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Biognese e regulao de vesculas sensveis insulina contendo GLUT4 INTRODUO Vrios exemplos de exocitose regulada, no-secretria de vesculas da membrana

a tm sido descritos. Em vertebrados, a translocao exoctica de vrias protenas da membrana ocorre em resposta a hormnios e outros estmulos extracelulares, fornecendo um mecanismo para a regulao de fisiologia sistmica. Um dos exemplos mais estudados desse processo a translocao estimulada por insulina de transportadores de glicose GLUT4. Uma protena da transmembrana 12, GLUT4 o transportador de glicose predominante presente em gordura e msculo. A insulina regula a entrada de glicose controlando o nmero de transportadores na superfcie da clula, e age dentro de minutos para mobilizar GLUT4 de locais intracelulares. Como essa ao se compromete durante o desenvolvimento da diabetes tipo 2, muito trabalho tem sido feito para entender a sinalizao de insulina e as vias de trfego de GLUT4 que medeiam esse processo. Mltiplas vias de sinalizao de insulina tm sido implicadas na regulao de GLUT4, e podem cruzar com vias de trfego de GLUT4 em etapas diferentes. Grande ateno tem sido dada sinalizao atravs de Akt2 para AS160/TBC1D4 e TBC1D1, protenas ativadoras de Rab GTPase que direcionam GLUT4 em gordura e msculo, respectivamente. Outras vias de sinalizao que foram implicadas envolvem isoformas atpicas de protena quinase C e a famlia Rho GTPase, TC10. Essas vias podem ser revistas em outros lugares. Aqui, ns focamos em mecanismos de trfego de protena que regulam GLUT4. Em particular, ns resumimos trabalhos recentes que levaram a um maior entendimento sobre como GLUT4 e outras protenas se juntam em vesculas responsivas insulina (IRVs), como essas vesculas so retidas de maneira intracelular em clulas no-estimuladas, e como elas podem ser mobilizadas por insulina. Classificao de protenas em IRVs

Microscopia imunoeltrica de clulas musculares esquelticas e adiposas, bem como dados bioqumicos, mostram que sob condies basais, at 75% do total de GLUT4 intracelular est localizado em pequenas vesculas e tbulos curtos. O resto do transportador est presente em membranas intracelulares grandes que se sedimentam rapidamente, que provavelmente representam endossomos e estruturas da rede trans-golgi (TGN). Vesculas pequenas que contm GLUT4 no apresentam compartimento homogneo e incluem ao menos 2 populaes vesiculares: vesculas responsivas a insulina, que so translocadas membrana plasmtica com 100% de eficincia, e vesculas de transporte intracelular ubquo que no so recrutadas membrana plasmtica por insulina. Em adipcitos, as ltimas vesculas so marcadas pela presena de celugirina, uma protena transmembrana-4, com funo fisiolgica ainda desconhecida, que representa um homlogo ubquo de sinaptogirina, um grande constituinte de vescular sinpticas. Uma anlise sistemtica e IRVs altamente purificados foi recentemente feita por Jedrychowski et al. Resultados desse estudo confirmam que GLUT4, IRAP, e sortilin, as protenas que foram antes encontradas na preparao total de vesculas pequenas de GLUT4, estavam presentes em IRVs em vrias cpias. Alm disso, ele descobriu que protena 1 ligada a lipoprotena de baixa densidade (LRP1) tambm fica nos IRVs. LRP1 j conhecida h muito tempo por passar por translocao dependente de insulina membrana plasmtica em clulas adiposas, mas escapou a anlise prvia de vesculas de GLUT4, provavelmente por conta de seu tamanho enorme. Finalmente, os IRVs contm VAMP2 que representa o vSNARE nesse compartimento. Outras protenas podem tambm residir nos IRVs como componentes relativamente menores. Cada rodada de estimulao de insulina leva a translocao da membrana plasmtica de todas as protenas IRVs. Como h uma baixa ocorrncia de eventos rpidos, cada protena IRV est suscetvel a ser internalizada pela membrana plasmtica ao seu prprio ritmo. Isso significa que IRVs funcionais devem de alguma forma ser remontados a partir de componentes individuais aps cada evento de translocao, ou seja, milhares e dezenas de milhares de vezes atravs do ciclo de vida da clula

