Pessoal, tudo que tiver de negrito pensamento meu. Palavras minhas. Nada a ver com o que os autores escreveram.

. Sugiro que vocs imprimam uma cpia de cada pagina do artigo e acompanhem. Como eu j alertei, a pagina 3683 est faltando, e sim, ela vai fazer falta pra vocs. Existem certas coisas a no texto que no d pra eu colocar aqui, como por exemplo, 10 elevado a menos oito. A bom que vocs tenham em mos os originais na hora de estudar para entender exatamente os dados que eles estavam colocando. Obedeci a estrutura do texto pra ficar fcil vocs se localizarem. Tem muitas palavras a que eu nem conhecia, espero que vocs que so da rea conheam. Por exemplo: acilao que a transformao de uma substncia em cido. Qualquer duvida: (87) 99545958 A correlao da dependncia do pH e o mecanismo por passos de aquimotripsina - reaes catalisadas

A dependncia do pH da acilao da a-quimotripsina por acetato de pnitrofenil, e da hidrlise catalisada por a-quimotripsina de amido N-acetil-Ltriptofano, amido N-acetil-L-fenilalanina e N-acetil-L- ster etlico de triptofano foram determinados. A acilao da a-quimotripsina por pnitrofenil acetato apresenta um perfil em forma de campnula pH-k2, indicando que a reao dependente de dois grupos ionizveis, um cido de pKa9 e uma base de pKa7. A desacilao das vrias acil-a-quimotripsina exibe um perfil de pH-2 sigmoide, indicando que a reao dependente de um grupo ionizvel, uma base de pKa~ 7. Os perfis de pH-Keat da hidrlise catalisada a-quimotripsina dos dois substratos especficos de amida acima citados, cuja constante de velocidade cataltica tem sido postulada a ser determinada apenas por meio de acilao, K2, est previsto para que nesta base se exponham as curvas em forma de sino; isto encontrado experimentalmente. Os perfis de pH-Keat da hidrlise catalisada aquimotripsina do substrato ster especfico acima mencionado, cuja constante de velocidade cataltica postulada para ser determinada por desacilao, k1, a pH 7, previsto que nesta base se exiba uma curva sigmoide para pH elevado, em determinado ponto em que h uma alterao no passo determinante da taxa, est previsto que esta curva sigmoide mude para uma curva em forma de campnula (sino), este comportamento encontrado experimentalmente e pode ser quantitativamente montado por um dado sistema. Assim, todas as dependncias de pH de substratos especficos so consistentes com o mecanismo de passo a passo da reao envolvendo um intermedirio acil-enzima. Os efeitos do xido de deutrio nas hidrlises catalisadas a-quimotripsina de n-acetil-ltryptophanamide e n-acetil-L-triptofano ster etlico foram determinados. Como os encontrados nas hidrlises de substratos no especficos, um efeito isotpico cintico do xido de deutrio (kH2O/kD1O) de 2-3 encontrada, o efeito istopo sendo ligeiramente superior quando Keat

reflete desacilao (ster etlico) do que quando Keat refete acilao (amida). Um efeito isotpico de equilbrio encontra-se tambm no pKa de um dos grupos em que as reaes enzimticas so dependentes de ser 0,5 + ou- 0,2 unidades de pKa maiores do que no xido de deutrio em gua. Estes efeitos isotpicos so atribudos ao envolvimento de uma transferncia de prtons, em determinar a taxa de etapas da catlise enzimtica.

