UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO FACULDADE DE ARQUITETURA, ENGENHARIA E TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA SANITRIA E AMBIENTAL

APOSTILA DE MICROBIOLOGIA GERAL: aulas prticas

Responsvel: Profa. Dra. Danila Soares Caixeta Colaboradores: Prof. Dr. Eduardo Beraldo de Morais Profa. Dra. Zoraidy Marques de Lima Rossean Fernandes Golin

CUIAB MT 2011/2

NORMAS DE SEGURANA NO LABORATRIO Para conduzir as aulas prticas no Laboratrio de Microbiologia do Departamento de Engenharia Sanitria e Ambiental imprescindvel que algumas normas sejam seguidas para garantir o bom desempenho e segurana nas atividades laboratoriais

1. Colocar blusas e outros objetos fora da bancada de trabalho. Deixe apenas o material necessrio prtica. 2. O uso de JALECO obrigatrio. 3. No usar chinelos e sandlias, pois, em caso de acidentes, vidrarias e outros equipamentos podem causar srios ferimentos. 4. Lavar bem as mos antes do incio e aps o trmino da aula. 5. Limpar a mesa de trabalho, antes e depois de cada sesso de trabalho, usando desinfetante. Fechar a gua, o gs e desligar o interruptor e tomada do microscpio. 6. O laboratrio deve ser um ambiente calmo. Os alunos devem evitar falar em voz alta e sair, desnecessariamente de seus lugares. 7. inadmissvel qualquer tipo de brincadeira durante as aulas prticas. 8. No comer, beber ou fumar dentro do laboratrio e nem colocar, caneta, papel ou dedos na boca. 9. Proteger o cabelo da chama do bico de Bunsen e de contaminao microbiana. 10. No usar os refrigeradores ou estufas para conservar ou aquecer alimentos. 11. Nunca usar frascos de laboratrio para beber gua. 12. Ser cuidadoso com materiais que possam causar ferimentos na pele, como seringas, pipetas de Pasteur, lminas em geral, dentre outros. 13. Nunca pegue material quente ou substncias qumicas sem luvas adequadas ou garras especiais. 14. Caso uma cultura seja derramada, cobrir o material com desinfetante eficiente, lavar bem as mos com gua e sabo e comunicar o fato imediatamente ao professor. 15. Devem ser registrados os acidentes como o derrame de culturas, ferimentos, etc.

16. No pipetar material txico ou infeccioso com a boca. O trabalho de pipetagem dever ser realizado com o auxlio de ajudantes de pipeta mecnicos. 17. A expulso rpida e violenta do contedo da pipeta pode produzir aerossis; geralmente, no trabalho microbiolgico prefervel movimentao suave e tranqila. 18. As pipetas usadas devem ser colocadas horizontalmente em soluo desinfetante imediatamente aps o uso, antes de esterilizar em autoclave. 19. No cheirar os meios de culturas inoculados. 20. Luvas e mscaras devero ser utilizadas quando necessrio. 21. Todo material contaminado antes de ser lavado, deve passar pelo processo de esterilizao, para que toda a sua flora microbiolgica seja completamente destruda, evitando-se que o mesmo seja uma fonte de contaminao. 22. A autoclave, que um equipamento usado nas atividades rotineiras do laboratrio, deve ser inspecionado e verificado quanto eficincia de esterilizao periodicamente. 23. Descartar todo o material contaminado em recipiente apropriado e esterilizar em autoclave. 24. A ala de platina e agulha utilizadas na manipulao dos micro-organismos devem ser esterilizadas no bico de Bunsen antes e depois de utilizadas. Coloclas sempre em posio vertical no suporte e no sobre a bancada. 24. As lminas e lamnulas usadas devem ser colocadas em recipiente com desinfetante. 25. No manusear objetos no interior da cmera de fluxo laminar com a luz ultravioleta ligada 26. No devolva reagentes ao frasco de origem, nunca retire do frasco mais do que necessrio. Descartar esptulas usadas em locais apropriados

OBSERVAES: No ser permitida a participao de alunos nas aulas prticas, que no cumprirem as normas acima. Sero dados 5 minutos de tolerncia para o incio da atividade prtica, no sendo permitido entrada de alunos retardatrios.

PRTICA 1 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS DE LABORATRIO INTRODUO Os micro-organismos vm evoluindo a aproximadamente 4 bilhes de anos, e at 2 bilhes de anos atrs eram as nicas formas de vida na Terra. Estes compreendem uma definio taxonmica que congrega grupos variados de organismos unicelulares de dimenses microscpicas, que vivem na natureza como clulas isoladas ou em agregados celulares, incluindo os grupos: bactrias, fungos filamentosos e leveduras, protozorias e vrus. O estudo dos micro-organismos est muitas vezes dependente da possibilidade de cultivar e mant-los viveis no laboratrio, sob a forma de cultura pura, no entanto, alguns utenslios, vidrarias e equipamentos so considerados bsicos na rotina de um laboratrio. Dentre os diversos equipamentos necessrios para as atividades, como preparo de meio de cultura, solues, esterilizao de material, manipulao de microorganismos, dentre outras, citam-se microscpio, incubadoras, estufas esterilizadoras, autoclaves, geladeiras, balanas, agitadores, destilador de gua, centrfuga, banhomaria, filtros, vidrarias especficas entre outros materiais.

OBJETIVOS Conhecer materiais, equipamentos e normas do Laboratrio de Microbiologia do Departamento de Engenharia Sanitria e Ambiental-UFMT, para o bom desempenho das aulas prticas.

MATERIAIS

Equipamentos, Utenslios e Vidrarias Agitador, autoclave, balana analtica, cmara de fluxo laminar, contador de colnias, estufa esterilizadora, incubadora ou BOD, microscpio, bico de Bunsen, geladeira, ala de Drigalsky e platina, balo volumtrico, basto de vidro, bquer, estilete, frasco de Erlenmeyer, lmina, lmina escavada, lamnula, pina, pipeta automtica, pipeta de Pasteur, pipetador, placa de Petri, proveta, tubo de cultura, tubo de Durham, cmara de Neubauer.

PROCEDIMENTO Esclarecer minuciosamente as regras estabelecidas no laboratrio. Exibir os materiais e utenslios utilizados nas aulas prticas.

ATIVIDADES 1. Descreva a funo de cada um dos utenslios abaixo. Bico de Bunsen

Cmara de fluxo laminar

Placa de Petri

Tubo de Durham

Ala de Drigalsky e platina

Pipeta de Pasteur

2. Qual a importncia do uso da autoclave, no processo de esterilizao de materiais?

3. Explique o efeito da radiao sobre as clulas microbianas

PRTICA 2 PREPARO DE MEIO DE CULTURA

INTRODUO Todos os organismos vivos necessitam de uma variedade de elementos qumicos como nutrientes, que participam diretamente nas reaes catablicas e anablicas, podendo ser divididos em dois grandes grupos: micronutrientes e macronutrientes. A partir dos conhecimentos dos requerimentos nutricionais, podem ser confeccionados meios que permitem o crescimento in vitro. Algumas bactrias podem crescer normalmente em qualquer meio de cultura, outras necessitam de meios especiais e existem aquelas que no so capazes de crescer em nenhum meio de cultura j desenvolvido. Os micro-organismos que crescem e se multiplicam nos meio de cultura so denominados cultura. Para o crescimento de micro-organismos no laboratrio h uma grande variedade de meios de cultura, podendo ser classificados de acordo com a consistncia em slido, semi-slido e lquido e quanto composio em quimicamente definido e complexo. O meio de cultura dever ser inicialmente estril, para que ocorre o crescimento somente de micro-organismos adicionados. Finalmente, a cultura dever ser incubada a temperatura adequada para o seu crescimento.

