Anda di halaman 1dari 5

Nama : Satria Torang Hutagalung NRP : G34080106

Asisten : Muhammad Abduh Seni Kurnia G34090021 G34090040

Kelompok : 18 Lab. Bio 5

Mohammad Fadhilah G34090094

ISOLASI PLASMID

Pendahuluan Didalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA. Vektor untuk kloning DNA biasanya menggunakan Plasmid, karena relatif mudah dalam penanganannya. Plasmid dapat dipindahkan antar sel bakteri dengan cara konjugasi atau transformasi. Dalam hal ini, plasmid digunakan sebagai pembawa fragmen DNA asing. Dengan kata lain, plasmid dikombinasikan dengan DNA asing sehingga untuk mengetahuinya dilakukan beberapa percobaan (Anam 2010). Isolasi plasmid dibagi menjadi tiga tahapan kegiatan, yaitu tahap kultivasi dan pemanenan, tahap lisis, dan tahap pemurnian DNA plasmid. Pada tahap kultivasi bakteri diberi kesempatan untuk memperbanyak diri sehingga pada saat pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. Lisis adalah proses pemecahan membran sel bakteri, membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri atas lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi protein di dalamnya (Saunders
and Parkers 1999).

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas berat molekul dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anoda). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu

fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromida. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromida sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet (Anam 2010). Tujuan Percobaan ini bertujuan agar mahasiswa dapat mengetahui dan mengisolasi plasmid untuk vektor cloning. Prosedur Percobaan kultur sebanyak 1,5ml disentrifugase selama 5 menit, 10.000rpm peletnya diambil ditambahkan larutan A sebanyak 250L kemudian divortek ditambahkan larutan B sebanyak 250L dibolak balik sebanyak 10x menambahkan larutan C sebanyak 250L dibolak balik sebanyak 10x kemudian disentrifugasi selama 10menit, 10.000rpm 4oC supernatan + PCI (1xvolume) divorteks disentrifugasi selama 10menit, 10.000rpm

supernatan (fase atas) diambil 500L ditambahkan 0,1x volume NaOAC dan 2-3x volume EtoH 100% diinkubasi freezer selama 30-60menit disentrifugasi selama 20menit, 10.000rpm 4oC dicampur EtOH 70% 500L disentrifugasi 10.000rpm selama 5menit +RNase 0,2x volume Inkubasi selama 10menit di dalam freezer

Hasil Percobaan

Gambar1 hasil elektroforesis sel agarose DNA Keterangan : Sumur dengan plasmid adalah sumur ke 4, 5, 6, 8, dan 12 (dilihat dari kiri) Sumur tanpa plasmid adalah sumur ke 7, 9, 10, dan 11 (dilihat dari kiri) Sumur 1 dan 2 adalah sumur berisi marker dan sumur 3 berisi kontrol

Pembahasan Ukuran DNA hasil elektroforesis dapat dilihat dari laju migrasi DNA yang terlihat sebagai pada sumur. Berdasarkan hasil pengamatan pada gel agarose, dapat dilihat bahwa sumur yang berhasil yaitu sumur yang memiliki plasmid dan terlihat pendarannya (pita), seperti sumur 4, 5, 6, 8, dan 12 (gambar 1). Sumur yang tidak mempunyai pita adalah sumur 7, 9, 10, dan 11 (gambar1). Ketidakberhasilan ini dikarenakan pada saat isolasi plasmid dari sel bakteri tidak diperoleh plasmid yang diinginkan, kemungkinan lain adalah terdapat kontaminan atau materi yang tidak diinginkan di dalam tabung hasil isolasi. Pada praktikum kali ini terdapat beberapa larutan yang digunakan untuk mengisolasi plasmid sampai proses elektroforesis. Proses isolasi plasmid, endapan bakteri diresuspensi menggunakan larutan A(EDTA) untuk mempermudah proses selanjutnya. Endapan yang telah tersuspensi diberi larutan B (NaOH dan SDS). Tujuan pemberian larutan ini untuk melisiskan membran sel bakteri. Setelah membran sel bakteri lisis larutan C ditambahkan (sodium asetat), larutan ini berfungsi penetralisir proses pelisisan sebelumnya sehingga hanya DNA yang bisa keluar. Selain ketiga larutan tersebut, plasmid diekstrak dengan larutan PCI (Fenol/Kloroform/Isoamil alkohol) untuk memisahkan sampel DNA menjadi tiga fase (DNA, protein, dan fenol). Pada proses elektroforesis, DNA yang akan dimigrasikan dicampur dengan larutan loading dye/ loading buffer dan blue bromophenol. larutan ini ditambahkan untuk menandai sekaligus menjadi pemberat agar plasmid berada di dasar sumur. Pembuatan media untuk elektroforesis pada praktikum kali ini menggunakan agarose. Media agarose dipilih karena media ini cocok untuk plasmid yang digunakan. Media untuk elektroforesis dibedakan berdasarkan kepadatan dan kerapatan media. Kerapatan untuk media jenis tertentu dapat diatur dengan cara mengubah konsentrasi media. DNA akan semakin sulit melewati media ketika media dalam keadaan padat atau kerapatan tinggi. Jenis media memiliki kerapatan minimum dan maksimum yang berbeda-beda, sehingga elektroforesis DNA dengan ukuran khusus memerlukan media dengan kerapatan yang tepat.

Kesimpulan berdasarkan hasil isolasi dan elektroforesis DNA pada media gel agarose dapat disimpulkan bahwa elektroforesis dikatakan berhasil jika terlihat pita (pendaran) yang yang sesuai dengan sumur kontrol. Kelompok yang berhasil adalah kelompok 4, 5, 6, 8, dan 12. Hasil dari kelompok 18 tidak terlihat pita pada gel hasil elektroforeis. Hal ini membuktikan bahwa isolasi plasmid dari kelompok 18 tidak berhasil.

Daftar Pustaka Anam K. 2010. Isolasi dan pemetaan DNA plasmid. Bogor : Bioteknologi Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Saunders & Parker. 1990. Molekuler Biotechnology, Principles and Applications of Recombinan DNA. Washinton DC : ASM Press.