazos que no tienen sus nucletidos apareados. El brazo que no tiene bucle presenta en su cadena ms larga (extremo 3') siempre el triplete CCA que es el que sujeta al aminocido precisamente por la A. El bucle del brazo opuesto posee un triplete de anclaje que es complementario de un triplete del ARNm. Estos dos tipos de tripletes reciben distintos nombres: el del ARNm se llama codon y el correspondiente del ARNt anticodon. Cada molcula de ARNt es especfica de cada aminocido, de tal manera, que segn el anticodon de anclaje que posea, sujeta por el triplete CCA a uno u otro aminocido de los que existen libres en el citoplasma de la clula. La fijacin de un aminocido al triplete CCA del ARNt exige una previa activacin de dicho aminocido por una molcula de ATP que libera un grupo pirofosfato y se precisa la intervencin de un enzima, la aminoacil-ARNtsintetasa, especfico de cada aminocido. El complejo aminocido-ARNt unidos recibe el nombre de complejo de transferencia y constituye la forma en que los aminocidos son transportados y unidos para formar las cadenas de protenas. Ejemplo: el triplete que codifica el aminocido Metionina (Met) es AUG. Cuando en una posicin determinada de una protena debe colocarse una Met, en el ARNm aparece el triplete (codon) AUG. Sobre este codon slo podr colocarse aquel ARNt que posea un triplete (anticodon) complementario, es decir UAC. Dicho ARNt llevar en el otro extremo de su molcula, unido al triplete CCA el aminocido Met que habr sido unido por el enzima Metionil-ARNt-sintetasa formando un complejo de transferencia con Met (representado por ARNtMet). Tanto en los procariotas como en los eucariotas, el mecanismo de la sntesis de protenas se puede considerar dividido en tres etapas sucesivas: iniciacin, elongacin y terminacin. - Iniciacin de la sntesis de protenas: Hacen falta dos seales de iniciacin para que comience la sntesis de protenas: el triplete iniciador AUG, que codifica la Metionina, y la caperuza de metil-GTP del ARNm, de tal manera que la traduccin comienza por el triplete AUG ms prximo a la caperuza. Con la energa que produce la hidrlisis del metil-GTP la subunidad menor del ribosoma se une al ARNm en la zona prxima a la caperuza (extremo 5'), formando el complejo de iniciacin, y se coloca el ARNt iniciador, que est cargado con el aminocido Metionina y posee el anticodon complementario al AUG (por ello, todas las protenas recin sintetizadas poseen metionina en su extremo N-terminal; despus, en muchos casos, esta Met se elimina). Al final de esta etapa de iniciacin la subunidad mayor del ribosoma se acopla con el complejo de iniciacin para formar un ribosoma completo dotado de dos hendiduras o sitios de fijacin: el sitio P, que queda ocupado por el ARNtMet, y el sitio A, que est libre para recibir a un segundo ARNt cargado con su correspondiente aminocido. - Elongacin de la cadena polipeptdica: consiste en la unin de sucesivos aminocidos que se van aadiendo a la cadena polipeptdica en el seno de los ribosomas. Puede considerarse como la repeticin de ciclos de elongacin, cada uno de los cuales consiste en aadir un nuevo aminocido. Cada ciclo de elongacin consta de tres fases:

