Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia-UESB Departamento de Cincias Biolgicas-DCB Curso: Farmcia Disciplina: Microbiologia Bsica Docente: Ana Paula

de Oliveira Menezes

Identificao de Bactrias: Provas bioqumicas

Jequi - BA Maro/2013

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA CURSO DE FARMCIA DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA BSICA DOCENTE: ANA PAULA DE OLIVEIRA MENEZES

Caroline Rocha da Mata Indhyana Lopes Oliveira Rebeca Cardoso

Relatrio apresentado professora Ana Paula Menezes, junto disciplina de Microbiologia Bsica, para obteno de nota parcial referente ao terceiro semestre.

Jequi BA Maro/2013

INTRODUO

Identificar um dado organismo como espcie baseia-se no preenchimento das caractersticas atribudas quela espcie. O reconhecimento da fonte ou origem do espcime (ambiente, espcie animal, tipo de patologia e localizao) do organismo s vezes fundamental para identificao. A execuo inadequada de um teste preliminar pode confundir e prejudicar todo processo de identificao. Na rotina laboratorial so utilizados certos testes chaves para reduzir o trabalho, o custo e abreviar o tempo requerido para diagnstico. O processo de identificao dos microrganismos efetuado atravs da determinao de um nmero mnimo de propriedades. Portanto, quanto menor o nmero de observaes efetuadas, maior o risco de erros de identificao. Usualmente necessrio utilizar organismos como controles positivos e negativos para a execuo de cada teste. A correta caracterizao cultural do organismo em meios de isolamento primrio, assim como a execuo e interpretao da colorao e reao ao Gram so vitais para esse sistema de identificao. O perodo de incubao varia usualmente com o organismo que est sendo isolado, mas a maioria dos organismos pode apresentar crescimento visvel aps 48 horas. Para a atmosfera de incubao tambm se aplica o mesmo princpio, i.e., para organismos aerbios e anaerbios facultativos utiliza-se a atmosfera ambiente, e para o isolamento de microrganismos microaerbios e anaerbios obrigatrios torna-se necessrio obter a atmosfera adequada atravs de mtodos especiais. Aps escolher ou receber o espcime a ser estudado procede-se ao isolamento em meios slidos apropriados. Para exemplificar usaremos o gar simples e uma cultura mista composta de bactrias conhecidas. Para isolar o microrganismo efetua-se a inoculao ou semeadura, utilizando a tcnica do esgotamento do inculo por estrias, tendo-se o cuidado de usar inteiramente toda a rea do meio para garantir a separao das bactrias, de modo que aps a incubao cada clula separada origine uma colnia. Tambm so empregadas as tcnicas de semeadura por disseminao com ala de Drigalsky ou a tcnica de pour-plate quando, alm do isolamento, pretende-se quantificar a populao microbiana presente originalmente na amostra.

Aps a observao dessas caractersticas devem ser feitos esfregaos para coloraes especiais, para observao da morfologia microscpica (forma, arranjos, tamanho e reao ao Gram), presena ou ausncia de esporos (forma e localizao, com deformao ou no do corpo bacteriano), flagelos (nmero e localizao), cpsulas, granulaes metacromticas (comum em corinebactrias) e colorao bipolar (freqente nas pasteurelas e yersinias). Tambm pode ser verificada a motilidade por exame a fresco. A motilidade verdadeira consiste no deslocamento do organismo em diferentes direes, no devendo ser confundido com o movimento Browniano ou metablico, i.e., o organismo vibra mas no se desloca. Os procedimentos seguintes envolvem a caracterizao metablica, tolerncia a agentes qumicos e fsicos, a antimicrobianos e fagos (fagotipagem), bem como propriedades antignicas ou sorolgicas e patogenicidade atravs da inoculao em espcies animais susceptveis (apropriadas). A investigao das atividades metablicas das bactrias in vitro chamada de Provas Bioqumicas e servem para auxiliar o microbiologista a identificar grupos ou espcies de bactrias ou leveduras atravs da verificao das transformaes qumicas, que ocorrem num determinado substrato, pela ao das enzimas de um dado microrganismo. Como muitas vezes um determinado microrganismo possui um sistema enzimtico especfico, promovendo transformao bioqumica especfica, as provas bioqumicas podem ser utilizadas na prtica para a sua caracterizao. Para a realizao das provas bioqumicas necessrio utilizar meios de cultivo especiais contendo o substrato a ser analisado e fornecer ao microrganismo as condies nutritivas e ambientais necessrias ao seu desenvolvimento. Objetivos: executar e interpretar os resultados e as transformaes metablicas ocorridas em algumas provas bioqumicas empregadas para identificao de bactrias. As principais e mais utilizadas provas bioqumicas so:
1.

