2.09.09. Salmonelosis

CAPTULO 2.9.9.
SALMONELOSIS*
RESUMEN
La salmonelosis es una enfermedad infecciosa del hombre y los animales causada por microorganismos de dos especies de Salmonella (Salmonella enterica y S. bongori). Aunque fundamentalmente son bacterias intestinales, Salmonella est muy distribuida en el ambiente y se encuentran con frecuencia en vertidos de granjas, en las aguas residuales humanas y en cualquier material con contaminacin fecal. En el hombre, los microorganismos del gnero Salmonella son agentes etiolgicos de infecciones intestinales y sistmicas, por lo general, como contaminantes secundarios de los alimentos, de origen animal y ambiental o, frecuentemente, como consecuencia de la infeccin subclnica en animales de abasto que provoca la contaminacin de la carne, los huevos y la leche o la contaminacin secundaria de frutas y verduras que se han fertilizado o regado con desechos orgnicos. La salmonelosis humana es una de las enfermedades zoonsicas ms frecuentes y de mayor impacto econmico causadas por estos microorganismos. Los agentes de Salmonella se pueden encontrar tambin en los alimentos y originando el transporte gastrointestinal asintomtico o enfermedades infecciosas en los animales, particularmente en aves y en cerdos. En todos los pases existe la salmonelosis, pero parece tener una mayor prevalencia en reas de produccin animal intensiva, especialmente de cerdos, de terneros y de algunos tipos de aves criadas en cautividad (con frecuencia, los reptiles son portadores asintomticos de Salmonella). Varios serotipos son especficos del hospedador (ej. S. Abortusovis en ovejas o S. Typhi en humanos) o adaptados al hospedador (como por ejemplo S. Choleraesuis y S. Dublin). La enfermedad puede afectar a todas las especies de animales domsticos; los ms susceptibles son los animales jvenes, en estado de gestacin, o lactantes. La manifestacin ms comn de la enfermedad es la entrica, pero se puede observar un espectro muy amplio de sntomas clnicos que incluye septicemia aguda, aborto, artritis y enfermedad respiratoria. Muchos animales, en especial los cerdos y las aves, pueden estar infectados sin manifestar la enfermedad clnica. Tales animales pueden ser importantes en la difusin de la enfermedad entre explotaciones y como fuentes de contaminacin alimentaria y de infeccin humana. La tifosis aviar y la pullorosis, que son otras enfermedades aviares causadas por Salmonella, se presentan en el captulo 2.3.11. de este Manual. Identificacin del agente: El diagnstico se basa en el aislamiento del microorganismo a partir de tejidos recogidos aspticamente en necropsias o de las heces, de frotis rectales o muestras ambientales, de productos alimenticios o de pienso; se puede diagnosticar tambin serolgicamente la infeccin anterior o actual de animales por algunos serotipos. Cuando aparece infeccin en los rganos reproductores, en el embrin o en caso de aborto, es necesario cultivar el contenido del estmago fetal, de los frotis placentarios y vaginales y, en el caso de las aves, de los huevos embrionados. Salmonella puede aislarse utilizando varias tcnicas, una de las cuales es un pre-enriquecimiento para recuperarlas con dao subletal, medios de enriquecimiento que contienen sustancias inhibidoras para evitar microorganismos competidores, y medios slidos selectivos en placa para diferenciar Salmonella de otras enterobacterias. Para obtener una confirmacin definitiva de la cepa aislada, se pueden aplicar varias pruebas bioqumicas, serolgicas y moleculares a los cultivos puros. Salmonela posee antgenos llamados somticos (O), flagelares (H) y de virulencia (Vi), que pueden identificarse mediante sueros especficos de tipo, y despus puede determinarse el serotipo por referencia a la frmula antignica del esquema de KauffmanWhite. Muchos laboratorios necesitan enviar los
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
Captulo 2.9.9.- Salmonelosis
aislamientos a un laboratorio de referencia para confirmar por completo la identidad serolgica y determinar, cuando sea posible, el fagotipo y el genotipo de la cepa. Pruebas serolgicas: Las pruebas serolgicas deben realizarse en una muestra de la poblacin que sea estadsticamente significativa, pero estas pruebas poseen un valor limitado si se utiliza la vacunacin. En el diagnstico rpido de S. Pullorum/Gallinarum en aves de granjas avcolas se utiliza la prueba de sangre completa, que es una prueba diagnstica relativamente fiable en determinadas circunstancias. En el laboratorio, el mtodo preferido para la exportacin y el diagnstico de muestras de todos los animales de granja es la prueba de aglutinacin en tubo. Existen enzimoinmunoensayos para algunos serotipos, y pueden utilizarse para el diagnstico serolgico y el control, especialmente, en el caso de aves y cerdos. La vacunacin puede comprometer el valor diagnstico de las pruebas serolgicas. Requisitos para las vacunas y el material de diagnstico: Contra la salmonelosis se utilizan muchas vacunas inactivadas y hay comercializadas algunas vacunas vivas. Debido a la baja eficacia de las vacunas inactivadas, se utilizan adyuvantes con aceite o hidrxido de aluminio para mejorar sus propiedades inmungenas. A menudo se carece de datos sobre la eficacia en condiciones de campo, aunque las pruebas de laboratorio pueden servir como indicadoras. Las pruebas de inocuidad se realizan en animales de laboratorio y, en el caso de las vacunas inactivadas, se llevan a cabo pruebas de esterilidad con medios bacteriolgicos de enriquecimiento. Para las vacunas producidas por manipulacin gentica se necesita ms seguridad, por ejemplo en lo que respecta al impacto ambiental y a la estabilidad. Para reducir las infecciones por Salmonella en las aves y otras especies animales se puede emplear la exclusin competitiva.
A. INTRODUCCIN
De acuerdo con la actual nomenclatura, que refleja avances recientes en la taxonoma (42), el gnero Salmonella incluye solo dos especies importantes: S. enterica y S. bongori. Se ha propuesto tambin una supuesta tercera especie, S. subterranea, tras el aislamiento de una nica cepa ambiental poco usual (24, 27, 50, 54). Salmonella enterica se divide en seis subespecies, que se distinguen por algunas caractersticas bioqumicas, y algunas de ellas se corresponden con subgneros anteriores. Estas subespecies son: Subgneros originales Subespecie I Subespecie II Subespecie IIIa Subespecie IIIb Subespecie IV Subespecie VI Nomenclatura Actual subespecie enterica subespecie salamae subespecie arizonae subespecie diarizonae subespecie houtenae subespecie indica
= = = = = =
El smbolo V se reserva para los serotipos de S. bongori a fin de evitar confusiones con el nombre de serotipo de S. enterica subesp. enterica. Las cepas de Salmonella se clasifican en serotipos segn la gran diversidad de los antgenos (O) del lipopolisacrido (LPS) y de los antgenos proteicos de los flagelos (H), de acuerdo con la clasificacin de KauffmannWhite; en la actualidad se reconocen aproximadamente 2.500 serotipos (42). Este nmero est en constante aumento. Los serotipos ms comunes que causan infeccin en humanos y en animales de abasto pertenecen a la subespecie enterica. Los serotipos de las otras subespecies tienen mayor probabilidad de presentarse en animales poiquilotermos (de sangre fra) y en el ambiente, pero a veces se les asocia con la enfermedad en humanos. Algunos serotipos de las subespecies S. arizonae y S. diarizonae se han asociado con enfermedades en los pavos y en las ovejas, y otros pueden ser vehiculados por reptiles y anfibios silvestres o en cautividad. Solo se conservan los nombres para los serotipos de la subespecie enterica. Estos nombres no deben escribirse en cursiva. La primera letra es mayscula. En la prctica clnica, no es necesario indicar el nombre de la subespecie, ya que solamente llevan nombre los serotipos de la subespecie enterica; por ejemplo, Typhimurium, London, o Montevideo son serotipos de la subespecie enterica. En la prctica rutinaria, se puede usar el gnero Salmonella seguido del nombre del serotipo (ej. Salmonella Typhimurium). La mayor parte de los serotipos de otras subespecies se designan mediante una frmula antignica que incluye la subespecie, designada mediante nmeros romanos (ej. Salmonella IV 48:q.z51) En este captulo se siguen las nuevas convenciones establecidas de forma abreviada; es decir, se usa S. Typhimurium en lugar de la nomenclatura ms completa S. enterica, subesp. enterica serotipo Typhimurium.