Primera fase: el sitio P est ocupado inicialmente por el ARNtMet y en el sitio A, que est vaco, se introduce el ARNt cargado con su correspondiente aminocido, cuyo anticodon es complementario al triplete siguiente al AUG (en el esquema ACU); se aloja por tanto el ARNt con el anticodon UGA, que lleva la Treonina (ARNtThr). Segunda fase: la Metionina, que est unida por su grupo carboxilo al ARNt, rompe este enlace y se une, mediante enlace peptdico, al grupo amino de la Treonina, que, a su vez, est enlazada a su ARNt. El resultado es la formacin de un dipptido (Met-Thr) unido al ARNt de la Treonina y alojado en el sitio A. Tercera fase: El ribosoma se desplaza a lo largo del ARNm exactamente 3 nucletidos en sentido 5'--3'. Esto provoca la expulsin del ARNt de la Met del sitio P, mientras que el ARNt de la Treonina, junto con el dipptido que lleva unido, pasan del sitio A al sitio P, dejando vaco el primero, con lo que se vuelve a la primera fase y se inicia otro ciclo de elongacin que, en el esquema corresponde a la Fenilalanina (Phe). - Terminacin de la sntesis de protenas: La sntesis de la cadena polipeptdica se detiene cuando aparece, durante la tercera fase de un ciclo de elongacin, en el sitio A uno de los tres codones de terminacin en el ARNm (UAA, UAG o UGA). En este momento un factor proteico de terminacin (RF) se une al codon de terminacin e impide que algn complejo de transferencia se aloje en el sitio A, con lo que al desplazarse el ribosoma queda libre el extremo C-terminal de la protena, y por tanto la protena misma, habiendo terminado su sntesis. REGULACIN DE LA EXPRESIN GNICA La supervivencia en ambientes a menudo hostiles y cambiantes ha obligado a los seres vivos a adoptar un conjunto de estrategias encaminadas a regular con la mxima eficacia la expresin de sus genes. Por ello, para aprovechar adecuadamente las fuentes energticas de que disponen, que no siempre son abundantes, y evitar el despilfarro de energa, las clulas procariticas y eucariticas sintetizan en cada momento slo aquellas protenas que necesitan. Las bacterias estn obligadas a responder continuamente a los cambios producidos en el ambiente externo y, por tanto, utilizan en cada momento solamente aquella fraccin de informacin gentica que resulta realmente necesaria para dar respuesta a la variacin de factores ambientales (nutrientes, temperatura, etc.). A principios de los aos sesenta, Jacob y Monod propusieron un modelo denominado opern para la regulacin de la expresin gnica en las bacterias. Un opern es un conjunto de genes que codifican protenas diferentes implicadas en procesos bioqumicos muy relacionados (por ejemplo los enzimas que intervienen en una misma ruta metablica); todos estos genes se localizan en el cromosoma unos cerca de otros, con el fin de que la regulacin de su expresin se realice de forma coordinada. En cada opern se diferencian las siguientes partes: a) Los genes estructurales (GE1, GE2, GE3, ......) que codifican la sntesis de las protenas enzimticas (E1, E2, E3, .....) que participan en un determinado proceso bioqumico. b) El gen regulador (R) que codifica la sntesis de una protena represora y es el agente que controla materialmente la expresin. c) El promotor (P) que est prximo a los genes estructurales y que es la zona donde se une la RNA-polimerasa y decide el inicio de la transcripcin. d) El operador (O) que es una regin intercalada entre el promotor y los genes estructurales y que posee una secuencia caracterstica que cuando es reconocida por la protena represora, bloquea el operador impidiendo el avance de la RNA-polimerasa con lo que la transcripcin se interrumpe y se produce una represin gnica (los genes no se expresan).

Ejemplo de regulacin de la expresin gnica: opern lactosa: el proceso seguido es el siguiente: el gen regulador se transcribe y se sintetiza la protena represora que bloquea el operador e impide la sntesis de los enzimas E1, E2, E3, .....encargados de metabolizar la lactosa y transformarla en los productos 1, 2, 3 .... y P (producto final). La lactosa aportada por la dieta es capaz de unirse a la protena represora y provocarle un cambio que la vuelve inactiva, por lo que, al alcanzar la lactosa un nivel determinado de concentracin, se inactiva toda la protena represora y el operador se desbloquea; los genes estructurales se expresan (se transcriben y traducen) y los enzimas E1, E2, E3,.... catalizan la

