Universidade de So Paulo Instituto de Fsica de So Carlos Bacharelado em Cincias Fsicas e Biomoleculares Biologia Molecular e Celular I 2012 Aula Prtica

ica 9: ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA SDS (SDS-PAGE) A eletroforese uma tcnica analtica que separa molculas por carga e tamanho. Na eletroforese de protenas utiliza-se o gel de poliacrilamida, o qual formado pela co-polimerizao de acrilamida e bisacrilamida, constituindo-se em uma rede porosa, cujo dimetro dos poros inversamente proporcional a concentrao de acrilamida. Quando deseja-se separar as protenas somente por tamanho, utiliza-se a tcnica de SDS-PAGE (SDSPolyacrylamide Gel Electrophoresis). O SDS um detergente aninico forte, que se liga aos resduos positivamente carregados das protenas, conferindo s mesmas uma carga final negativa e ocasionando a desnaturao. Outro agente que auxilia na desnaturao proteica o -mercaptoetanol, que promove a reduo das ligaes dissulfeto entre os resduos de cistena. Desta forma, todas as protenas da amostra possuiro carga negativa, estaro linearizadas, e migraro em direo ao eletrodo positivamente carregado. A velocidade de migrao depender somente da massa molecular, sendo que protenas com menor tamanho passaro mais facilmente atravs da malha do gel e, portanto, migraro a uma distncia maior.

O gel de poliacrilamida formado por duas partes. O gel de empilhamento, com menor concentrao de poliacrilamida e poros grandes que permitem a migrao igualitria das protenas, independente das massas moleculares, levando-as a empilharem-se em uma faixa estreita. Aps o empilhamento, as protenas entram no gel de separao, cujos poros so menores, e a velocidade de migrao passa a ser dependente das massas moleculares.

A tabela abaixo apresenta a relao entre a concentrao de acrilamida e a faixa de separao das protenas em KDa. Concentrao de acrilamida (%) Faixa de separao (kDa) 15 12 43 10 7,5 5 16 68 36 94 57 212

A. Preparo do gel de policarilamida (j foi realizado) OBS: As quantidades dos reagentes so suficientes para o preparo de 3 gis Gel de separao (baixo): 15% 7,33 mL de acrilamida 30%, bisacrilamida 0,8% 2,75 mL de 2 M de Tris-HCl pH 8,8 146,3 L de SDS 10% 4,35 mL de gua milli-Q 90 L de persulfato de amnio 10% 16,7 L de TEMED O gel de separao foi adicionado entre as placas do aparato e, para retirar bolhas, 100 L de gua destilada foram adicionados sobre o gel. Aps a polimerizao, a gua foi retirada e a superfcie do gel de separao foi seca com papel filtro. Gel de empilhamento (cima): 3% 600 L de acrilamida 30%, bisacrilamida 0,8% 251 L de 2 M de Tris-HCl pH 6,8 40 L de SDS 10% 3,5 mL de gua milli-Q 33,4 L de persulfato de amnio 10% 6,7 L de TEMED O gel de empilhamento foi adicionado sobre o gel de polimerizao, e logo em seguida, o pente para criar os poos de aplicao foi colocado. Aps a polimerizao, o pente foi retirado e o aparato contendo o gel foi submergido em tampo para corrida dentro de uma cuba para eletroforese de protenas. B. SDS-PAGE Analisaremos as amostras coletadas nas aulas anteriores antes da purificao e aps a purificao, sendo: 1) 2) 3) 4) Cultura bacteriana antes da induo da expresso (Aula 7); Cultura bacteriana 16h aps a induo da expresso (Aula 7); Extrato protico da cultura bacteriana 16h aps a induo da expresso (Aula 8); Protena purificada do extrato protico (Aula 8).

1) Nas aulas anteriores, foram preparados 4 tubos contendo 20 L das amostras e 10 L de tampo da amostra (125 mM de Tris-HCl, pH 6,8; 4% (m/v) de SDS; 20% (v/v) de glicerol; 1% (v/v) de -mercaptoetanol; e 0,03 mM de azul de bromofenol). As amostras foram fervidas por 5 minutos. 2) Aplique as amostras no gel de poliacrilamida, o qual j est preparado na cuba e submerso em tampo adequado (25 mM deTris-HCl; 250 mM de glicina; e 0,1% de SDS, pH 8,8). 3) Aplique uma diferena de potencial de 100 V por aproximadamente 1h30min. 4) Retire o gel da cuba e coloque-o, por 10 min, em soluo de Coomassie para corar as protenas (0,25 g de Coomassie Brilliant Blue R250 em 90 mL de metanol : gua (1:1); e 10 mL cido actico). 5) Transfira o gel para a soluo descorante (mesma soluo de colorao, mas sem o Coomassie) e mantenha-o sob leve agitao at que seja possvel observar as bandas. C. Questes 1) Quais as funes do SDS, persulfato de amnio e TEMED no gel de poliacrilamida? 2) Por que as amostras proticas devem ser fervidas junto com tampo de amostra antes de serem aplicadas no gel? 3) Quais os resultados obtidos para cada amostra? Justifique.