capturo 25

Ferramentas paraAchar as Famlias

H muito tempo a qumica chamadade cincia central; ela est envolvida em todos os aspectosda vida, Muito do que aprendemos sobrequmica estrelacionado com como as coisas funcionam. Jo;; ;""* podem ser tratadasem nvel molecular, e como os materiais que precisamosno nosso dia-a-dia podem ier aperfeioados, ou novospodemsercriados. Das muitasaplicaei da qumica. porm,h uma de dimenJo importante, que certamenteno das menores,relativa aos trabalhosdJdireitos homanosglobal e de justia. Como bem sabemos,em muitas partesdo mundo existem situaesem que pessoas se sepraramde susparentesdevido aos atos cruis de gueffa ou de terorismo. Alguns cientistasestorastreandconexesae failia, deixadasaps esseseventosdolorosos,usandoferramentasmodernasde qumica. Laboratrios como os de M.-C. King (Universidade de'Washington) estotentando ajudar famflias no reconhecimento,quando s restosde parentessuspeitosso achados,e reunir pessoas em casosem que as vtimas sobreviverame elas ou seusfamiliares procurando esto por laosde parentescos. A chave paa esta arefa o DNA, a impressodigital qumica, presenteem cada tecido de cada indivduo. Embora a estruturageral do DNA seja a mesma de uma pessoapara outra lveja o grfico molecular acima), a evidncia de parentescoest presentena seqnciadetalhadado DNA de caa uria. Com o emprego de qu mica relativamentesimples, envolvendo corantesfluorescentesou istopos radioativos, enzimasde-bact;as termoficas e outras fontes, eletroforeseem gel e um processochamadde reaoem cadeia da polimerase (PC-R,sigla inglesa), que rendeu a seu inventor o Prmio Nobel de Qumica Oe Sg: (Seo25.8;, tornou-se fcil hoje sintetizar milhes de cpias a partir de uma amostrade DIIA e elaborar sua ieqncia rpida e convenientemente.A aplicaodessas ferramentaspara a comparaode amostrasde DNA e vtimaJe parentes forrece esperanade que, ao menos em poucos casos,a laiuna entre membros de famlia serfechaa.

25.I 25.2 25.3 25.4

Introduo Nucleotdeos e Nucleosdeos Sntese de Nucleosdeos e Nucleotdeos em Laboratrio O cido Desoxirribonuctico: DNA

?{ < RNA e Sntese de Protenas 25.6 Determinao da Seqncia de Bases do DNA

Jan

Sntese de Oligonucleotdeos em Laboratrio

25.8 A Reao em Cadeia pela Polimerase

cidos Nuclicos e Sntesede Protenas

439

25.I lrrRoDuo
Os cidos nuclicos, cido desoxirribonuclico(DNA, sigla em ingls) e cido ribonuclico (RNA, sigla em ingls) so,respectivamente, as molculas que preservama informao hereditriae as qge a transcreveme traduzem, de modo a permitir a sntesede todas as diversasprotenasda clula. As vezes essespolmeros biolgicos encontram-seassociadoscom protenase sob esta forma so conhecidos como nucleoprotenas. Boa pare do conhecimentoque temos sobrea preservao da informao genca,sobrea forma como para as sucessivas geraesdo organismo e sobre a sua transformaoem partesfuncionais da passada clula provm do estudodos cidosnuclicos. Por essas razes,vamos focalizar nossaatenonas estruturas e propriedadesdos cidos nuclicos e de seuscomponentes,nucleodeos e nucleosdeos.

25.2 Nucleoroeos E NucLEosDEos

A degradao brandados cidosnuclicosproduz suasunidadesmonomricas,os compostoschamados de nucleotdeos.Uma frmula geral de um nucleotdeoe a estruturaespecficade um deles, chamado de cido adenflico, so mostradasna Fig. 25.1. A hidrlise completa de um nucleotdeo fornece: 1. Uma baseheterocclica, a purina ou a pirimidina. 2. Um monossacardeo com cinco carbonos,a D-ribose ou a 2-desoxi-D-ribose. 3. Um on fosfato.
Base heterocclica

t*' -j,,

Ligao B-N-glicosdica J

o ll s'

N
8( ,.N

NH, t6
-{

ill -*?'

Nt

Um nucleotdeo la)

cido adenilico

()

Fig. 25. | (a) Estrutura geral de um nucleotdeoobtido do RNA. A baseheterocclica a purina ou a pirimidina. Em nucleotdeos do DNA, o acar a 2'-desoxirribose; isto , o grupo -OH na posio2' estrsubstitdo por -II. O grupo fosfato do nucleotdeo mostrado ligado ao C5'; ele pode tambm estar ligado ao C3'. No DNA e no RNA uma ligaofosfodister une o C5' de um nucleotdeo ao C3' do () cido outro. A baseheterocclica estrsempreligada ao Cl' por uma ligaoB-N-glicosdica. adenflico, um nucleotdeotpico. A parte central de um nucleotdeo o monossacardeo, semprepresentecomo um anel de cinco membros,isto , como um furanosdio.A baseheterocclicado nucleodeoest gadaao C 1' da unidadeda riboseou da desoxirriboseatravsde uma ligaoN-glicosdic4 que semprep. O grupo fosfato do nucleotdeo estpresentecomo fosfoster,podendoestarligado ao C5' ou ao C3' . (Nos nucleodeos os tomosde cmpor nrmeroscom linhas, isto , 1', 2' , 3' etc.) bono da poro do monossacardeo sodesignados A remoo do grupo fosfato de um nucleodeo convere-o num composto coecido como nucleosdeo (Seo22.I5A). Todos os nucleosdeosque podem ser obtidos do DNA contm a 2-desoxi-D-ribose como seucomponenteacar,e uma dasquatro basesheterocclicas,adenina,guanina,citosina ou timina: NH,

NH,

z^-^
'^*'
HH
Adenina

n I '1^NANu,
Guanina

,-Ar-t

|'
tl

Ao,

H'c"-

ilt \No
HH Citosina

r\*-"
ill \NAo

Timina Pimidinas

r(c)u(T),

440

cidos Nuclicos e Sntese de Protenas

Os nucleosdeosobtidos do RNA contm o acarD-ribose e a adenina,ou a guanina,ou a citosina. ou a uracila, como baseheterocclica.

o tl
Uracila substitui timina nos nucleosdeos ry-t especiais de RNA podemainda conter outras purinas e pirimidinas semelhantes.)

\*Ao l,:::'3;ni"Hi";,lii*
I H Uracila (uma pirimidina) As basesheterocclicas obtidasdos nucleosdeos podem existir em mais de uma forma tautomrica. As formas que mostramosso asformas predominantesque as basesassumemquandopresentes nos cidos nuclicos. Problema 25. | > Escreva as estruturasdas outras formas tautomricasda adenina,guanina, citosina, timina e uracila. Os nomes e as estruturasdos nucleosdeosencontradosno DNA estona Fig. 25.2; os encontrados no RNA estonaFig.25.3. Probf ema 25.2 > Os nucleosdeosmostradosnas Figs. 25.2 e 25.3 so estveisem base diluda. Em cido diludo. porm, eles sofrem hidrlise rpida, produzindo um acar (desoxirriboseou ribose) e uma base heterocclica.(a) Que caractersticaestrutural do nucleosdeo responsvelpor estecompoamento? (b) Proponhaum mecanismo razovelpara a hidrlise. Os nucleotdeossodenominadospor diversosmodos. Por exemplo, o cido adenflico (Fig. 25.1) chamado de cido 5'-adenlico, para designar a posio do grupo fosfato; tambm chamado de 5'-fosfato de adenosinaou simplesmentemonofosfato de adenosina(AMP, sigla em ingls). O cido

Guanina

,---

,*4ry-"
\^r-{

luoclz...o\ L/\

H /l

-N^NH,

HL/H
tl HO H

NH

2'-Desoxiguanosina Timina

t--F
Fig. 25.2 Nucleosdeos que podemser obtidosdo DNA. O DNA desoxigenado na posio2'. O RNA possui gruposhidrodla nesta posio. O RNA tem um hidrognio no lugar do grupo metila da timina, o que constitui a baseuracila (e o nucleosdeo uridina).