OBJETIVOS Preparar os meios de cultura gar sabouraud e gar nutriente. Executar a

esterilizao em autoclave (calor mido) dos meios de cultura

MATERIAIS Provetas, Erlenmeyers, balana, tubos de ensaio, pHmetro, autoclave, microondas, meio de cultivo, esptula, basto de vidro.

PROCEDIMENTO Para preparar os meios de cultura pesar os ingredientes indicados em papel alumnio e colocar em um frasco de erlenmeyer de 1 litro.

gar Nutriente Extrato de carne ............................... 3g Peptona .............................................5g Agar...................................................15 g gua destilada ..................................1000 mL

1. Dissolver os ingredientes. 2. Ajustar o pH para 6,80,2. 3. Esterilizar a 121C/15 min.

gar Sabouraud Peptona ............................................ 10g Dextrose ........................................... 40g gar ................................................. 15g gua destilada ................................. 1000 mL

1. Dissolver os ingredientes em micro-ondas. 2. Ajustar o pH para 5,60,2. 3. Esterilizar a 121C/15 min.

Obs. Existem alguns equivalentes comerciais nos quais estes meios esto prontos para serem utilizados. Neste caso seguir as especificaes do rtulo.

ATIVIDADES 1. Para quais fins utiliza-se o meio de cultura slido, semi-slido e lquido?

2. Por que, algumas vezes, a esterilizao de meios de cultura por calor sob presso, em autoclave, no adequada? Qual seria a alternativa sugerida nesses casos?

3. Cite os cuidados necessrios para que o material no seja contaminado aps os procedimentos de esterilizao.

PRTICA 3 ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS DO AMBIENTE INTRODUO Os micro-organismos podem ser encontrados nos mais variados ambientes, desde que condies favorveis como gua, nutriente e superfcie, sejam disponibilizadas para o crescimento. So transportados por correntes areas desde a superfcie da Terra at as camadas superiores da atmosfera. Os micro-organismos desempenham um papel importante na natureza e em processos tecnolgicos. Dependendo da rea, podem ser indesejveis ou benficos. Na natureza, os micro-organismos apresentam um papel crucial na ciclagem de nutrientes aquticos e terrestres, na biodegradao de poluentes ambientais, no processo de biorremediao, na recuperao de leo, extrao de metais, agricultura e no processo de nodulao de leguminosas, em contrapartida, eles podem ser indesejveis na indstria em mbito global, causando srios problemas de higiene e perdas econmicas, devido a danos em alimentos e equipamentos. Os micro-organismos tm sido relatados ser responsveis por causar doenas em humanas e animais. Os microbiologistas devem estimular e otimizar o desenvolvimento de microorganismos benficos e inibir aqueles que causam doenas ou deterioram os alimentos e o ambiente.

OBJETIVOS Isolar micro-organismos de diferentes ambientes.

MATERIAIS

Meios de cultivo gar nutriente, gar Sabouraud e gua peptonada.

Equipamentos e utenslios Agitador, cmara de fluxo laminar, bico de Bunsen, incubadora, ala de Drigalsky, swab, pipeta, placa de Petri.

PROCEDIMENTO

Para averiguar a presena de micro-organismos no ambiente, utilize placas de Petri com meio de cultivo estril e swab. Exponha placa a condio de inoculao em qualquer ambiente por 15 minutos, ou faa um esfregao com auxlio de um swab, sobre uma superfcie desejvel. Identificar as placas, anotando na tampa tipo de exposio a que foram submetidas e o nmero do grupo. Incubar as placas na posio invertida a 37 C por 2448 horas. Realizar as contagens das colnias diariamente avaliando sua abundncia e diversidade.

ATIVIDADES 1. Qual a utilidade do bico de Bunsen no laboratrio de microbiologia?

PRTICA 4 OBSERVAO MACROSCPICA E MICROSCPICA DOS MICROORGANISMOS

INTRODUO Todas as clulas vivas podem ser classificadas como procariotas, das palavras gregas pro (antes) e Karyon (ncleo), ou eucariticas, de eu (verdadeiro) e Karyon (ncleo). Todos os organismos procariontes so unicelulares, como exemplificado pelas bactrias, enquanto os eucariontes incluem os vegetais, animais, fungos e protistas. De acordo com o grupo a que pertencem, os micro-organismos apresentam dimenses reduzidas e bastante variveis. Os procariotos esto entre os menores organismos, a maioria deles medem de 0,5 e 2,0 m de dimetro e mais de 100 m de comprimento, enquanto que os eucariontes possuem dimetro maior que 10 m e muitos so bem maiores. Em relao s formas, as maiorias das bactrias estudadas seguem um padro menos varivel, embora existam vrios tipos morfolgicos distintos. De maneira geral, as bactrias podem ser agrupadas em trs tipos morfolgicos gerais: esfrica, basto e espiral. As leveduras so normalmente ovais, mas algumas vezes so alongadas ou esfricas. Diferentemente das leveduras unicelulares, os fungos filamentosos so organismos multicelulares que aparecem com filamentos. O corpo, ou talo de um fungo filamentoso, consiste em um miclio e nos esporos latentes. Cada miclio uma massa de filamentos chamada hifa, podendo ser classificadas em cenoctica ou como septadas. Por serem os micro-organismos muito pequenos, estes devem ser observados atravs de microscpios, podendo ser utilizados microscpios pticos, eletrnicos, epifluorescncia, contraste de fase, fora atmica e outros. No entanto, para que os microscpios sejam teis, os espcimes a serem observados devem ser preparados corretamente.

OBJETIVOS Reconhecer e descrever caractersticas de colnias e estruturas de microorganismos. Identificar o grupo ao qual o micro-organismo pertence com base nas caractersticas macro e micromorfolgicas.

Preparar lminas a fresco

MATERIAIS

Micro-organismos Micro-organismos (fungos filamentosos, leveduras e bactrias) crescidos em meio slido, isolados de diferentes ambientes (Prtica 3).

Solues Azul de metileno

Equipamentos e utenslios Microscpio tico, lminas, lamnulas, ala de platina, bico de Bunsen, gua destilada, pipeta de Pauster.

PROCEDIMENTOS 1. A partir das placas da aula anterior selecionar 3 colnias diferentes (escolher colnias que apresentam aspecto filamentoso, cor brilhante e opaca. 2. Com o auxlio de uma ala ou agulha de inoculao, assepticamente, transferir uma pequena poro da cultura para uma lmina de vidro com uma gota de gua. 3. Fixar pelo calor, passando a lmina pela chama do bico de Bunsen por 3 vezes. Adicionar uma gota de azul de metileno sobre o esfregao e cobrir com a lamnula. 4. Examinar ao microscpio tico nas objetivas de 10X, 40X e 100X (colocar olho de imerso), observando forma das clulas/hifas, tamanho relativo, modo e estruturas de reproduo.

OBSERVAES: No levante a platina do microscpio (movimentando o macromtrico) com a objetiva de maior aumento encaixada. Procure o campo onde os organismos esto, utilizando os parafusos de charrior. Terminada a observao, desligue a luz; gire o revolver para encaixa a objetiva de menor aumento, passando pela objetiva de 10x; abaixe a platina e retire a lmina.

Aps a observao, descarte a lmina e a lamnula em locais apropriados com detergente e desinfetante.

ATIVIDADES 1. Examinar macroscopicamente as culturas descrevendo cor, textura, borda, forma, tamanho e brilho da colnia. Esquematizar cada uma delas.