Tambin se dan cambios de forma regular en la clasificacin de los serotipos a medida que se dispone de nueva evidencia sobre el parentesco gentico, ej. S. Pullorum se clasifica actualmente como S. gallinarum serotipo Pullorum (42). La salmonelosis es una enfermedad infecciosa del hombre y de los animales causada por microorganismos de las dos especies de Salmonella (S. enterica y S. bongori). Aunque fundamentalmente son bacterias intestinales, Salmonella est muy distribuida en el ambiente y se encuentra con frecuencia en vertidos de granjas, en las aguas residuales humanas y en cualquier material con contaminacin fecal. En todos los pases existe salmonelosis, pero parece ser ms prevalente en reas de produccin animal intensiva, especialmente de aves y cerdos. La enfermedad puede afectar a todas las especies de animales domsticos, siendo ms susceptibles los ms jvenes y los animales gestantes. La manifestacin clnica ms comn es la enfermedad entrica, que a menudo se presenta como una diarrea sanguinolenta y muy acuosa acompaada de fiebre, pero se puede observar un amplio espectro de sntomas clnicos, como septicemia aguda, aborto, artritis, necrosis de las extremidades y enfermedad respiratoria. Los sntomas y las lesiones no son patognomnicos. Muchos animales, especialmente las aves y los cerdos, pueden estar infectados pero no mostrar enfermedad clnica (65). Tales animales pueden ser importantes en la diseminacin de la enfermedad entre explotaciones y ser causa de intoxicacin alimentaria humana. En el ltimo caso, esto puede suceder cuando estos animales entran en la cadena alimentaria y originan productos alimenticios contaminados (64, 65). El curso de la infeccin, los sntomas clnicos, los hallazgos post mrtem y los modelos epidemiolgicos varan segn el serotipo y la especie animal implicada. Algunos serotipos solo afectan a determinados hospedadores, por ejemplo S. Gallinarum a aves y S. Cholerasuis a cerdos, aunque la mayor parte pueden causar enfermedad en un amplio rango de especies animales (51). Se ha visto que muchos serotipos (incluyendo los que estn adaptados a hospedadores) tales como S. Coholeraesuis y S. Dublin originan la enfermedad en humanos, y los trabajadores que asisten a los animales, los veterinarios y los empleados de mataderos, pueden infectarse directamente en el trabajo, as como el personal de laboratorio. Normalmente, la enfermedad se describe como salmonelosis, aunque se puede usar el trmino de fiebre paratifoidea, por ejemplo, la paratifoidea porcina. En la industria avcola, la pulorosis o diarrea blanca bacilar y la tifosis aviar designan a menudo las infecciones causadas por S. Pullorum y S. Gallinarum, respectivamente (51). La tifosis aviar y la pulorosis se describen con detalle en el captulo 2.3.11 del presente Manual. Para las investigaciones epidemiolgicas detalladas es necesario identificar las cepas, y tales investigaciones han descansado tradicionalmente en mtodos bioqumicos y serolgicos, en la fagotipificacin de algunos serotipos y en los antibiogramas. En los ltimos aos se ha utilizado con xito el anlisis genotpico de los microorganismos mediante el uso de la reaccin en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) y la determinacin molecular de las huellas del ADN. El anlisis del perfil de plsmidos es un mtodo rpido y relativamente fcil para caracterizar cepas, y se ha empleado para estudiar la dispersin de Salmonella tanto en medicina humana como en veterinaria. Esta tcnica presenta limitaciones, pues no todas las cepas de Salmonella presentan plsmidos, y los plsmidos se pueden adquirir con facilidad o ser de un tamao similar pero genticamente diferentes. Sin embargo, ese procedimiento ha resultado ser til para la investigacin de los brotes como complemento de otros mtodos. Para suplementar los estudios del perfil de los plsmidos se han utilizado otras tcnicas genticas alternativas, como la electroforesis en gel de campo pulsante, el AFLP (polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados), VNTR (nmero variable de repeticiones en tndem), anlisis SNP (polimorfismo de nucletido nico) y ribotipificacin automatizada (4, 32, 53. 56). La genotipificacin es un campo de trabajo en expansin y, en los ltimos aos se han desarrollado muchos mtodos nuevos. Debe tenerse en cuenta que un nico mtodo puede no servir para todos los aislamientos y que puede ser necesario evaluar diferentes tcnicas hasta encontrar un mtodo o combinacin de mtodos que resulte satisfactorio y capaz de diferenciar clones de un serotipo o fagotipo particular (45, 55). A menudo las tcnicas moleculares son ms discriminatorias y rpidas y estn sustituyendo a los mtodos fenotpicos, tales como la serotipificacin y la tipificacin mediante el fago, en las investigaciones epidemiolgicas de algunos laboratorios. Sin embargo, estas herramientas moleculares no estn disponibles necesariamente en todos los laboratorios o no han sido estandarizadas para producir resultados replicables en diferentes laboratorios, y es posible que los aislamientos tengan que enviarse a un laboratorio de referencia adecuado. Se estn elaborando tcnicas genticas como la hibridacin en microarrays y la PCR mltiple destinadas a identificar serotipos especficos y a proporcionar informacin adicional sobre el contenido gentico (18, 19, 44). El aislamiento de Salmonella y su posterior identificacin depende no solo de la calidad de la muestra sino tambin del medio de cultivo y de las caractersticas de crecimiento del serotipo, particularmente, en aquellos casos en que estn adaptados a una especie hospedadora. Se ha publicado recientemente una revisin completa de la infeccin de animales domsticos por Salmonella (65).
En muchos pases se han llevado a cabo programas nacionales para controlar las infecciones animales por Salmonella con vistas a proteger al consumidor. En la Unin Europea, la Directiva de Zoonosis 2003/99/EC establece el control respecto a S. Enteritidis y S. Typhimurium de las explotaciones de ms de 250 aves y de las incubadoras. De acuerdo con la legislacin adicional, S. Virchow, S. Infantis y S. Hadar tambin se sometern a controles especiales (10). El mismo da de la llegada se realiza el cultivo de los revestimientos de las jaulas de reparto de las aves, de las aves muertas y de algunas al azar. A las 4 semanas de edad y 2 semanas antes de la puesta de huevos, se cultivan las heces de hasta 60 muestras, dependiendo del tamao de la explotacin. Despus, los adultos se muestrean cada 2 semanas. Tambin se llevan a cabo cada 2 semanas, en las incubadoras donde eclosionan los huevos, se cultiva el meconio y los animales muertos dentro del cascarn, aunque existen planes para sustituir lo anterior por la observacin de los revestimietos de los compartimentos de la incubadora en la granja. La UE tambin est legislando sobre el control de Salmonella en parvadas de asentamientos comerciales, pollos de asar, pavos y cerdos. El anlisis serolgico est permitido como medida complementaria, pero no puede seguir reemplazando al anlisis bacteriolgico de las aves de corral. En Dinamarca se utiliza el control serolgico de Salmonella en explotaciones porcinas y en explotaciones comerciales de aves ponedoras. En otros varios pases existen actualmente programas de vigilancia para sacrificar piaras de cerdos utilizando muestras de jugo de carne o suero tomado en el matadero. Las infecciones de animales de abasto por Salmonella tienen un papel importante en la salud pblica y particularmente en la seguridad alimentaria, ya que los alimentos de origen animal se consideran como la fuente principal de infecciones por Salmonella en el hombre (64). Se han realizado programas especiales para el control de aves, cerdos y ganado bovino, que incluyen el control de animales sanos que pueden ser portadores subclnicos de estos microorganismos. Tambin se controla la contaminacin cruzada durante el procesamiento de los alimentos, ya que puede ocurrir contaminacin por manipuladores de alimentos sanos (65). El pienso contaminado con Salmonella es la fuente ms frecuente de infeccin en animales. Como la contaminacin del pienso se debe a menudo a serotipos de importancia para la salud pblica, los piensos, sobre todo la harina de carne y huesos, deben analizarse para investigar la presencia de Salmonella (46). El pienso contaminado con Salmonella ha sido la fuente ms comn de introduccin de nuevas cepas de Salmonella en las redes de produccin de ganado, desde las que se disemina por los desplazamientos de los animales portadores y por otras vas. En muchas situaciones la mayor amenaza puede provenir del comercio nacional o internacional de ganado; puede ser que el pienso contenga serotipos medioambientales menos patgenos que no causen la enfermedad ni ciclos de infeccin en animales. Como la contaminacin del pienso se debe a menudo a serotipos de Salmonella de importancia para la salud pblica, debe analizarse el mismo para detectar la presencia de Salmonella (65). Como los piensos se elaboran con mezclas de ingredientes de procedencia variada, puede encontrase en los mismos una amplia gama de salmonelas exticas. Una vez establecidas en una instalacin, la propagacin de unos animales a otros, la contaminacin ambiental y las plagas de la granja se convierten en las principales causas de la continuidad y la propagacin de la infeccin. Las muestras de pienso y de comida analizadas para investigar presencia de Salmonella deben ser representativas. Se deben tomar medidas adecuadas para evitar la contaminacin durante el transporte o el almacenamiento (20, 21). Debido a la amplia variedad de alimentos y de productos alimenticios no hay un nico mtodo de muestreo que sea apropiado para todos los casos. Por lo tanto, se deben utilizar mtodos diferentes que sean especficos para el producto (11, 22). La Organizacin Mundial de la Salud proporciona informacin sobre el desarrollo de medidas adecuadas para la prevencin y el control de las enfermedades transmitidas por los alimentos, incluyendo las infecciones del hombre por Salmonella. Los vehculos ms comunes de infeccin son los huevos y sus productos derivados, la carne de pollo y de otros animales, as como los derivados crnicos. Las cosechas de verduras contaminadas y las especias tambin son causa de numerosos brotes. Los serotipos ms frecuentes en muchos pases europeos son S. Enteritidis y S. Typhimurium (aunque Salmonella es escasa en la produccin de ganado, algunos pases de la UE cuentan con estrictos programas de control), mientras que el serotipo dominante en Norteamrica es S. Typhimurium (64). Una poltica de control de Salmonella a efectos de la salud pblica debe cubrir todas las etapas desde el establo a la mesa. Debe incluir la declaracin obligatoria de todos los brotes de la enfermedad (13), y el control del pienso y la comida (65). El control de alimentos debe incluir el muestreo de los alimentos compuestos y de otras materias primas no procesadas para alimentacin, as como el muestreo durante el procesamiento de la comida. Deben realizarse investigaciones epidemiolgicas a nivel mundial para analizar la transmisin de Salmonella y para apoyar las polticas de control de Salmonella. Son esenciales los controles sanitarios e higinicos en los mataderos, y se deben tomar precauciones especiales durante el sacrificio de poblaciones animales potencialmente infectadas. Deben practicarse medidas de descontaminacin durante el procesamiento. Cada vez es mayor la utilizacin de vacunas para disminuir Salmonella en las aves de corral y es importante diferenciarla de las infecciones de campo para fines de control y asegurarse de que las vacunas no contagian a los animales no vacunados (60).
