Apostila de Parasitologia

Protozorios - Helmintos

Professora Especialista: Rose Felipe

2009

Parasitologia - Introduo

I) EXAME DIRETO EXAME MACROSCPICO DE PREPARAES A FRESCO O diagnstico realizado pela observao microscpica dos oocistos entre lminas e lamnulas. O exame direto a fresco realizado diretamente das fezes diarreicas, ou aps a diluio das fezes pastosas, em soluo salina a 0,85% (1:5). Examinar com objetiva de imerso. A microscopia de contraste de fase facilita a observao dos parasitas. Observaes: O oocisto no exame direto aparece maior que aqueles observados nos esfregaos fixados e corados. Os oocistos apresentam-se como elemento esfricos de 5 a 6 m de dimetro, com membrana externa fina, com um citoplasma finalmente granulado, e com mancha negra proeminente, central ou lateral, quer representa os corpos residuais. Os quatro esporozotos livres aparecem como pequenas manchas dispostas na periferia em forma de "C". O ncleo visto no centro do organismo (GARCIA et al., 1983; LEMETEIL, 1987; MEHLHORN, 1988).

2) Mtodo de Faust e cols: centrfugo - flutuao

1) Princpio do teste A pesquisa de cistos nas fezes pode ser realizada por diferentes mtodos. O mtodo de Faust est baseado na centrifugao e na flutuao em uma soluo de Sulfato de zinco. Uma alquota de fezes filtrada e posteriormente centrifugada. O sobrenadante colocado numa soluo de Sulfato de zinco e centrifugado. O material a examinar retirado da parte superficial, tratado com soluo de lugol e observado ao microscpio. 2) Aplicao clnica A principal aplicao do mtodo de Faust a pesquisa de cistos de protozorios, destacando-se a pesquisa de cistos de Iodameba btschlii, Entamoeba histolytica, Entamoeba coli, Endolimax nana. Outros cistos de protozorios, ovos e larvas de helmintos podem ser pesquisados. 3) Reagentes

3.1 Lugol 1 g de Iodo macerada com 2 g de Iodeto de potssio. Medir 200 mL de gua Tipo I. Adicionar lentamente pequena quantidade desta gua com homogeneizao constante. Quando houver solubilizao total, adicionar o volume restante desta gua. Armazenar em um frasco de vidro mbar e rotular. Transferir 20 mL para um frasco conta-gotas mbar, o qual ser usado no diaa-dia. 3.2 Sulfato de zinco a 33 %

Preparar uma soluo em gua Tipo I de modo produzir uma soluo de Sulfato de zinco a 33 % com densidade 1.180 g/L. Habitualmente a soluo de Sulfato de zinco a 33 % apresenta densidade 1.180 g/L, mas a densidade deve ser medida e corrigida conforme necessrio. 4) Outros insumos 4.1 Borrel ou frasco de vidro. 4.2 Funil de plstico pequeno. 4.3 Palito de sorvete 4.4 Tubo cnico de plstico. 4.5 Caneta para marcar tubo. 4.6 Gaze tipo queijo ou tamiz metlico de 80 a 100 malhas/cm2. 4.7 Estante. 4.8 Lmina de vidro. 4.9 Lamnula de vidro. 4.10 Ala de inoculao ou pipeta Pasteur. 5) Equipamentos 5.1 Centrfuga. 5.2 Microscpio.

6) Procedimento detalhado

OBS: Para executar este procedimento indispensvel o uso de luvas, mscara e avental.

1 Preparar uma suspenso 1:10 de fezes em gua Tipo II num frasco do tipo Borrel, identificado com o nmero de registro do paciente. 2 Adaptar a gaze ao funil de vidro. 3 Identificar um tubo cnico com o nmero de registro do paciente. 4 - Filtrar a suspenso para este tubo cnico. 5 Centrifugar a 2500 rpm por 1 minuto. 6 Desprezar o sobrenadante. 7 Adicionar 3 mL de gua Tipo II e misturar. 8 Repetir os itens 5, 6 e 7 mais duas vezes. 9 No ltimo sedimento, adicionar 3 mL de soluo de Sulfato de zinco. 10 Agitar e completar o volume do tubo com o Sulfato de zinco. 11 Centrifugar a 2500 rpm por 1 minuto. 12 Aspirar a pelcula superior.