Introduo O mecanismo de passo a passo das reaes da a-quimotripsina mostrado na eq. 1 conduz possibilidade de que mais do que uma dependncia de pH pode ser vista, dependendo da taxa :

(Equao 1)

a etapa determinante da reao e na dependncia do pH dos passos individuais. Uma anlise dos dados fragmentrios da literatura sobre as hidrlises catalisadas de a-quimotripsina de substratos especficos de ster e amido indicam que mais que uma dependncia de PH podem ser observadas de fato. A dependncia de PH da desacilao, k3, de acil-aquimotripsina j foi detalhada anteriormente. Eles fizeram isso o artigo todo. Dizem que j foi falado anteriormente e do a referncia bibliogrfica no rodap da pagina. Contudo, ns investigamos a dependncia de pH de um discreto passo a acilao, a acilao da aquimotripsina por p-nitrofenil acetato, e a dependncia do pH na hidrolise catalisada a-quimotripsina de dois substratos especficos de amido, amido N-fenilanina e amido N-acetil-L-fenilanina, cujo passo de taxa determinante foi anteriormente postulado para ser acilao, e um substrato de ster especfico, ster etlico N-acetil-L-triptofan, que tem taxa determinante previamente postulada para ser desacilao. A dependncia do pH de um passo discreto da acilao, K2, dar uma medida direta do equilbrio prototrpico cineticamente importante de ES; k2 encontrado aqui para ser dependente em dois grupos ionizveis, um acido e uma base. A dependncia do pH de k2/Ks dar uma medida direta do equilbrio prototrpico cineticamente importante do E; K2/Ks encontrado aqui para ser dependente em dois grupos, um acido e uma base, similarmente a K2. A dependncia do pH da etapa de desacilao discreta, K8, dar uma medida direta do equilbrio prototrpico cineticamente importante de ES; K8 foi previamente encontrada como sendo dependente de um grupo ionizvel, uma base.

Com base nos fatos acima, uma elaborao mnima da eq. 1 pode ser proposta para levar em conta os efeitos do PH em cada uma das partes constituintes da reao. (equao 2) A equao 2 conduz diretamente para as dependncias de pH de Ks, k2, e k8 dado nas eq. 3-5 (equao 3) (equao 4) (equao 5) Essas equaes so bastante parecidas com aquelas dadas anteriormente para processos similares, com exceo que aqui, apenas uma ionizao prototrpica dada por ES, enquanto que essas duas ionizaes so postuladas para Es e E. A dependncia do pH da reao de um determinado substrato em que a etapa taxa determinante exclusivamente para acilao, poderia ser a da etapa de acilao discreta, isto , um perfil pH-keat em forma de campnula. De forma similar, a dependncia do pH da reao de um substrato especfico em que a etapa taxa determinante pra ser exclusivamente desacilao, poderia ser um etapa da desacilao discreta, isto , um peril pH-keat sigmoide. Contudo, em regra geral, uma proviso deve ser feita para uma mudana com pH na etapa taxa determinante. Isso pode ser feito usando as equaes 6 e 7 , que foram mostradas pertencendo a equao 1 em conjuno com a 3, 4 e 5. (equao 6) (equao 7) Uma parte de Vmax/km(app) com pH (ou Keat/km(app) vs. pH) ele fala aqui como se fizesse uma analogia da frmula fsica de velocidade mdia. Enfim, acho que alguma coisa a ver com as constantes k de velocidade de reao que vocs estudam produz as constantes de dissociao das enzimas livres, independentemente do numero de intermedirios no sistema, e por isso, para uma enzima que catalisa a reao de diversos substratos, a dependncia de pH de Keat/Km(app) deve ser o mesmo, desde que todos os substratos interajam com os mesmos grupos de enzimas. Essas concluses podem ser vistas nas equaes trs e quatro. O quociente da equao quatro divida pela equao trs, (e o da 6/7) d K2/K8= Keat/Km(app) (equao 8) Ento as equaes 8, 4 e 5 do as dependncias de pH das enzimas livres, substrato complexo enzimtico, e acil-enzimas respectivamente. As dependncias de pH so vistas dessas equaes para ser curva em forma de sino, curva em forma de sino e uma curva sigmoide, respectivamente.