HoH,

HOH
2'-Desoxicitidina
2'-Desoxitimidina

cidos Nuclicos e Snresede Protenas

441

Adenina NH"

t-

( ll

zN=r;^N
N N Z

OH

OH
Adenosina Guanosina

Fig. 25.3 Nucleosdeos que podem ser obtidos do RNA. O DNA tem tomos de hidrognio no lugar dos grupos hidroxila da ribose (DNA desoxigenado na posio 2' de sua ribose).

OH OII Citidina

OH

OII

Uridina

uridflico tambmchamadocido 5'-uridlico, 5'-fosfato de uridina ou monofosfatode uridina (UMp, sigla em ingls),e assimpor diante. Nucleosdeose nucleotdeos so encontradosem outros lugares alm da estrutura do DNA e do RNA. Vimos, por exemplo, que unidades de adenosina fazemparle da estrutura de duas oenzimas importantes, NADH e coenzima A. O 5'-trifosfato de adenosina, claro, a importante fonte de energia,ATP (Seo22.18). O compostochamado cido 3' ,5'-cicloadenflico(u AMp cclico) (Fig. 25.4) um reguladorimportanteda atividadehormonal. As clulassintetizamestecomposto a partir do ATP, pela ao da enzima adenilciclase. Em laboratrio, o cido 3',5,cicloadenlico pode ser preparadopela desidratao do cido 5'-adenlico, na presenade dicicloex i lcarbodiimida.

^''-----l
Pirofosfaro

Adeniciclase

Y
ttl -

IINH,

1*-^*
|

cido 5'-adenico

bodiimida

)#*
/

Fig.25.4 cido 3',5'cicloadenlico, sua biossntese e sntese em laboratrio.

o:.
o

?.,v'$^^,'
l\
\

\- J

\ l 'o

I oH

Problema 25.3 >

Quandoo cido 3', 5'-cicloadenflico tratadocom hidrxido de sdio aquoso,o produto principal obtido o cido 3'-adenlico (fosfato de 3'-adenosina) em vez do cido 5'-adenlico. Sugira uma explicao para o curso destareao.

442

de Protenas cidos Nuclicose Sntese

DE NucLEosDEosE NucLEorDEos EM 25.3 SNTEsE LaeoRAroRto

Vrios mtodos foram desenvolvidospara a sntesede nucleosdeos.Uma tecnica empregareaes que constroemo nucleosdeoa partir de derivados da ribose e de basesheterocclicasativados e proiegidos adequadamente.Um exemplo a seguinte sntese da adenosina a partir do cloreto de ribofuranosila protegido e da cloromercuripurina.

NHCCH3
-l-\

o il
I

,f-r\*
ll

- Hecr".

\^*o

cH3ro orcH3
o o

I HgCl

NHCCH3

c\coctHTo\\A*z
()H ' o

1-t
SAdenosina

cH3co orcH3

\J tl

Outra tcnica envolve a formao da baseheterocclicanum derivado da ribosilamina protegido:

c6H5coH2 CH CH OCC^H.
I

tl

C\

tl

tl

NH

-----H

(-2 GrtoH) -

c:o

il" " o

OC zlrs oc2Hs B-Etoxi'N' etoxicarbonilacrilamida

23,5-Thi-O-benzoil B-D-ribofuranosilamina

c6Hsco CH2

o tl

Ary-"
\-_-,\^ --o

N-

ot
HrO

> u.idinu

cidos Nuclicos e Sntesede hotenas

M3

Probfema 25.4 >

Baseandosua respostasobre reaesque j foram vistas, proponha um mecanismoprovvel para a na primeira etapa da snteseda uridina que acabmosde mostrar. reaode condensao Uma terceira tcnica envolve a sntesede um nucleosdeocom um substifuinte no anel heterocclico que pode ser substitudopor outros grupos.Estemtodotem sido muito usadopara sintetizarnucleosnanatureza.O exemplo a seguirutizaum derivado deosincomunsque no ocorrem,necessariamente, da 6-cloropurina, obtido a partir do cloreto de ribofuranosila apropriado e da cloromercuripurina. NH"

)--'^N

^*" R
CI

Adenosina S

'"'2"{A'..',
\/ "{
HO

1o'u

)='rA*-"
\^*z
R

OH

)-rl\N ^"" R
em nucleotdeos.Um Vrios agentesde fosforilao tm sido usadospara converter nucleosdeos dos mais empregados o fosfocloridrato de dibenzila. c6H5cHro\ /o

cl c6HscH2o Fosfocloridrato de dibenzila Pode-seconseguir a fosforilao especficado grupo -OH em 5' se os grupos -OH em 2' e3' do nucleosdeoestiverem protegidos por um grupo isopropilideno (veja a figura a seguir).

,zPr.

(c6HscH2o)2P-cl +

o tl

HOH2
Diridina

H3C

><o

CH.'

Grupopotetor isopropilideno

(c6HscH2o)2PocH
( I ) HrO+, H,O (2) H,, Pd

tl

HO- POCH OH \

tl

IL

oxo
H,c
CH,

-/

444

cidos Nuclicos e Snresede Protenas

A hidrlise cida moderadaremove o grupo isopropilideno e a hidrogenlise cliva as ligaes fosfato de benzila.

Problema 25.5 > Problema 25. >

(a) Que tipo de ligao estenvolvida no nucleosdeoprotegido por isopropilideno e por que ela sensvel hidrlise cida moderada?(b) Como se pode instalar estegrupo protetor? O esquemareacional a seguir mostra a snteseda cordicepina (um nucleosdeoantibitico) e a primeira snteseda 2'-desoxiadenosina(relatadaem 1958 por C. D. Anderson, L. Goodman e B. R. Baker, do Instituto de Pesquisade Stanford).

Nquel deRaney , cordicepina (r)

I socl, \no
\ Nquel Ranev de , 2,-Desoxiadenosina (II)

(a) Qual a estruturada cordicepina? (I e II so ismeros.) (b) Proponhaum mecanismo que explique a formao de II.

25.3A AplicaesMedicinais
Elion e Hitchings comprtilharam o Prmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de 1988pelo desenvolmento de agentesqmioteraputicosderivadosda purina. No incio da dcadade 50, Gertrude Elion e George Hitchings (dos Laboratrios de Pesquisa \/ellcome) descobriram que a 6-mercaptopurinatinha propriedadesantitumorais e antileucmicas. Esta descoberta levou ao desenvolvimentode outros derivadospurnicos e de compostosrelacionados,incluindo os nucleosdeosde importncia medicinal considervel.A seguir tm-se trs exemplos: SH

o
"\N\--\

II

Nz\'N.'.

tlt =n'^

)
H,N

t ll
-l
N^{' Alopurinol

)
\or-.,.--Ort
Aciclovir

H 6-Mercaptopurina

A 6-mercaptopurina usada,em combinao com outros agentesquimioteraputicos,no tratamento da leucemia agudaem crianas,pelo qual, quase807odas crianastratadasso curadashoje. O alopurinol, outro derivado da purina, a droga padro para o tratamentoda gota. O aciclovir, nucleosdeoque no possui dois tomos de carbono no seu anel da ribose, altamenteeficiente no tratamento de doenascausadas por certos vrus da herpes,dentre os quais o herpes simplex do tipo 1 (pnfigo agudo), do tipo 2 (herpesgenital) e do herpes zoster (cobreiro).