musculas esqueltica ou de gordura. O mecanismo de montagem do IRV deveria funcionar com grande fidelidade, pois o mau funcionamento desse processo pode diminuir o nmero de IRVs na clula ou levar a formao de clulas menos sensveis a insulina e, eventualmente, a resistncia insulina. Ento, como GLUT4, IRAP, sortilina e LRP1 se encontram na clula para formar um carreador vesicular altamente especfico e nico? partir da membrana plasmtica, protenas IRV so internalizadas em endossomos de organizao e eventualmente atingem o compartimento perinuclear positivo de sintaxina. Esse compartimento perinuclear provavelmente inclui um subdomnio de TGN bem como endosomos reciclveis. Em msculo esqueltico humano, o trfego retrgado de GLUT4 de endossomos de organizao para o TGN um passo essencial na via GLUT4 e pode envolver a sintaxina 10. Em humanos, essa etapa mediada pela isoforma especfica da clatrina, CHC22. O interessante que nem CHC22, nem sintaxina-10 esto expressos em camundongos; isso pode contribuir para uma entrada relativamente menor de msculo esqueltico em homeostase de glicose geral em camundongos versus humanos. De um ponto de vista bioqumico, o compartimento perinuclear representa uma mistura de IRVs e membranas grandes sedimentares, doadoras que existem em equilbrio dinmico. Embora a resoluo de microscopia por fluorescncia convencional no possa distinguir as membranas doadoras de pequenas vesculas, estas podem ser facilmente separadas por fracionamento bioqumico. GLUT4, IRAP, e sortilina so visadas s membranas doadoras perinucleares pelos seus domnios citoplasmticos. Ao chegar nesse compartimento, essas protenas podem ser redistribudas aos IRVs por ao em massa. Especificamente, GLUT4, IRAP, sortilina e um novo componente IRV descoberto, o LRP1, podem interagir entre si atravs de domnios de luminal. Assim, interaes mtuas de luminal podem juntar essas protenas nas membranas doadoras e facilitar a classificao proteica ativa nos IRVs.

Biognese dos IRVs A formao das vesculas da membrana acionada por capas de membrana que so recrutadas para stios especficos em membranas doadoras por protenas adaptadoras. Essas ltimas se associam com membranas doadoras atravs de mltiplas interaes com os domnios citoplasmticos de protenas cargo, arf-GTP e fosfatos fosfatidilinositol. A formao de IRVs em membranas doadoras intracelulares requer capas de clatrina e adaptadores de CGA. O nico componente proteico dos IRVs que conhecido por interagir com CGA sortilina, que tem um motivo ligante a CGA DXXLL convencional. No entanto, como sortilina pode interagir com GLUT4, IRAP e LRP1 no lumen da vescula, pode funcionar como andaime transmembrana, juntando as protenas maiores que compem IRV, em um grande complexo oligomrico. Ento, sortilina, GLUT4, IRAP e LRP1 podem se dividir na frao vesicular como uma nica entidade, usando maquinaria de ligao de vescula dependente de CGA. Adaptadores de CGA podem no ser suficiente para a formao dos IRVs. Outra protena adaptadora que possui um papel fundamental na formao dessas vesculas a ACAP1, que interage com o loop citoplasmtico central do GLUT4 e recruta a claritina aos IRVs ligantes. Assim, formao dos IRVs pode envolver ao coordenada do CGA e ACAP1. Alm disso, vrios relatos anteriores sugerem que adaptadores de AP1 e AP3 podem tambm participar. A ao recproca entre diferentes adaptadores no processo de informao de IRV merece investigao futura. Ambos CGA e ACAP1 podem interagir com Arf6 que controla a reciclagem da superfcie da clula e secreo regulada em vrios tipos de clulas. Em adipcitos 3T3-L1, a localizao intracelular de Arf6 se sobrepe de GLUT4 nas membranas doadoras perinucleares. Mais importante ainda, a depleo de Arf6 em adipcitos 3T3-L1 inibe totalmente a translocao estimulada por insulina de GLUT4.

