PRACTICA 5 SIEMBRAS Y CULTIVOS BACTERIANOS.

CITOLOGIA MICROBIANA UNIVERSIDAD DE PAMPLONA FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA

INTRODUCCIN Un mtodo fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio de cultivo ya sea lquido o en la superficie de un medio slido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van, desde azcares simples hasta sustancias complejas que se adicionan para satisfacer las necesidades de algunos grupos microbianos. Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo slido donde las clulas que se multiplican no cambian de localizacin; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisin binaria una estructura macroscpica fcilmente visible denominada colonia compuesta por decenas de millones de clulas similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecer como cultivo puro de un solo tipo de bacteria. Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfolgicamente que es imposible diferenciarlas slo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus caractersticas bioqumicas sembrndolas en medios de cultivo especiales. As, algunos medios contienen un producto que inhibe el crecimiento de la mayora de las especies bacterianas, pero no la de un tipo que deseamos averiguar si est presente. Otras veces el medio de cultivo contiene determinados azcares especiales que slo pueden utilizar algunas bacterias. En algunos medios se aaden indicadores de pH que cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se generan catabolitos cidos. Si las bacterias son capaces de producir fermentacin, generan gases que pueden ser apreciados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado. Con otros medios de cultivo se identifica si las bacterias producen determinadas enzimas que digieren los nutrientes: as, algunas bacterias con enzimas hemolticas (capaces de romper los glbulos rojos) producen hemlisis y cambios apreciables macroscpicamente en las placas de agar-sangre. Los diferentes medios y tcnicas de cultivo son esenciales en el laboratorio de microbiologa de un hospital, pues sirven para identificar las bacterias causantes de las enfermedades infecciosas y los antibiticos a los que son sensibles esas bacterias. MEDIOS DE CULTIVO. El tipo de medio que utiliza un microbilogo depende del microorganismo que est cultivando y el porqu de dicho cultivo. Los microorganismos presentan una enorme variedad de requerimientos nutricionales. Se utiliza un medio mnimo para determinar los requerimientos nutricionales de un organismo y un medio rico si se desea obtener masa celular de una forma rpida. Los medios se pueden formular para el desarrollo de una especie o para distinguir entre especies o cepas. Por tanto, los medios se clasifican en definidos, complejos o indefinidos, selectivos, diferenciales, selectivos-diferenciales y de enriquecimiento, dependiendo de su composicin y uso. Medios definidos Un medio definido es aquel en el cual se conoce composicin qumica exacta, porque ha sido preparado a partir de compuestos qumicos puros. Es fcilmente reproducible y cada uno de sus componentes cumple una funcin nutricional especfica. Existen grupos bacterianos que pueden crecer en medios con composiciones simples basadas en una fuente de carbono orgnico (glucosa) y pueden obtener el resto de los nutrientes esenciales a partir de