dentro deste contexto que a dependncia de Ph das reaes catalisadas aquimotripsina sero discutidas. Como um adjunto aos estudos de taxa de pH de perfis constantes de hidrolise catalisada de a-quimotripsina de substratos especficos, ns tambm investigamos a taxa de pD de perfis constantes de hidrolise de dois substratos especficos, amido N-acetil-L-triptofano e ster etlico N-acetil-Ltriptofano. Os efeitos do xido de deutrio nos perfis desses substratos especficos suplementam investigaes anteriores com substratos no especficos sobre a participao de uma transferncia de prton na taxa determinante em reaes a-quimotripsina. Experimento Materiais a-quimotripsina era um produto Worthington trs vezes cristalizado. Solues enzimticas eram feitas em acetato ou em tampes de fosfato; eles eram centrifugados por 30 min. em 15000 rpm e sua normalidade foi determinada por titulao espectrofotomtrica com N-transcinamoil imidazole a 335 mu b. olhem na original essas medidas, pq num d pra fazer aqui no. N-trans-cinamoil imidazole foi recristalizado de n-hexano imediatamente antes do uso; m.p. 134.0-134.5. A enzima trs vezes cristalizada da Worthington deu um valor de titulao de cerca de 70-85% do que calculado na base do peso, assumindo um mol. Wt. De 24800. Acetato de p-Nitrofenil, foi anteriormente descrito. ster etlico N-acetil-L-triptofano tem sido descrito agora. Amido N-acetil-Ltriptofano era um produto da Mann Biochemicals Co.; ele foi recristalizado do ster-metanol-hexano. Amido N-acetil-L-fenilanina era um produto da Cyclo Chemical Corp. recristalizado uma vez da gua e uma vez da acetona. Acetato, fosfato, Tris termologia deles, no d pra saber o que :/- e tampes de carbonato foram preparados de gua bidestilada e produtos de analise de grau de reao. Acetonitrila (gral espectral de Bastman Kodak) foi destilado em pentxido de fsforo. O xido de deutrio era da General Dynamics Corp. Batch XX (>99,05%). A Soluo de deutrio clordrico em xido de deutrio foi amavelmente preparada pelo Dr. E. Euranto de acordo com Holmberg. Os tampes no xido de deutrio foram preparados pela dissoluo de hidrogenofosfato dissdico slido seco, fosfato di-hidrofosfato de potssio, no sei como se chamariam essas substncias pela nomenclatura que ns temos, mas d pra entender n? Di-hidrofosfato de potssio = Um fosfato, dois hidrognios e potssio. Carbonato de sdio, e hidrocarbonato de sdio em xido de deutrio, mantendo a quantidade de hidrognio introduzido nas solues abaixo de 1%. Para os experimentos em xido de deutrio, o estoque de soluo enzimtica tambm foi obtido de xido de deutrio. O pH (pD) de todas as reaes foi determinado imediatamente depois da reao utilizando um medidor de pH Radimetro 4c. Medies Cinticas: a cintica da hidrlise catalisada de a-quimotripsina do amido N-acetil-L-triptofano e ster etlico N-acetil-L-triptofano, em gua ou