A identidade do fosfato fosfatidilinositosol que est envolvido na formao de IRV ainda desconhecida. Recentemente PI4P tem sido visto interagir com adaptadores de GGA e recrut-los ao TGN. Como o TGN provavelmente representa um compartimento doador para a formao de IRV mediada por GGA, PI4P surge como uma candidata plausvel. Os IRVs em si so esgotados de atividade fosfatidilinositosol 4-quinase; no entanto, vesculas de transporte positivas para celugirina contm PI4K tipo IIa. Como essas vesculas podem entregar protenas do componente IRV a partir de endossomos de distribuio s membranas doadoras perinucleares, a gerao de PI4P pode equilibrar a entrada de fluxo proteico com o nvel de formao de IRV e manter a integridade do compartimento doador. Alvos das protenas IRV novas sintetizadas GLUT4 e IRAP sintetizados de modo novo no so destinados membrana plasmtica como a maioria das protenas da membrana, mas chegam no compartimento sensvel a insulina dentro de 6-9 horas. Provavelmente, essas protenas trafegam diretamente da via secretria aos IRVs. Alcanar o compartimento sensvel a insulina requer sinais-alvo especficos nas regies citoplasmticas das protenas. Para GLUT4, esses sinais ficam no N-terminus e loop grande central. Para o IRAP, o motivo di-leucina nas posies 76 e 77 necessrio. Esses sinais so diferentes dos que navegam pelo trfego intracelular de protenas recicladoras. Ainda assim, o processo de escolha do alvo de GLUT4 e IRAP novas sintetizadas ao compartimento sensvel a insulina tambm requer adaptadores GGA. Ainda falta ser visto se GLUT4 e IRAP novas sintetizadas se misturam ou no com protenas recicladoras nas membranas doadoras de IRV, ou se elas so visadas ao mesmo compartimento sensvel a insulina a partir de uma origem diferente. Captura e reteno intracelular dos IRVs Uma vez formados, IRVs so retidos de forma muito eficiente dentro de clulas no expostas a insulina. Exatamente como essas vesculas so retidas dentro da clula ainda desconhecido, mas elas provavelmente participam no ciclo intracelular envolvendo endossomos e/ou TGN. Dados

