Clulas-tronco pluripotentes

e doenas neurolgicas
Alysson Renato Muotri
Introduo
iopsias

do sistema nervoso perifrico so frequentes e muitas vezes executadas com o objetivo de investigar o processo patolgico em alguns pacientes. No entanto, em razo da caracterstica extremamente invasiva do do procedimento, biopsias no sistema nervoso central (SNC) so apenas feitas em condies especiais e raras. Essa incapacidade de explorar o crebro de um indivduo vivo limita em muito nosso conhecimento sobre o avano de doenas do desenvolvimento e neurodegenerativas. Atualmente, nosso conhecimento sobre os fentipos celulares relacionados como doenas humanas do SNC oriundo de tecidos post-mortem, no necessariamente preservados de forma apropriada. Alm disso, na grande maioria dos casos, os tecidos representam apenas o estgio final da doena, eliminando a possibilidade de explorar os eventos iniciais responsveis pela cascata de alteraes celulares que leva ao resultado final, seja ele alteraes estruturais ou mesmo morte celular. Modelos animais so extremamente teis porque podem reproduzir diversas formas de doenas genticas humanas neurodegenerativas. Modelos transgnicos ou knockouts produziram inmeros insights sobre novos mecanismos moleculares por trs de diversas patologias humanas, gerando novas possibilidades de interveno teraputica. Atualmente, esses modelos so restritos a doenas monogenticas, limitando o espectro de uso e apenas representando um nmero pequeno de doenas humanas passveis de modelagem. Dificuldades tcnicas, diferenas entre espcies e diferenas nos backgrounds genticos acabam por interferir no processo de modelagem animal, mesmo no caso de doenas monogenticas. Em muitos casos, a tecnologia de transgnicos ou knockout no consegue reproduzir os sintomas humanos em animais, indicando uma necessidade clara de modelos humanos. Os experimentos originais de reprogramao celular, liderados pelo pesquisador japons Shinya Yamanaka, surpreenderam a comunidade cientfica por quebrarem o dogma de que clulas especializadas do corpo humano teriam uma identidade vitalcia (Takahashi et al., 2007). A expresso forada de um grupo de fatores de transcrio, genes relacionados ao estado pluripotente, tem a capacidade de redirecionar a identidade de clulas especializadas e representa uma forma extraordinria de demonstrar a flexibilidade celular. Essa volta induzida ao estgio embrionrio pluripotente foi batizado de iPSC (do ingls, Induced Pluripotent Stem Cells).

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De forma concisa, a reprogramao gentica consiste no retorno a uma forma mais plstica e potente a partir de uma clula j diferenciada ou especializada. Por exemplo, pode-se usar a clula da pele de um indivduo adulto e transform-la numa clula no especializada, indiferenciada e com a capacidade de se dividir indefinitivamente. Essa clula indiferenciada e imortal teria o potencial de se especializar novamente na mesma clula da pele ou em outro tipo celular qualquer, mesmo num neurnio. Em resumo, consegue-se obter clulas-tronco embrionrias sob encomenda, usando o mesmo material gentico do paciente e evitando uma eventual rejeio em caso de transplante. Apesar de a ideia de um transplante sem rejeio ser extremamente atraente para os interessados numa eventual terapia celular, os experimentos de Yamanaka permitem trazer realidade o sonho de muitos neurocientistas: capturar o genoma humano de um paciente em clulas-tronco pluripotentes e us-las para a produo ilimitada de clulas especializadas do sistema nervoso (Muotri, 2009). Apesar de iPSC geradas do prprio paciente serem, em teoria, menos imunognicas para eventuais terapias de transplante, o foco deste artigo est voltado para futuras aplicaes clnicas dessa tecnologia in vitro, como a modelagem de doenas neurolgicas e o uso biotecnolgico para descoberta de novos medicamentos por meio da triagem de drogas.