deutrio foi determinada espectrofotometricamente usando uma Cary 14 PM, equipamento espectrofotmetro de gravao com um compartimento com clula termostato. A observncia da lei de Beer foi checada e as iniciais e infinitas observncias foram usadas pra checar a estequiometria da reao. Para o amido N-acetil-L-triptofano, uma alquota de 200 a 500 ul de uma soluo enzimtica concentrada foi adicionada a 3 ml de substrato no tampo apropriado, previamente equilibrado no compartimento-clula do espectrofotmetro. O compartimento de referencia do espectrofotmetro manteve duas clulas juntas, uma contendo 3 ml de substrato, mais uma alquota de 200 a 500 ul de tampo, e outra contendo 3 ml de tampo mais a alquota apropriada de enzima. Dessa maneira foi possvel deixar em branco Ca 3 unidades de absorvncia do fundo e medir as taxas inicias de reao usando o fio de slides de 0 a 0.1 do espectrofotmetro de Cary pela seguinte diminuio de absorvncia em 306 mu pra a transformao de amido em cido, De (seria delta e) = 73.8%, uma mdia de seis determinaes. As cinticas das hidrlises de ster etlico N-acetil-L-triptofano foi descrita. A extino do coeficiente para a transformao de ster para cido carboxlico tem uma dependncia de pH abaixo do pH 5, diminuindo a medida que o acido carboxlico se torna protonado, de modo que a um pH de 3.12 e 2.52 a diferena do coeficiente de extino 65 e 28 respectivamente, pequenos valores que diminuem consideravelmente o erro experimental das taxas constantes nesses pHs. As cinticas das hidrolises do acetato p-nitrofenil foi acompanhada espectrofotometricamente em ambos os espectrofotmetros de gravao Cary 14 PM e o espectrofotmetro foi equipado com um dispositivo misturador stopped-flow, como descrito anteriormente. As cinticas das hidrlises do amido N-acetil-L-fenilanina foi acompanhada espectrofotometricamente usando o reagente Nessler para a determinao da quantidade de amnia liberada. Uma vez que na determinao da dependncia de pH de vrias hidrolises catalisadas a-quimotripsina, ns estvamos interessados em investigar com uma gama de pH to ampla quanto possvel, isso foi obrigatrio pra podermos determinar a estabilidade da enzima ao longo do campo do pH. Em solues acidas, solues reserva de a-quimotripsina da ordem de 10- M so estveis, como determinado pela titulao com N-trans-cinamoil imidazole, por vrias semanas, e assim o problema de desnaturao na temperatura da sala nessa regio de pH desprezvel. Acima do pH 6 a taxa de desnaturao de a-quimotripsina comea a acabar e estudos foram feitos dessas taxas na inteno de determinar em qual regio do pH ns (figura 1)

poderamos observar as cinticas de hidrlises sem as complicaes da desnaturao irreversvel. Em investigaes anteriores, usando um ensaio de taxa de um ster etlico N-acetil-L-tirosina, foi constatado que a taxa de desnaturao diminuiu drasticamente com uma pequena indicao mnima de pH 9.5, e alm do que a taxa de desnaturao era dependente do tampo. Na presente investigao, a taxa de desnaturao irreversvel foi determinada por titulao espectrofotomtrica dos lugares ativos da enzima com N-trans-cinamoil imidazole, depois de removidas as alquotas da mistura reagente e dilu-las em um tampo de acetato de pH 5.05, onde algumas enzimas reversivelmente desnaturadas foram reativadas. Mais desnaturaes foram estudadas cineticamente a a 50% da reao, onde comeou a ocorrer precipitao. Os dados mostrados na figura 1 no so compreensveis, mas servem para ilustrar as cinticas de desnaturao dentro de condies da presente reao de hidrlise. Diversas concluses interessantes podem ser tiradas desse trabalho. Em um pH de 6.9 a taxa de desnaturao irreversvel de primeira ordem em concentrao enzimtica desde a meia vida de desnaturao independente da concentrao enzimtica de 8.9 106 9 X 10- M. Embora desnaturao irreversvel geralmente descrita como uma autlise envolvendo a clivagem de ligaes peptdicas das enzimas, a cintica de primeira ordem, o ponto mximo na figura 1 e o valor absoluto do mnimo indicam que a reao hidroltica no est sendo observado, mas sim a taxa determinante de desnaturao reversvel seguido por uma rpida reao hidroltica. Embora no seja possvel caracterizar o processo de desnaturao irreversvel com esse experimento, especialmente efeitos de sal ou tampo no foram investigados em detalhe, os resultados indicam que a desnaturao em pH 11.5 no mais rpida que em 8.5, tornando possvel determinar a cintica das reaes catalisadas a-quimotripsina at cerca do pH 12. Em todos os experimentos cinticos em pH alto, taxas iniciais foram determinadas, e o tempo de observao dessas taxas iniciais tambm foram reguladas, ento temos que: menos que 2% de desnaturao, e na maioria dos casos menos que 1% de desnaturao ocorreu. Resultados A dependncia de pH da acilao de a-quimotripsina por acetato de pnitrofenil. A dependncia de pH nessa reao j foi investigada pelo menos quatro vezes. Em todas as investigaes anteriores, evidencias para um perfil de taxa sigmoide de pH constante foi obtido o que indicava a importncia da cintica de um nico grupo bsico de pKs 6.22 elevado a 85, 6.7 a 28, 7.0 a 27 e 7.14 a 18. Enquanto que em investigaes anteriores a cintica no foi determinada acima do pH 7.8, nesse estudo, a cintica de acilao foi determinada do pH de 4.18 at 9.98 objetivando determinar se o perfil de pH K2 de curva sigmoide ou em forma de sino. Expliquem-me pra qu estudar desse tanto pra entender se uma reao apresenta