Levedura

Fungo filamentoso

Bactrias

2. Quais so as vantagens e as desvantagens da observao de lminas em preparaes a fresco?

3. No laboratrio, examinando culturas de micro-organismos, como podemos definir se trata de bactria, fungo filamentoso ou levedura?

ANEXO

Figura 1 Microscpio ptico

Figura 2 Morfologia celular de bactrias

Figura 3 Caracterstica das colnias bacterianas (Harley e Prescott; 2002)

Figura 4 Caractersticas morfolgicas de fungos filamentosos evidenciando suas estruturas microscpicas.

Figura 5 Padro morfolgico do gnero Aspergillus (A) e Penicillium(B)

Figura 6 Padro morfolgico de levedura

PRTICA 5 ISOLAMENTO DE BACTRIA EM CULTURA PURA: tcnica de semeadura por esgotamento INTRODUO Em ambiente naturais, os micro-organismos se encontram, em comunidades microbianas. Assim sendo, para que seja possvel estudar as caractersticas das espcies que compem essas comunidades microbianas, necessrio fazer o isolamento e cultivo em cultura pura. Uma cultura pura consiste em micro-organismos geneticamente idnticos, originados a partir de uma nica clula. Para a obteno de culturas puras o mtodo mais comumente utilizado o mtodo de semeadura por esgotamento. A metodologia de semeadura por esgotamento pode se aplicada com sucesso para o isolamento de organismos presentes em grandes nmeros relativos populao microbiana.

OBJETIVOS Obter cultura pura pelo mtodo de semeadura por esgotamento, produzindo estrias simples e compostas.

MATERIAIS Placa Petri contendo meio de cultura slido (gar Nutriente), ala de platina, cultura de micro-organismos, bico de Bunsen.

PROCEDIMENTOS 1. Escolher entre os micro-organismos isolados, uma colnia de bactria. 2. Realizar o trabalho prximo ao bico de Bunsen, adotando procedimentos que evitem a contaminao. 3. Esterilizar a ala de platina na chama e esfri-la. 4. Com a ala carregada, realizar estrias (simples e composta) na placa contendo gar Nutriente. 5. Flambe a ala novamente, deixe-a esfriar 6. Incubar as placas em posio invertida a 37 C por 24-48 horas. Observe o isolamento de colnias isoladas.

ATIVIDADES 1. Qual a diferena entre culturas mistas, puras e axnicas?

2. Por que os meios slidos so preferidos para o isolamento dos microorganismos?

3. Esquematize os mtodos de esgotamento por estrias simples e composta.

ANEXO

1. Segure a ala de inoculao como na figura

2. Esterilize a ala de repicagem, deixe-a esfriar

3. Transfira a suspenso bacteriana contida na ala de repicagem para a superfcie do meio de cultura, espalhando conforme uma das tcnicas: estria simples e estria composta.

4. 4. Espalhar o inculo na rea A e estriar em direo a B. Repetir o processo de B para C.

PRTICA 6 COLORAO DIFERENCIAL: Gram INTRODUO Em microbiologia, so utilizados dois tipos principais de colorao: colorao simples e colorao diferencial. Na colorao simples utiliza um nico corante e revela os formatos bsicos das clulas e seus arranjos. Por outro lado, a colorao diferencial utiliza dois ou mais corantes e diferencia dois tipos de organismos ou partes diferentes de um mesmo organismo. A colorao de Gram, provavelmente a colorao diferencial que mais tem sido utilizada, foi desenvolvida pelo mdico dinamarqus Hans Christian Gram em 1884. Durante a colorao de Gram, as clulas so tratadas com cristal violeta (corante primrio) e em seguida com uma soluo de iodo (mordente), resultando na formao de um complexo cristal violeta-iodo (CVI) dentro da clula. Quando uma bactria Gram-negativa tratada com etanol, o lipdeo na membrana dissolvido e removido. Isso rompe a membrana externa e aumenta sua permeabilidade. Assim, o CVI pode ser removido, descorando a clula que pode ento ser tingida com o corante safranina. Em bactrias Gram-positiva, o etanol faz com que os poros no peptideoglicano se contraiam, e o CVI permanece no interior da clula.

OBJETIVOS Realizar a tcnica de colorao de Gram para o exame microscpico, diferindo as bactrias de acordo com sua resposta a colorao de Gram.

MATERIAIS Micro-organismos Cultura de bactrias em meio lquido ou slido crescidas por 24 horas.

Meios e solues gua destilada, cristal violeta, lugol, lcool, fucsina ou safranina, leo de imerso.

Equipamentos e utenslios Microscpio tico, lminas, ala de repicagem, bico de Bunsen, bandejas e suporte para lminas.

PROCEDIMENTO Limpe bem uma lmina com papel, flambe-a com o bico de Bunsen e deixe-a esfriar a temperatura ambiente. Esterilize a ala de repicagem, aquecendo-a ao rubro no bico de Bunsen. Transfira assepticamente com a ala de repicagem uma gota da cultura de bactria do meio lquido ou slido, para o centro da lmina. Se a cultura estiver em meio slido, coloque uma gota de gua destilada sobre a lmina e colete o material, e adicione na gota pr existente. Prepare o esfregao, espalhando a suspenso com a ala de repicagem; Fixe o esfregao por trs vezes. Deixe a lmina esfriar. Inicie a colorao de Gram, sempre respeitando o tempo indicado para cada reagente. Cubra o esfregao com cristal violeta (1 minuto), em seguida, lave com gua destilada (evite jato de gua muito forte sobre o esfregao, para no desprendlo). Cubra com soluo de lugol (1 minuto). Lave com gua destilada. Lave a lmina com etanol 95%, rapidamente, at que no desprenda mais corante da preparao. Lave o excesso de gua com lcool. Cubra o esfregao com soluo safranina ou fucsina (30 segundos) Lave a lmina com gua e deixe-a secar ao ar. Manuseie corretamente o microscpio tico. Focalize o material corado, sequencialmente, com as objetivas de 4X, 10X, 40 X. Trave o microscpio, adicione uma gota de leo de imerso sobre o esfregao e visualize com a objetiva de 100X, usando o micromtrico. Terminada a observao, desligue a luz, gire o revolver para encaixar a objetiva de menor aumento, passando pela objetiva de 10X, abaixe a platina e retire a lmina. Aps a observao, descarte a lmina e a lamnula em locais apropriados.

OBSERVAO: Limpar as lentes das objetivas com ter.

ATIVIDADES 1. Desenhe os campos observados, fazendo distino entre a forma, arranjo das bactrias e cor predominante.

Bactria 1

Bactria 2

2. Por que a colorao de Gram importante em microbiologia?

3. D exemplos de outras tcnicas de colorao diferencial, alm da colorao de Gram.

PRTICA 7 ISOLAMENTO DE FUNGOS FILAMENTOSOS INTRODUO Os micro-organismos normalmente crescem em complexas populaes, as quais so encontrados em solo, guas, ar, alimentos, serragem e na superfcie de qualquer lugar. Os fungos terrestres so as espcies mais conhecidas entre os fungos. Ente grupo inclui leveduras e fungos filamentosos. Todos caracterizam pela nutrio atravs da absoro e com exceo das leveduras (geralmente unicelulares), a maioria produz um miclio bem desenvolvido constitudo de hifas septadas ou cenocticas. Como saprfitos, degradam a matria orgnica transformando-a em formas qumicas simples que retornam ao solo. Por outro lado, podem causar a deteriorao de alimentos, tecidos vegetais e ambientes. Como parasitas, causam doenas em vegetais e animais, inclusive no homem. Os fungos podem atuar ainda em associaes simbiticas de grande importncia, como as associaes com outros organismos, tais como as algas, formando os lquens, ou com razes de plantas, formando as micorrizas. Para o estudo de uma determinada espcie necessrio separ-la da populao mista. Os mtodos usados para o isolamento de fungos e seu cultivo dependem muito do seu habitat natural. Geralmente, empregam-se meios slidos acidificados, com pH em torno de 4 a 5, com o objetivo de inibir o crescimento de bactrias. Nos ltimos anos, o desenvolvimento de novos meios de cultura e novas tcnicas de isolamento, deteco e enumerao de fungos tm-se aperfeioado muito no mbito internacional, sendo, entretanto, muito pouco explorados no Brasil, at o momento.