25.4O ctoo DesoxrnRtBoNucltco: DNA

25.4A Estrutura Primria
Os nucleotdeosdetm a mesmarelaocom os cidos nuclicos que os aminocidosdetm com as protenas;eles so suasunidadesmonomricas.As ligaes de conexo nas protenasso grupos amida; nos cidos nuclicos so as ligaes de fosfosteres.Os fosfosteresligam o grupo 3'-OH de uma ribose (ou desoxirribose)ao grupo 5'-OH de outro. Isto faz com que o cido nuclico tenha uma cadeia longa no-ramificada como uma "espinha dorsal" de unidades de acar e de fosfato,

Acidos Nuclicos e Sntesede

",

1*f t*A*y'
Adenina

o
urC-.',,A*.-H lr ^i

pentose-base

o:B-o-H,

l5'

^ o-

\--.\^ -N' -O
Timina

-o
|J q lt
o:P-o-cHz ll/ -O K
|

o
,N-.'Ar.r-"
5-:-\*-\-.^-.-

pentose-base

-NH, :.,*i: \c,,",.i''" 7 ---'-''.

rrr

fosfatol bsfat
Pentoie-rase

Fig. 25.5 Segmento hipottico de uma nica cadeia de DNA mostrando como os grupos ster de fosfato ligam os grupos -OH das posies 3' e 5' das unidades da desoxirribose. O RNA tem estrutura semelhante, com duas excees:em cada unidade da ribose um grupo hidroxila substitui um tomo de hidrognio na posio2'eauracila substitui a timina.

-O

Pentose-base

o:P-o-o
com as basesheterocclicassaindo da cadeia,em intervalos regulares(Fig. 25.5). Indicaremos a modo: na Fig.25.5, do seguinte reodasbases, 5, <_ di-

----> 3, A-T-G-C aseqnciadebasesao longo dacadeiadeDNA quecontmainformaogentica Como veremos, em hidrlises enzicodificada. A seqnciade basespode ser determinadaatravsde tcnicasbaseadas (Seo jfoi 25.6). determinada bases das a seqnciareal nuclicos cs Paramuitos mticasseletivas.

I I

25.48 Estrutura Secundria

t'No me surpreenderei se um dia um cientista entusiasmado batizar seus gmeos recm-nascidos como Adenina e Timina." F. H. C. Crick.*

de Watson e Crik (feita em 1953e verificadalogo depoisporWilkins, Foi a proposta,hoje clssica, um modelo para a estrutura secundriado DNA' A atravsde anlise de raios X) que estabeleceu porque nos permite entendercomo a inimportante, especialmente DNA do estrutura secundria formao gentica preservada,cmo ela pode ser continuadaduranteo processode diviso celular poe t". transcrita para fornecer um gabarito para a sntesede protenas. " "orn Da maior importncia para a propostade Watson e Crick foi uma observaoantiga,por E' Charnas percentagens gaff (no final d dcadad 40), de que certasregularidadespodem ser observadas 25.1 fornece os A Tabela de espcies. variedade de uma DNA do obtidas heterocclicas bases as resultadostpicos que se obtm. Chargaffndicou que, para todas as espciesexaminadas: igual das pirimidinas, isto , (7oG * 1. A percentagemmolar total das purinas aproximadmente V o A)l (% o C * V o T)= t. :- I), e a percentagem 2. A percentagemmolar da adenina quaseigual da timina (isto , VoN%T = I)' (isto ' VoGlVoC ml* du ganina quaseigual da citosina
(e *Crick, jmtamente com J. D. Watson e Mauice wilkins, mmpartilhmm o Prmio Nobel de Fisiologia ou Medicina, em 1962, pela proposta pela Material;' Sci.Am,1954, 191 (10)' 20' 54-61 ) ev-ldrciaj esnutum de duplahlicedo DNA. (De Crick, F. H. C. '"The Stuctue of the Hereditay

446

cidos Nuclicos e Sntese de Potenas

do DNA de Vrias Espcies Tabela 25. I Composio

dasBases(7o molar) Propores

Espcie
Sarcina lutea EschertchiacoliKl2 Germe de trigo Timo bovino Staphylococcusaureus Timo humano Fgado humano

c
13,4 26,0 28,2 30,8 30,9 30,3

T
12,4 23,9 27,r 27,8 29,2 29,4 ?o?

G+A C+T
t,02 1,08 1,00 0,96 1,1 1 1,01 0,98

A+T G+C
o?5 1,00 1,19 1,27 1,50
1<t 1 <^

G 1,00 0,99 1,00 0,96 1, 1 1 1, 01 0,98

T
1,08 1,09 1,01 1,01 1,05

37,r 24,9
))'7

37,r
)\J )) )t Ra \a

21,5 2t,0 t9,9 19,5

19,0 19,8 19,9

1,0s
1,00

'Citosina + melcitosina. of Biochemistry: Fonte: Smith, E. L.; Hill, R. L.; khman, I. R.; Lefkowitz, R. J.; Handler, P. e White, A. Princples General Aspects, 7." ed.; McGraw-Hill: Nova York ' 1983; p' 132'

* Chargaff tambm notou que arazo que vaia de espciepara espcie (VoA + VoT)l(VoG VoC). qu9 mesmo o tazo caactestica do DNA de uma dada espcie, Alnidisso, observou qo "tta apreciavelmente varia no que DNA este e DNA obtido de diferntes tecidos do mesmo animal, com a idade ou com as condiesde crescimentode organismosindividuais de uma mesmaespcie'Watsone Crick tambm possuamdados de raios X que lhes forneceram os comprimentos e os ngulos das ligaes dos anis purnicos e pirimidnicos de compostos modelados.Alm disso, tiam os dadosde Wilkins, qo" indi.uuu-ummdulo derepetiomuito longo(344) no DNA natural. para Raciocinandosobreestei dados,Watson e Crick propuserImuma dupla hlice como modelo so mannuclico cido de cadeias duas modelo, este com acordo De DNA. do a estmtura secundria tidasjuntas por ligaes hidrognio entre pares de basesde fitas opostas.Esta cadeiadupla enroscadaob a frmae nelice, colmambas aJcadeiasdividindo o mesmo eixo. Os pares de baseficam passoda na parte interna da hlice e o esqueletoacar-fosfatofica na parte extema (Fig.25.6)' O

y'sco
Sulco

secundrio

w
H

principal.

@ o
Sulco secundrio

y'"ur"o

ster C n a cadeia do osfato-

@
,ru
P

.-

-r"
I
Fig. 25. Modelo molecular de uma poroda duPla hlicedo DNA. (AdaPtado deNeal,A.L.Chemistry A anil Biochemistry: Comprehensive Introduction : McGraw'Ilill: Nova York, 1971.Usado com autorizao dc McGraw-Hill Book Company,Nova York.)
3, 4 A

CeNnasbases

@
W

F-ro

cidos Nuclicos e Sntesede protenas

U7

hlice (menor distncia em que a hlice se repete) tal que l0 pares sucessivosde nucleotdeosdo uma volta completa em 34 A (o mdulo de repetio).O dimetro externo da espiral cerca de 20 e a distnciainterna entre as posies 1' das unidadesde ribose das cadeiasopoitas cercade I I . Usando modelos molecularesem escala,Watson e Crick observaramqu a distncia interna da dupla hlice s permitia ligaes hidrognio, entre os paresde bases,do tipo purina-pirimidina. No ocorriam, entre os pares de basespurina-purina, por seremmuito grandespara se encaiiarem na hlice,

Adenina

cl'da desoxirribose
no DNA

cl ' da desoxiribose no DNA

(a)

Citosina

Guanina

l,eo
Fig. 25.7 Emparelhamento dasbases(a) adeninacom timina e (b) citosina com guanina.As dimenses dos pares ligados por ligao hidrognio,timina-adenina e citosina-guanina,sotais que permitem a formao de ligaeshidrognio fortes e tambm possibilitam que os pares de bases seencaixemno interior das duas cadeiasde fosfato-ribose da dupla hlice. [Adaptado de Pauling,L.; Corey,R. B. Arch. Biochem. Btophy s. 1956,65,164.181.1 Os mapasde potencial eletrostrtico calculados para as bases indiduais mostrarn a distribuio complementar de cargas que leva formao de ligao hidrognio.

cl ' da desoxirribose no DNA

C1' d a - j desoxirribose no DNA

(b)

448

de Protenas cidos Nuclicose Sntese

nem entre os paes pirimidina-pirimidina, porque estariam muito afastadospara formar ligaes hiognio efetivas. Watson e Crick deram ainda um passoposterior fundamentalem suaproposta.Assumindo que as basesheterocclicasoxigenadasexistiam nas formas cetnicas,argumentramque o emparelhamento de basesatravsde ligaes hidrognio s podia ocoffer por uma maneira especfica:adenina(A) com timina (T), e citosina (C) com guanina(G). A Fig. 25.7 mostraasdimensesdos parese os mapas de potencial eletrostticopara as basesindividuais.
Emparelhamento de adenina e timina e Emparelhamento de guanina e citosina

H N_H.....,rr

\
Timina Adenina

( )''""''-(X*. 'r1,....."-JH Citosina Guanina

l- 1

,>-(t

,N\

de Chargaff de que VoN%T de bases consistentecom a descoberta Este tipo de emparelhamento = Ie T o Gl Vo C = 1 . O emparelhamentoespecfico dasbasessignifica ainda que as duas cadeiasde DNA so complementares.Sempre que a adeninaapaeceem uma cadeia, a timina deve aparecerem outra oposta e sempreque h citosina numa cadeia,a guanina deve aparecerna outra (Fig' 25.8).