Otro elemento esencial en la profilaxis de la salmonelosis humana es la educacin del consumidor, en particular, la concienciacin sobre el manejo y almacenamiento seguro del alimento, la higiene en la cocina y el tratamiento culinario adecuado para limitar el riesgo de infeccin.
B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1. Identificacin del agente
La frecuencia del muestreo y el tipo de muestras obtenidas dependern en gran medida de los objetivos del programa de pruebas (incluidos los requisitos estatutarios), los hallazgos clnicos, los niveles de deteccin o la precisin necesaria en la estimacin de la prevalencia, el coste y la disponibilidad de recursos para el muestreo y de instalaciones de laboratorio. Las muestras individuales para pruebas bacteriolgicas se recogen tan aspticamente como sea posible y, en caso de enfermedad clnica o de control rutinario, deben recogerse antes de comenzar cualquier tratamiento antibitico. Con preferencia, las muestras clnicas se recogen durante la fase aguda de la enfermedad o muy pronto despus de la muerte. En el caso de las parvadas de aves de corral o de otras especies avcolas, las muestras ambientales, como las heces agrupadas de forma natural, la basura y el polvo, los barridos o los frotis a partir de las superficies del suelo, pueden ser el modo ms eficaz, en cuanto al coste, de identificar granjas infectadas (5, 25). Se deben tomar precauciones para evitar la contaminacin cruzada de las muestras durante la recogida, el desplazamiento y en el laboratorio. Los envos deben mantenerse en fro y estar acompaados de una informacin adecuada. Si es posible, en el caso de especies animales pequeas, es preferible enviar al laboratorio un nmero representativo de animales enfermos o recin muertos (63). Normalmente, los serotipos adaptados al hospedador son ms difciles de aislar de las heces, de modo que, si se sospecha esta situacin, se deben cultivar tejidos infectados siempre que sea posible. Se debe prestar una atencin particular al aislamiento de Salmonella en animales con infecciones subclnicas, ya que estos pueden liberar bacterias solo de modo intermitente y en cantidades bajas. Se puede lograr aumentar la sensibilidad diagnstica incrementando el tamao de las muestras y el nmero de las muestras para que representen ms individuos, todo ello combinado en algunos casos con la mezcla de las muestras y la repeticin de los muestreos. En tales situaciones los mtodos bacteriolgicos o serolgicos se deben utilizar para identificar poblaciones infectadas ms que para identificar animales individuales infectados.
Cultivo
Existen muchos mtodos para aislar Salmonella que son de uso universal (9, 14, 17, 29, 46, 63). Ms adelante se describen algunos de los mtodos ms comunes. Las tcnicas y medios de cultivo con los mejores resultados en una situacin diagnstica concreta dependen de una variedad de factores que incluyen el tipo de Salmonella, el origen y tipo del ejemplar, la experiencia del microbilogo y la disponibilidad de medios de enriquecimiento selectivo y de medios selectivos en placas. Todos los medios de cultivo preparados deben someterse a controles de calidad y permitir el crecimiento del microorganismo sospechoso a partir de un inculo pequeo. El uso de la cepa de referencia en paralelo con las muestras rutinarias puede dar lugar a contaminacin cruzada de las muestras por la utilizacin inadecuada de las tcnicas, as que debe utilizarse un serotipo escaso con caractersticas de cultivo tpicas que sean semejantes a las de la cepa problema ms prioritaria. El establecimiento progresivo de programas para la garanta externa de la calidad ha impulsado la utilizacin creciente de mtodos estndar, como la norma ISO 6579:2002; aunque esta no ha sido validada para muestras fecales y ambientales y se estableci para los alimentos y los piensos. En los ltimos aos se ha elaborado y evaluado un mtodo estndar para la deteccin de Salmonella a partir de la industria de produccin animal, y casi se ha adoptado un mtodo ISO (35). Lo esencial del mtodo estndar es el preenriquecimiento en agua de peptona tamponada, el enriquecimiento en RappaportVassiliadis (MSRV) semi-slido modificado, el aislamiento en agar xilosa-lisina-dexosicolato (XLD) y un medio selectivo de cultivo en placa.
a)
Medios de preenriquecimiento
El nmero de salmonelas es normalmente bajo en las heces de los animales asintomticos, en muestras ambientales, en los alimentos para el ganado y en los alimentos, por lo que es necesario utilizar medios de preenriquecimiento para facilitar el aislamiento, tal como el agua de peptona tamponada o el caldo universal de preenriquecimiento. Esto puede permitir que un escaso nmero de Salmonella se multipliquen sin que mueran por los efectos txicos de los medios de enriquecimiento, o puede ayudar a la recuperacin de las que presentan daos subletales, como los debidos a la congelacin, el calentamiento, la exposicin a las substancias microbicidas o a la desecacin El preenriquecimeinto puede que no sea el mejor mtodo para aislar cepas poco vigorosas de Salmonella de las heces, como el caso de las cepas adaptadas al
hospedador, debido a un sobrecrecimiento preenriquecimiento no selectivo.