num grfico um desenho de um jeito ou um desenho de outro jeito?! E quando acabar o maluco sou eu. Duas abordagens cinticas foram usadas. A primeira, usando a tcnica stopped-flow, permite determinar a cintica de k2 e Ks separadamente, como definido na equao 9 (equao 9) Esses experimentos foram realizados com [E]o<<[S]o, como descrito anteriormente. Em um dado pH, as constantes de acilao aparentes de primeira ordem, Keap, foram calculadas usando pelo menos dois dos trs mtodos descritos anteriormente e bons resultados sempre foram obtidos. De Keap, K2 e Ks foram calculados de um dado pH usando parcelas de Lineweaver Burk e o mtodo de quadrados mnimos. A tabela 1 sumariza o documento: (tabela 1) A segunda abordagem cintica envolve o uso de cinticas de segunda ordem com Eo=So<<Ks, (s lembrando: quando tiver formula, olhar a original) de acordo com o mtodo descrito anteriormente. A constante de segunda ordem k2/Ks foi usada pra checar os resultados obtidos do primeiro conjunto de condies, dado diretamente o declive dos rendimentos K2/Ks das partes de Lineweaver-Burk mencionados acima. Em pHs mais elevados, o hidrxido de hidrlises on-catalisadas podem ser levados em conta com o uso da equao 10 (equao 10) As taxas constantes de segunda ordem tambm esto listadas na tabela 1. Figuras 2 e 3 mostram os perfis pH de taxa constante para acilao de aquimotripsina e acetato p-nitrofenil, usando a pura taxa constante de primeira ordem K2, e o Agora seria a pagina 3683 que no tem :S Inicio da pagina 3684 tem a figura, e embaixo traz os valores ae, de informao que precise ser traduzida s diz que no foram observados efeitos da amnia nas taxas iniciais. Ai comea de novo: segundo pargrafo, pagina 3684 A dependncia de pH das hidrlises catalisadas a-quimotripsina de amido Nacetil-L-fenilanina foi determinada. Os valores na tabela III so os valores para o composto L (tabela III) ao pH de 7.92, 8.44 e 9.95, enquanto os valores em outros pHs so valores para o composto DL, que foi corrigido para o composto L usando a relao

(figura 6) Ks/Ki, encontrado graficamente como igual a 2.52 (esse valor se compara favoravelmente com o que foi encontrado por Niemann, 2.4 + ou 0.4). A curva em forma de sino calculada da figura 5 foi determinada de acordo com o mtodo de Alberty, usando os valores de Keat (mximo terico) = 4.76 X 10- sec -, pK1= 6.55 e pK2= 9.23. A dependncia de pH das hidrlises catalisadas a-quimotripsina do ster etlico N-acetil-L-triptofano representado na tabela IV e na figura 6: a curva (B) de pH-Keat um hbrido entre sigmoide e curva em forma de campnula; (tabela IV) a curva (A) de pH-Keat/Km(app) em forma de sino; e a curva (C) pH-Km independente de pH em pH baixo, mas cresce nitidamente quando em pH alto. Os perfis de pH-Keat da hidrlise catalisada de a-quimotripsina, j repeti esse nome tantas vezes, vou colocar s H C Aq