13 Identificar a lmina de vidro com o nmero de registro do paciente. 13 Colocar 1 gota na lmina de vidro. 14 Colocar 1 gota de lugol na lmina de vidro. 15 Homogeneizar. 16 Colocar a lminula de vidro. 17 Observar no microscpio, inicialmente com pequeno aumento. 18 Registrar o resultado na Planilha de exame 7) Leitura 1 A riqueza de cistos pode ser verificada com pequeno aumento do microscpio. 2 As caractersticas de cada espcie so observadas com grande aumento ou imerso. 3 Observar: o nmero de nuclolos dos cistos, a sua estrutura, a distribuio, a colorao e o aspecto do glicognio neles contido. 8) Limitaes do mtodo 1 Amostra do paciente contendo poucos cistos pode fornecer resultado falso negativos. 2 A incapacidade do observador em identificar as caractersticas morfolgicas das diferentes espcies poder causar resultados enganosos.

III) Tcnica de Colorao por Hematoxilina Frrica

A hematoxilina frrica utilizando fezes preservadas sem dvida, o mtodo que maior segurana oferece na identificao e no diagnstico da E. histolytica. Os trofozotas apresentam uma cor cinza-azulada, diferenciando-se de estruturas de tonalidades escuras. Seu tamanho varia entre 15 a 60 micra. O citoplasma distinto e observa-se uma ntida diferenciao entre o ectoplasma e o endoplasma, principalmente se a forma observada estava emitindo pseudpodes quando da sua fixao. O ectoplasma apresenta-se hialino com uma colorao cinza-clara, diferenciando-se do endoplasma, que se apresenta granuloso e mais intensamente corado. No seu interior pode-se observar uma ou mais hemcias coradas de negro, evidenciadas nitidamente por um halo claro em toda sua parte externa. O ncleo geralmente no central, permanecendo em local afastado da emisso dos pseudpodes, corando suas estruturas em negro. O cariossoma geralmente central, mais corado, os grnulos de cromatina so escuros e distribudos uniformemente no interior da membrana nuclear.

A forma pr-cistica geralmente esfrica, podendo apresentar-se oval, corando em azulacinzentado e no apresentando diferenciao entre o ectoplasma e o endoplasma. O vacolo ocupa 2/3 do parasito, que o vacolo de glicognio, pouco corado. Os corpos cromatides, corados em negro, se apresentam como um ou dois bastonetes de tamanhos diferentes. O ncleo se apresenta um pouco maior na forma pr-cistica. O cariosoma grande, de aspecto geralmente uniforme. J nos cistos pode-se observar uma ntida membrana cstica corada em negro e o citoplasma se apresenta em uma cor cinza-azulada contendo um vacolo de glicognio grande e no corado. Os corpos cromatides, mais freqentes nos cistos imaturos, coram em negro e apresentam-se em quantidades variveis, porm dificilmente so observados nos cistos tetranucleados. Outros protozorios de interesse nos exames de fezes so: E. coli, E. hartmani, Endolimax nana, Iodamoeba butschlii, Isospora belli, Balantidium coli. Pode usar para pesquisa de Trichomonas vaginalis (secreo vaginal e uretral) Procedimento Prtico

I)

Material para anlise: fezes diarricas obtidas por purgantes (30 gramas de sulfato de sdio dissolvidos em gua). Evacuao deve ser feita no laboratrio

II)

Fezes muito pastosas ou endurecidas devem ser colocadas em fixador de preferncia o de Schaudinn (veneno).

III)

Utilizar lamnulas limpas e desengorduradas presas a um suporte de borracha para facilitar a manipulao (figura 1).

IV)

Com uma pzinha de sorvete espalhar as fezes fazendo um esfregao e aps emergir ema placa de Petri contendo o fixador de Schaudinn.