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sales minerales. En cambio, otros organismos, denominados exigentes, requieren medios qumicamente complejos ya que requiere un medio con muchos ingredientes. Los medios definidos se usan generalmente para realizar estudios genticos, pero sus inconvenientes a menudo sobre pasan sus ventajas. As, se requiere un tiempo considerable para preparar un medio definido y las bacterias crecen ms despacio en ellos. Adems, no conocemos los requerimientos nutricionales de todas las bacterias y por tanto, no siempre pueden utilizarse. Medios complejos En los medios complejos se desconoce la composicin qumica exacta de un medio complejo, ya que estos medios son preparados a partir de extractos de productos naturales tales como carne, sangre, casena (la protena de la leche), levaduras o soja. La adicin de compuestos cumplen necesidades nutricionales mas completas que los medios definidos, por ejemplo, la casena u otras protenas que se aaden a los medios son usualmente hidrolizadas con enzimas o en medio cido, para hacerlas ms solubles y, por tanto, ms fciles de utilizar nutricionalmente. Una hidrlisis parcial rompe las protenas en pptidos. Una hidrlisis total las degrada hasta aminocidos. A las protenas parcialmente hidrolizadas se les denomina peptonas, quienes son los principales compuestos que poseen hoy en da todos los medios de cultivo. Entre las peptonas comerciales se encuentra la proteosapeptona, la triptona y la triptosa. A la casena totalmente hidrolizada se le denomina hidrolizado de casena. Los diversos componentes de un medio complejo se venden como polvos deshidratados. Tambin existen ya cientos de mezclas complejas que se comercializan como medios complejos especficos. Uno de estos medios es el caldo nutritivo, probablemente el medio complejo que ms se utiliza. Generalmente se prefiere la utilizacin de los medios complejos, ya que son fciles de preparar y permiten un crecimiento rpido de los microorganismos. Medios selectivos Un medio selectivo favorece el crecimiento de ciertos microorganismos, mientras suprime el crecimiento de otros. Los medios selectivos se utilizan para aislar especies particulares a partir de una mezcla compleja vinculan o contienen un producto qumico, como la azida sdca, antibiticos como la polimixina, la tetraciclina, la sulfadiacina, componentes reductores como el telurito potsico, aminocidos toxicos, sustancias que influyen en los procesos de osmodifusion y actividad acuosa como sales o colorantes como el cristal violeta, finalmente la selectividad tambin se puede lograr en otros medios de cultivo cuando se utilizan un valor extremo de pH, limitando el rango de crecimiento de algunos grupos microbianos. Medios diferenciales Se utiliza un medio diferencial para identificar las colonias de un determinado microorganismo. Y las bacterias relacionadas con ella se identifican en medios con un indicador de pH porque originan productos metablicos cidos, que cambian el color del indicador y por tanto de sus colonias. Medios selectivos-diferenciales Algunos medios son selectivos y diferenciales al mismo tiempo, quiere decir que poseen varios componentes que cumplen funciones tanto como de separacin, eliminacin e identificacin de grupos microbianos.

VARIABLES DE CULTIVO EN LABORATORIO Un medio se formula para suministrar todos los nutrientes que un microorganismo necesita para crecer, pero esto no es suficiente para llevar a buen trmino el desarrollo de un cultivo microbiano, existen variables que puede ser modificadas o controladas e influir en el xito para el aislamiento, estas variables son: La temperatura, el pH y la concentracin de oxigeno.