de
microorganismos
competidores
durante
un
b)
Medios de enriquecimiento
Los medios de enriquecimiento son medios lquidos o semislidos que contienen substancias que permiten el crecimiento selectivo de las salmonelas a la vez que inhiben el crecimiento de otras bacterias. Algunos, sin embargo, son tambin relativamente txicos para algunos serotipos de Salmonella, por ejemplo, el selenito inhibe S. Cholerasuis, y el colorante verde brillante es txico para muchas cepas de S. Dublin. Tambin se han utilizado las temperaturas elevadas para aumentar la selectividad del medio de enriquecimiento. En algunos laboratorios se utiliza una temperatura de 43C, aunque con algunos medios puede resultar inhibidora; por ejemplo, los medios de tetrationato y de RappaportVassiliadis inhiben las cepas termosensibles, especialmente S. dublin, y ahora se recomienda 41.5C para incubacin en caldo de RappaportVassiliadis (22). Tambin se puede emplear el enriquecimiento selectivo por movilidad para aumentar la sensibilidad del aislamiento de Salmonella y la utilizacin de medios de enriquecimiento semislidos, como MSRV o medio semislido para el diagnstico de Salmonella (DIASALM), que pueden proporcionar mayor sensibilidad (59). La composicin del medio, que puede variar de un proveedor a otro, o incluso en algunos casos de un lote a otro, la temperatura y la duracin de la incubacin, y el volumen de las muestras utilizadas como inculo del medio, pueden servir para influir en la tasa de aislamiento, y se deben tener siempre en cuenta estas variables. Ejemplos de medios selectivos de enriquecimiento son el de tetrationato sdico, como en el caldo de MullerKauffman, los caldos con selenito F, con selenito cistena, con verde brillante, el de RappaportVassiliadis o el medio semislido de RappaportVassiliadis. En algunos casos puede resultar ventajosa la utilizacin de ms de un caldo selectivo o el cultivo mediante preenriquecimiento y el enriquecimiento y la siembra directa, aunque a menudo el beneficio no justifica el aumento de los costes. Se pueden aadir a los medios selectivos substancias como la Ferrioxamina E para mejorar el aislamiento de Salmonella en muestras con limitacin de hierro o de nutrientes como los huevos, el agua o el suelo (46), o pueden aadirse antibiticos para mejorar el aislamiento de las cepas resistentes a los antimicrobianos.
c)
Medios selectivos en placa

Estos son medios selectivos solidificados con agar que permiten un crecimiento diferencial en varios aspectos. Inhiben el crecimiento de bacterias distintas a Salmonella y suministran informacin sobre algunas de las principales caractersticas bioqumicas diferenciales normalmente la incapacidad de fermentar de la lactosa y la produccin de sulfuro de hidrgeno (H2S). Los resultados se obtienen despus de 24 y 48 horas de cultivo a 37C. En dichos medios Salmonella forma colonias caractersticas que son distintas de las producidas por otras bacterias en la placa, con la posible excepcin de Proteus, Pseudomonas y Citrobacter. En ocasiones, se pueden aislar salmonelas fermentadoras de la lactosa y la produccin de H2S puede ser variable. Se pueden detectar de modo ms eficaz tales cepas atpicas cuando se utilizan medios selectivos semislidos. A este respecto, el medio DIASALM es particularmente til ya que se puede realizar una confirmacin provisional por aglutinacin en porta utilizando antisueros polivalentes anti-O, anti-H o especficos, con lquido de la zona de crecimiento de la placa. Salmonella Abortusovis es un serotipo de crecimiento lento, y es normal incubar las placas durante 72 horas y utilizar el medio no selectivo de agar-sangre. Ejemplos de medios selectivos slidos son el agar verde brillante, el agar xilosalisina-desoxicolato, el agar desoxicolato/citrato, el agar Rambach, y el agar sulfito de bismuto, aunque en la literatura y en los catlogos de medios pueden encontrarse muchos ms. Actualmente se dispone de una amplia variedad de medios slidos. Muchos de estos pueden servir de ayuda para la diferenciacin entre colonias sospechosas, pero deben ser validados para las matrices de muestra, los sistemas de cultivo, y la gama de serotipos utilizados, ya que, bajo ciertas condiciones, la sensibilidad puede ser pobre.
Identificacin de colonias sospechosas
Las colonias sospechosas se subcultivan en medios slidos selectivos y no selectivos para asegurar la ausencia de posibles contaminantes como Proteus spp. Si hay un crecimiento abundante en cultivo puro, las colonias sospechosas se pueden probar por aglutinacin en porta con sueros polivalentes para la tipificacin de Salmonella (28). En algunos casos, la colonia sospechosa puede no aglutinar o autoaglutinar y es necesario entonces utilizar pruebas bioqumicas para confirmar la identificacin. Estas pruebas se pueden realizar con azcares en agua de peptona o con sistemas comerciales (tales como el sistema ndice de Perfil Analtico [API]), la prueba OBIS o en medios compuestos (tales como el agar triple azcar-hierro [TSI]) (12). La identificacin de los antgenos O y H, y, en circunstancias especiales, del antgeno Vi, se realiza mediante aglutinacin directa en porta o por aglutinacin en tubo utilizando antisueros especficos. En el caso de microorganismos bifsicos, es necesario identificar ambas fases mediante el uso de la inversin de fase lo que implica el pase por medio semislido que contenga antisuero contra la fase conocida. La deteccin se facilita por la disponibilidad de antisueros dirigidos contra varios factores, y puede mejorarse utilizando sueros monovalentes de tipificacin. Aunque muchos de los laboratorios puede identificar los serotipos ms comunes, se necesita
utilizar los servicios de un laboratorio de referencia para confirmar la identidad de un aislamiento y, posiblemente, para obtener informacin sobre la fagotipia, si existe una clasificacin disponible, y sobre el perfil gentico. Se pueden necesitar pruebas bioqumicas adicionales para identificar algunas variantes serotpicas, por ejemplo, la del d-tartrato que permite diferenciar S. Paratyphi B var. Java de S. Paratyphi B. Los aislamientos se deben probar en cuanto a su sensibilidad a un conjunto de agentes antimicrobianos ya que existe una preocupacin creciente por la emergencia de mltiples cepas nuevas resistentes que albergan genes de resistencia transferibles a las cefalosporinas y las fluoroquinolonas (26, 43, 61). Las cepas vacunales vivas tambin se identifican mediante marcadores de resistencia a antimicrobianos y por cambios bioqumicos como el auxotrofismo o rugosidad.
Mtodos de reconocimiento inmunolgicos y de cidos nucleicos
Se usan y comercializan numerosos mtodos alternativos de deteccin de Salmonella (6, 8, 12, 48, 49, 52, 57, 66). Estos incluyen mtodos basados en la conductancia/impedancia elctrica, en la separacin inmunomagntica (IMS), en los enzimoinmunoensayos (ELISA), mtodos de la PCR con sondas gnicas, incluyendo la amplificacin basada en la secuencia de cidos nucleicos (NASBA) (6) y en la PCR en tiempo real (16, 31, 40) o cuantitativa (41). Muchos de estos mtodos no han sido validados para muestras fecales y ambientales, y resultan ms adecuados para el anlisis de alimentos humanos (39). Los mtodos rpidos suelen ser ms costosos que los cultivos convencionales, pero pueden resultar econmicamente viables para analizar materiales donde se espera una prevalencia baja de contaminacin o donde los materiales, como los alimentos, estn pendientes de una prueba negativa. Un mtodo de enriquecimiento/IMS en combinacin con un ELISA o PCR puede proporcionar resultados en 24 horas. En la actualidad, ninguno de los mtodos rpidos se ha mostrado adecuado para la deteccin directa de Salmonella, de modo que se necesitan etapas de enriquecimiento selectivo o no selectivo (37). Esto introduce ms pasos en el proceso de deteccin y requiere ms tiempo para el operador. En los mtodos basados en el ADN, la inhibicin de la reaccin de la PCR por elementos de la matriz de la muestra, especialmente en el caso de las heces, resulta problemtica y requiere tcnicas adecuadas de extraccin del ADN (23). Los mtodos de aislamiento rpido pueden tambin estar ligados a sistemas de deteccin sofisticados, como biosensores (38). En los mtodos rpidos para deteccin de Salmonella hay muchas variaciones y avances, pero ninguno parece reemplazar satisfactoriamente al cultivo en todas las circunstancias. Por tanto, no es posible dar detalles de todos los mtodos en este captulo o hacer recomendaciones, pero los artculos de revisin citados ms arriba contienen informacin adicional. Actualmente se estn haciendo esfuerzos para estandarizar a nivel internacional el empleo de algunos mtodos rpidos (30), pero todava existe una cantidad considerable de trabajo pendiente.