*y'
Sulco secundrio

Base

-?
Fig. 25.8 Diagramada dupla hlicedo DNA mostrandoo emparelhamento complementar das bases.As setasindicam a direo 3' -+ 5'.

Pirimidina

cidos Nuclicos e Sntesede c,t:o

+19

observe que, enquantoaspinha dorsal acar-fosfatodo DNA completamente resuxa"a seqnciade paresde basesheterocclicasao longo destaestruturapode assumir taes diferentes.Isto importante, pois a seqnciaexatados pares de bases -i,"i-p"" qr;;-2i,;gu, informao gentica. observe tambm que uma cadeia da fita aupta e o complemento da orirra. Se a seqnciadas basesao longo de uma cadeia for conhecida, possvel o!r"r"u".qtieocia ao longo da outra p-orqueA sempre se emparelha com T, e G sempre se emparelha com C. Esta complementaridade.das duas fitas explica como a molcula ae ONe ," ,"pli"u au.uot. u diviso celular, transmitindo, assim, a infrmao gentica para cada uma das duas clulas filhas.

25.4C Replicao do DNA

Pouco antesda diviso celular, a dupla hlice deDNA comeaa sedesenrolar.Fitas complementares se formam ao longo de cada cadeia (Fig.25.9). Na realidade, cada cadeia atua como om gauto para a formao do seu complemento. Quando o desenrolamentoe a duplicao terminamlformaram-seduasmolculasde DNA idnticas,onde apenas uma existia.Estasduasmolculaspodem ento passarpara as clulas descendentes, uma para cada clula.

Fig. 25.9 Replicao do DNA. A cadeia dupla se desenrola numa extremidade. formando cadeias complementares emparelhadas ao longo de cada cadeia desenrolada.

450

e Sntese de Protenas cidosNuclicos

Probfema 25.7 >

(a) Existem aproximadamente6 bilhes de pares de basesno DNA de uma nica clula humana. Admitindo que esteDNA exista como dupla hlice, calcule o comprimento de todo o DNA contido numa clula humana. (b) O peso do DNA de uma clula humana 6 X 10-12g. Admitindo podemos concluir que toda a que a populaoda Terra seja cerca de 3,5 bilhes de pessoas, informao genticaque deu origem a todos os sereshumanosvivos nos dias de hoje estava fertilizados. Qual o peso total desteDNA? (O contida no DNA dos vulos correspondentes volume que esteDNA ocuparia aproximadamenteo de uma gota de chuva. Porm, se as molculas individuais fossem enfileiradas,cabeacom p, elas cobririam o comprimento correspondente a quaseoito vezesa distncia de ida e volta Lua') (a) A forma tautomrica mais estvel da guanina a forma lactmica. Esta normalmente a forma presenteno DNA e, conforme j vimos, emparelha-seespecificamentecom a citosina. Se a guanina se tautomerizana forma anormal lactmica, emparelha-secom a timina. Escrevafrmulas estruturaismostrando as ligaes hidrognio destepar de basesanormal.

Problema 25.8 >

ooH

)-4"-t
HH

)--.-I*t
)4*4"",
Forma lactmica da guanina

)4rA^",
Forma lactimica da guanina

que ocoem durante o (b) O emparelhamentoimprprio de basesprovocado por tautomerizaes, Vimos na parte processode replicao do DNA, sugerido como fonte de mutaesespontneas. (a) que, se a tautomerizaoda guanina ocorrer no momento apropriado,poder levar introduo da timina (emvez da citosina) na cadeia complementardo DNA. Que erro estanova cadeia de DNA introduziia em sua frta complementar,na prxima replicao, mesmo sem ocorrer nenhuma outra tatomenzao? Problema 25.9 > As mutaestambm podem ser provocadasquimicamente, sendoo cido nitroso um dos agentes mutagnicos mais potentes.Uma explicao sugeridapara o efeito mutagnico deste cido que ele causareaesde desaminaoem purinas e pirimidinas contendo grupos amino. Quando, por exemplo, um nucleotdeocontendo adenina tratado com cido nitroso, converte-seem um derivado de hipoxantina.

o
N N R
Nucleotdeo adenina

rrNo, ----r ()--''4|0-" ll I

R

l^*"

Nucleotdeo hipoxantina

(a) Baseandosua respostaem reaesquej foram vistas, quais so os intermedirios provveis na interconversoadenina?hipoxantina? (b) Normalmente a adeninase emparelhacom a timina no DNA, mas a hipoxantina se emparelhacom a citosina. Mostre as ligaes hidrognio do par de basehipoxantina + citosina. (c) Mostre quais erros a interconversoadenina-+ hipoxantina poderia gerar no DNA aps duas replicaes.

25.5 RNA e SnresEDEPRorENAs

Logo depois da publicao da hiptese de Watson-Crick, os cientistascomearma estend-la, formulando o que Crick chamou de "o dogma central da genticamolecular". Este dogma esteleceu que a informao gentica flui da seguinte maneira: DNA --+ RNA ----) protena A sntesede protena , obviamente,muito importante para a funo da clula, pois as protenas (as enzimas) catalisam suasreaes.Mesmo clulas muito primitivas, de certasbactrias,requerem

cidos Nuclicos e Sntesede protenas

451

Existemrus, chamados retrorus, em que as informaes fluem do RNA p a raoDNA . O v r us causadorda AIDS um retrorus.

pelo menos 3.000 enzimasdiferentes.Isto significa que as molculas do DNA dessas clulas devem conter um nmero correspondente de genespara direcionar a sntesedessas protenas.Gene o segmento da molcula de DNA que contm a informao necessria para direionar a sntesede uma protena (ou de um polipeptdio). O DNA encontrado,primordialmente, no ncleo das clulas eucariticas.A sntesedas protenas ocone principalmente na parte da clula chamadacitoplasma. A sntesedas protenas."qu"r u realizaode dois processosprincipais; o primeiro ocorre no ncleo da clula e segundono citoplasma. O primeiro a transcrio, processono qual a mensagem geniica transrita pra uma forma do RNA, chamadaRNA mensageiro(mRNA). O segundoproessoenvolve duas outras formas de RNA, o RNA ribossmico (rRNA) e o RNA rraasportador(tRNA).

25.5A Sntese do RNA Mensageiro.Transcrio

A sntese dasprotenascomeano ncleo dasclulas,com a sntese do mRNA. Parteda dupla hlice do DNA se desenrola o suficientepra expor. numa nica c adeia,apartecorrespondente a peio menos um gene.Os ribonucleotdeos, presentes no ncleo da clula, agrupam-se ao longo da cadeade DNA exposta,emparelhando-se com as basesdo DNA. Os padresde emparelhamento so os mesmosdo DNA, exceto que no RNA a uracila substitui a timina. As unidadesde ribonucleotdeos do mRNA esto unidas numa cadeiapor uma enzima chamada RNApolimerase. Este processoest ilustrado na Fig.

25.t0.

Problema25.10>

Escrevafrmulas estruturaismostrando como a forma cetnica da uracila (Seo 25.2),no mRNA, pode emparelhar-secom a adeninado DNA atravsda formao de ligao hidrognio. Depois de o mRNA ter sido sintetizado no ncleo da clula, ele migra para o citoplasma onde, como veremos, age como um gabarito para a sntesedas protenas.