mais recentes sugerem que IRVs no se fundem com endossomos que contm receptor de tranferrina. Alm disso, reteno intracelular eficiente de GLUT4 endocitosado requer componentes SNARE que levam a fuso de membrana no TGN . Esses componentes incluem sintaxina-16, sintaxina-6, Vtila, VAMP4 em camundongos; em humanos: sintaxina-16, sintaxina-10, Vtila e VAMP3. Uma possibilidade que os IRVs passam por um ciclo dentro e fora do TGN, o que poderia sequestra-los para longe dos endossomos e da membrana plasmtica. Tal ciclo de pareamento e fuso ajudaria com o enriquecimento dos componentes IRV e da reteno intracelular desses componentes em clulas no-estimuladas (figura 1). Foi proposto que TUG um componente essencial do mecanismo responsvel por capturar IRVs dentro de clulas. TUG (amarra contendo um domnio UBX, para GLUT4) foi identificada em um ecr funcional para reguladores de alvo para GLUT4. Uma protena cistlica, TUG se liga diretamente e especificamente ao GLUT4 e no GLUT1. Em adipcitos 3T3-L1, TUG co-localiza com GLUT4 no-endossomal. A interao TUGGLUT4 mediada parcialmente pelo loop intracelular grande de GLUT4. Dados sugerem uma segunda interao, que pode envolver o N-terminus do GLUT4. Como visto acima, essas regies do GLUT4 so necessrias para o trfego sensvel a insulina. A especificidade da interao TUG-GLUT4 uma prova que apoia a ideia de que TUG regula GLUT4 em IRVs, e no em outros locais. As regies centrais e N-terminal do TUG interagem com GLUT4; o terminal-C de TUG no exigido para essa interao, mas essencial para reter GLUT4 intracelularmente. Foi criada uma hiptese de que o terminal-C do TUG interage com uma protena de ancorao, que pode reprimir um ciclo intracelular exigido para a reteno intracelular de GLUT4. Protenas candidatas no TGN para preencher esse papel foram agora identificadas. Em adio, um fragmento do terminal-C de TUG, UBXCter, age de maneira dominante negativa para romper a reteno intracelular de GLUT4 em clulas no estimuladas. Presume-se que UBXCter age ligando o stio de ancorao, e prevenindo a interao de TUG intactos e endgenos nesse stio. Apoiando esse modelo, efeitos da depleo de TUG mediada por RNAi e expresso de UBX-Cter so

indistinguveis: ambos redistribuem GLUT4 para a membrana plasmtica. A magnitude desse efeito semelhante da ao da insulina, e no h grandes efeitos na distribuio de receptor de transferrina. Em clulas que contm TUG UBX-Cter negativo dominante, GLUT4 que no est na membrana plasmtica aparentemente fica nos endossomos. Por contraste, a superexpresso de TUG causa GLUT4 a acumular em vesculas no endossomais, que so provavelmente IRVs. Esses achados so consistentes com a noo de que TUG regula IRVs e que a ao de insulina nesse stio um ponto mximo de controle. Se IRVs so de fato retidos por um ciclo no TGN, ento componentes IRV podem entrar nesse ciclo seja diretamente por uma via secretria ou por trfego retrgado via endossomos. De qualquer forma, o recrutamento de TUG para membranas que contm GLUT4 exigido para captura-lo, possivelmente por fuso de facilitao no TGN. As aes sequenciais de sortilina e TUG podem ento conferir especificidade para protenas sequestradas em IRVs, e proporcionam um mecanismo para sequestrao. Como a expresso de sortilina regulada durante a diferenciao de adipcitos, esse modelo tambm vale para a especificidade de tecido da regulao de IRV. Mobilizao de IRV por insulina A insulina estimula a dissociao do GLUT4 de TUG, ambos em adipcitos 3T3-L1 e em msculo. A dissociao ocorre rapidamente, e precede a translocao em adipcitos 3T3-L1. Mais importante ainda, o nmero de complexos TUG-GLUT4 que dissociam controla o nmero de protenas GLUT que so translocadas rapidamente com a adio de insulina, a isso aparece como um estouro inicial na superfcie da clula. Essa combinao de dados bioqumicos e cinticos inicialmente sugeriu que TUG controla um piscina de IRV, que aumentada em clulas que superexpressam TUG e extrada em clulas que contm o fragmento negativo dominante UBXCter. Esses achados indicam um modelo em que a insulina desencadeia uma desmontagem do complexo TUG-GLUT4 para mobilizar IRVs. TUG contm um domnio UBC bem como uma regio N-terminal parecida com ubiquitina. Domnios UBX so conhecidos por ligar p96/VCP/cdc48,