OBJETIVOS Isolar fungos de diferentes ambientes e preparar lminas a partir de cultura pura.

PROCEDIMENTO Amostras Frutas e vegetais em decomposio, cogumelos, material vegetal contaminado com fungos fitopatognicos.

Meios e solues gar Sabouraud, azul de metileno e leo de imerso.

Equipamentos e utenslios Incubadora, pina, placas de Petri com gar sabouraud, ala de platina e/ou agulha de inoculao, estilete, papel absorvente.

PROCEDIMENTO Isolamento de fungos filamentosos saprfitas a partir de material vegetal em decomposio: Recolher com ala de platina e/ou agulha de inoculao esporos ou miclio de fungos contaminando alimentos ou outros materiais em decomposio. Fazer trs pontos no centro da placa de gar Sabouraud. Identificar as placas colocando o nome da amostra e grupo. Incubar a 25 C por 7 dias ou at a formao visvel de colnias.

Isolamento de fungo saprfita a partir do corpo de frutificao (cogumelo) Lavar bem o cogumelo em gua corrente e deixar escorrer o excesso de gua em papel absorvente limpo. Molhar a pina no lcool, passar pela chama e esperar at que todo o lcool se queime. Abrir o cogumelo e, do interior, retirar uma pequena poro do pseudotecido com auxlio de uma pina. Transferir o fragmento do cogumelo para uma placa com gar Sabouraud (colocar em cada placa 4 fragmentos bem separados uns dos outros). Incubar a 25 C por 7 dias ou at a formao visvel de colnias.

Preparo de lminas e visualizao em microscpio tico Retirar o bloco de gar com o fungo desenvolvido. Transferir para a lmina e adicionar o azul de metileno. Cobrir com lamnula e esmagar o bloco Observar no microscpio. Manuseie corretamente o microscpio tico. Focalize o material corado, sequencialmente, com as objetivas de 4X, 10X, 40 X. Trave o microscpio, adicione uma gota de leo de imerso sobre o esfregao e visualize com a objetiva de 100X, usando o micromtrico.

 Terminada a observao, desligue a luz, gire o revolver para encaixar a objetiva de menor aumento, passando pela objetiva de 10X, abaixe a platina e retire a lmina. Aps a observao, descarte a lmina e a lamnula em locais apropriados.

OBSERVAO: Limpar as lentes das objetivas com ter.

ATIVIDADES 1. Avalie o crescimento de fungos nos meios utilizados e esquematize as colnias fngicas encontradas.

Saprfita

Cogumelo

2. Esquematize as estruturas dos fungos

PRTICA 8 CONTAGEM PADRO EM PLACA: Spread plate

INTRODUO O mtodo de contagem em placa a tcnica mais utilizada na determinao do tamanho de uma populao bacteriana. A grande vantagem deste mtodo que as clulas viveis so qualificadas. Em contra partida, a desvantagem pode ser o tempo, em geral 24 horas, para o aparecimento visvel de colnias na placa. Na realizao do mtodo de contagem em placa essencial que somente um nmero limitado de colnias cresa em cada placa. Normalmente, somente sero analisadas para contagem, as placas que contem entre 30 e 300 colnias. Quando essa tcnica utilizada, deve-se utilizar o mtodo de diluio seriada para garantir que o nmero de colnias na placa permanea na faixa desejada. Na diluio seriada o inculo diludo em uma srie de tubos de diluio, onde cada tubo subseqente conter um dcimo do nmero de bactrias presentes na anterior. Posteriormente, as amostras destes tubos sero transferidas para placas de Petri contendo meio de cultura onde ocorrer o crescimento das colnias e a contagem. Existem duas metodologias para se realizar a contagem de bactrias em placa: mtodo de espalhamento em superfcie (spread plate) ou mtodo de espalhamento em profundidade (pour plate). No mtodo de espalhamento em superfcie, 0,1 mL da diluio bacteriana adicionado a superfcie do meio contendo gar j solidificado. O inculo ento, espalhado uniformemente na superfcie por meio de um basto de vidro especial (ala de Drigalsky). Nesse mtodo, as colnias crescem somente na superfcie do meio e no entram em contato com o gar fundido, permitindo identificar e observar caractersticas da colnia.

OBJETIVOS Identificar micro-organismos presentes em amostras de leite utilizando como metodologia a tcnica de plaqueamento em superfcie.

AMOSTRA Amostra de leite obtida no mercado de Cuiab.

EQUIPAMENTOS E UTENSLIOS Placas de Petri com meios de cultivo (gar nutriente), tubos de diluio (gua peptonada), bico de Bunsen, pipetas, pipetadores, ala de Drigalski.

PROCEDIMENTO Marque os tubos de diluio presentes na estante com os valores da diluio (101

, 10-2, 10-3, etc. As diluies que sero utilizadas dependero da natureza da

amostra). Faa o mesmo com as placas de Petri. Faa duplicata de cada placa. Agite bem o material recebido (amostra), retire 1,0 mL com pipeta esterilizada e transfira para o tubo marcado 10-1. Agite-o. A partir do tubo 10-1 transfira 1,0 mL utilizando pipeta esterilizada para o tubo marca 10-2. Agite. Repita este procedimento at atingir a diluio necessria. Coloque cuidadosamente 0,1 mL da suspenso do tubo marcado 10-2, aps agitlo, no centro das placas marcadas com esta diluio (Anexo). Espalhe bem o material presente em ambas as placas, utilizando a ala de Drigalski. Para tanto, a ala (que deve permanecer mergulhada em lcool) deve ser flambada e depois esfriada antes de entrar em contato com o material a ser espalhado. Repita o procedimento para os demais tubos de diluio (10 -3 e 10-4). As placas devero ser incubadas a 37 C por 48 horas. Conte as colnias nas placas cujo nmero esteja entre 30-300. Calcule a mdia das duplicatas e registre como UFC (unidades formadoras de colnias)/mL.

Clculo e expresso dos resultados UFC/mL = n colnias x inverso da diluio = UFC/mL Inculo

ATIVIDADES 1. Cite as vantagens de utilizar a tcnica de espalhamento em superfcie.

2. Esquematize o processo de diluio e plaqueamento em superfcie

3. Expresse os valores encontrados nas placas selecionadas (30 a 300 colnias)

ANEXO

Figura 1 Plaqueamento em superfcie (Harley e Prescott, 2002)

PRTICA 9 CONTAGEM PADRO EM PLACA: Pour plate INTRODUO No mtodo de plaqueamento em profundidade (pour plate), 1,0 mL da diluio bacteriana inoculado diretamente na placa de Petri. O meio de cultivo, mantido em banho-maria a 50 C vertido sobre a amostra, que ser misturada, agitando-se suavemente a placa. Aps a solidificao do gar a placa incubada na temperatura de crescimento das bactrias. Esta metodologia permite o crescimento das colnias dentro e na superfcie da placa de gar. Bactrias sensveis ao calor so destrudas durante a solidificao do gar, no formando colnias; essa metodologia tem ainda a desvantagem de no ser aplicvel em mtodos diagnsticos, ou seja, quando caracterstica na superfcie do meio. necessrio identificar uma colnia

OBJETIVOS Analisar a qualidade da gua obtidas de diferentes residncias na cidade de Cuiab-MT, aplicando a tcnica de espalhamento em profundidade (pour plate).