25.58 Ribossomas - rRNA

Espalhadosno citoplasma da maioria das clulas esto pequenoscorpos chamadosde ribossomas. Os ribossomasdaEscherichia coli (8. coli),por exemplo, tm um dimetro por volta de 180 e so compostos de aproximad amente6OVo de RNA (RNA riboss mico) e 4OVo de protena. Apaentemente eles existem como duas subunidades associadas, chamadassubunidades 50S e 30S Gig. 2S.1t;; iuntos formam o ribossoma 70S.x Apesar de os ribossomasestaremno stio da sntesed proteins, o

et.

j.

*t.

etc.
t3

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I P

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PP

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| ,rc:-W "Y * r-" -'T

I
*'-. I
Cadeiade DNA do gene

I " r::::;:cJ &

PP ;l Cadeia do DNA

W e:i:iiic+

-I
I

G{ I P

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I

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I I

G+
I I
P

e.
t-('' )

p
I

ffi-*;:::;;c{
Cadeia complementar do RNA U = Uracila

ffic 1

c{

Ribonucleotdeos

I Cadeia do mRNA

Fi g .25. l0 Transcriodo cdigogentico do DNAparaonRNA.

P = Ligao de ster de fosfato K = Desoxirribose

A = Adenina C = Citosina G = Guanina

= nioo."

+S o smbolo da unidade suedberg, usada pma descrgver o compoamento das protenm em uma ultracentrfuga

452

de Protenas cidos Nuclicose Sntese

Ribossoma 50S

*,O".r"t"r'r{
Ribossoma 30S

Fig. 25.1| O ribossoma70S mostrando susduas subunidades.

prprio rRNA no direciona a sntesede protenas.Em vez disso, vrios ribossomasse ligam caei ae mRNA formando o que se chama de polissoma. ao longo do polissoma - com o mRNA atuando como gabarito - que ocorre a sntesedas protenas.Uma das funes do rRNA ligar o ribossoma cadeia do mRNA.

25.5C RNA Transpoador

O RNAtransportadortempesomolecularmuitobaixo, quandocomparadoao do mRNA e dorRNA. Conseqentemente,o RNA transportador muito mais solvel do que o mRNA ou o rRNA sendo, s vezes,denominadoRNA solvel. A funo do tRNA transpoar aminocidospara reasespecficasdo mRNA do polissoma.Existem, assim,muitas formas de tRNA; mais de uma para cadaum dos 20 aminocidosque estoincorporadosnas protenas,incluindo as redundnciasno cdigo gentico (ver Tabela25.2).

Tabefa 25.20 CdigoGenticodo RNA Mensageiro

Seqncia de Bases 5'-+3' Seqncia de Bases 5'- +3 '

Aminocido

Aminocido

GCA GCC GCG GCU AGA AGG CGA CGC CGG CGU AAC AAU Asp
Cis

AGC AGU UCA UCG UCC UCU ACA ACC ACG ACU UGG UGG UAC UAU

GAC GAU UGC UGU CAA CAG GAA GAG GGA GGC GGG GGU

UUU UUC CCA

Gln

GUA GUG GUC GUU

Iniciao da cadeia fMet (N-formilmetionina) Trmino da cadeia

ccc

Glu

CCG CCU

rEmbora as protenas sejam constitdas por 22 minocidos diferentes, a sntese de prctenas requer apenas 20 deles. A prolina convertida em hidroxiprolina e a cistena convertida em cistina depois de terminada a sntese da cadeia polipeptdica.

Acidos Nuclicos e Sntesere h-:r,::no

453

A estruturada maioria dos IRNA j foi determinada.So compostospor um nmero relauv.''nte pequenode unidadesnucleotdicas (70-90 unidades),enrohds tiu, .tplt* ou o*- p.l-. emparelhamentodas basesao longo da cadeia (Fig..25.12). Um brao "- sempretrmina na citosina-citosina-adenina. E a estebrao que um aminocido especfico se ga, aftavs a, "eqlrilm ur-i*o-

OH A

I
I

3' do cido adenlico

A I ::::::
tl

y
ou "i" /c-A-u-c= F' c..-..-=p..-..-' G ,

tl iiii!!c rl 9::::::c tl

::::: : tt GU

"\D-c'----c------D-r c-c-H-a,
G\

:!::i::i:ii:

J
G

c-4-.;..- 9-gl \ !: ::: i:! !!: ::! b * / --c-'-'-: -'F-F.-.' U

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\A

U::::::A

i!ii!ic tl

?::::::
:::::: *\ ,/c

lr

Y u...
I-G-C IEF-J
\a)

'U
.rMr

Anticdon

Fig. 25. | 2 (a) Estrutura do tRNA isoladoda levedurae que possuia funo especicade transportar resduosda alanina. Os nNs transportadores contm, freqentemente,nucleosdeos incomuns. PSU = pseudouridina, RT = ribotimidina, MI = l-metilinosina. I = inosina,DMG = M-metilguanosina,DHU = 4,5-diidrouriaina. iMG = l-metilguanosina. (b) A estrutura de cristal de raios X do tNA da fenilalaninada levedura(Hingerty, B. 8.1 Brown, R. S.; Jack, A..L Mol. Biol.1978, 124,523,nomedo arquivo do Bancode Dadosde Protena:4TNA.pdb).

454

cidos Nuclicos e Sntesede Protenas

terminal.Estareaode conexo catsada por uma enzima o ster,ao grupo 3'---OH da adenosina em questo.Esta especificidadepode ultrapassaa hapara aminocido para e o o tRNA especfica de basesao longo de outros braos do tRNA. bilidade da enzimaem reconhecerseqncias Na espiral de outro brao h uma seqnciaespecfica de basesdenominadaanticdon. O anticdon muito importante pois permite que o tRNA se ligue a um stio especfico- chamadocdon - do mRNA. A ordem em que os aminocidossolevadospor suasunidadesde tRNA para o filamento de mRNA determinada pela seqnciade cdons. Esta seqncia,ento, constitui uma mensagem gentica.As unidadesindividuais destamensagem(aspalavrasindividuais, cadaqual correspondendo a um aminocido) so trincas de nucleotdeos.

25.5DO Cdigo Gentico

Qual trinca do mRNA conespondea qual aminocido o que se chama de cdigo gentico (veja a Tabela 25.2). O cdigo deve ser na forma de trs bases,no de uma ou de duas, pois existem 20 quatrobasesdiferentesno mRNA. dasprotenas,mas apenas aminocidosdiferentesusadosna sntese possveis, um nmeromuito 42ou 16 combinaes duasbaseshaveriaapenas apenas Se fossemusadas pequenopara acomodartodos os possveisaminocidos.Porm, com um cdigo de trs bases,43ou diferentes so possveis.Isto muito mais do que o necessrioe permite especificar 64 seqncias de pontuaoda snteum aminocido em maneirasmltiplas. Tambm abreespaopara seqncias que, por exemplo, determinem, "comece aqui" ou "termine aqui". se de protenas,seqncias A metionina (Met) e a N-formilmetionina (fMet) possuemo mesmo cdigo mRNA (AUG); porm, a N-formilmetionina transpoada por um tRNA diferente do que transportaa metionina. A Nformilmetionina pareceser o primeiro aminocido incorporado na cadeiade protenasnas bactrias: e o tRNA que transportaa fMet pareceser a marca de pontuaoque determina "comece aqui". Antes da sntesede polipeptdio terminar, a N-formilmetionina removida da cadeia de protena por uma hidrlise enzimtica. cH3scH2cH2cHCo2H
I

