Historia
La primera deteccin de Resonancia Magntica Nuclear debida a la formacin de una diferencia en las energas de ciertos ncleos en presencia de un campo magntico fue reportada por Bloch (para el agua lquida) y Purcell (para la cera de parafina) en 1946. La aplicacin qumica de la RMN fue descubierta a principios de los cincuenta, al observarse que la frecuencia de resonancia de un ncleo dependa fuertemente de su entorno qumico (chemical shift). A partir de los aos setenta, el desarrollo de nuevas tcnicas y mayores campos magnticos (que incrementan tanto la sensibilidad como la resolucin de las seales) permitieron estudiar molculas cada vez ms grandes. El advenimiento de la RMN multidimensional y el uso del marcaje 13C y 15N marc el inicio de la RMN biolgica.
Tipos de RMN
Espectroscopia de RMN con Onda Continua (CW: Continuous Wave)
Desde sus comienzos hasta finales de los 60, la espectroscopia de RMN utiliz una tcnica conocida como espectroscopia de onda continua (CW). La manera de registrar un espectro de RMN en el modo de CW era, bien mantener constante el campo magntico e ir haciendo un barrido de frecuencias con un campo oscilante, o bien, lo que era usado ms a menudo, se mantena constante la frecuencia del campo oscilante, y se iba variando la intensidad del campo magntico para encontrar las transiciones (picos del espectro). En la RMN de CW las seales del espectro se registran como seales en resonancia. La espectroscopia CW est limitada por su baja sensibilidad, ya que cada seal se registra una sola vez por cada barrido y la tcnica de resonancia magntica nuclear ya es de por s no demasiado sensible; esto quiere decir que la tcnica sufre de una baja relacin seal-ruido. Afortunadamente, en RMN es posible mejorar la relacin seal-ruido mediante el promediado de seal. El promediado de seal consiste en repetir la adquisicin del experimento e ir sumando los espectros que se obtienen. De esta manera, las zonas del espectro en que existen seales se suman de
Espectroscopia de resonancia magntica nuclear manera constructiva, mientras que, por su parte, las zonas en que hay ruido, por su carcter aleatorio, se acumula ms lentamente que la seal. Mediante el promediado de seal se incrementa la relacin seal-ruido en un valor que es la raz cuadrada del nmero de espectros que se han acumulado. Esta relacin se cumple con espectros de RMN en los que intervienen un slo tipo de ncleos, por ejemplo, slo 1H, 13C, etc., tambin llamados espectros homonucleares.
3 La FID es una onda que contiene todas las seales del espectro en una forma que es dependiente del tiempo. Esta onda puede convertirse en un espectro de seales en funcin de su frecuencia. Para ello se utiliza una funcin matemtica conocida como Transformada de Fourier. El resultado es lo que se conoce como un espectro de RMN (espectro de frecuencias).
La posibilidad de excitar la muestra con uno o ms pulsos de radiofrecuencia (RF), cada uno de ellos aplicado con una potencia, duracin, frecuencia, forma y fase particulares, e introducirlos en momentos especficos de tiempo durante el experimento de RMN, generalmente antes de que el sistema haya regresado al equilibrio por relajacin, permite disear toda una gama de secuencias de pulsos de las que se puede extraer informacin molecular muy variada. Una secuencia de pulsos es una distribucin en el tiempo de alguno o varios de los siguientes elementos: i) un cierto nmero de pulsos de RF que afectn a uno o ms tipos de ncleos, ii) tiempos de espera en los que no se hace nada sino esperar a que el sistema evolucione de una determinada forma. Estos tiempos de espera pueden ser fijos o bien incrementables si su duracin se va aumentando a medida que se repite el experimento. iii) gradientes de campo magntico y iv) una etapa final en la que se adquiere la FID. En un experimento de RMN multidimensional la secuencia de pulsos debe constar de al menos dos pulsos y stos deben separados por un periodo de espera incrementable. La secuencia de pulsos se repite un nmero de veces adquirindose una FID en cada ocasin. La fase de alguno de los pulsos puede alterarse en cada repeticin as como incrementarse la duracin de uno o ms tiempos de espera variables. Si la secuencia de pulsos tiene un tiempo de espera incrementable el experimento tendr dos dimensiones, si tiene dos ser de tres dimensiones, si tiene tres el experimento ser de cuatro dimensiones. Aunque en teora no existe lmite en el nmero de dimensiones de un experimento, experimentalmente hay limitaciones impuestas por la consiguiente prdida de seal por relajacin que conlleva la deteccin de las distintas dimensiones. Los tiempos de registro de los experimentos de RMN multidimensional se pueden acortar drsticamente con las tcnicas rpidas de RMN desarrolladas en la presente dcada. Los experimentos multidimensionales se pueden clasificar en dos tipos principales: Experimentos de correlacin homonuclear: Son aquellos en los que todas las dimensiones corresponden al mismo ncleo. Ejemplos: COSY (COrrelation SpectroscopY), TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY), NOESY (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY). Experimentos de correlacin heteronuclear: En este experimentos se obtienen espectros cuyas dimensiones pertenecen a diferentes ncleos. Ejemplos: HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Correlation), HSQC (Heteronuclear Simple Quantum Correlation), HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation), HOESY (Heteronuclear Overhauser Effect SpectroscopY). Grosso modo, las interacciones que pueden detectarse por RMN se pueden clasisficar en dos tipos: 1. Las interacciones a travs de enlaces se basan en el acoplamiento escalar 2. Las interacciones a travs del espacio se basan en el acoplamiento dipolar. En el caso de muestras en disolucin, el acoplamiento dipolar se manifiesta como efecto Overhauser nuclear que permite determinar la distancia entre los tomos. Richard Ernst en 1991 y Kurt Wthrich en el 2002 fueron galardonados con el premio Nobel de Qumica por su contribuciones al desarrollo de la RMN de 2-dimensiones y multidimensional con transformada de Fourier. Los avances conseguidos por ellos y por otros grupos de investigadores han expandido la RMN a la bioqumica, y en
La seal que se detecta FID (Free Induction Decay) es una seal oscilante que contiene todas las seales del espectro y decae hasta hacerse cero.