Produo de catalase; Prova da coagulase; Prova da citocromo-oxidase; Prova da produo de urease; Utilizao do citrato como nica fonte de carbono; Prova da produo de indol; Prova da produo de gs sulfdrico ou sulfeto de hidrognio; Prova da fermentao de carboidratos (Lactose);

2.
3. 4.

5. 6. 7.
8.

9.
10. 11.

Prova da motilidade; Prova de Voges-Proskauer (VP) (Produo de H2S) Descarboxilao da lisina; Prova do vermelho de metila; Desaminao da fenilalanina.

12.
13.

OBJETIVOS

Conseguir identificar bactrias atravs de provas bioqumicas conhecendo cada uma dessas provas.

MATERIAIS UTILIZADOS

Ala bacteriolgica;

Amostras de bactrias; Bico de Bunsen; Provas bioqumicas;

Tubos de ensaio.

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

Primeiro, com o auxlio da ala bacteriolgica na estufa, inoculou-se uma amostra de bactria em cada tubo de ensaio contendo um meio diferente para possvel deteco da bactria e da prova qumica que seria realizada. Aps o cultivo das bactrias, observou-se cada tubo caracterizando qual era a bactria, atravs de cada tipo de prova bioqumica.

RESULTADOS E DISCUSSO Utilizao de fontes de carbono:

Provas fermentativas (Glicose, lactose, sacarose, manose, xilose, sorbitol etc.) Um determinado carboidrato pode ser fermentado originando diferentes produtos finais, o que depende do microrganismo envolvido. Isso pode gerar gs (que pode ser detectado pela presena de bolhas no tubo de Durham) e cidos orgnicos (que pode ser detectado pela mudana de cor do indicador). Mesmo com uma reao negativa, o microrganismo pode ter utilizado outros nutrientes do meio de cultura do teste, como a peptona. As leituras devem ser feitas em no mximo 24 h, pois podem ocorrer reaes alcalinas sobre outros substratos. Utilizam-se meios bsicos (pH 7,2) e o indicador Andrade para cidos.

VM (Vermelho de Metila) Teste que avalia se as bactrias fermentam a glicose pela via cida mista, com a produo de vrios cidos (cido frmico, ltico, actico), o que prova o abaixamento do pH a menos 4,4, que o limite de viragem do indicador de pH. Embora todas as enterobactrias fermentem glicose, alguns microrganismos, durante a fase final de incubao, convertem esses cidos a produtos no cidos como o etanol e a acetona, resultando num pH mais elevado (pH 6). O indicador de pH o vermelho de metila que em pH abaixo de 4,4 vermelho e acima de 6 amarelo. Adicionar 4 gotas e rolar gentilmente entre a palma das mos.

VP (Voges Proskauer) H bactrias que utilizam a fermentao butilenogliclica. Fermentam a glicose produzindo acetil-metil-carbinol (acetona), butilenoglicol e pequenas quantidades de cidos. Quando KOH (4 gotas do Barrit II) adicionado, e na presena de O2 atmosfrico, a acetona

oxidada a diacetil. A adio de alfa-naftol (10 gotas do Barrit I) nesta reao catalisa a produo de um anel vermelho tijolo, aps 10-15 minutos. Adicionar primeiro o Barrit I, depois o Barrit II e agitar o tubo para expor ao oxignio.

Hidrlise do amido O amido um polissacardeo de elevado peso molecular. Para ser transportado para o interior da clula e ser utilizado, necessrio, primeiro, que ele seja quebrado em unidades menores. A habilidade para hidrolisar esse polmero depende da produo e secreo de vrias amilases. A quebra do amido detectada utilizando-se culturas em gar amido que so cobertas com uma soluo de iodo (3 a 4 mL por placa). O iodo reage com o amido para formar um complexo azul escuro. As colnias que podem hidrolisar o amido apresentaro uma zona clara a seu redor.

Citrato Este teste determina se a bactria capaz de utilizar o citrato de sdio como nica fonte de carbono para o metabolismo e crescimento. Deve ser utilizado o meio Citrato de Simmons, contendo citrato de sdio, fosfato de amnia e azul de bromotimol. Com a facilidade do transporte de citrato pela citrato-permease h a sua utilizao pela citrase, com produo de hidrxido de amnia que eleva o pH, fazendo com que a reao se torne azul. Nesse teste, utilizam-se tubos com meio inclinado para a cultura ter mais acesso ao

oxignio, que necessrio para utilizao do citrato. O CO2 produzido reage com o sdio do citrato formando carbonatos de reao alcalina.

Malonato (teste FM) Essa prova determina a capacidade de uma bactria de utilizar malonato como nica fonte de carbono, alcalinizando o meio. O malonato liga-se competitivamente desidrogenase succnica, impedindo sua ao cataltica sobre o cido succnico com interrupo do Ciclo de Krebs, tirando da bactria sua principal fonte de energia e impedindo a formao de outros intermedirios necessrios ao metabolismo. Incuba-se a 35-37OC durante 24-48 horas. Indicador azul de bromotimol.