MATERIAIS E UTENSLIOS Placas de Petri, gar nutriente, tubos de diluio (gua peptonada), bico de Bunsen, pipetas, pipetadores, ala de Drigalski, frascos de coleta de gua, tiossulfato de sdio 10%, banho-maria a 50C.

PROCEDIMENTOS Recolher a gua seguindo os procedimentos de coleta (Anexo). Adicion-la ao frasco contendo 0,1 mL de tiossulfato de sdio 10%. Marque os tubos de diluio presentes na estante com os valores da diluio (101

, 10-2, 10-3, etc. As diluies que sero utilizadas dependero da natureza da

amostra). Faa o mesmo com as placas de Petri. Faa duplicata de cada placa.

 Agite bem o material recebido (amostra), retire 1,0 mL com pipeta esterilizada e transfira para o tubo marcado 10-1. Agite-o. A partir do tubo 10-1 transfira 1,0 mL utilizando pipeta esterilizada para o tubo marca 10-2. Agite. Repita este procedimento at atingir a diluio necessria. Pores de 1,0 mL de cada diluio preparadas como na aula anterior dever ser assepticamente colocadas no interior (centro) das mesmas e imediatamente o meio fundido deve ser adicionado. Mover a placa cuidadosamente num movimento em forma de 8, vrias vezes para homogeneizar. Aps a solidificao do meio na placa, levar estufa e incubar na posio invertida. Contar (calcular a mdia) e expressar em UFC/mL.

Clculo e expresso dos resultados UFC/mL = n colnias x inverso da diluio = UFC/mL Inculo

ATIVIDADES 1. Cite as vantagens de utilizar a tcnica de espalhamento em profundidade.

2. Esquematize o processo de diluio e plaqueamento em profundidade.

3. Expresse os valores encontrados nas placas selecionadas (30 a 300 colnias).

ANEXO

Figura 1 Plaqueamento em profundidade (Harley e Prescott, 2002)

PRTICA 10 TCNICA DO NMERO MAIS PROVVEL: Tubos mltiplos

INTRODUO O mtodo do nmero mais provvel (MNP), tambm chamada de tcnica dos tubos mltiplos, outra tcnica utilizada para estimar a contagem de alguns tipos de micro-organismos, como coliformes totais, coliformes termotolerantes, Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Esse mtodo foi introduzido por volta de 1915, mas muito utilizado at hoje. No entanto, o mtodo do NMP fornece somente uma estimativa de 95% de probabilidade de a populao bacteriana conter um nmero de bactrias e que o NMP da tabela estatisticamente o nmero mais provvel. Esta tcnica estatstica tem como princpio: quanto maior o nmero de bactrias em uma amostra maior ser o nmero de diluies necessrias para eliminar totalmente o crescimento em tubos contendo meios de cultura. Na tcnica do NMP, a amostra a ser analisada, aps homogeneizao, submetida pelo menos trs diluies decimais seriadas. De cada uma dessas diluies, alquotas iguais so transferidas para trs ou para cinco tubos contendo o meio de cultura escolhido e um tubo coletor de gs (tubo de Durhan). Todos os tubos so incubados, e, em seguida, os positivos so identificados. Para E. coli, positividade significa turvao do meio com produo de gs.

OBJETIVOS Determinar coliformes totais, coliformes termotolerantes e E. coli em amostra de gua obtida de locais diversos.

MATERIAIS E UTENSLIOS Amostra de gua bruta, Tubos de ensaio contendo meio Caldo Lactosado com Prpura de Bromocresol, Caldo Lactosado Verde Brilhante Bile a 2%, Caldo EC-MUG (suplementado com 4-metilumbeliferil--Dglicurondeo), tubos de Durhan, ala de platina, pipetas 5 e 10 mL, pipetadores, luz ultravioleta .

PROCEDIMENTOS

DETERMINAO DE COLIFORMES TOTAIS

Teste presuntivo Identificar 15 tubos, contendo caldo lactosado com prpura de bromocresol (CLPBC), com o volume e/ou diluio da amostra a ser inoculada e disp-los em uma estante, em fileiras de 5 tubos. Homogeneizar a amostra. Com uma pipeta de 10 mL, transferir 10 mL da amostra para um frasco contendo 90 mL de gua de diluio tamponada, antecipadamente identificado. Prepara-se assim a primeira diluio decimal (10 -1), sendo que 1 mL da mesma corresponde a 0,1 mL da amostra; Desprezar a pipeta de 10 mL e, com uma pipeta de 5 mL, inocular 1 mL da amostra em cada um dos 5 tubos correspondentes a essa quantidade de inculo; Homogeneizar a amostra com a primeira diluio (10 -1) agitando vigorosamente o frasco e, com uma nova pipeta, transferir 10 mL para um frasco contendo 90 mL de gua de diluio tamponada, conseguindo-se assim, a segunda diluio decimal (10-2), sendo que 1 mL da mesma corresponde a 0,01 mL da amostra; Proceder dessa maneira na seqncia de diluies desejadas; Aps a inoculao de todos os volumes da amostra e/ou diluies requeridas, colocar a estante contendo os tubos inoculados em incubadora a 37C, durante 24 horas; Aps esse perodo de incubao, efetuar a primeira leitura de resultados (24 horas). Retirar os tubos com resultado positivo (produo de gs) e anotar os resultados; Retornar os tubos com resultado negativo incubadora, por um perodo adicional de 24 horas. Na segunda leitura (48 horas), os tubos com resultado positivo sero separados e os negativos, desprezados.

Teste confirmativo Para a realizao do ensaio confirmativo, todos os tubos com resultado positivo em caldo lactosado com prpura de bromocresol (CL-PBC) nas leituras de 24 e 48 horas sero submetidos confirmao imediatamente aps as respectivas leituras.

 Identificar os tubos contendo caldo lactosado verde brilhante e bile a 2% (CLVBB) correspondentes a cada tubo de CL-PBC com resultado presuntivo positivo; Agitar cada tubo de CL-PBC e com uma ala de platina, inocular o tubo de CLVBB correspondente, evitando a pelcula superficial que pode se formar no CL-PBC presuntivo positivo; Incubar os tubos por 48 horas, a 37C; Proceder leitura, considerando como teste confirmativo positivo todos os tubos que apresentarem formao de gs e turvao do meio; Anotar resultados e calcular o NMP a partir dos dados obtidos.

Determinao de Escherichia coli Realizada a partir dos tubos positivos de CL-PBC. Efetuar a marcao de tubos contendo meio EC-MUG (previamente mantidos em banho-maria a 44,5 0,2C durante um mnimo de 30 minutos) com os nmeros correspondentes a cada tubo CL-PBC positivo; Agitar bem cada tubo e com uma ala de semeadura, inocular o tubo EC-MUG correspondente, evitando a pelcula superficial que pode se formar na cultura presuntiva positiva; Incubar os tubos EC-MUG inoculados, no mximo at 30 minutos aps a inoculao, em banho-maria 44,5 0,2C por 24 horas; Proceder leitura, considerando como resultado positivo, todos os tubos que apresentaram fluorescncia azul sob luz ultravioleta (lmpada 3 a 6w, ondas longas 365nm).