iPSC derivadas de doenas neurodegenerativas humanas

Doenas que podem ser modeladas pela reprogramao celular podem ser raras, monogenticas ou no amplo espectro de doenas espordicas ou multifatoriais. At o presente momento, no existe publicao cientfica demonstrando a utilidade da tecnologia de iPSC para modelar este ltimo grupo de doenas complexas. Possivelmente, tem sido complicado obter resultados conclusivos a partir desse tipo de doena complexa em razo dos diferentes backgrounds genticos e influncias do ambiente. Vale notar que mesmo doenas monogenticas tambm podem apresentar uma grande variabilidade fenotpica. Ser necessrio determinar se a variao gentipo-fentipo observada nos pacientes ser reproduzida por neurnios gerados a partir de iPSC dos pacientes ou se a reprogramao ir eliminar o rudo ambiental ou epigentico. A reprogramao de clulas somticas foi publicada para algumas doenas neurolgicas. Porm, uma leitura crtica revela que poucos estudos realmente mostraram que possvel recapitular o fentipo humano em neurnios derivados das iPSC. A derivao de neurnios oriundos de iPSC foi descrita para formas espordicas de doenas neurodegenerativas de sintomas tardios como esclerose amiotrfica lateral (ELA) e a doena de Parkinson (Park et al., 2008; Soldner et al., 2009; Dimos et al., 2008). Pela perspectiva da reprogramao celular, formidvel observar que fibroblastos de pacientes idosos (at 85 anos de idade) com ELA e Parkinson foram capazes de gerar iPSC com eficincia semelhante a fibroblastos de pacientes mais jovens. Apesar da empolgao com esses trabalhos iniciais, nenhum dos artigos demonstrou fentipos

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relacionados doena em clulas afetadas. possvel que os fentipos celulares s surgiro com o passar dos anos, exatamente como acontece no corpo dos pacientes. Isso tornaria o processo altamente ineficiente em razo das dificuldades tcnicas de manter neurnios funcionais em cultura por tanto tempo. Encontrar situaes que simulem o envelhecimento precoce, por exemplo, aumentado as espcies reativas de oxignio no meio de cultura, parece ser uma sada criativa. A modelagem parcial, com a gerao espontnea de um fentipo em laboratrio, foi observada para duas doenas monogenticas com sintomas precoces: atrofia muscular espinhal (AME) e Disautonomia Familial (DF) (Ebert et al., 2009; Lee et al., 2009). Ambas as doenas so autossmicas recessivas e tm em comum a rpida progresso nos primeiros anos de vida. Alm disso, ambas as doenas so associadas com a perda de funo de genes envolvidos no processamento de RNA. A AME representa um grupo de doenas recessivas causadas por delees ou mutaes pontuais nos genes SMN (Survival Motor Neuron). O gene SMN1 codifica para uma protena envolvida no processamento de RNA (Lorson et al., 1998). A AME tipo1 caracterizada por mutaes no gene SMN1, levando a uma degenerao rpida dos neurnios motores, induzindo uma atrofia muscular grave. Os sintomas aparecem por volta dos seis meses de idade e a morte do portador acontece por incapacidade respiratria antes dos dois anos de idade. Clulas iPSC de um nico paciente AME foram caracterizadas e diferenciadas em neurnios motores. Quando comparadas com neurnios motores derivados de iPSC de um controle materno normal, no portador da doena, verificou-se que as AME-iPSC produziram um nmero reduzido de neurnios motores, sugerindo a morte precoce desse tipo celular. O trabalho no faz uma caracterizao funcional dos neurnios motores gerados pelo grupo (capacidade de estimular potenciais de ao ou formar junes neuromusculares). Outra observao feita pelo grupo foi um aumento do nmero de agregados proteicos conhecidos como gemas, em fibroblastos e iPSC do paciente com AME. Essas gemas esto geralmente associadas diretamente com a intensidade da doena. Os agregados puderam ser revertidos em fibroblastos ou nas iPSC com a utilizao de drogas especficas. Infelizmente, o grupo no analisou a presena dessas gemas nas clulas de interesse, os neurnios motores. Esse trabalho mostra, pela primeira vez, a prova de princpio de que as iPSC podem ser utilizadas como uma futura plataforma para triagem de drogas que possam reverter ou atenuar os fentipos celulares relacionados com doenas humanas. Infelizmente, o entusiasmo inicial foi afetado pela ausncia de controles mais rigorosos e pela presena de outros pacientes com AME. A incorporao de mais controles, perda e ganho de funo teriam reduzido as crticas de que o fentipo observado seria uma mera consequncia intrnseca da variabilidade do sistema iPSC (tpico discutido em detalhes mais adiante). A DF tambm uma doena recessiva com alta incidncia em descendentes da linhagem judia Ashkenzi (Brunt & McKusick, 1970). A doena caracestudos avanados