transformacin de la lactosa en el producto P; a medida que descienden los niveles de lactosa, la protena represora vuelve a activarse, se bloquea el operador y la expresin de los genes estructurales vuelve a reprimirse. En los seres pluricelulares existe tambin una especializacin de las clulas que responde a determinados factores del ambiente interno. Esta especializacin lleva consigo la diferenciacin de tejidos en el organismo pluricelular. Aunque todas las clulas de un mismo organismo poseen el mismo ADN, los mismos genes, stos no se expresan en todas por igual; por ejemplo, los genes de la hemoglobina slo se expresan en los eritrocitos. Los mecanismos que regulan la expresin gnica constituyen, por tanto, el fundamento molecular de la diferenciacin celular, proceso por el cual, ya durante el desarrollo embrionario, determinados genes se reprimen y otros se expresan en diferentes tipos celulares para dar lugar ms tarde a los distintos tejidos de un organismo. El mecanismo ms importante y generalizado de regulacin de la expresin gnica, tanto en bacterias como en eucariotas, es el control sobre la transcripcin. En los tejidos de los organismos pluricelulares la mayora de las decisiones encaminadas a producir unas protenas y no otras se realiza mediante la activacin de la transcripcin de unos genes y la represin de otros. La activacin de la transcripcin se lleva a cabo frecuentemente por medio de una descondensacin de la cromatina. Frente a seales reguladoras del medio interno, generalmente de naturaleza hormonal, la cromatina de una regin determinada se descondensa durante un perodo de tiempo corto pero suficiente para que se transcriban los genes localizados en esa zona. En las plantas se da un caso especial de regulacin de la expresin gnica en el que es la luz la que ejerce una funcin activadora de determinados genes vegetales. La luz, adems de ser fuente de energa para la fotosntesis, controla el desarrollo de la planta mediante un proceso llamado fotomorfognesis que decide el tamao que debe alcanzar la planta, el nmero de hojas, cundo debe florecer y fructificar y, por ltimo, el tiempo que debe durar hasta que envejece y muere.

Cada uno de los grupos de azcar en la columna vertebral est unido (a travs de la unin roja) a un tercer tipo de molcula llamada base nucletica. Mientras que hay slo cuatro diferentes bases nucleotdicas que pueden estar en un cido nucleico, cada cido nucleico contiene millones de bases unidas a l. El orden en el cual estas bases nucletidas aparece en el cido nucleico, codifica la informacin contenida en la molcula. En otras palabras, las bases nucletidas sirven como una suerte de alfabeto gentico donde est codificada la estructura de cada protena de nuestros cuerpos. base nucletida base nucletida Pirimidinas Purinas Ribosa Desoxirribosa Pentosa Los nucletidos son steres fosfricos de los nuclesidos. El cido fosfrico se une a alguno de los hidroxilos libres de la pentosa, normalmente el 5': Nucletido = nuclesido + fosfato. Los nucletidos pueden tener una, dos o tres molculas de fosfato unidas entre s, segn se trate de nuclesidos monofosfato, difosfato o trifosfato.

http://html.rincondelvago.com/adn_3.html

cido nucleico

Representacin 3D del ADN.

Los cidos nucleicos son macromolculas, polmeros formados por la repeticin de monmerosllamados nucletidos, unidos mediante enlaces fosfodister. Se forman, as, largas cadenas o polinucletidos, lo que hace que algunas de estas molculas lleguen a alcanzar tamaos gigantes (de millones de nucletidos de largo). El descubrimiento de los cidos nucleicos se debe a Friedrich Miescher, quien en el ao 1869 aisl de los ncleos de las clulas una sustancia cida a la que llam nuclena, nombre que posteriormente se cambi a cido nucleico.