uma ATPase que possui diversos papis celulares. Alguns cofatores recrutam atividade p97 para regular fuso de membrana homotpica. Outros cofatores recrutam atividade p97 para vias de degradao de protena dependente de ubiquitina, incluindo degradao associada ao retculo endoplasmtico. Em ambos exemplos, acredita-se que p97 promove a desmontagem de complexos proteicos, e isso pode visar um componente de complexo ao proteassomo para degradao. Trabalhos recentes acham que uma pequena frao de TUG passa por clivagem endoproteoltica especfica, e essa clivagem necessria para que a insulina mobilize os IRVs. P97 pode participar nesse processo extraindo um produto da clivagem e visando-o para degradao proteassomal. Independente desse mecanismo preciso, atraente considerar a possibilidade de que p97 possa facilitar a desmontagem estimulada por insulina de um complexo TUG-GLUT4 para liberar GLUT4. Outras protenas que funcionam em modificao parecida com ubiquitina tm sido implicadas em regulao de IRV. Ubc9, uma enzima que conjuga SUMO, liga GLUT4 e provavelmente controla o seu trfego atravs de IRVs. Efeitos de depleo de Ubc9 mediada por RNAi foram recuperados por um mutante cataliticamente inativo, bem como pela protena wildtype (normal imutada). Assim ainda no certo se a modificao de SUMO est envolvida na regulao de IRV, e pode ser que Ubc9 funciona apenas como um andaime. Daxx outra protena que se liga a SUMO e alvo de sumoilao, que liga uma sequncia C-terminal do GLUT4 que necessria para o seu acmulo em IRVs. Contudo, nenhum papel funcional de Daxx no trfego de GLUT4 tem sido visto. Se Ubc9 e Daxx cooperam com TUG e p97 ainda precisa ser visto. A ideia de que insulina libera IRVs ao desmontar um complexo de protenas se encaixa bem com anlises de mobilizao do GLUT4. A insulina foi proposta para recrutar IRVs via de reciclagem da superfcie celular por um mecanismo de liberao quntica, em que concentraes mais altas de insulina liberam fraes maiores de GLUT4 sequestrado. Os IRVs so aparentemente mobilizados aleatoriamente, embora ainda no esteja claro qual etapa est limitando quando as concentraes de insulina so submximas. Vias distintas de sinalizao de insulina podem

ser responsveis pela imobilizao de IRV e pela fuso na membrana plasmtica, e alguns dados sugerem que a imobilizao de IRV independente de Akt e fosfatidilinositol-3-quinase. Essa ideia combina com trabalhos que mostram que em estados resistentes insulina, a translocao reduzida de GLUT4 pode ocorrer sem nenhuma reduo em sinalizao atravs de Akt para AS160/TBC1D4. Possivelmente, a sinalizao por TC10 exigida para mobilizar IRVs, e a ativao de Akt exigida em um estgio posterior na translocao. Finalmente, no se sabe se GLUT4 endocitosado segue o mesmo itinerrio na ausncia e presena estvel de insulina. Certamente, deve ser destinado a IRVs para sequestrao em clulas no estimuladas, e esses IRVs so mobilizados com a estimulao inicial da insulina. Ainda assim, a insulina modula o mecanismo endoctico, e altera a atividade de protenas Rab especficas. Logo, pode ser que o GLUT4 que endocitosado durante a presena continuada de insulina evite o compartimento de IRV totalmente, e retorne diretamente membrana plasmtica a partir de endossomos. Trabalhos futuros so necessrios para esclarecer esse momento. Concluses Esse sumrio enfatiza aspectos selecionadas do trfego de GLUT4 regulado por insulina. Muito trabalho importante acerca da sinalizao de insulina, modulao da atividade Rab, e fuso de vesculas na membrana plasmtica, no foi abrangido. Ser interessante aprender quais aspectos de trfego de GLUT4 so comprometidos na fixao da resistncia a insulina, e se esses processos podem contribuir para a patognese de diabetes tipo 2. Adicionalmente, os mecanismos que esto envolvidos no recrutamento de IRV, biognese, reteno e liberao, podem ser adaptados para controlar vrias outras protenas da membrana em outros tecidos. Assim, trabalhos futuros podem indicar paralelos entre processos fisiolgicos distintos que compartilham mecanismos moleculares iguais.

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