Ejemplo de procedimiento de un mtodo para aislar Salmonella de alimentos, piensos, muestras fecales y ambientales
i) Se aade una muestra de 1025 g a 10 volmenes de agua de peptona tamponada a temperatura ambiente. (NB: en el caso de muchos serotipos adaptados a un hospedador, y algunos serotipos arizonae, es preferible aadir la muestra a un medio selectivo de enriquecimiento, como caldo selenito-cistena, y probar muestras de tejido cuando sea posible [incluyendo la siembra directa; vase el mtodo de cultivo para S. Pullorum/Gallinarum en el captulo 2.3.11 de este Manual]. Se incuba el agua de peptona tamponada durante 1620 horas a 37C. Se inocula, con 0,2 ml del agua de peptona tamponada incubada, 20 ml de medio semislido modificado de RappaportVassiliadis o DIASALM en una placa de Petri. Se inocula, con 1ml del agua de peptona tamponada incubada, 10 ml de caldo de tetrationato. Se incuba el medio semislido modificado de RappaportVassiliadis o DIASALM a 41,5C y el caldo de tetrationato a 37C (se ha de estar seguro de que se utiliza una marca fiable de tetrationato para uso a 37C). Despus de 24 y 48 horas de enriquecimiento selectivo, se resiembra del medio semislido modificado de RappaportVassiliadis tomando material del borde de la zona turbia con el asa de 1 l y extendindolo por siembra en estra sobre una placa con agar de Rambach o agar verde brillante y sobre una placa con agar xilosa-lisina-desoxicolato ms novobiocina. Se resiembran 10 l del caldo de tetrationato sobre agar de Rambach o agar verde brillante y sobre agar xilosa-lisina-desoxicolato ms novobiocina.
ii) iii) iv) v)
vi)
vii)
viii) Se incuban las placas a 37C durante 24 horas. ix) Se examinan cinco colonias sospechosas (rojas/rosas con enrojecimiento del medio en el caso de agar verde brillante, carmes con bordes plidos o naranjas/sin color en agar Rambach, rojas con centro negro en agar xilosa-lisina-desoxicolato) utilizando antisuero poli O y poli H (fase 1 y fase 2) o medios bioqumicos compuestos.
x)
Se subcultivan las colonias muy sospechosas que no aglutinen con antisueros poli H en medios no selectivos y se repeten despus las pruebas. Si se obtiene una aglutinacin fuerte con poli O y poli H, esto es suficiente para una confirmacin preliminar. Tales aislamientos se pueden luego seroagrupar. Si los resultados de la aglutinacin no son claros, hay que realizar ms pruebas bioqumicas utilizando medios compuestos como el TSI o emplear ONPG (o-nitrofenil-beta-d-galactopiransido) y urea o pruebas bioqumicas comerciales, como el API ID 32 E.
2.
Pruebas serolgicas
Identificacin serolgica de animales y de explotaciones infectadas
Se han desarrollado varias pruebas serolgicas para diagnosticar las infecciones por Salmonella en animales. En aves, para la identificacin de granjas infectadas con S. Pullorum/Gallinarum, se han utilizado con xito durante ms de 50 aos la prueba de sangre completa, que utiliza un antgeno teido, y la prueba de aglutinacin srica (SAT). Como S. Enteridis posee el mismo antgeno somtico del grupo D que S. Pullorum/Gallinarum, la prueba de sangre completa y otras relacionadas pueden utilizarse en el diagnstico de la infeccin, pero la sensibilidad es baja. Recientemente se han desarrollado otras pruebas, como las de tipo ELISA (58), para el diagnstico de las infecciones por S. Enteritidis y S. Typhimurium y para otros serotipos de animales de granja. Los ensayos ELISA se han utilizado con eficacia para identificar serolgicamente ganado portador de S. Dublin y se pueden aplicar a la leche sin tratar, para analizar ganado estabulado de produccin lctea. En Dinamarca se utiliza un ELISA mixto con suero o fluido tisular liberado por congelacin y descongelacin de muestras de msculo para detectar infecciones de Salmonella en cerdos (36). Se utiliza una prueba similar para detectar anticuerpos contra S. Enteritidis y S. Typhimurium en la yema de huevo de explotaciones comerciales de ponedoras (13). Algunas pruebas ELISA son ahora de uso rutinario y se han comercializado varias, y ahora se requiere la estandarizacin de su utilizacin. La finalidad de esta seccin es considerar las pruebas serolgicas que se han evaluado por completo y que son de uso rutinario en el diagnstico de la salmonelosis en animales. Por tanto, no se considerarn otras pruebas que estn an en fase de desarrollo. Con frecuencia se presentan nuevas pruebas para el diagnstico de Salmonella, de modo que una bsqueda en Internet es a menudo el mejor modo de obtener una informacin actualizada.
1.
Factores que influyen en el diagnstico serolgico

Los mtodos serolgicos deben utilizarse para identificar poblaciones infectadas ms que para identificar animales individuales infectados, aunque se pueden emplear pruebas repetidas en la explotacin como una ayuda para seleccionar los animales portadores crnicos. Normalmente, las pruebas serolgicas se disean para detectar un nmero limitado de serotipos o serogrupos de Salmonella. Se sabe que algunos animales con respuesta serolgica positiva no pueden ser infectados de nuevo por Salmonella. De modo similar, animales que excretan activamente Salmonella pueden ser serolgicamente negativos. Tambin se aplican consideraciones similares a los mtodos de cultivo bacteriolgico, y as, los cultivos fecales con resultados negativos no indican necesariamente que el animal no est infectado. Sin embargo, ninguna de estas situaciones debe considerarse como un problema importante si se realizan suficientes pruebas. Los animales que son serolgicamente positivos pueden haber cesado de excretar Salmonella aunque las concentraciones de inmunoglobulinas circulantes pueden permanecer altas. Otros animales de la granja pueden estar todava infectados. Los animales serolgicamente negativos pueden ser el resultado de una infeccin reciente que origine la excrecin antes de que la produccin de inmunoglobulinas sea mxima, o de una infeccin con serotipos menos invasivos. Con toda probabilidad, los animales que han sido infectados recientemente sern detectados serolgicamente por un programa adecuado de anlisis a lo largo de la vida de la explotacin. Los animales recin nacidos son inmunolgicamente inmaduros y no responden serolgicamente al antgeno somtico LPS hasta las 23 semanas de edad. Sin embargo, s producen una respuesta serolgica a los antgenos de la protena flagelar. El ganado bovino puede no responder serolgicamente hasta las 1012 semanas de edad y es posible que los lechones no desarrollen una respuesta inmune o posean una respuesta de anticuerpos que refleja la inmunidad materna. Las respuestas diferenciadas que implican diferentes clases de anticuerpos (IgM, IgA, IgG) pueden utilizarse en cerdos para distinguir las infecciones recientes de las antiguas, pero con frecuencia eso no es de utilidad para ensayar piaras en las que los individuos se hallan normalmente en diferentes fases de la infeccin. La mayora de las pruebas se basan en la IgG, y es tpico que aparezcan elevados niveles de anticuerpos entre 1 y 3 semanas despus de la infeccin y que duren entre 2 y 3 meses. Los pollos pueden tambin adquirir pasivamente anticuerpos anti-salmonella de sus progenitores a travs del saco vitelino; esto puede indicar que la poblacin de los padres estaba infectada. Los mamferos pueden adquirir anticuerpos de la madre a travs del calostro.
2.
3.
4.
Durante muchos aos se ha utilizado la inmunizacin para controlar ciertas infecciones por Salmonella en animales de granja y, si se emplea serologa en el diagnstico, es necesario diferenciar entre la respuesta a la vacuna y a una infeccin real. Muchas vacunas vivas que se administran oralmente no proporcionan una respuesta de anticuerpos sricos significativa en la mayora de los animales, pero puede haber excepciones ocasionales. Las vacunas muertas inyectables utilizadas para el control de S. Enteritidis en pollos pueden producir una respuesta de anticuerpos muy prolongada. Sera muy provechoso que se pudiera fabricar una vacuna viva marcada que se pudiera diferenciar del desafo de campo mediante pruebas serolgicas. El efecto de la terapia con antibiticos en la respuesta serolgica no est claro. Algunos investigadores encuentran ttulos reducidos despus de la terapia, mientras que otros no detectan efecto alguno. No obstante, si se ha empleado terapia antimicrobiana, la serologa puede ser una tcnica de diagnstico para la salmonelosis ms til que el cultivo. Existen aproximadamente 2.500 serotipos diferentes de Salmonella. Dependiendo del antgeno y de la prueba utilizada, pueden ocurrir reacciones serolgicas cruzadas entre diferentes serotipos, por ejemplo entre S. Typhimurium, S. Pullorum y S. Enteritidis. En algunos casos pueden ocurrir reacciones cruzadas como resultado de la exposicin a microorganismos distintos de Salmonella. En las aves, la yema del huevo se puede probar para detectar inmunoglobulinas frente a Salmonella, y los huevos representan, por tanto, un mtodo para analizar explotaciones. En Dinamarca se emplea esta estrategia para controlar explotaciones comerciales de ponedoras. En el ganado bovino, se puede utilizar la leche para la deteccin de anticuerpos anti-Salmonella para analizar las explotaciones de produccin lctea. La utilizacin de discos de papel de filtro para recoger suero elimina la necesidad de separar el suero. Los discos tambin permiten la conservacin a largo plazo y reducen los costes de transporte al laboratorio. La sensibilidad de la prueba puede resultar levemente reducida en comparacin con las pruebas realizadas con suero fresco.