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Temperatura. Cada especie bacteriana se caracteriza por un intervalo de temperatura en el cual presenta su crecimiento ptimo. Por lo general, los microorganismos crecen ms rpidamente cuando se aumenta la temperatura, pero esta actividad y velocidad cesa o llega a cero cuando la temperatura alcanza una valor alto que impide los procesos celulares y desnaturaliza las protenas propias funcionales y estructurales, pero, tambin temperaturas bajas pueden influir en el crecimiento celular generalmente sin efecto letal pero si que retrasa y ralentiza la velocidad de crecimiento. Las temperaturas de laboratorio sulen dividirse en tres grandes grupos, para bacterias ambientales se emplea una temperatura de incubacin de 25 C +/-2C; para bacterias patgenas parasitas o comensales de animales y del hombre la temperatura de incubacin de 37 C +/-2C; y para bacterias que crecen en ambientes calidos se emplea una temperatura de incubacin de 44 C +/-2C. pH. El pH ptimo depende de la especie bacteriana, pero cada una de ellas crece en un intervalo de pH relativamente similar. Casi todas las bacterias crecen mejor a valores de pH prximos a la neutralidad, en el intervalo de 6,5 a7,5. Sin embargo, los hongos crecen mejor entre 4,5 y 6,0.Aunque el pH de un medio sea el adecuado cuando se inicia el cultivo, a menudo el crecimiento microbiano como resultado de la produccin de metabolitos tiende a modificarlo. Para disminuir los cambios de pH en los medios definidos se suelen utilizar tampones. En los medios complejos no suele ser esencial, porque sus materiales naturales actan como tampones dbiles. Los tampones ms eficaces para valores neutros de pH son los fosfatos y el carbonato clcico. Ambos se aaden normalmente como nutrientes (fuente de fsforo y calcio); pero si se desea que acten como tampones se precisarn cantidades mayores. Oxgeno. La concentracin de oxgeno del medio es un determinante crtico para el crecimiento bacteriano. Algunos microorganismos, a los cuales se denomina aerobios estrictos no pueden vivir sin oxgeno porque lo necesitan para obtener energa. Otros microorganismos, llamados anaerobios estrictos no pueden vivir en presencia de oxgeno, para ellos es un agente txico. Otros tipos de organismos, como los anaerobios facultativos o los anaerobios aerotolerantes, pueden crecer tanto en presencia de oxgeno como en su ausencia. Los anaerobios facultativos utilizan el oxgeno si disponen de l, pero tambin pueden crecer sin l. Los anaerobios aerotolerantes no utilizan el oxgeno, pero tampoco les afecta negativamente. Los organismos microaerfilos requieren ambientes con bajas tensiones de oxgeno; las altas tensiones, como las que existen en el are son txicas para ellos. Por tanto, dependiendo del microorganismo que se vaya a cultivar, se tendr que suministrar,restringir o eliminar el oxgeno. Suministrar oxgeno a las bacterias que lo necesitan para crecer, o que crecen ms rpidamente en su presencia,representa una dificultad tcnica. Los organismos aerobios que crecen en la superficie de las placas de agar, obtienen suficiente cantidad de oxgeno de la atmsfera, aunque el interior de toda colonia es completamente anaerobio. Cuando los microorganismos crecen en medios lquidos es ms difcil, porque no existe demasiado oxgeno disuelto en el agua y los microorganismos aerobios lo consumen rpidamente. Todos los cultivos lquidos con ms de uno o dos centmetros de profundidad deben oxigenarse. Esto se lleva a cabo haciendo pasar una corriente de aire a travs del cultivo o agitndolo vigorosamente de forma continua. En casi todos los laboratorios de microbiologa existen agitadores, que son plataformas en las cuales se pueden colocar los matraces convenientemente sujetos, para ser sometidos a un movimiento de rotacin o a una agitacin de vaivn, que mezclan el aire con el cultivo. El suministro de oxgeno a los cultivos de cientos de litros, como los que se utilizan para producir antibiticos, es un desafi para la ingeniera. Estos cultivos se remueven vigorosamente mediante grandes propulsores, mientras se fuerza a que pasen a travs de ellos enormes cantidades de aire. La exclusin del oxgeno del ambiente de los anaerobios tambin plantea problemas tcnicos. Muchos microorganismos anaerobios se pueden cultivar en tubos de ensayo expuestos al oxgeno, s el medio contiene un compuesto qumico que reaccione con el mismo, como el tioglicalato que reacciona con el oxigeno manteniendo la parte inferior del tubo libre de oxgeno. Los anaerobios tambin pueden cultivarse en placas Petri, si estas se incuban dentro de unos contenedores, en los cuales se haya eliminado totalmente el oxgeno y se haya reemplazado por un gas inerte como nitrgeno o argn. Tambin se puede llevar a cabo una eliminacin qumica del oxigeno. Para ello, se comercializan paquetes DANNY ARMANDO PISCIOTTI ORTEGA Microbilogo con nfasis en alimentos 2012 3

con unas mezclas (le reactivos que producen hidrgeno cuando se les aade agua; el hidrgeno reacciona con el oxgeno en presencia de un catalizador; la reaccin consume el oxgeno produciendo agua. Un mtodo muy sencillo para disminuir la concentracin de oxigeno (y al mismo tiempo producir anhdrido carbnico, el cual es beneficioso para ciertos microorganismos) es encender una vela dentro de un recipiente y cerrarlo hermticamente; la vela consumir oxgeno hasta que se extinga. Esta tcnica se utilizaba para cultivar anaerobios aerotolerantes, como las bacterias del cido lctico. Tambin ha sido utilizada para microacrfilos, especialmente cuando el dixido de carbono les favorece. Los microorganismos anaerobios estrictos, que mueren incluso con una breve exposicin al aire, pueden cultivarse en jarras de cristal hermticamente cerradas. Cuando se abren estos contenedores para aadir medio o tomar muestras, se utiliza una corriente de nitrgeno para sacar el aire de la vasija. A veces, se requieren tcnicas ms elaboradas. Es frecuente el uso de cmaras libres de oxgeno, en las cuales se trabaja usando unos guantes conectados a las mismas.

MTODOS DE CONSERVACION. En cualquier laboratorio de microbiologa es fundamental el mantenimiento y conservacin de las colecciones de microorganismos con las que se trabaja ya que facilita posteriormente otros procedimientos analticos. Existen una gran variedad de mtodos de mantenimiento y conservacin de los microorganismos cuya utilizacin va a depender en parte del tiempo previsto (Mantenimiento por Cortos perodos de tiempo, das; Conservacin Largos perodos de tiempo, aos) y en parte de las caractersticas de los diferentes microorganismos (bacterias, hongos, virus, algas, protozoos). Los objetivos de las colecciones de los microorganismos son muy simples: 1.- Mantener los cultivos viables a lo largo del tiempo. 2.- Mantener los cultivos puros, sin contaminaciones. 3.- Mantener los cultivos sin cambios en sus caractersticas, es decir estables.