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terizada pela degenerao de neurnios sensoriais e autnomos, levando a uma disfuno geral severa e letal. O quadro clnico inclui hipoatividade, lacrimao, indiferena a dor e temperatura. Um defeito no processamento de edio do gene IKBKAP resulta na perda de funo da protena em determinados tecidos (Slaugenhaupt et al., 2001). As iPSC derivadas de trs portadores de DF foram diferenciadas em clulas neurais progenitoras e revelaram nveis baixos de expresso de IKBKAP quando comparado ao grupo controle. Defeitos na migrao e capacidade de diferenciao neuronal tambm foram notados nas progenitoras neurais derivadas de DF-iPSC. Uma droga (cinetina) foi usada para recuperar em parte a edio do RNA de IKBKAP nessas clulas, revertendo os defeitos de migrao mas no de diferenciao neuronal. Variaes qumicas da cinetina poderiam ter sido usadas na tentativa de recuperar ambos os defeitos. De qualquer forma, esse segundo trabalho apresenta vantagens sobre o primeiro, principalmente pelo uso de mais de um paciente. Modelando doenas do desenvolvimento neural Apesar de os avanos de modelagem com iPSC se restringirem, at o momento, em doenas neurodegenerativas, antecipo que a tecnologia ser til para doenas do desenvolvimento e psiquitricas como o espectro autista e a esquizofrenia. No entanto, acredito que resultados iniciais viro muito provavelmente de doenas monogenticas de causa conhecida e com sintomas precoces. Um exemplo de uma doena humana com grande potencial de modelagem a sndrome de Rett, que caracterizada por um retardo no desenvolvimento natural durante os primeiros anos de vida, regresso das habilidades manuais, perda do vocabulrio, movimentos estereotipados e um amplo espectro autista (Samaco et al., 2005). Portadores da sndrome de Rett geralmente carregam mutaes no gene MeCP2, localizado no cromossomo X. A protena MeCP2 tem uma maior afinidade por DNA metilado e parece estar envolvida na regulao epigentica de genes-alvo no sistema nervoso. O fato de conhecermos o gene envolvido nessa sndrome permitir a manipulao gentica em neurnios derivados de Rett-iPSC, validando eventuais fentipos celulares ou moleculares encontrados aps a diferenciao. Essa importante validao ser imprescindvel para nos convencer de que os fentipos observados no so frutos de variaes experimentais. A sndrome de Rett faz parte das sndromes associadas ao espectro autista e talvez seja o prottipo ideal para comear a investigar doenas psiquitricas complexas. Seguindo esse modelo, o prximo passo consistiria em buscar fentipos semelhantes em diversas sndromes do espectro autista, procurando vias moleculares comuns. Um desafio maior para essa categoria de doenas estaria na distino da contribuio de fatores do background gentico e do ambiente. Novas ferramentas para a manipulao do genoma de clulas-tronco pluripotentes, como a recombinao homloga e uso de zinc-fingers com endonucleases especficas, podem ajudar na eliminao do rudo ou variabilidade experimental

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(Zwaka & Thomson, 20003; Hockemeyer et al., 2009). Uma outra via para revelar fentipos neuronais complexos e comportamentos neurais especficos pode ser pelo uso de animais quimricos. O transplante de clulas-tronco embrionrias humanas no crebro de embries murinos revelou o enorme potencial de adaptao das clulas pluripotentes em decorrncia do contato com nicho celular (Muotri et al., 2005). Esse tipo de modelagem une o background celular gentico humano e a manipulao de um organismo animal, permitindo o estudo das consequncias de alteraes ambientais em neurnios humanos.