5.
6.
7.
8.
a)
La prueba de sangre completa

La prueba de sangre completa es una prueba rpida para la tifosis aviar y la pulorosis que puede utilizarse en la granja. La sensibilidad de esta prueba es baja y, sin experiencia, se pueden registrar muchos resultados como falsos positivos y falsos negativos. Para una descripcin detallada de la prueba de sangre completa, vase el captulo 2.3.11 Tifosis aviar y pulorosis.
b)
Prueba rpida de aglutinacin en porta

El suero (0,02 ml) se mezcla con antgeno polivalente teido con cristal violeta (0,02 ml). El porta se mueve cuidadosamente durante 2 minutos, tras los cuales se ve el resultado de la prueba. Los componentes de la prueba se guardan a 4C y antes de usarlos deben alcanzar la temperatura ambiente. Los sueros problema deben estar libres de contaminantes y de hemolisis. Puede ser conveniente centrifugar las muestras de suero que se hayan mantenido guardadas por algn tiempo. Si se sospecha la existencia de reacciones falsas positivas inespecficas, los sueros positivo/sospechosos deben probarse de nuevo despus de una inactivacin trmica a 56C durante 30 minutos.
c)
Prueba de aglutinacin srica

La SAT es relativamente poco sensible, y muchos animales viejos tienen niveles bajos de aglutininas en sus sueros debido a enterobacterias distintas a Salmonella. Las muestras aisladas carecen de valor diagnstico excepto como muestras para el examen inicial del rebao. Se necesitan muestras pareadas como requisito mnimo para confirmar una infeccin activa. La prueba es relativamente barata; los antgenos se pueden preparar con facilidad y no se requiere un equipo costoso. La SAT se puede adaptar a formato de microtitulacin y se puede utilizar para determinar ttulos somticos o flagelares. Se recomienda utilizar para SAT un suero estndar y otros mtodos confirmativos para el control de la pureza y la inmunogenicidad de las preparaciones de antgeno(s) para SAT, que no dependan de los sueros producidos a partir de dichos antgenos. i) Preparacin del antgeno somtico Se resiembra Salmonella, desde el cultivo apropiado de mantenimiento, a una placa con medio agarsangre base (BAB), u otro medio adecuado, para crecimiento de colonias aisladas. Incubar durante toda la noche a 37C (2C).
ii) iii) iv) v) vi) vii)
Se selecciona una colonia lisa y realizar una prueba de aglutinacin en porta para confirmar que est presente el antgeno somtico requerido. Mediante un asa estril, se inocula con la colonia seleccionada un tubo de agar nutritivo inclinado. Se incuba el cultivo durante 812 horas a 37C (2C). Con una pipeta Pasteur, se retira el crecimiento, preferentemente en una cabina de seguridad, con aproximadamente 2 ml de alcohol absoluto y se transfiere el contenido a un tubo estril. Se deja el antgeno a temperatura ambiente durante 46 horas para que el alcohol mate las bacterias y suelte los flagelos. Se centrifuga el tubo en una centrfuga de mesa durante 5 minutos a 1.000 g. Se vierte el lquido y se aade suficiente solucin salina con fenol para conseguir que el antgeno alcance una opacidad equivalente a la de un tubo No. 2 en la escala de Braun (aproximadamente 108 unidades formadoras de colonias/ml) u otro estndar apropiado.
viii) Se realiza una titulacin estndar con un suero conocido para confirmar que el antgeno es positivo para el factor requerido. ix) i) ii) Se guarda en un refrigerador a 4C hasta su utilizacin. Preparacin de antgenos flagelares Se resiembra Salmonella, desde el cultivo apropiado de mantenimiento, a una placa con medio BAB, u otro medio adecuado. Incubar durante toda la noche a 37C (2C). Se realiza un pase en medio semislido (con aproximadamente 0,3% de agar) en un tubo de Craigie, u otro contenedor adecuado, para inducir la expresin ptima del antgeno flagelar apropiado. Si el serotipo es bifsico, se aade al medio antisuero H que corresponda a la fase a suprimir. Se utiliza la aglutinacin en porta para comprobar que Salmonella est en la fase requerida. Si es as, se inocula con un asa de cultivo 20 ml de caldo nutritivo. Se incuba durante 1218 horas a 37C (2C) para un crecimiento ptimo. (Si la fase es incorrecta, se vuelve a pasar por el medio semislido). Se pipetean en la suspensin de antgeno 250 l de formaldehdo al 40% (se deben usar guantes y se debe trabajar preferiblemente en una cabina de seguridad), y se deja toda la noche. Se prueba el antgeno por SAT utilizando el suero de tipificacin apropiado. Procedimiento de la prueba Es ms fcil analizar los sueros a una dilucin de 1/20; se aaden 0,25 ml de antgeno a 0,25 ml de suero prediluido a 1/10 en solucin salina normal. Las mezclas se incuban en un bao de agua a 50C durante 24 horas en el caso de los antgenos somticos, y durante 4 horas, para los antgenos flagelares. La dilucin y el tiempo de incubacin puede variar dependiendo del antisuero usado. Los sueros que dan reaccin positiva se diluyen luego de 1/20 a 1/320 y se vuelven a probar con el antgeno apropiado.
iii)
iv) v) i) ii)
iii)
d)
ELISA para Salmonella Enteritidis

Para la deteccin de IgG (IgY) especfica para S. Enteritidis, existen dos sistemas bsicos principales: el ELISA indirecto (2) y el ELISA competitivo tipo sandwich (58). El ELISA indirecto supone el uso de un antgeno detector que recubre los pocillos de una placa de microtitulacin. Despus de aplicar un reactivo bloqueante para reducir uniones inespecficas, se aaden a los pocillos las muestras problema. El anticuerpo de la muestra que se une especficamente se detecta con un conjugado anticuerpo/enzima. Se han utilizado varios antgenos, incluyendo LPS, flagelos, fimbrias SEF 14, protenas de la membrana externa y preparaciones de antgenos celulares totales. El ELISA sndwich competitivo emplea un reactivo especfico un anticuerpo monoclonal (MAb) o policlonal para recubrir los pocillos de antgeno. Luego se aade una preparacin pura o cruda de antgeno. Despus se aplican las muestras problema seguidas por el anticuerpo conjugado, que no se unir al antgeno si la muestra contiene anticuerpos especficos. El tiempo de ensayo se puede acortar aadiendo simultneamente la muestra problema y el conjugado. Se ha preparado MAb de LPS, flagelos y SEF14 de S. Enteritidis. Ambos sistemas presentan ventajas y desventajas. El ensayo indirecto es ms simple y hay reactivos disponibles para todos los serotipos de Salmonella de pollos, pavos, patos y mamferos. El ELISA
10
competitivo se puede aplicar a todas las especies animales y, en general, muestra mayor especificidad. Sin embargo, no hay reactivos comercializados para todos los serotipos. Tambin hay algunos problemas de afinidad y puede ser menos sensible que las tcnicas indirectas. En condiciones de campo, ambos sistemas han producido reacciones positivas falsas y en algunos casos el anlisis con un ELISA indirecto con LPS puede confirmarse despus con un ELISA competitivo flagelar. Ambos tipos de ensayo pueden utilizarse con suero, yema de huevo o sangre seca reconstituida eluida de discos de papel de filtro. En Dinamarca y otros pases se emplea un ELISA mixto (o ELISA de jugo de carne) para detectar infecciones de Salmonella en cerdos (36). Este ELISA contiene los antgenos O de tipo 1, 4, 5, 6, 7 y 12 del LPS de S. Typhimurium y S. Cholerasuis, lo que capacita al ensayo para detectar serolgicamente el 95% de los serogrupos de Salmonella que se encuentran en los cerdos de la mayora de pases europeos. Tambin se han aadido antgenos del grupo D a algunos kits para ELISA. El suero se utiliza para analizar granjas de produccin y multiplicacin, mientras que, para cerdos en el matadero, se realiza el ensayo con el fluido tisular (jugo de carne) que se libera cuando se