TECNICAS DE MANTENIMIENTO Y CONSERVACION DE LOS MICROORGANISMOS Subcultivo seriado Consiste en resembrar el microorganismo cada cierto tiempo en un medio adecuado; generalmente se utiliza agar inclinado ya que en medio slido se detectan mejor los contaminantes que en medio lquido y el hacerlo inclinado tiene por objeto el evitar la desecacin rpida del medio. Este mtodo es vlido para cortos perodos de tiempo (semana - 15 das) por lo que deben ser resembrados con frecuencia lo que incrementa el riesgo de contaminacin. Adems, al mantenerlos a temperatura ambiente, pueden crecer y espontneamente cambiar sus caractersticas genticas (mutacin, prdida de plsmidos, etc.) que pueden afectar al carcter por el que fueron seleccionados. Estos dos inconvenientes pueden subsanarse en parte enlenteciendo el metabolismo de los microorganismos al mantenerlos a 4C con lo que su crecimiento es inferior y la necesidad de hacer subcultivos se prolonga a 1 - 3 meses. En microbiologa industrial hay que pensar en mantener las colecciones durante perodos de aos y no de meses, por lo tanto se utilizan otras tcnicas que nos ahorran trabajo y disminuyen los riesgos. Desecacin La eliminacin del agua (deshidratacin) es un mtodo de conservacin que reduce drsticamente el metabolismo. Sin embargo, no todos los microorganismos sobreviven a estos mtodos de secado, por lo que se hace necesario aadir agentes protectores (leche descremada, glutamato sdico al 10%). Una vez secos es importante mantener el producto sellado (tapn de rosca, ampolla) para evitar el contacto con el aire ya que son higroscpicos.

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Los soportes que se suelen utilizar son arena, suelo, slica gel previamente secados y esterilizados por calentamiento con aire caliente (no utilizar autoclave y s calor seco). Sobre estos soportes se aade la suspensin de los microorganismos y se deja secar a temperatura ambiente. Tambin se pueden utilizar como soportes discos o tiras de papel, agar , discos de gelatina donde se aade la suspensin de microorganismos y posteriormente se seca al vaco evitando la congelacin, lo que se denomina L-secado (L-drying). Estos mtodos de secado son particularmente tiles para conservar microorganismos productores de esporas, p.j. actinomicetos. Congelacin Al bajar la temperatura hasta el punto de congelacin o por debajo de ste se reduce el metabolismo drsticamente hasta el caso de prcticamente anularlo con nitrgeno lquido (-196C). Sin embargo, existen una serie de problemas que debemos tener en cuenta. La formacin de cristales de hielo pueden romper las clulas, adems al eliminar el agua lquida por convertirse en hielo existe una concentracin de sales que puede ser perjudicial. Para evitar estos problemas se deben utilizar suspensiones que contengan el mnimo de sales posibles as como utilizar agentes protectores como el glicerol (25%) o dimetilsulfxido (DMSO c.a. 10%) que neutralizan el efecto de las sales. El realizar el proceso de congelacin de una forma rpida o gradualmente no est claro. Algunos recomiendan una bajada gradual (1C/min) hasta -20C para posteriormente enfriar rpidamente. Sin embargo, la descongelacin debe ser rpida. Las distintas temperaturas que se utilizan para la conservacin de los microorganismos por congelacin son: -30C: congelador de frigorfico. No se recomienda debido a la formacin de eutcticos (suspensin con distintos puntos de congelacin debido a los solutos que pueden daar a las clulas). -70C: nieve carbnica (CO2 slido) o ultracongeladores. Es el mtodo ms utilizado en los laboratorios de microbiologa. -196C: nitrgeno lquido. Se utiliza para la conservacin de bacterias, virus y lneas celulares. Existen varios problemas prcticos: el nitrgeno se evapora continuamente por lo que se debe rellenar regularmente; se deben utilizar recipientes que resistan bien estas temperaturas y que estn bien cerrados para evitar la entrada de nitrgeno lquido. Liofilizacin Es el mtodo ms utilizado por las colecciones internacionales de cultivos tipo para la conservacin de los microorganismos. Bsicamente consiste en congelar rpidamente una suspensin de microorganismos y eliminar el agua como vapor de agua directamente del hielo sin pasar por el estado intermedio lquido. Por lo tanto, combina las dos tcnicas anteriormente citadas ya que es una desecacin por sublimacin. El sistema requiere tres componentes: mecanismo de congelacin, bomba de vaco y una trampa de agua. Los lifilos se conservan entre 0 y 5C durante muchos aos. Para su recuperacin se resuspende el lifilo en el medio de cultivo adecuado y se incuban a la temperatura adecuada. No obstante, hay que estudiar, como en los casos anteriores (desecacin y congelacin), las condiciones ptimas de supervivencia de nuestro microorganismo.