NH

c:o
lr-rormitmltlionina Podemosver agoracomo deveria ocoffer a sntesede um polipeptdio hipottico. Este processo chamadotraduo. Imagine que uma longa fita de mRNA estejano citoplasma de uma clula e em 20 aminocidosdiferentes,cadaum contato com ribossomas.No citoplasmatambm estopresentes acilado em seu prprio tRNA. Como mostra aFig. 25.13, o tRNA que crega a fMet empregaseu anticdon para se associarao cdon apropriado (AUG), na parte do mRNA que est em contato com um ribossoma. A prxima trinca de basesnesta adeiaparticular de mRNA AAA; este o cdon especfico da lisina. Um lisil-tRNA, com o anticdon conveniente,UUU, se liga a estestio. Os dois aminocidos,fMet e Lis, encontram-seagoraem posio apropriadapaa uma enzima uni-los numa ligao peptdica.Depois que isto aconteceo o ribossoma se desloana cadeia para entrar em contato com o prximo cdon. Este cdon, GUA, especficoda valina. O tRNA que canega avalina (com o anticdon apropriado) liga a valina cadeiapolipeptdica. Ento, todo o processe liga nestestio. Outra reao enzimttica O ribossoma se move ao longo da cadeia do mRNA, outros tRNAs se so se repete sucessivamente. deslocam com seusrespectivos aminocidos,novas ligaes peptdicas se formam e a cadeia poliremove a fMet do incio da capeptdica vai aumentando.Em algum ponto uma reao errzimttica deia. Por fim, quandoa cadeiaestno comprimento apropriado,o ribossomaalcanaa marca de pontambm da cadeiado mRNA e separa-se tuao,UAA, dizendo "pare aqui". O ribossoma separa-se a protena formada. Mesmo antes de a cadeiapolipeptdica estar completamentecrescida,ela comea a formar suas prprias estruturassecundriae terciria (Fig. 25.14).Isto ocorre porque a suaestmturaprimiria est coneta - seusaminoidosestoordenadosna maneiracorreta.Formam-seento ligaeshidrognio, dando segmentosespecficosde a-hlice, de lminas pregueadase de espiras ou novelos. Em seguida,toda a cadeia se dobra e encurva; as enzimas instalam as ligaes dissulfeto, de modo que, quando a cadeia se completa, a protena tem exatamenteo formato que necessitapara realizar sua da protena a partir da seqnciade funo. (Entretanto,prever as estruturassecundria eerci$7a aminocidos ainda um problema ctico na bioqumica estrutural.) Se a protena for a lisozima, por exemplo, h uma fenda ou boca profunda onde um polissacardeo especfico pode se encaixar. Se for a lisozima, e acontecerque uma bactria passepor perto, a boca comea a agir; atacae quebra o seu primeiro polissacardeopela metade.

cidos Nuclicos e Sntesede Protena:

455

(?Hr, ? HCNH-CH-C
o
fMet

cH3?

NHz

A cadeia se inicia

o,->.b
\

.%-

t-

Anticdon: Cdon: mRNA

Fig. 25. l3 Crescimento, passo a passo, de uma cadeia polipeptdica, com o RNA mensageiro agindo como gabarito. Os RNAs transportadores carregm os resduos de aminocidos para o stio do mRNA que est em contato com um ribossoma. Ocorre ento o emparelhamento cdonanticdon entre o mRNA e o RNA, na superfcie do ribossoma. Uma reao enzimtica liga os resduos de aminocidos atravs de uma ligao amdica. Depois que a primeira ligao amdica se forma, o ribossoma se move para o prximo cdon do mRNA. Um novo tRNA se aproxima, emparelha-se e transporta seu resduo de aminocido para a cadeia peptdica em crescimento, e assim sucessivamente.

UUGGAAGA

TRNALIS

Adio de valina

UGGAAA

Enquanto isto, outros ribossomas,mais prximos do incio da cadeia do mRNA, j se aprontam, cadaqual sintetizandooutra molcula de polipeptdio. O tempo necess ro para sintetizaruma protena depende, claro, do nmero de resduosde aminocidosque ela contm; de maneira geral, cada ribossoma pode provocar a formao de 150 ligaes peptdicaspor minuto. Assim, uma protena, tal como a lisozima, com I29 resduosde aminocidos,requer menos de um minuto paa ser sintetizada. Entretanto, se quatro ribossomas estiverem operando sobre uma nica cadeia de mRNA, o polissoma pode produzir uma molcula de lisozima a cada 13 segundos. Pode-seperguntar por que necessriaa sntesede protenas- especialmentenum organismo totalmente desenvolvido? A resposta que as protenasno so permanentes;no so sintetizadas uma vez e depois deixadasintactasna clula pela vida toda do organismo.As protenasso sintetizaDepois so desmembradas, das quando e onde so necessrias. voltando aos aminocidos;so enzi-

456

cidos Nuclicos e Sntese de Protenas

Fig. 25. l4 O enovelamento da molculade protena durante sua sntese. [Adaptado com a permisso de Phillips, D. C. "The Three-Dimensional Structure of an Enzyme Molecule." Em Bin-organic Chemistry;Calvin, M., M. J., Eds.; Jorgenson, Freemanand Co.: San Francisco,1968;p.62. Direito autoral @1966da Scientic American, Inc. Todos os direitos reservados. @Irving Geis.l

Cadeia polipeptdica

emcrescimento

RNA mensageiro

Ribossoma

Nmerodo cdon

mas que desmembramas enzimas. Alguns aminocidos so metabolizadospaa gerar energia; outros - novos - provm do alimento que o organismo ingere, e todo o processose repetemais uma vez.

Problema 25. | | >

Um segmentode DNA tem a seguinte seqnciade bases: ...A C C C C C A A A A TG TC G...

(a) Que seqnciade basesapaeceriano mRNA transcrito por este segmento? (b) Assuma que a primeira baseneste mRNA seja o incio de um cdon. Qual a ordem de aminocidosque seria traduzidano polipeptdio sintetizado ao longo deste segmento? (c) Fornea anticdons para cadaIRNA associado traduo do item (b).

cidos Nuclicos e Sntesede Protenas

457

Problema 25.12>

(a) Usando o primeiro cdon de cada aminocido da Tabela 25.2, escrevaa seqnciade bases do mRNA que traduziria a sntesedo seguintepentapeptdio: Arg'Ile'Cis'Tir'Val (b) Que seqnciade bases,no DNA, transcreveriaa sntesedo mRNA? (c) Que anticdons apareceriamnos tRNAs envolvidos na sntesedo pentapeptdio?

Problema 25. | 3 >

Explique como um erro de uma nica base em cada fita de DNA poderia provoca um eo no resduo de aminocido causandoa anemia falciforme (Seo24.6C).

DASEeNcra DEBAsEs Do DNA 25.6 DerenurNAo

A estratgiabsica usadapara seqenciaro DNA assemelha-se aos mtodos de seqenciamento iniialmendasprotenas(Seo24.5). Como as molculas de DNA somuito grandes,necessita-se, te, quebr-lasem fragmentosmenores,mais ffatveis.Tais fragmentosso seqenciados individualmente, e ento, identificando os pontos de sobreposio,so todos ordenadosde modo a revelar a seqnciade nucleotdeosdo cido nuclico original. A primeira parte do processo realizadamediante enzimasdenominadasendonucleasesde restrio. Estasenzimas clivam a fita dupla do DNA em seqncias de basesespecficas.Hoje so conhecidascentenasde endonucleases de restrio.Uma delas,por exemplo, chamadaAlul, provoca a clivagem da seqnciaAGCT entre G e C. Uma outra, a EcoRl, rompe a seqnciaGAATTC entre G e A. A maioria dos stios reconhecidospelas enzimas de restrio possui seqnciade pares de basescom a mesmaordem, em ambasas fitas, quandolidas a partir de 5' na direo de 3'. Por exemplo: C-T-T-A-A-G Essas seqnciasso conhecidascomo palndromos. (Palndromos so palavras ou frases que se lem da mesmaforma num sentido ou no sentido inverso. Por exemplo, osso,radar, orava o avaro, Roma me tem amor.) O seqenciamento dos fragmentos (chamadosfragmentos de restrio) pode ser feito quimicamente (mtodo descrito a seguir) ou com o auxflio de enzimas.O primeiro mtodo qumico foi introduzido em 1977 por Allan M. Maxam e Walter Gilbert, da Universidade de Harvard; o primeiro mno mesmo ano, por Frederick Sanger. todo enzimtico foi apresentado, 5' <-3' <G*A-A-T-T-C ----> 3', ----' 5'

Gilbert e Sangercompartilharam o Prmio Nobel de Qumicade 1980com Paul Berg, pelo trabalho com cidosnuclicos. Sanger (Seo 24.5),pioneiro no seqenciamento de protenas,j havia recebidoo Prmio Nobel de 1958pela determinao da estrutura da insulina.