RMN Multidimensional
Espectroscopia de resonancia magntica nuclear particular a la determinacin de la estructura en disolucin de biopolmeros como protenas o incluso cidos nucleicos de tamao pequeo.
Slidos
La RMN en disolucin es complementaria de la cristalografa de rayos X ya que la primera permite estudiar la estructura tridimensional de las molculas en fase lquida o disuelta en un cristal lquido, mientras que la cristalografa de rayos-X, como su nombre indica, estudia las molculas en fase slida. La RMN puede utilizarse tambin para el estudio de muestras en estado slido. Si bien en su estado actual queda lejos de poder proporcionar con buen detalle la estructura tridimensional de una biomolcula. En el estado slido las molculas estn estticas y no existe, como ocurre con las molculas en disolucin, un promediado de la seal de RMN por el efecto de la rotacin trmica de la molcula respecto a la direccin del campo magntico. Las molculas de un slido estn prcticamente inmviles, y cada una de ellas experimenta un entorno electrnico ligeramente diferente, dando lugar a una seal diferente. Esta variacin del entorno electrnico disminuye la resolucin de las seales y dificulta su interpretacin. Raymond Andrew fue uno de los pioneros en el desarrollo de mtodos de alta resolucin para resonancia magntica nuclear en estado slido. l fue quien introdujo la tcnica de la rotacin en el ngulo mgico Magic Angle Spinning (MAS) que permiti incrementar la resolucin de los espectros de slidos varios rdenes de magnitud. En MAS, las interacciones se promedian rotando la muestra a una velocidad de varios kilohertzios. Alex Pines en colaboracin con John Waugh revolucionaron tambin la RMN de slidos introduciendo la tcnica de la polarizacin cruzada (CP) que consigue incrementar la sensibilidad de ncleos poco abundantes gracias a la transferencia de polarizacin de los protones a los ncleos ms insensibles cercanos, generalmente 13C, 15N o 29Si. A caballo entre la RMN en disolucin y en fase slida, se encuentra la tcnica de HR-MAS (High Resolution with Magic Angle Sinning), cuya aplicacin fundamental es el anlisis de geles y materiales semislidos. El fundamento del HR-MAS es hacer girar la muestra, al ngulo mgico, a una velocidad muy superior que en slidos habituales. El efecto conseguido son espectros mono y bidimensionales de gran calidad, prxima a la RMN en disolucin. La principal aplicacin de esta tcnica es el anlisis de matrices biolgicas y polimricas, como resinas para sntesis en fase slida solvatadas.
Sensibilidad
Debido a que la intensidad de la seal de RMN, y por tanto, tambin la sensibilidad de la tcnica depende de la fortaleza del campo magntico, desde los inicios de la RMN ha existido gran inters por el desarrollo de imanes ms potentes. En la actualidad los imanes comerciales ms potentes estn en torno a los 22.31 T, o 950 MHz frecuencia de resonancia de 1H. Los avances en la tecnologa audio-visual e informtica tambin han mejorado los aspectos de generacin de pulsos y la recepcin de seal y el procesado de la informacin. La sensibilidad de las seales tambin depende de la presencia de ncleos magnticamente-susceptibles a la RMN y, por tanto, de la abundancia natural de tales ncleos. Para el caso de biomolculas los ncleos ms abundantes y magnticamente susceptibles son los istopos de hidrgeno 1H y fsforo 31P. Por el contrario, ncleos como carbono y nitrgeno tienen istopos tiles a la RMN, 13C y 15N, respectivamente, pero se presentan en baja abundancia natural. Para hacer frente a esta dificultad existe la posibilidad de enriquecer las molculas de la muestra con estos istopos (ej. sustitucin de 12C por 13C y/o de 14N por 15N) para poder estudiarlos por RMN con la suficiente sensibilidad. Se trata de istopos perfectamente estables que no producen ms que una pequea variacin en la masa molecular de la molcula, sin afectar para nada a otras propiedades estructurales o qumicas de la muestra.
Espectroscopia de resonancia magntica nuclear Espectro monodimensional de 13C: Al igual que en 1 H el desplazamiento qumico da informacin de los grupos funcionales. Dependiendo del tipo de experimento realizado se puede obtener informacin del nmero de hidrgenos unidos a cada carbono.
Espectros bidimensionales homonucleares: Los experimentos COSY y TOCSY dan informacin de las relaciones entre los protones de la molcula, por acomplamiento escalar o dipolar (NOESY) Espectros bidimensionales heteronucleares: Los experimentos HMQC y HSQC indican qu hidrgenos estn unidos a qu carbonos. El experimento HMBC permite determinar relaciones entre protones y carbonos a mayor distancia (2 o 3 enlaces) Experimentos con otros ncleos: Si la molcula posee otros ncleos activos en RMN es posible su medida a travs de experimentos monodimensionales o bidimensionales (por deteccin indirecta)
Ejemplo de un espectro COSY.
Referencias
[1] Instalaciones cientficas de la U.C.T.R.A. (KAUST) (http:/ / www. kaust. edu. sa/ research/ core-imaging. aspx)
Enlaces externos
Artculo sobre espectrometra de Resonancia Magntica Nuclear (http://www.espectrometria.com/ espectrometra_de_resonancia_magntica_nuclear) www.organicworldwide.net/nmr.html (en) (http://www.organicworldwide.net/nmr.html)
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