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PROCEDIMIENTO. PREPARACION DEL INOCULO. A partir de un cultivo bacteriano en medio solido prepare una suspensin transfiriendo una asada (asa redonda) a un tubo con 10 ml de agua destilada estril, compare la turbidez generada por su microorganismo con la de otras preparaciones, de este primer inoculo transfiera 1 ml a otro tubo de ensayo con 9 ml de agua destilada estril (dilucin 1/100) (Realice el procedimiento de forma asptica, no se olvide de flamear el tubo antes y despus de inocularlo) SIEMBRAS EN SUPERFICIE EN MEDIOS BASICOS. Efecto de la temperatura sobre la velocidad de crecimiento A partir del patrn de la segunda dilucin (1/100) del inoculo en suspensin tome 0,1 ml y depostelo en la superficie del medio de cultivo, distribuya la muestra con la ayuda del asa de digralsky (asa de hockey) realice el procedimiento sembrando en cinco cajas de agar nutritivo e incube cada una a diferentes temperaturas. (5C, 25C, 37C, 42C y 55C), observe como se desarrolla el crecimiento a las 3 horas, a las 6 horas, 12 horas, 24 y 48 horas respectivamente; realice las anotaciones y comparaciones pertinentes. Efecto de tensin de oxigeno sobre el crecimiento celular A partir del patrn de la segunda dilucin (1/100) del inoculo en suspensin tome 0,1 ml y depostelo en la superficie del medio de cultivo, distribuya la muestra con la ayuda del asa de digralsky (asa de hockey) realice el procedimiento sembrando en cinco cajas de agar nutritivo realice este procedimiento por duplicado, un juego de cajas se incuban en aerobiosis y otro juego de cajas se disponen en jarras de anaerobiosis y se llevan a incubacin a diferentes temperaturas. (5C, 25C, 37C, 42C y 55C), observe como se desarrolla el crecimiento a las 6 horas, 12 horas, 24 y 48 horas respectivamente; realice las anotaciones y comparaciones pertinentes.

SIEMBRAS EN SUPERFICIE EN MEDIOS SELECTIVOS DIFERENCIALES. Efecto de los nutrientes y aditivos sobre el crecimiento A partir del patrn de la primera dilucin (1/10) del inoculo en suspensin tome una asada con un asa redonda calibrada (0,1 ml) y realice siembras por agotamiento en la superficie de los medios de cultivo MYP, SALADO MANITOL, HEKTOEN, VRB, PALCAM, PDA y MULLER HINTON, realice las siembras por triplicado e incube cada una de las cajas sembradas por cada medio de cultivo a 5C, 37C y 55C por 48 horas; una vez pasado el periodo de Incubacin, observe las cajas y determine la respuesta celular en cada una de ellas en funcin de la sensibilidad (No hay crecimiento) , resistencia (crecimiento abundante) o tolerancia (crecimiento mnimo) de acuerdo a la composicin de cada uno de los medios, o actividad enzimtica diferencia ( si hay crecimiento y este se caracteriza por tener alguna reaccin diferente al de los dems grupos). Efecto de la presencia de aditivos en etapas de enriquecimiento sobre el crecimiento A partir del patrn de la segunda dilucin (1/100) del inoculo en suspensin tome 0,1 ml y depostelo en los siguientes tubos de ensayo con medios lquidos: AGUA DESTILADA ESTERIL, CALDO BHI, CALDO PEPTONA, CALDO TETRATIONATE, CALDO PEPTONA+10% CLORURO DE SODIO, CALDO BHI+10% ETANOL AL 70%, CALDO RAPAPPORT VASILIADIS, CALDO SELENITO CISTEINA Y CALDO PEPTONA + 5% GLUCOSA. Realice el procedimiento por triplicado y cada uno de los tubos incbelos a diferentes temperaturas: a 25C, 37C y 45C/24 horas, pasado el tiempo de incubacin, observe como se desarrolla el crecimiento y determine el crecimiento como positivo cuando se presente Turbidez ptica considerable, el crecimiento mnimo cuando haya un ligera turbidez y el crecimiento negativo cuando el tubo se encuentra translucido y sin ningn cambio. En una hoja de clculo asigne valores numricos a cada uno de los resultados obtenidos (crecimiento positivo = 1, crecimiento mnimo = 0,5 y crecimiento negativo = 0) grafique dichos resultados y comente sus DANNY ARMANDO PISCIOTTI ORTEGA Microbilogo con nfasis en alimentos 2012 6