descongelan 10 g de muestra de msculo congelado. Con algunos ELISA se puede diferenciar entre las infecciones producidas por serotipos de Salmonella de diferentes serogrupos. Entre los grupos B y D y otros serotipos invasivos se produce alguna reaccin cruzada. Sin embargo, normalmente hay una mayor respuesta de anticuerpos cuando en el ELISA se utiliza LPS del serotipo homlogo. An no se ha decidido ni existe acuerdo internacional sobre cul es el mejor mtodo para establecer un valor de corte en la absorbancia, por encima del cual los sueros se designan como procedentes de una poblacin afectada por S. Enteritidis, sin que se produzca un nivel inaceptable de resultados positivos falsos. Los ELISA estn adaptados a la automatizacin y, por tanto, a programas de muestreo a gran escala. Un problema importante es que se necesita un equipo costoso, y muchos de los reactivos son tambin caros. Hay varias preparaciones ELISA y ELISA-mixtas comercializadas para S. Enteritidis, S. Typhimurium y Grupo B/C. En teora, estas deberan validarse mediante ensayos internacionales coordinados antes de adoptarse a efectos de control. Un ejemplo de un ELISA validado es el desarrollado por el Laboratorio de Referencia de la OIE de VLA Weybridge (ver direccin en el Cuadro de la parte 3 de este Manual). Los requisitos se indican a continuacin. Equipo
Placas de PVC, tipo Falcon microprueba III; pipetas apropiadas y cilindros de medida; lavador de placas de microprueba; lector de placas ELISA; filtro de prueba de 405410 nm y filtro de referencia de 630 nm. i) Antgeno El LPS de S. Enteritidis extrado con fenol est comercialmente disponible (Catlogo Sigma No. L6011). Este se reconstituye en 1 ml de agua desionizada y se guarda a 20C en alcuotas de 100 l en solucin salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7, a una concentracin de 2,5 mg/ml. Para su uso, el antgeno debe ser descongelado en tampn de recubrimiento a la concentracin apropiada. El antgeno LPS tambin se puede preparar por la tcnica de Westphal & Luderitz (62) y estandarizar, en lo que respecta a su concentracin en carbohidrato, por el mtodo de Gerhardt (15) a una concentracin ajustada a 1.000 g/ml. Diluyente del suero y del conjugado
ii)
Se aade seroalbmina bovina (BSA) (2 g) y Tween 20 (0,05 ml) a PBS (100 ml) (Alternativamente, la leche en polvo [1 g] puede reemplazar a la BSA). Se guarda a 4C y se hacen soluciones frescas cada semana. Tampn de recubrimiento: Se aade carbonato sdico (1.59 g) y bicarbonato sdico (2.93 g) a agua desionizada (1 litro) y se ajusta a pH 9,6. (Alternativamente, se disuelve una tableta de tampn 0,05 M carbonato/bicarbonato de Sigma [No. Catlogo C-3041] en agua desionizada [100 ml]). Se guarda a 4C y se renueva cada 2 semanas. Tampn de substrato: Se prepara una solucin de dietanolamina al 10% (v/v) en agua desionizada. La dietanolamina debe precalentarse a 37C antes de distribuirse, y el pH de la solucin debe ajustarse a pH 9,8 con cido clorhdrico 1 M. Se guarda a 4C y se renueva cada 2 semanas. Conjugado enzimtico: Inmunoglobulina anti-pollo de cabra conjugada a fosfatasa alcalina (por ejemplo, ICN Immunobiologicals, o como suministro alternativo de Sigma: A9171) o globulina anti-pollo de otras especies. Se guarda a 4C diluida en diluyente a la concentracin apropiada y se renueva cada semana.
11
Substrato del enzima: Se disuelve una tableta de p-nitrofenil fosfato disdico (5 mg) en tampn de substrato (5 ml) no antes de 30 minutos de su uso, y se mantiene en la oscuridad. i) Estndares Antisuero control positivo preparado por inoculacin intramuscular de cuatro pollos libres de patgenos especficos (SPF) de 1 semana de edad con un inculo que contenga 106 S. Enteritidis. El suero se obtiene 34 semanas despus, cuando los ttulos de anticuerpo son mximos. Suero control negativo A de cuatro aves SPF de 1 semana de edad. Suero control negativo B de 58 productoras de 1 semana de edad que estn libres de infecciones por Salmonella. Se juntan los sueros y se guardan en volmenes de 100 l a 20C.
ii) iii)
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNSTICO

Se utilizan muchas vacunas inactivadas contra la salmonelosis causada por serotipos diferentes en varias especies animales, incluyendo una vacuna combinada contra S. Enteritidis y S. Typhimurium para empleo en aves. La inactivacin se realiza normalmente por calentamiento o por tratamiento con formalina y se suele utilizar un adyuvante, como el hidrxido alumnico. En varios pases tambin se han utilizado vacunas vivas; estas incluyen las cepas semi-rugosas, tales como la 9R para la tifosis aviar y la HWS51 para las infecciones por S. dublin (33). Otras vacunas atenuadas incluyen mutantes autotrficos y de deriva metablica, que se usan en Alemania para evitar infecciones por Salmonella en animales de granja y en el Reino Unido para S. Enteritidis y S. Typhimurium en aves de corral. Se han desarrollado vacunas mutantes, atenuadas racionalmente por supresin de genes mediante tcnicas de biologa molecular, para aves de corral y para otras especies; estas comprenden los mutantes aroA y las cepas con mutaciones en los genes que codifican la adenilato ciclasa (cya) y la protena receptora del adenosn monofosfato cclico (crp) (7), disponibles en los EE.UU. Normalmente, en Europa no se permite el uso como vacunas de microorganismos genticamente modificados. Las normas para la produccin de vacunas veterinarias se presentan en el captulo 1.1.8. Principios de produccin de vacunas veterinarias. Las directrices que se indican aqu y en el captulo 1.1.8 son de carcter general y pueden suplementarse con requisitos nacionales y regionales.
1.
a)
Control del inculo

Caractersticas del inculo
Para vacunas vivas o muertas, la cepa bacteriana debe de estar lo ms estrechamente relacionada que sea posible con las cepas salvajes de circulacin actual. Debe escogerse cuidadosamente de casos de enfermedad clnica grave y debe determinarse su virulencia y la produccin de antgeno. Es mejor evaluar varias cepas potenciales de este modo antes de probar la seleccin+ final. Las cepas vacunales finales deben identificarse por documentacin histrica y caracterizarse por marcadores fenotpicos y/o genticos estables. Las cepas de vacunas vivas debern poseer caracteres estables que permitan su distincin de las cepas salvajes. Se pueden usar marcadores de resistencia a antimicrobianos, por ejemplo a rifampicina. La atenuacin de la virulencia debe ser estable y lograrse preferiblemente por dos mutaciones independientes definidas. La estabilidad de las cepas vacunales vivas puede verificarse mediante comprobaciones peridicas utilizando la determinacin molecular sensible (de las huellas de ADN) y las tcnicas de hibridacin en microarrays.
b)
Mtodo de cultivo
El cultivo de inculo se propaga y mantiene utilizando medios adecuados, muchos de los cuales se han descrito (en libros de texto) para el crecimiento de Salmonella. Los medios empleados no deben contener suero ni tejidos animales. El cultivo puede ser en medio slido, en frascos de Roux, o en medio lquido, en cuyo caso se puede utilizar un equipo de fermentacin a gran escala. La limitacin de hierro o la incubacin a baja temperatura en un medio mnimo puede aumentar la produccin de antgeno LPS por la cepa vacunal.
c)
Validacin como una vacuna

i) Pureza La cepa vacunal debe comprobarse del siguiente modo: Tincin de un frotis de suspensin bacteriana en un porta de vidrio empleando la tincin de Gram. Homogeneidad del cultivo en medios no selectivos. Requerimientos metablicos indicados por pruebas bioqumicas. Deteccin de marcadores, y fagotipia. Aglutinacin con antisuero especfico.