Uso de neurnios humanos como ferramenta para triagem de novas drogas

No passado, a seleo de drogas candidatas era feita em linhagens de clulas humanas e representaram um grande avano para a medicina. Um exemplo foi o desenvolvimento da vacina contra plio, originalmente concebida in vitro, usando a linhagem de clulas HeLa (Syverton et al., 1954). As iPSC derivadas de pacientes podem oferecer uma vantagem bem maior em relao ao modelo tradicional de linhagens celulares transformadas, uma vez que levam em considerao o genoma original do doador, alm da capacidade de diferenciao no tipo especfico de clula afetada durante o exato momento do desenvolvimento. Um dos grandes benefcios da reprogramao celular a possibilidade de estudar estgios do desenvolvimento de clulas precursoras neurais, antes da completa maturao em um neurnio funcional. Clulas precursoras neurais podem se especializar tanto em neurnios como em glia. Essas populaes podem ainda se dividir em subtipos especficos de neurnios, por exemplo, gerando diversos de tipos celulares responsveis pelo desenvolvimento e pela formao do crebro (Muotri & Gage, 2006). bem provvel que algumas doenas apenas afetem um subtipo especfico de neurnio que tenha origem ainda na fase precursora. Nesses casos, as intervenes teraputicas devem acontecer no estgio exato do desenvolvimento. Alm dessas vantagens, as iPSC oferecem a oportunidade nica de testar drogas diretamente em redes neurais humanas, algo que era dificilmente imaginado h alguns anos. A observao de fentipos celulares durante a triagem de drogas pode se beneficiar imensamente das tcnicas de neurocincia que j esto estabelecidas. A anlise de clulas individualizadas pode ser feita de medidas morfomtricas, arborizao neuronal, polaridade, densidade de espinhos neuronais ou tempo de maturao. Da mesma forma, eletrofisiologia pode ser utilizada para demonstrar a comunicao entre duas clulas. Efeitos no autnomos, como a influncia de astrcitos, podem tambm ser estudados aps a diferenciao das iPSC e cocultura com mais de um tipo celular. Alguns protocolos de diferenciao para certos subtipos de neurnios j existem, mas ainda no sabemos como diferenciar em cultura as iPSC em todos os tipos celulares do crebro humano. A converso direta a partir de clulas somticas, ou mesmo precursoras neurais derivadas de iPSC, pode ser uma alternativa e poder ser obtida

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com um cocktail de fatores de transcrio especficos para cada tipo celular. A obteno desses protocolos permitir o estabelecimento de circuitos neuronais em cultura, um passo mais avanado para compreenso de doenas e teste de novos medicamentos. Uma vez que um fentipo celular consistente observado em neurnios derivados de iPSC de um paciente, plataformas para teste de drogas podem ser desenvolvidas com o intuito de testar novos medicamentos que possam reverter ou atenuar o defeito neuronal. Aps diversos testes, em diferentes condies experimentais, novos compostos teraputicos podem emergir, beneficiando diversos pacientes (Figura 1).

A variabilidade intrnseca das clulas-tronco pluripotentes

Clulas-tronco embrionrias humanas disponveis so extremamente variveis em relao a marcadores epigenticos, perfil de expresso gnica e propenso a diferenciao (Osafune et al., 2008). Aparentemente, as iPSC se comportam de maneira semelhante, oferecendo o mesmo espectro de variabilidade intrnseca (Pick et al., 2009). As diferenas no perfil de expresso gnica so geralmente atribudas introduo dos vetores de reprogramao que se integram de maneira aleatria no genoma ou mesmo continua expresso dos cDNAs pluripotentes usados no processo. Uma explicao alternativa, gerada a partir da reprogramao sem o uso de vetores virais, sugere a reteno da memria gentica da clula original (Marchetto et al., 2009). O porqu da variao ainda uma questo em aberto, e mais dados sero necessrios para a formulao de hipteses a serem testadas. De qualquer forma, esse ainda um ponto muito importante para definir o nvel de variabilidade entre diversos clones de iPSC geradas a partir de um mesmo indivduo. Esse tipo de informao imprescindvel para o estabelecimento de controles rigorosos durante a definio de fentipos celulares.