Clculo e expresso de resultados A Tabela 1 apresenta o NMP para vrias combinaes de resultados positivos e negativos, quando so inoculados 5 pores de 10 mL, 5 pores de 1 mL e 5 pores de 0,1 mL da amostra. Para a sua utilizao, procuram-se os cdigos formados por trs algarismos correspondentes ao nmero de tubos com resultado positivo em trs sries consecutivas inoculadas. Para a obteno do NMP de coliformes totais, o cdigo composto com resultado positivo no meio Caldo VBB.

Quando so inoculadas 3 sries de 5 tubos, sendo utilizados os volumes indicados na tabela (10 mL, 1,0 mL e 0,1 mL), o NMP obtido diretamente na tabela. Quando so inoculadas 3 sries de 5 tubos, sendo utilizados volumes decimais diferentes aos indicados na tabela, procura-se o cdigo formado pelo nmero de tubos com resultados positivos obtido nas trs sries consecutivas inoculadas, verificando-se o valor de NMP correspondente a ele. O NMP/100 mL ser dado atravs da seguinte frmula: NMP correspondente ao cdigo _______10__________ Maior volume inoculado

ATIVIDADES 1. Expresse os resultados obtidos nas anlises

ANEXO

Tabela 1 Clculo do nmero mais provvel (NMP)

ndice de N.M.P. e Limites de Confiana de 95% para vrias combinaes de resultados positivos e negativos, quando so utilizadas 5 pores de 10 mL, 5 pores de 1mL, 5 pores de 0,1 mL N de tubos que apresentam reao positiva quando so utilizados 5 tubos 5 tubos 5 tubos de de 10 mL de 1 mL 0,1 mL 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 2 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 2 0 2 0 0 2 0 1 2 1 0 2 1 1 2 2 0 2 3 0 3 0 0 3 0 1 3 1 0 3 1 1 3 2 0 3 2 1 4 0 0 4 0 1 4 1 0 4 1 1 4 1 2 4 2 0 4 2 1 4 3 0 4 3 1 4 4 0 5 0 0 5 0 1 5 0 2 5 1 0 5 1 1 5 1 2 5 2 0 5 2 1 5 2 2 5 3 0 5 3 1 5 3 2 5 3 3 5 4 0 5 4 1 5 4 2 5 4 3 5 4 4 5 5 0 5 5 1 5 5 2 5 5 3 5 5 4 5 5 5

ndice de N.N.P. por 100 mL <2 2 2 4 2 4 4 6 6 4 7 7 9 9 12 8 11 11 14 14 17 13 17 17 21 26 22 26 27 33 34 23 30 40 30 50 60 50 70 90 60 110 140 170 130 170 220 260 350 240 300 500 900 1600 >1600

Limites de confiana 95 %

Inferior <1 <1 <1 <1 1 1 2 2 1 2 2 3 3 5 3 4 4 6 6 7 5 7 7 9 12 9 12 12 15 16 9 10 20 10 20 30 20 30 40 30 40 60 80 50 70 100 120 160 100 100 200 300 600 -

Superior 10 10 13 11 15 15 18 18 17 20 21 24 25 29 24 29 29 35 35 40 36 45 46 55 63 56 65 67 77 80 86 110 140 120 150 160 170 210 250 250 300 360 410 390 480 560 690 820 940 1300 2000 2900 5300 -

PRTICA 11 TCNICA DE MEMBRANA FILTRANTE

INTRODUO A tcnica de membrana filtrante (MF) um mtodo rpido e preciso para isolamento e identificao de colnias de bactrias. Esta tcnica recomendada pelo Standard of Methods for the Examination of Water and Wasterwater, referncia internacional em anlises em guas. Na tcnica de MF, volumes conhecidos da amostra so filtrados atravs de membranas com uma porosidade 0,45m, onde as bactrias ficam retidas. Essas membranas so dispostas sobre meios de cultura slidos preparados em placas de Petri e incubadas; assim, as bactrias crescero na superfcie das membranas formando colnias discretas. A seletividade do meio de cultura propiciar a identificao de colnias tpicas da bactria procurada, por caractersticas morfolgicas e de cor. A densidade de bactrias obtida pela contagem das colnias tpicas, e os resultados so expressos em unidades formadoras de colnias (UFC)/100 mL. O volume da amostra a ser filtrada depende da qualidade presumvel da gua. Para guas de boa qualidade, por exemplo, guas tratadas, devem-se filtrar 100 mL da amostra; em contrapartida, amostras de guas de pior qualidade exigiro diluies, caso contrrio, o nmero de colnias ser to elevado que dificultar a contagem ou prejudicar o crescimento das bactrias em colnias discretas. Em geral, recomenda-se que a contagem seja feita em membranas com 20-80 colnias, nunca com mais de 200. Portanto, na anlise de gua de qualidade desconhecida deve-se filtrar diferentes diluies da amostra, sempre em rplicas.

OB JETIVO Realizar anlises bacteriolgicas em amostras ambientais atravs da tcnica de membrana filtrante para determinar os principais indicadores utilizados no controle de qualidade de guas.

MATERIAIS E UTENSLIOS Amostra de gua bruta, porta-filtro adaptados ao frasco de filtrao, Kitassato de segurana, placas de Petri contendo meio gar M-Endo Les (coliformes totais), gar

m-FC (coliformes termotolerantes) e gar Chromocult (coliformes totais e Escherichia coli), pinas, provetas, membranas filtrantes, gua de diluio tamponada estril (Tampo Fosfato com Cloreto de Magnsio).

PROCEDIMENTO 1a Etapa Identificao da amostra, definir os volumes a serem filtrados em funo de sua procedncia

Tabela 1 Seleo de volumes recomendados para filtrao de acordo com a procedncia da amostra. Procedncia da amostra
guas tratadas guas de piscinas guas de poos, fontes, nascentes guas de lagos, reservatrios Mananciais que abastecem ETAs 100 X X X X Volumes a serem filtrados 50 10 1 X X X X X 0,1

Fonte: American Public Health Association (APHA) Identificar as placas de Petri com o nmero da amostra, volume da amostra a ser filtrado, identificao do grupo e data. 2a Etapa Filtrao da amostra Homogeneizar a amostra; Distribuir os volumes requeridos da amostra em provetas estreis ou diretamente nos porta-filtro graduados para efetuar a filtrao; Retirar a parte superior do porta-filtro e, com as extremidades de uma pina flambada e resfriada, colocar a membrana filtrante estril, com a face quadriculada voltada para cima, centralizando-a sobre a parte inferior do portafiltro; Acoplar a parte superior do porta-filtro parte inferior, tomando cuidado para no danificar a membrana; Verter cuidadosamente o volume da amostra a ser examinada no porta-filtro, evitando que a gua respingue sobre as bordas superiores do mesmo; Ligar a bomba de vcuo e proceder filtrao;

 Aps a filtrao, enxaguar o porta-filtro duas vezes, com pores de aproximadamente 20 a 30 mL de gua de diluio tamponada estril, para evitar a reteno de alguma bactria nas paredes internas do mesmo; Desligar a fonte de vcuo ao finalizar a operao; Separar a parte superior do porta-filtro e, com uma pina cujas extremidades foram flambadas e resfriadas, retirar, com cuidado, a membrana. Acoplar novamente a parte superior do porta-filtro parte inferior; Obedecendo aos cuidados de assepsia, colocar cuidadosamente a membrana, com a superfcie quadriculada voltada para cima, na superfcie do meio de cultura contido na placa de Petri. Seguir as seguintes condies de incubao:

Contagem Coliformes totais Coliformes termotolerantes Coliformes Escherichia coli totais

Meio de cultura gar M-Endo Les gar m-FC

Condies de incubao 35C / 24 horas 44,5C / 24 horas 35C / 24 horas

e gar Chromocult

Aps o perodo de incubao, efetuar a contagem de colnias tpicas nos diversos meios:

Meio de cultura gar M-Endo Les

Contagem Coliformes totais

Caractersticas das colnias Rseas a vermelho escuras, com brilho verde metlico ou brilho dourado

gar m-FC

Coliformes termotolerantes

Azuis

gar Chromocult gar Chromocult 3a Etapa Leitura

Coliformes totais Escherichia coli

Rosadas Azuis escuras ou violeta

Os limites aceitveis para a contagem de colnias tpicas de coliformes totais em M-Endo gar Les ou gar M-Endo se situam entre 20 a 80, sendo que a contagem total (colnias tpicas e atpicas) deve ser inferior a 200;

No caso de terem sido filtrados volumes diferentes de 100 mL, selecionar para leitura apenas aquele (s) que tiver (em) fornecido contagem de colnias dentro dos limites aceitveis;

Se a contagem em todos os volumes filtrados for inferior a 20 colnias tpicas, no considerar o limite mnimo e efetuar a leitura em todas as placas correspondentes aos volumes filtrados da amostra

Nos casos em que todos os volumes filtrados fornecerem contagem superiores a 80, mas for possvel a contagem, efetuar a contagem no menor desses volumes; Quando todos os volumes filtrados no apresentarem crescimento bacteriano, expressar o resultado como: ausncia de coliformes ou, <1 coliformes por 100 mL;

Quando a estimativa visual do total de colnias (tpicas e atpicas) for superior a 200, ou quando houver crescimento em toda a rea de filtrao da membrana, sem colnias bem definidas (crescimento confluente), a contagem no efetuada, sendo requerido o procedimento de confirmao da presena de coliformes;

Ocasionalmente, as bactrias do grupo coliforme podem produzir colnias atpicas. Nos casos em que ocorrem apenas colnias atpicas em grande nmero, recomendvel efetuar a contagem e posterior confirmao.

Clculo e expresso de resultados

Calcular a densidade de coliformes totais a partir da contagem de colnias tpicas em M-Endo gar Les ou m-Endo em 100 ml da amostra filtrada, atravs da aplicao da seguinte frmula: N de colnias de coliformes totais/ 100 mL = n de colnias tpicas 100

Volume filtrado da amostra (mL)

Se as contagens obtidas forem inferiores aos limites ideais, considerar as contagens efetuadas em todas as placas (incluindo as que forem igual a zero) correspondentes aos volumes filtrados e calcular a densidade em 100 mL atravs da seguinte frmula: N de colnias de coliformes totais/ 100 mL = Soma das colnias tpicas 100

Soma dos volumes correspondentes s contagens (mL)

ATIVIDADES 1. Expresse os valores encontrados

PRTICA 12 MTODO DO SUBSTRATO CROMOGNICO/FLUOROGNICO

INTRODUO Mais recentemente desenvolveram-se mtodos baseados nas atividades enzimticas especficas dos coliformes (-galactosidade) e de E. coli (-glucoronidase). Os meios de cultura contm nutrientes indicadores (substrato cromognico) que, hidrolisados pelas enzimas especficas dos coliformes e/ou E. coli, provocam uma mudana de cor no meio, no caso de coliformes, ou produzem fluorescncia quando a amostra exposta luz ultravioleta, no caso de E. coli. Estes substratos cromognicos, quando hidrolisados pelas enzimas dos coliformes e de E. coli, liberam, respectivamente, O-nitrofenol (de cor amarela) e 4-metil-unberliferona (fuorescente). O mtodo pode ser aplicado tanto em anlises qualitativas, como quantitativas. Alm da maior preciso, outra grande vantagem o tempo de resposta, j que a determinao simultnea de coliformes (totais) e de E. coli efetuada aps incubao das amostras a 37 C por 24 horas, no havendo necessidade de ensaios confirmativos.

OBJETIVOS Determinar coliformes totais e Escherichia coli em amostra de gua bruta, atravs da tcnica do substrato cromognico e fluorognico pela tcnica de tubos mltiplos e pelo mtodo de presena-ausncia.

MATERIAIS E UTENSLIOS Amostra de gua bruta, Substrato cromognico/fluorognico adquirido comercialmente (Colilert), cartelas Quanti-Tray, Frascos contendo gua de diluio tamponada, seladora.

PROCEDIMENTOS Mtodo quantitativo Selecionar a diluio adequada para o teste. Abrir, assepticamente, um envelope contendo a quantidade pr-pesada do substrato (envelope adquirido comercialmente), requerida para o teste. Adicionar o contedo do mesmo a 100 mL da amostra de gua, contida em frasco estril.

 Fechar o recipiente e homogeneizar bem para sua completa dissoluo. Coloque a amostra na cartela Quality-Tray e sele-a Incubar por 24 horas a 37 C.

Mtodo de presena-ausncia (qualitativo) Abrir, assepticamente, um envelope contendo a quantidade pr-pesada do substrato (envelope adquirido comercialmente), requerida para o teste. Adicionar o contedo do mesmo a 100 mL da amostra de gua, contida em frasco estril. Fechar o recipiente e homogeneizar bem para sua completa dissoluo. Incubar por 24 horas a 37 C.

Leitura dos resultados

Coliformes Totais: Considerar resultado positivo a colorao amarela nos frascos e na cartela. Escherichia coli: Aps a leitura dos resultados para coliforme totais, efetuar a exposio do frasco e da cartela luz ultravioleta, a uma distncia de 6 a 8 cm. Se E. coli estiver presente, uma fluorescncia azul brilhante observada.

Clculo e expresso dos resultados Mtodo quantitativo Relatar o resultado com NMP/100 mL de coliformes totais e NMP/100 mL de E. coli. Utilizar as tabelas de NMP especficas.

Mtodo de presena-ausncia (qualitativo) Presena (ou ausncia) de coliformes totais por 100 mL. Presena (ou ausncia) de E. coli por 100 mL.

ATIVIDADES 1. Expresse os resultados quantitativo e qualitativo.

PRTICA 13 CONTROLE DE BIOFILME MICROBIANO: Agentes qumicos PRTICA 2 INTRODUO PREPARO DE MEIO DE CULTURA A higienizao utilizada com o objetivo de preservar a qualidade microbiolgica de vrios ambientes ou alimentos. Pode ocorrer em duas etapas distintas, onde a primeira corresponde limpeza que, tem como objetivo principal remoo de resduos orgnicos e minerais aderidos superfcie, constitudos principalmente por protenas, gorduras e sais minerais, e depois, a sanificao, para eliminar microorganismos patognicos e reduzir o nmero de alteradores em nveis aceitveis. O procedimento de limpeza pode remover 90% ou mais dos micro-organismos associados superfcie, porm no possui a capacidade de mat-los, o que pode posteriormente ocasionar a adeso de tais micro-organismos em outras superfcies. A sanificao definida como a operao que visa destruio de micro-organismos em nveis tolerveis. Os sanificantes fsicos ou qumicos eliminam clulas vegetativas de micro-organismos de importncia para a sade pblica e outros no patognicos encontrados nas superfcies de equipamentos, utenslios, manipuladores e dos ambientes. Na sanificao por meios fsicos emprega-se calor (vapor; gua quente) e radiao ultravioleta, enquanto que na sanificao por agentes qumicos utilizam-se compostos clorados, iodforos, composto quartenrio de amnia, cido peractico, perxido de hidrognio, ou seja, utilizam-se desde cidos orgnicos at agentes umectantes complexos. A reduo do nmero de microrganismos quando se utilizam sanificantes qumicos depende, entre outras coisas, das propriedades microbicidas do agente, da concentrao, da temperatura e do pH, bem como do grau de contato entre o sanificante e os microrganismos, sendo que esse pode ser conseguido por agitao, turbulncia (uso de ultra-som) e baixa tenso superficial, vale ressaltar, que os vrios microrganismos apresentam resistncia diferente aos esterilizantes qumicos. A determinao do sanificante eficiente freqentemente realizada nos testes de suspenso e ocasionalmente por testes baseados na superfcie. Os testes de suspenso tm uma variedade de benefcios, como por exemplo, eles so relativamente simples e no requerem equipamentos especializados e extensos no laboratrio, alm de possuir mo-de-obra barata. Dentro dos testes metodolgicos possvel testar uma diversidade