25.A Seqenciamento Qumico

O fragmento de restrioda fita dupla a ser seqenciado inicialmente marcadoenzimaticamente na extremidade5' por um grupo fosfato contendofsforo radioativo. Depois disso, as fitas so separadas e isoladas.Em seguida os fragmentos de fita simples, marcados,so tratados com reagentes que atacambasesespecficas,modificando-as de modo a permitir a clivagem da cadeiaprximo quelas para a direita), bases.Por exemplo, numa cadeiacomo a que se segue(lida de 5' para3 ', da esquerda 32P-GCAATCACGTC otratamentodofragmentocomhidrazina(NHrNHr)emNaCl I,SM,itatacar(porumcaminhoque no descreveremos aqui) os resduosde citosina, de modo que o tratamentoposterior com piperidina (Seo20.18) causara clivagem no lado 5' de resduosC. O que produzir os seguintesfragmentos, marcados em 5': 32P-GCAATCACGT 3'P-GCAATCA 32P-GCAAT 32P-G por uma tcnica chamadaeletroforese em gel (Fig. Essesfragmentospodem ento ser separados 25.15). Uma amostracontendoa mistura de fragmentos olocadanuma extremidadeda lmina fina de gel de poliacrilamida KCHTCHCONH1. O gel ir sepaaos fragmentoscom o marcadorradioativo, sobre a ao de um cmpo eltrico. Os fragmentosdesloam-seatravsdo gel, em velocidades diferentes,conforme o nmero de grupos fosfato com carga negativa que possueme, tambm, dos seusrespectivostamanhos.Os fragmentosmenoresmovem-semais rapidamente.Depois da separaoa lmina de gel colocada em contato com uma chapa fotogrfia. A radiao de um fragmento contendo o fosfato radioativo na posio 5' provoca o surgimento de uma mancha escurana

458

cidos Nuclicos e Sntesede Porenas

Fig. 25. l5 Aparelho para eletroforese em gel. As amostrs so aplicadas nas fendas no topo do gel. Aplicao de uma diferena de voltagem faz as amostras se deslocarem. As amostras se movem em trajetrias paralelas. (De Voet, D.; Voet, J. G. Biochemistry,2." ed.; Wiley: Nova York, 1995,p.92. [Usado com autorizao.l)

chapa fotogrfica, no ponto em contato com o gel. A chapa exposta uma auto-radiograa e esta tcnica denominadatcrljca auto-radiogrfica. Os fragmentos no marcadosda cadeia mediana tambm estopresentes,mas no se revelam na placa e por isso so ignorados. O DNA a ser seqenciadopode ser rompido prximo a certos pares especficos,submetendo-o em alquotasseprradas a quatro tratamentosdiferentes.Alm da clivagem exclusiva prxima do C, mencionadaanteriormente,h reagentesque clivam, no lado do terminal 5', exclusivos para o G, e n o l a d o d e 5 ' p a ra o Ae Genol adodo5' paraoC eT.A psacl i vagem,asal quotassep ar adasso submetidasa eletroforesessimultaeas,em quatro pistasparalelasdo gel. Depois da auto-radiografia os resultados,como os mostradosna Fig. 25 .16, permitem a leitura da seqncia de DNA diretamente do gel. A leitura do gel feita a partir da parte inferior: h uma mancha escurana pista A + G, mas nenhuma na pista G. Isto indica que o menor fragmento marcado A. O mesmo padro ocorre no segundo nvel, indicando outro A. O terceiro nvel acima esurona pista do C e claro na pista C + T, indicandoqueCaterceirabasenaseqncia.AquartabaseAmaisumavez,eassimpordiante. O processo to regular que se usam computadoreshoje em dia para auxiliar a leitura dos gis.

A*G
Fig. 25.l Uma autoradiografia de seqenciamento em gel contendo fragmentos de um segmento de DNA que foi submetido a seqenciamento qumico. O DNA foi marcado com 32P na extremidade 5'. A seqncia deduzida para o fragmento de DNA est escrita na coluna da direita. Como os fragmentos menores esto no fundo da placa de gel, a direo 5' --> 3' na seqncia corresponde direo de baixo para cima no gel. (Cortesia de Dad Dressler, de Yoet, D. e Voet J. G. Biochemistry,2." edl.; Wiley, Nova York, 1995, p. 892. Usado com autorizao.)

C*T
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T T G T.

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T oG T T T A T A A

cidos Nuclicos e Sntesede hotenas

459

O avano no seqenciamentode DNA tem sido to rpido que, nos dias de hoje, este seqenciamento no gene corespondente a uma protena o mtodo mais fcil para determinar a seqncia de aminocidosde uma protena. (Uma vez conhecido o cdigo gentico,pode-sededuzir a seqncia de aminocidosda protena a partir da seqnciade basesdo DNA que codifica a protena.j Um recente xito no seqenciamentode DNA foi a determinaoda seqnciatotal dos 172.282 pares de basesdo vrus Epstein-Barr (vrus do herpeshumano); tambm estsendorpido o progressono seqenciamento dos 2,9 bilhes de pares de basesdos 100.000genesque constituem o genoma humano.

25.7 Snrese DE OltcoNuclEoroeos

EM LABoRAToRto

Um gene o projeto da protena que est codifiada em uma seqnciaespecfica de pares de basesdo DNA. O que fazem os genesindividuais e como funcionam? So essasas perguntasqrr" fazem os bilogos e bioqumicos atualmente.Ao enunci-las,estousandouma abordeemcomoletamentenova para o estudoda gentica, chamadagentica invertida. A definio tradiional da gentica envolve a alteraoou a anulaoaleatriasdos genes,mediantemutaesinduzidas no organismo, observandodepois os efeitos nos descendentes. Com organismossuperiores,como os vertebrados, existem desvantagens sriasnestaabordagem.As geraesso inconvenientementelongas, o nmero de descendentes pequenoe as mutaesmais interessantes geralmenteso letais sendo, por isso, difceis de se propagar e de seremestudadas. A abordagemda genticainvertida consisteem iniciar com um gene clonado e manipul-lo para descobrir como ele funciona. Uma forma de manipulao ade sintetizarcadeiasde DNA (oligonucleotdeoscom aproximadamente15 bases)que socomplementares a determinadas partesdo gene. Essesoligonucleotdeos sintticos, chamadosnucleotdeos anti-sensores, so capazesde ligar-se no que se denomina a seqnciasensor do DNA. Assim, podem alterar aatividade do gene ou mesmo anul-lo totalmente. Por exemplo, se a parte de sensordo DNA num gene for A _G-A -C -C _G-T_G-G o oligonucleotdeo anti-sensorseria T-C _T-G_G-C _A _C _C T-C_T-G_G-C_A_C_C A capacidadede desativar genesespecficosdessamaneira leva a grandesesperanas mdicas. Alguns vrus e bactrias,durante seusciclos vitais, utilizam um mtodo como essepara regular alguns dos seusprprios genes.A esperan4, portanto, sintetizaroligonucleotdeosan-sensresque procurasseme destrussemvrus nas clulas de uma pessoa,ligando-se a seqncias fundamentais do DNA ou do RNA do vrus. A sntesedestesoligonucleotdeos uma rea ativa de pesquisanos dias de hoje, e se direciona a muitas doenasprovocadaspor vrus, inclusive a AIDS. Os mtodoscomuns para a sntesede oligonucleotdeosso similares aos utilizados na sntesede protenas,e entre eles as tcnicasem fase slida automatizadas (Seo24.7D). Um nucleotdeo,adequadamenteprotegido, conectadoa uma fase slida denominada"vidro de poros controlados" ou CPG (sigla em ingls) (Fig. 25.17), por uma ligao que poder ser posteriormenteclivada. O prximo nucleotdeoprotegido, na forma de um fosforamidito, adicionadoe o acoplamento proocado por um agentede acoplamento,geralmenteo I,2,3,4-tetrazol. O trister de fosfito resultantedo acoplamento oxidado a trister de fosfato, pelo iodo, produzindo uma adeiaestendidapor um nucleotdeo. O grupo dimetoxitritila (DMTr) usadopara proteger a extremidade5' do nucleotdeo removido pelo tratamentocom um cido, e as etapasde acoplamento, oxidao e destritilao so repetidas.(Todas as etapasso realizadasem solventesno aquosos.)Com sintetizadoresautomatizadoso processopode ser repetido pelo menos 50 vezese o tempo paa um ciclo completo 40 minutos ou menos. Depois que o oligonucleotdeo desejadofoi sintetizado, ele liberado do suporte slido e ento os grupos protetores,incluindo os das bases,so removidos.