Concluses
Cientistas do mundo todo esto usando a tecnologia de iPSC para investigar estgios iniciais do desenvolvimento neural humano e para modelagem de doenas neurolgicas. At ento, essa tecnologia mostrou-se restrita para doenas monogenticas, revelando uma nova metodologia de trabalho para elucidar novas vias moleculares responsveis por patologias humanas. A modelagem de doenas com sintomas tardios, como Alzheimer, ou mesmo psiquitricas, como no autismo, vai precisar de fatores adicionais para que o sistema seja desafiado e revele fentipos celulares relevantes. O potencial da reprogramao celular parece estar mesmo limitado pela capacidade criativa humana e pelos princpios ticos definidos pela sociedade. Neurocientistas do passado no poderiam imaginar um cenrio como esse, onde infinitas clulas nervosas de pacientes vivos pudessem ser geradas constantemente e estudadas em laboratrios do mundo todo. Por sua vez, pesquisadores do futuro no conseguiro imaginar a cincia sem uma ferramenta como essa. Quem viver ver.
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Figura 1 Modelagem de doenas neurolgicas usando a tecnologia de iPSC. Reprogramao de clulas somticas de pacientes e controles, gerando iPSC isognicas, isto , com o mesmo genoma do paciente. Clulas progenitoras neurais so derivadas das iPSC e diferenciadas em neurnios ou clulas da glia. Neurnios podem ser diferenciados em subtipos especficos, de acordo com a clulaalvo de cada doena. Fentipos celulares so analisados por morfometria, por exemplo, tamanho do soma , nmero de processos etc. Conexes entre neurnios e a formao de circuitos em cultura podem ser estudadas por diferentes mtodos j estabelecidos em neurocincia, como eletrofisiologia. Alm disso, a interao neurnio-glia pode ser estudada em coculturas para distinguir eventos autnomos de fentipos secundrios em cada tipo de doena humana. Uma vez que o fentipo identificado, plataformas para a triagem de drogas capazes de reverter ou atenuar o fentipo podem ser utilizadas. Novas terapias e remdios podem surgir a partir desse tipo de abordagem, beneficiando uma srie de pacientes portadores de doenas neurolgicas. Adaptada de Marchetto et al., 2010.

Referncias
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 Grande parte do conhecimento atual dos fentipos celulares relacionados a doenas neurolgicas foi obtida a partir de estudos de tecidos cerebrais coletados aps a morte do indivduo. Essas amostras geralmente representam os estgios finais da doena e, portanto, no servem como fiel representao de como os sintomas aparecem. Alm disso, nessas circunstncias, a patologia observada pode muito bem ser um efeito secundrio do processo patolgico ou mesmo da deteriorao do tecido em vez de um fentipo celular autntico. Da mesma forma, modelos animais nem sempre recapitulam exatamente a patologia das doenas em humanos. Neste artigo, pretendo apresentar uma viso crtica dos recentes avanos obtidos a partir da modelagem de doenas neurolgicas humanas, utilizando clulas-tronco pluripotentes. O foco na reprogramao celular de clulas somticas, gerando clulas-tronco pluripotentes induzidas, justificase em razo do grande potencial experimental no s para a modelagem de doenas humanas, mas tambm como ferramenta biotecnolgica para triagem de novas drogas, contribuindo para uma futura medicina personalizada.
resumo palavras-chave: Clulas-tronco pluripotentes, Reprogramao gentica, Doenas neurolgicas, Triagem de drogas. abstract Most of our current knowledge about cellular phenotypes related to neurological diseases was gathered from studies performed in brain tissue collected postmortem. These samples often represent the end-stage of the disease process and may not represent a fair picture of how the disease developed over time. Futhermore, under these conditions, the pathology may as well be a secundary effect of the disease process or even due to the poor tissue condition and may not represent an authentic cellular phenotype. Likewise, animal models not always recapitulate the pathology from human disorders. In this article, I will present a critical view on the recent advances obtained from disease modeling using human pluripotent stem cells. The focus on cellular reprogramming as tool to generate patient-specific induced pluripotent stem cells is justified by the great experimental potential, not only for disease modeling, but also as a biotecnological tool for future drug-screening platforms and personalized medicine. keywords: Pluripotent stem cells, Cellular reprogramming, Neurological diseases, Drug-screening.

Alysson Renato Muotri, Ph.D., professor da University of California San Diego, Dept. Pediatrics/Cellular & Molecular Medicine. @ muotri@ucsd.edu Recebido em 23.9.2010 e aceito em 29.9.2010.

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