observaciones y concluya, como influye la presencia de aditivos en el crecimiento y estos cmo interactan con la temperatura de incubacin. METODOS DE CONSERVACION. Siembra en tubo inclinado A partir de un cultivo en medio solido, tomo una asada del microorganismos (asa recta) y transfiera al inoculo a un tubo con agar nutritivo inclinado, realice una puncin hasta el fondo del medio. (Realice el procedimiento de forma asptica, no se olvide de flamear el tubo antes y despus de inocularlo) a 25C, 24 horas y despus restire y conserve a 5C/15 das, pasado este tiempo repita el procedimiento, mantenga el microorganismo viable durante mes y medio. (45 das) Siembra en caldo y centrifugacin. A partir de un cultivo en medio solido prepare una suspensin transfiriendo una asada a dos tubos con 10 ml de caldo (uno con BHI, otro con Caldo peptona y otro con agua destilada estril) realice este procedimiento por duplicado, Incube a 37C/24 horas, transcurrido ese tiempo, centrifugue los tubos a 2500 rpm por 10 minutos, retire el sobrenadante, realice el procedimiento por duplicado a un grupo de tubos, llvelos a congelacin directa a -40C/30 das; al otro grupo de tubos adicinele entre 2 y 5 ml de glicerol estril y llvelo a congelacin a -40C/30 das; pasado este tiempo, descongele lentamente los tubos (deje los tubos a temperatura ambiente durante 4 horas) rehidrate cada uno de ellos adicionando 10 ml de agua destilada estril y siembre 0,1 ml de cada uno de los tubos en la superficie de agar nutritivo en cajas de petri, distribuya la muestra con la ayuda del asa de digralsky (asa de hockey)e incube a 37C/24, pasado el tiempo cuente el crecimiento y comprelo con los datos de crecimiento del inoculo bajo condiciones normales. Siembra en caldo crio protector y congelacin A partir de un cultivo en medio solido prepare una suspensin transfiriendo una asada a dos tubos con 10 ml de caldo BHI con crioprotectores (sacarosa, glicerol) y SKIM MILK, Incube a 37C/24 horas transcurrido ese tiempo distribuya de 1 ml de cada caldo en viales (tubos eppendorf), sllelos y mrquelos adecuadamente y dispngalos en una bandeja para ser ultrcongelados a -80C/30 das. Pasado este tiempo, descongele lentamente los tubos (deje los tubos a temperatura ambiente durante 4 horas) tome una asada y realice una siembra por agotamiento en la superficie de agar nutritivo, incube a 37C/24, pasado el tiempo observe el crecimiento y comprelo con los datos de crecimiento del inoculo de cada uno de los caldos con crioprotector. CONSULTA. Qu es congelacin rpida y congelacin lenta? Cmo influye la formacin de cristales en el proceso de congelamiento y descongelamiento celular? Qu es un crioprotector, cuales son los ms comnmente usados y en que concentraciones suelen emplearse?

BIBLIOGRAFIA. Mateos, G. Pedro. TEMA 4: MANTENIMIENTO Y CONSERVACION DE MICROORGANISMOS INDUSTRIALES. http://darwin.usal.es/profesores/pfmg/sefin/MI/tema04MI.html Romero Cabello, R. Microbiologa y Parasitologa Humana: Bases etiolgicas de las enfermedades infecciosas.Editorial Panamericana, Mxico 2001. 2ed. Pp.257-429

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