Contenido
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1 Tipos de cidos nucleicos 2 Nuclesidos y nucletidos

o
3 ADN 4 ARN

2.1 Listado de las bases nitrogenadas

5 cidos nucleicos artificiales 6 Enlaces externos

[editar]Tipos

de cidos nucleicos

Existen dos tipos de cidos nucleicos: ADN (cido desoxirribonucleico) y ARN (cido ribonucleico), que se diferencian:

por el glcido (pentosa) que contienen: la desoxirribosa en el ADN y la ribosa en el ARN; por las bases nitrogenadas que contienen: adenina, guanina, citosina y timina, en el ADN; adenina, guanina, citosina y uracilo, en el ARN;

en los organismos eucariotas, la estructura del ADN es de doble cadena, mientras que la estructura del ARN es monocatenaria, aunque puede presentarse en forma extendida, como el ARNm, o en forma plegada, como el ARNt y el ARNr, y

en la masa molecular: la del ADN es generalmente mayor que la del ARN.

[editar]Nuclesidos

y nucletidos

Artculos principales: Nuclesido y Nucletido

Las unidades que forman los cidos nucleicos son los nucletidos. Cada nucletido es una molcula compuesta por la unin de tres unidades: un monosacrido de cinco carbonos (una pentosa, ribosa en el ARN y desoxirribosa en el ADN), una base nitrogenada purnica (adenina, guanina) o pirimidnica (citosina, timina o uracilo) y uno o varios grupos fosfato (cido fosfrico). Tanto la base nitrogenada como los grupos fosfato estn unidos a la pentosa. La unin formada por la pentosa y la base nitrogenada se denomina nuclesido. Cuando lleva unido una unidad de fosfato al carbono 5' de la ribosa o desoxirribosa y dicho fosfato sirve de enlace entre nucletidos, unindose al carbono 3' del siguiente nucletido; se denomina nucletido-monofosfato (como el AMP) cuando hay un solo grupo fosfato, nucletido-difosfato (como el ADP) si lleva dos y nucletido-trifosfato (como el ATP) si lleva tres.

[editar]Listado

de las bases nitrogenadas

Las bases nitrogenadas conocidas son:

adenina, presente en ADN y ARN guanina, presente en ADN y ARN citosina, presente en ADN y ARN timina, exclusiva del ADN uracilo, exclusiva del ARN.

Estructura qumica de Estructura qumica de laadenina. laguanina. Estructura qumica de lacitosina. Estructura qumica de latimina.

Estructura qumica de Estructura qumica deluracilo. laribosa.

Estructura qumica delcido fosfrico.

[editar]ADN
Artculo principal: ADN

El ADN es bicatenario, est constituido por dos cadenas polinucleotdicas unidas entre s en toda su longitud. Esta doble cadena puede disponerse en forma lineal (ADN del ncleo de las clulas eucariticas) o en forma circular (ADN de las clulas procariticas, as como de las mitocondrias y cloroplastos eucariticos). La molcula de ADN porta la informacin necesaria para el desarrollo de las caractersticas biolgicas de un individuo y contiene los mensajes e instrucciones para que las clulas realicen sus funciones. Dependiendo de la composicin del ADN (refirindose a composicin como la secuencia particular de bases), puede desnaturalizarse o romperse los puentes de hidrgenos entre bases pasando a ADN de cadena simple o ADNsc abreviadamente. Excepcionalmente, el ADN de algunos virus es monocatenario, es decir, est formado por un solo polinucletido, sin cadena complementaria.

[editar]ARN
Artculo principal: ARN

El ARN difiere del ADN en que la pentosa de los nucletidos constituyentes es ribosa en lugar de desoxirribosa, y en que, en lugar de las cuatro bases A, G, C, T, aparece A, G, C, U (es decir, uracilo en lugar de timina). Las cadenas de ARN son ms cortas que las de ADN, aunque dicha caracterstica es debido a consideraciones de carcter biolgico, ya que no existe limitacin qumica para formar cadenas de ARN tan largas como de ADN, al ser el enlace fosfodister qumicamente idntico. El ARN est constituido casi siempre por una nica cadena (es monocatenario), aunque en ciertas situaciones, como en los ARNt y ARNr puede formar estructuras plegadas complejas. Mientras que el ADN contiene la informacin, el ARN expresa dicha informacin, pasando de una secuencia lineal de nucletidos, a una secuencia lineal de aminocidos en una protena. Para expresar dicha informacin, se necesitan varias etapas y, en consecuencia, existen varios tipos de ARN:

El ARN mensajero se sintetiza en el ncleo de la clula, y su secuencia de bases es complementaria de un fragmento de una de las cadenas de ADN. Acta como intermediario en el traslado de la informacin gentica desde el ncleo hasta el citoplasma. Poco despus de su sntesis sale del ncleo a travs de los poros nucleares asocindose a los ribosomas donde acta como matriz o molde que ordena los aminocidos en la cadena proteica. Su vida es muy corta: una vez cumplida su misin, se destruye.

El ARN de transferencia existe en forma de molculas relativamente pequeas. La nica hebra de la que consta la molcula puede llegar a presentar zonas de estructura secundaria gracias a los enlaces por puente de hidrgeno que se forman entre bases complementarias, lo que da lugar a que se formen una serie de brazos, bucles o asas. Su funcin es la de captar aminocidos en el citoplasma unindose a ellos y transportndolos hasta los ribosomas, colocndolos en el lugar adecuado que indica la secuencia de nucletidos del ARN mensajero para llegar a la sntesis de una cadena polipeptdica determinada y por lo tanto, a la sntesis de una protena.

El ARN ribosmico es el ms abundante (80 por ciento del total del ARN), se encuentra en los ribosomas y forma parte de ellos, aunque tambin existen protenas ribosmicas. El ARN ribosmico recin sintetizado es empaquetado inmediatamente con protenas ribosmicas, dando lugar a las subunidades del ribosoma.

[editar]cidos

nucleicos artificiales

Existen, aparte de los naturales, algunos cidos nucleicos no presentes en la naturaleza, sintetizados en el laboratorio.

cido nucleico peptdico, donde el esqueleto de fosfato-(desoxi)ribosa ha sido sustituido por 2(N-aminoetil)glicina, unida por un enlace peptdico clsico. Las bases pricas y pirimidnicas se unen al esqueleto por el carbono carbonlico. Al carecer de un esqueleto cargado (el in fosfato lleva una carga negativa a pH fisiolgico en el ADN/ARN), se une con ms fuerza a una cadena complementaria de ADN monocatenario, al no existir repulsin electrosttica. La fuerza de interaccin crece cuando se forma un ANP bicatenario. Este cido nucleico, al no ser reconocido por algunos enzimas debido a su diferente estructura, resiste la accin de nucleasas y proteasas.

Morfolino y cido nucleico bloqueado (LNA, en ingls). El morfolino es un derivado de un cido nucleico natural, con la diferencia de que usa un anillo de morfolina en vez del azcar, conservando el enlace fosfodister y la base nitrogenada de los cidos nucleicos naturales. Se usan con fines de investigacin, generalmente en forma de oligmeros de 25 nucletidos. Se usan para hacer gentica inversa, ya que son capaces de unirse complementariamente a preARNm, con lo que se evita su posterior recorte y procesamiento. Tambin tienen un uso farmacutico, y pueden actuar contra bacterias y virus o para tratar enfermedades genticas al impedir la traduccin de un determinado ARNm.

cido nucleico gliclico. Es un cido nucleico artificial donde se sustituye la ribosa por glicerol, conservando la base y el enlace fosfodister. No existe en la naturaleza. Puede unirse complementariamente al ADN y al ARN, y sorprendentemente, lo hace de forma ms estable. Es la forma qumicamente ms simple de un cido nucleico y se especula con que haya sido el precursor ancestral de los actuales cidos nucleicos.

cido nucleico tresico. Se diferencia de los cidos nucleicos naturales en el azcar del esqueleto, que en este caso es una treosa. Se han sintetizado cadenas hbridas ATN-ADN usando ADN polimerasas. Se une complementariamente al ARN, y podra haber sido su precursor.

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