25.8A Rrao EMCaoen eELA Poltuenase

A reao em cadeia pela polimerase (RCP) um mtodo extraordinariamente simplese efiiente para se ampliar seqncias de DNA. Partindo-sede uma s molula de DNA, a reaoem cadeia pela polimerasepode gerar 100 bilhes de cpias numa nica tarde. A reao fcll de realizar requer alguns reagentes, um tubo de ensaio e uma fonte de calor. A RCP j provocou efeito importante na biologia molecular. Est sendousadana medicina para diagnosticardoenasinfecciosase genticas. Um dos objetivos originais no desenvolvimentoda RCp era us-la para aumentar a velocidade e a eficincia do diagnstico pr-natal da anemia falciforme (Seo 24.6C). Atualmente est sendo aplicada no diagnstico de vrias outras doenasgenticas.

460

cidos Nuclicos e Sntese de protenas

H-O-1,,O!B'
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BpB'2, B, : Basesprotegidas

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Fig,25.17 Etapas envolvidas na sntese automatizada de oligonucleotdeos usando o mtodo de acoplamento com fosforamidito.

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incluindo a distrofia muscular e a fibrose cstica. Dentre as doenasinfecciosas,a RCP usadapara detectarcitomegalovruse vrus que causamAIDS, certoscarcinomascervicais,hepatite,sarampoe doenade Epstein-Barr. A RCP usadana prtica jurdica, na genticahumana e na biologia evolucioniria. A amostrade DNA copiada pode provir de uma gota de sangueou de smen,ou de um fio de cabelo deixado na cena de um crime. Pode at mesmo provir do crebro de uma mmia ou de um peludo mamute de 40.000 anos.

cidos Nucicos e Sntesede Protena-s

461

Mullis recebeuo Prmio Nobel de Qumica pelo seu trabalho em 1993.

A RCP foi inventada por Karl B. Mullis e desenvolvida por ele e seuscolaboradores.na Cetus Corporation. UtilizaaenzimaDNA polimerase,descobertaem 1955 por Arthur Kornberg e associados,na Universidade de Stanford. Nas clulas vivas a DNA polimerase ajuda a reparar e replicar o DNA. A RCP empregauma propriedadecaractestica das DNA polimerases:a capacidadede ligar nucleotdeosadicionais a um pequenooligonucleotdeo "iniciador", quando esteiniciador estligado a cadeiascomplementaresde DNA denominadasgabarito. Os nucleotdeosso ligados na extremidade 3' do iniciador e o nucleotdeo ao qual a polimerase se liga sero complementar base na posio adjacenteda cadeia do gabarito. Se o nucleotdeo adjacenteno gabarito G, a polimerase adiciona C ao iniiador; se o nucleotdeoadjacenteno gabarito A a polimerase adiciona T, e assim por diante. A polimeraserepeteesteprocessoinmerasvezes,enquantoos nucleotdeosnecessrios (na forma de trifosfatos) estiverem presentesna soluo, at atingir a extremidade5' do gabarito. A Fig. 25.18 mostra um ciclo da RCP na maneira que normalmentercalizada.No necessrio conhecera seqnciade nucleotdeosdo alvo da RCP. No entanto, necessrioconhecera seqncia em pequenossegmentosem cada lado do alvo, para sintetizar dois oligonucleotdeosde cadeia simples (com - 20 nucleotdeos)que atuaro como iniciadores. Os iniciadores devem possuir seqnciasde nucleotdeoscomplementaress seqncias laterais de cada cadeia do DNA. No incio da RCP, o DNA com dupla cadeia (duplex) aquecidopaa separaras cadeias.Os inilaterais.Adiciadores (umpara cadacadeia)so adicionadose acopladoss respectivasseqncias cionam-seento a DNA polimerasee os trifosfatos dos nucleotdeos,praque a polimerasepromova o alongamentode cada iniciador atravsda seqnciaalvo de cadacadeia.Se o alongamentode um dado iniciador for suficiente, ele incluir a seqnciacomplementarao outro iniciador. Conseqen-

AACGACTGCAAGGAT
tl l tttttLtttttttttttl ttttttttttttttttttl tl

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paraseparar as I Rquecimento cadeias; depois adio do iniciador {

AACGACTGCAAGGA

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tttttl tttttl

TTGCTGACGT

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Fig. 25.18 Um ciclo da reao em cadeia pela polimerase. O aquecimento separa as cadeias de DNA do alvo, dando dois gabaritos com uma s cadeia. Os iniciadores. designados para complementar a seqncia de nucleotdeos, ao se acoplarem lateralmente ao alvo. xam-se em cada cadeia. A DNA polimerase, na presena de trifosfatos de nucleotdeos, catalisa a sntese de dois fragmentos de DNA. cada um idntico ao DNA original do alvo.

I Rdicaode DNA oolimerase t' le de nucleotoeos Y de trifosfatos

AACGAC TTGC

tttttttttl tttttttttl t tl ttttttttttttttttl tt

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462

cidos Nuclicos e Sntesede Protenas

Separaodas cadeias e adio do iniciador

paa Extenso dos iniciadores fazerem-seas cpias

A AC GAC T G C AA G A TT c a u A u | | l | | l tl I Il I I I I a A A T T GC T G A C GTTC CT c

A A C G A C T G C A A G G A T T C CGA

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A A C A C TG C A A GGA T TC c GA G I I I l | | | | l I I T T u T u A C GTTC C TA A G u cTC

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A A C GA C TG C A A GG A T TC C GA G l | | | | | | l | | | | tl TTGCTGA C GTTC CTA A GGC TC

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A A C GA C T U c A A U A TT C C GA l Itl I I I I I I I I I TTGC T A C T T CC T A A u C T C

A AC GA C | | | tl T T G C T G A C GTC C
A A C G A C T U c A A u A T TC Cu A G il||l I I I I tl I T T G C T G A C G T T C c T A G Gc T c Fig. 25. l9 Cada ciclo da reao em cadeia pela polimerase duplica o nmero de cpias do DNA na rea-alvo.

temente,cadanovo produto de alongamentopode atuar,depoisque as cadeiasforem separadas, como gabarito para outro ciclo. Cadaciclo duplica a quantidadede DNA alvo (Fig. 25.19).Isto significa que a quantidadede DNA aumentaexponencialmente.Aps n cilos, a quantidade de DNA ter crescido 2" yezes.Aps 10 ciclos haver aproximadamente 1.000 vezesmais DNA; aps20 ciclos seraproximadamente 1 milho de vezesmaior. A aplicaoda RCP bastanterpidae foi automatizada;2Sciclos podem ser feitos em t hora.

Acidos Nuclrcose Sntese de P:,r:e;:r,

Palavras-chave e Conceitos
cidos nuclicos Nucleotdeos Nucleosdeos Replicao Transcrio Cdigo gentico Cdon, anticdon Traduo Endonucleases de restrio Reao em cadeia pela polimerase (RCP)

Sees 25.1,25,4e 25.5 Sees 25.2e 25.3 25.2e 25.3 Sees Seo 25.4C Seo 25.54 Sees 25.5Ce 25.5D Seo 25.5C 25.5D Seo 25.6 Seo Seo 25.8