(-)

(+)

Utilizao de fontes de nitrognio:

Fenilalanina - desaminao (teste FM) H bactrias que produzem enzimas que removem o grupo amina da fenilalanina presente no meio, originando o cido fenilpirvico, que reage com o cloreto frrico (10%) adicionado ao meio, formando uma cor verde. Obs: Como se utiliza o mesmo ensaio para o malonato, necessrio acidificar o meio com HCl, que passa para amarelo, antes de adicionar o cloreto frrico.

Lisina - descarboxilao Algumas bactrias possuem a lisina descarboxilase (LDC) que atua sobre a poro carboxila dos aminocidos, com formao de aminas, de reao alcalina (por ex. cadaverina), e CO2. A reao ocorre preferencialmente em condies anaerbias e ligeiramente cidas, mas inicialmente ocorre a utilizao da glicose do meio para enriquecimento da cultura e acidificao do meio. O meio contm o indicador bromocresol prpura. Nas etapas iniciais de incubao, o tubo torna-se amarelo devido fermentao da glicose. Se o aminocido descarboxilado o meio retorna cor prpura. A reao se processa em anaerobiose, podendo-se cobrir o meio com leo mineral para agilizar o processo.

Indol

O indol produzido pela ao da triptofanase sobre o triptofano existente no meio de cultura, ocorrendo, tambm, a produo de cido pirvico e amnia. O indol pode ser detectado pela formao de um anel rosa (pink) na parte superior do tubo, aps a adio de p-dimetilaminobenzaldedo (reativo de Erlich).

Produo de H2S (meio SIM) Algumas bactrias so capazes de degradar compostos contendo enxofre (como o tiossulfato de sdio e a cistena das peptonas), atravs da tiossulfato redutase, produzindo H2S que incolor. Este reage com o ferro (indicador) formando um precipitado preto (sulfeto ferroso). Para que esta reao ocorra necessrio que o meio esteja cido.

Uria H bactrias que possuem a enzima urease que garante a capacidade de degradar a uria presente no meio liberando amnia, CO2 e H2O. A amnia reage formando carbonato de amnia que alcaliniza o meio. O indicador de pH o vermelho de fenol que em meio alcalino toma a colorao magenta. Uma colorao meio rosa suficiente para considerar a reao positiva.

Reduo de Nitratos Muitas bactrias so capazes de reduzir nitratos a nitritos, ocorrendo mais rapidamente em condies anaerbias (condio em que o nitrato substitui o oxignio como aceptor final de eltrons). Adicionando-se algumas gotas dos reativos de Griess-Ilosva, o nitrito evidenciado atravs da formao de um composto avermelhado.

Motilidade A motilidade observada atravs do aspecto do meio, isso decorre pelo do fato de o meio ser semi-slido o que permite o crescimento bacteriano no interior do meio, por todo o tubo. Se a motilidade positiva o aspecto do meio ser turvo enquanto que motilidade negativa o crescimento s ser observado na zona da picada. Fica mais fcil de observar a motilidade pondo os tubos contra uma folha de papel pautado, se conseguir observar as linhas atravs do tubo motilidade negativa.

Escherichia coli

Esta bactria altamente mvel e provocar turbidez Klebsiella pneumoniae no meio.

Esta bactria no mvel e formar somente uma linha de crescimento.

Foi feita uma tabela para melhor entendimento: Testes Salm Enter Escherichi Shigell Citrobacte Klebsiell Hafni Proteu Yersini bioquimico o o a a r a a s a s. nella bacter Lactose + D + + Gs + + + + + + + (glicose) H2S + D D Urase D + D + + L-TD + Motilidade D + + + + + D Indol + D D D D Lisina + + + D + Citrato de + + + + D D simmons
Tab.01. Tipos de provas bioqumicas e suas respectivas reaes

CONCLUSO

Quando nos deparamos com um material biolgico, a fim de identificar os tipos bacterianos presentes ali, vrios mtodos de identificao, de isolamento, diferenciais e seletivos so utilizados, porm os testes bioqumicos so de fundamental importncia, uma vez que podemos identificar bactrias que possuem mecanismos de fuga do Sistema Imune com base nas enzimas que elas produzem. Alm do papel de diferenciao entre bactrias de um mesmo gnero, como os Stafilococos que so catalase positivo, mas que s o S. aureus DNAse positivo e coagulase positivo.

REFERNCIAS

TRABULSI, L. R., Alterthum, F.; Microbiologia, 5 ed., So Paulo, Editora Atheneu, 2008. MURRAY, Patrick R. , et AL.Microbiologia mdica.4ed.Rio de Janeiro:Guanabara Koogan S.A,1998.