de variveis incluindo o tempo de contato, temperatura, tipos de microrganismos e superfcies de interferncia. Porm, o maior problema, que eles no refletem

necessariamente condies de uso.

OBJETIVOS Verificar a eficincia de agentes qumicos sobre o biofilme.

EQUIPAMENTOS E UTENSLIOS Pipetas, bico de Bunsen, tubos de ensaio com gua peptonada, placas com gar nutriente, caldo nutriente, placas de Petri estril, cepas padro de Escherichia coli e Bacillus subtilis, cupons de diferentes materiais, swabs, hipoclorito de sdio 2% , cido peractico 0,2%.

PROCEDIMENTO Adeso das clulas bacterianas Adicionar em placas de Petri de 140 mm de dimenso, os cupons, 60 mL de caldo nutriente e 1 mL de cada cultura. Incubar a 37 C por 5 dias. Enumera das clulas aderidas Retirar com auxilio de uma pina um cupom, lav-lo em gua destilada estril, para a eliminao de clulas no aderidas; Remover o biofilme utilizando-se swab padronizado esterilizado. Transferir os swabs para tubos contendo gua peptonada 0,1% (v/v), sendo, em seguida, agitados em vrtex, por 2 minutos. Promover diluio seriada; Empregar a tcnica de espalhamento em superfcie em caldo nutriente. Incubar as placas a 37 C, por, aproximadamente, 24 horas, sendo realizada, ao final desse perodo, a contagem padro em placas, expressa em UFC/cm2

Sanificao Retirar um cupom da placa de Petri, Transfer-lo para 10 mL de soluo sanificante e movimentar suavemente, para melhor contato do agente qumico com o biofilme, durante 15 minutos, temperatura ambiente; Enxaguar os cupons em gua destilada estril; Realizar esfregao com swabs estreis; Transferir os swabs para tubos contendo gua peptonada 0,1% (v/v), sendo, em seguida, agitados em vrtex, por 2 minutos. Promover diluio seriada; Empregar a tcnica de espalhamento em superfcie em caldo nutriente. Incubar as placas a 37 C, por, aproximadamente, 24 horas, sendo realizada, ao final desse perodo, a contagem padro em placas, expressa em UFC/cm2 ATIVIDADES 1. Qual o tempo mnimo necessrio para matar os micro-organismos, utilizando os agentes qumicos?

2. Expresse os resultados obtidos.

REFERNCIAS BLACK, J. G. Microbiologia, fundamentos e perspectivas. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2002, 829 p. BRASIL. Vigilncia e controle da qualidade da gua para consumo humano/ Ministrio da Sade, Secretaria de Vigilncia em Sade. Braslia: Ministrio da Sade, 2006. 212 p. HARLEY, J. H.; PRESCOTT, L. M. Laboratory exercises in microbiology. 1. ed. 2002, 466p. MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M.; PARKER, J. Microbiologia do Brock. 10 ed. So Paulo: Printice Hall, 2004, 608 p. PELCZAR Jr, M. J.; CHAN, E. C. S; KRIEG, N. R. Microbiologia conceitos e aplicaes. 2 ed. So Paulo: Pearson Education do Brasil, vol. 1 e 2. 1996.

ANEXO ANEXO Preparo de meios e reagentes

gua de Diluio (Tampo Fosfato com Cloreto de Magnsio)

Soluo A (Estoque) KH2PO4 ________________ 34,0g gua destilada ___________ completar para 1 litro pH ____________________ 7,2 0,2

Soluo B (Cloreto de magnsio) Cloreto de magnsio (MgCl2.6H2O) _______ 81,1g gua destilada _______________________ 1 litro

gua de diluio Soluo A (estoque) ___________ 1,25mL Soluo B (MgCl2) ____________ 5,00 ml gua destilada _______________ completar para 1 litro Caldo Lactosado com Prpura de Bromocresol (CL-PBC) teste presuntivo Extrato de carne _________ 3,0g Peptona _______________ 5,0g Lactose _______________ 5,0g Prpura de bromocresol (1,0 mL da soluo 1%) __ 0,01g gua destilada _________ 1 litro pH __________________ 6,9 0,2 Caldo Verde Brilhante Bile 2% (VBB) teste confirmativo Bile de boi __________________ 20,0g Peptona ____________________ 10,0g Lactose _____________________ 10,0g Verde brilhante

(13,3ml da soluo aquosa 0,1%)__ 0,0133g gua destilada ________________ 1 litro pH _________________________ 7,2 0,2

Caldo E. coli com MUG Triptose ____________________ 20,0g Lactose _____________________ 5,0g Sais biliares n3 ______________ 1,5g Fosfato dipotssico (K2HPO4) ___ 4,0g Fosfato monopatssico (KH2PO4)_ 1,5g Cloreto de sdio ______________ 5,0g gua destilada ________________ 1 litro 4-metilumbeliferil--Dglicurondeo_ 50 mg pH _________________________ 6,0 0,2

gar Cetrimide Hidrolisado pancretico de gelatina ______ 20,0g Cloreto de magnsio __________________ 1,4 g Sulfato de potssio ___________________ 10,0g Glicerol ____________________________ 10,0 mL Cetrimide __________________________ 0,3g gar ______________________________ 15,0g

gar King B Peptona ______________ 20,0g MgSO4 . 7H2O ________ 1,5g K2HPO4 _____________ 1,5g Glicerol ______________ 10 ml gar King B __________ 15g Solues de corantes para a colorao de Gram Cristal Violeta

Soluo A: Cristal violeta (90% pureza) _________ 2,0g

Etanol __________________________ 20,0 mL

Soluo B: Oxalato de amnio monohidratado ____ 0,2g gua destilada ____________________ 20,0 mL

Misturar as solues A e B, deixar de repouso por 24 horas e filtrar em papel de filtro comum. Estocar em frasco escuro.

Soluo de iodo (Lugol) Iodo ____________________________ 1,0g Iodeto de potssio _________________ 2,0g gua destilada ____________________ 300,0 mL

Colocar o iodeto de potssio num almofariz, adicionar o iodo e homogeneizar com o pistilo. Adicionar, consecutivamente, pores de 1 mL, 5 mL e 10 mL de gua destilada, homogeneizando a soluo aps cada adio. Em seguida, transferir a soluo para um frasco escuro, lavando o almofariz e pistilo com o restante da gua destilada.

Safranina (contra-corante) Safranina _________________________ 0,25g Etanol 95% _______________________ 10,0 mL gua destilada ____________________ 100,0 mL

Dissolver a safranina no lcool e adicionar a soluo resultante aos 100,0 mL de gua destilada.