12
ii)
Inocuidad Se debe determinar en ratones la LD50 (dosis letal 50%) o la ID50 (dosis infectiva 50%). A la especie a vacunar se le debe suministrar diez veces la dosis de campo de vacuna viva, o el doble de la dosis de vacuna inactivada, a la edad y por la ruta recomendadas. Los animales se observan para comprobar la ausencia de reacciones adversas. Para las vacunas vivas debe demostrarse su estabilidad y la ausencia de reversin a la virulencia despus de pases seriados en especies susceptibles. Tambin es necesario considerar vacunaciones repetidas. Debe demostrarse que las vacunas vivas no persisten por mucho tiempo en los animales vacunados o que no se transmitan a la leche o a los huevos que puedan consumirse, y el mtodo de aplicacin no debera presentar riesgos a los operadores.
iii)
Eficacia Para demostrar que la vacuna es eficaz deben utilizarse experimentos de laboratorio y ensayos de campo. Los experimentos de laboratorio consisten en pruebas de vacunacin e inoculaciones de desafo en la especie a vacunar, a las dosis y edad recomendadas. Los datos sobre eficacia tambin pueden utilizarse como base para la prueba de potencia de los lotes. Los ensayos de campo para probar la eficacia son ms difciles de realizar, debido a las dificultades para estandarizar las condiciones del desafo y disponer de los controles apropiados.
iv)
Aspectos ambientales Las vacunas vivas deben probarse respecto a su capacidad para persistir en el ambiente e infectar otras especies, como roedores o aves salvajes que puedan resultar expuestas. La supervivencia prolongada de algunas vacunas vivas en las heces y en las camas puede representar un riesgo ambiental inaceptable cuando el material se extrae de los habitculos animales. No deberan usarse vacunas vivas durante la puesta de huevos.
2.
Mtodo de produccin
Las vacunas deben producirse en habitaciones limpias y adecuadas a las que solo tenga acceso personal autorizado. Se debe tener cuidado en evitar la contaminacin cruzada entre reas donde se procesan microorganismos vivos y otras zonas. Debe evitarse la contaminacin de los operadores y del medio, y la preparacin de las vacunas debe tener lugar en una zona separada de la de trabajo con cultivos para diagnstico. Los operarios no deben manejar la vacuna mientras estn enfermos y no deben estar sometidos a condiciones inmunosupresoras o a medicacin. En las reas de produccin y en las habitaciones para animales se debe suministrar ropa protectora al personal. A partir del cultivo del inculo primario se preparan lotes de cultivos de siembra, y el nmero de pases depende de la validacin del proceso. La vacuna se puede preparar por inoculacin de un medio adecuado, como caldo nutritivo, con un cultivo reciente y mediante incubacin en un agitador a 37C durante 24 horas, con o sin aireacin. Los microorganismos se recogen por sedimentacin o centrifugacin. Alternativamente, los microorganismos se pueden cultivar y recoger tanto de medios slidos, como de agar nutritivo. En el caso de vacunas vivas, la suspensin se diluye en PBS, pH 7,0, y se puede liofilizar. El tiempo de inactivacin para una vacuna muerta debe ser al menos un 33% superior al necesario para reducir el nmero de viables a un nivel indetectable. El proceso de inactivacin se debe aplicar a todo el volumen de clulas recogidas como vacuna. Los conservantes, excipientes para la liofilizacin, estabilizadores para recipientes multidosis y otras substancias aadidas o en combinacin con las vacunas no deben tener efecto perjudicial sobre la potencia inmunizante del producto.
3.
Control interno
Los siguientes aspectos requieren atencin: Control visual de la suspensin, homogeneidad por la tincin de Gram, cultivo en medio no selectivo. Aglutinacin en porta con antisueros especficos. Titulacin de bacterias por turbidimetra y/o recuento en placa. Prueba de inactivacin eficaz (vacunas muertas) sembrando en medio no selectivo o utilizando un medio que proporcione ptimo crecimiento, por ejemplo, medio de produccin con la neutralizacin del compuesto inactivante. Titulacin de bacterias viables (vacunas vivas) antes y despus de la liofilizacin.
13
4.
a)
Control de lotes
Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminacin en materiales biolgicos se encuentran en el captulo 1.1.9.
b)
Inocuidad
Se puede utilizar una prueba de laboratorio en ratones, que previamente se haya visto que se correlaciona con la seguridad en la especie a vacunar, para determinar la LD50 y/o la ID50. Cada lote se debe probar en la especie que se ha de vacunar, a la edad y por la va recomendada, utilizando al menos dos veces la dosis de campo para vacunas muertas y diez veces la dosis para vacunas vivas.
c)
Potencia
La potencia se prueba utilizando ensayos de vacunacin-desafo en ratones y otras especies, incluyendo (si es posible) la especie que se ha de vacunar y la respuesta inmunolgica en la especie que se ha de vacunar.
d)
Duracin de la inmunidad
La duracin de la inmunidad suele variar considerablemente segn los productos, los regmenes de vacunacin y los animales individuales vacunados. La inmunidad a Salmonella es normalmente especfica de serogrupo. Las consultas entre colegas sugieren que la mayora de las vacunas muertas proporcionan proteccin durante 6 meses, mientras que algunas vacunas vivas administradas mediante inyeccin inducen una inmunidad ms fuerte, que puede persistir durante 1 ao o ms. Debe recordarse, sin embargo, que un desafo fuerte como el asociado a granjas de ocupacin continua o a roedores infectados puede superar la inmunidad vacunal y las vacunas vivas comerciales pueden ser atenuadas para reducir la supervivencia ambiental de forma tal que disminuya la respuesta inmune. Tambin pueden presentarse problemas con la administracin oral eficaz de la vacuna, con las vacunas vacas o con la precisin de la inyeccin de vacunas inyectables vivas y muertas.
e)
Estabilidad
Se carece de informacin sobre la estabilidad de las vacunas muertas. La estabilidad est afectada por las condiciones de conservacin y por la presencia de microorganismos contaminantes creciendo en el producto. La estabilidad se determina por pruebas de potencia repetidas a intervalos temporales adecuados. La estabilidad de las vacunas vivas se puede determinar realizando un recuento del nmero de microorganismos viables de modo repetitivo a intervalos temporales adecuados.
f)
Conservantes
En las vacunas bacterianas muertas se incluyen a menudo compuestos con actividad antimicrobiana como conservantes, del tipo del tiomersal, fenol o cristal violeta.
g)
Precauciones
En ocasiones, algunas vacunas muertas pueden causar aborto en hembras preadas debido a su contenido en LPS, y las vacunas vivas deben utilizarse tambin con precaucin en estos animales. A veces, sin embargo, es necesario vacunar hembras preadas para proporcionar inmunidad maternal a su descendencia. Puede resultar til incluir en el programa de pruebas de seguridad un ensayo de endotoxinas, de modo que se puedan comparar los niveles con aquellos que se muestran seguros en las pruebas de doble dosis. Las vacunas tambin pueden causar inflamacin en el sitio de la inyeccin.
5.
a)
Pruebas del producto final

Inocuidad
Las vacunas muertas se ensayan en una prueba de dosis doble y las vacunas vivas en una prueba que utiliza diez veces la dosis, en la especie a vacunar.
b)
Potencia
La prueba de potencia debe relacionarse con la eficacia de la vacuna en la especie a la que va dirigida, si es posible, y se deben aplicar criterios adecuados para aprobar los lotes. Es posible estimar las vacunas muertas por la respuesta producida de anticuerpos anti O-H, aunque debe tenerse en cuenta que los
14
anticuerpos sricos son solamente una parte de los mecanismos de proteccin del hospedador contra Salmonella. Alternativamente, la potencia de la vacuna se puede estimar por su efecto sobre la LD50 en ratones.
D. EXCLUSIN COMPETITIVA
En las aves de corral, la susceptibilidad a la infeccin por Salmonella puede reducirse notablemente mediante un tratamiento oral o en aerosol antes de su exposicin al microorganismo (es ideal en la eclosin del huevo) con un cultivo de microflora anaerbica del ciego, que inhibe la colonizacin de Salmonella, ocupando los sitios de la colonizacin intestinal, produciendo cidos y otras sustancias inhibidoras y estimulando las respuestas inmunes generalizadas de tipo local y mucosal. En algunos pases este tratamiento se utiliza con frecuencia, pero en otros solo se emplea como ayuda para descontaminar granjas con infeccin persistente. Tambin es til minimizar la alteracin de la flora intestinal tras el tratamiento microbiano o el estrs y potenciar el efecto de las vacunas administradas a continuacin. Al igual que ocurra con el tratamiento que disminuye la prevalencia o las cantidades de microorganismos de Salmonella excretados por grupos de animales infectados, puede ocurrir alguna interferencia con programas de vigilancia y puede tener que ajustarse el muestreo y la sensibilidad de la prueba para compensar ese inconveniente (1, 34, 47).
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* * * NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la salmonelosis (vase el cuadro en la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consltese la lista ms actualizada en la pgina web de la OIE: www.oie.int).
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ii) iii) iv) v) vi) vii)

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