V)

Passar esta preparao pelos seguintes lquidos:

1- lcool iodado - 1 minuto 2- lcool a 95% - 1 minuto 3- gua corrente para lavagem 1 minuto dentro da cuba 4- Mordente (alumnio de ferro) 3 minutos 5- gua corrente - 1 minuto dentro da cuba 6- Soluo de Hematoxilina frrica 5 minutos 7- gua corrente - 1 minuto dentro da cuba 8- Diferenciador (alumnio de ferro) at que o esfregao adquira uma transparncia adequada. (muita experincia): momento crucial 9- gua corrente - 2 minutos dentro da cuba. 10- lcool absoluto 2 minutos.

11- lcool a 95% - 2 minutos 12- lcool creosoto - 2 minutos 13- Creosoto de Faia - 2 minutos 14- Montar com blsamo do Canad: sobre uma lmina limpa e desengordurada colocar uma gota de blsamo, e sem deixar bolhas de ar, colocar a preparao com o esfregao voltado para baixo, sobre o mesmo. A preparao poder ser colocada em estufa a 37 C para a secagem do blsamo do Canad, limpando-se o excesso com auxlio de xilol e papel de filtro. Examinar com objetiva de imerso e ocular 5x ou 10x.

Entamoeba histolytica

cisto

Entamoeba coli (trofozoto e cisto)

Trofozoto

Giardia lamblia cisto

Trofozoto

Desenhos das Lminas

Protozorios sanguneos
Preparao do esfregao sanguneo e colorao Mtodo de GIEMSA: (diagnstico do tripanosomas, dos plasmdios, das leishmanias e Toxoplasma). I) Preparo de esfregao sanguneo
A) Sangue com EDTA B) Preparam-se esfregaos finos tocando uma lmina limpa, desengordurada, em uma pequena gota de sangue, de modo que fique prximo de uma extrimidade da lmina. Uma segunda lmina espalhadora (lmina de extenso) segurada pelas bordas, em ngulo de 30 graus sobre a lmina que tem o material e recuada sobre a gota fazendo que se espalhe ao longo da borda da lmina espalhadora. Com suavidez e rapidez, empurre a lmina espalhadora para frente, de modo que o sangue se espalhe e corra em camada plana. C) Deixe secar ao ar e core conforme a descrio. II) Procedimento de colorao

A) Identificao do Trypanosoma cruzi hemoflagelado

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Objetivos da aula: reconhecer as seguintes formas evolutivas: tripomastigotas, amatigostas e epimastigotas de T. cruzi. 1) Tripomastigotas

Examinar lmina de esfregao sanguneo corado pelo mtodo Giemsa (visualizar o parasito entre as hemceas). Descrever a posio do cinestoplasto, posio do ncleo, membrana ondulante e flagelo.
Epimastigota de T.cruzi

Amastigota de T. cruzi

B) Identificao de Leishmania spp.

Objetivos da aula: reconhecer as seguintes formas evolutivas: promastigotas e amastigotas de Leishamnia ssp.

1) Promastigotas As promastigotas de Leishmania ssp so encontradas no trato intestinal do

mosquisto Flebotomneo (mosquito palha), mas tambm podem ser encontrados em culturas in vitro Descrever a posio do cinestoplasto, posio do ncleo e flagelo.

2) Amastigotas

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As amastigotas sero encontradas em clulas do sistema fagocitrio, presentes no sangue circulante ou nos rgos de indivduos infectados. Examinar lminas obtidas de amstigotas obtidas em linfonodo. Descrever a posio do cinestoplasto, posio do ncleo e flagelo.

D) Identificao de Plasmdios (Plasmodium sp)

Objetivos da aula: reconhecimento das formas sanguneas dos palsmdios

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D) Identificao de Toxoplasma gondii.

Objetivos da aula: reconhecimento dos principais estgios parasitrios de gondii, diferenciando estgios encontrados na fase aguda (taquizotos) da fase crnica (bradizotos em cistos teciduais).

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Taquizotos

Bradizoto

Desenhos das Lminas

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Schistosoma mansoni

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Desenhos das Lminas

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Mtodo de Lutz ou de Hoffmann (sedimentao espontnea)

Princpio do mtodo:
Mtodo baseado na sedimentao espontnea, especfico para a pesquisa de ovos de Schistosoma mansoni, porm altamente eficiente e amplamente utilizado para a pesquisa de todos os parasitos.

Material necessrio:
1. Clice de decantao 2. Peneira 3. Gaze dobrada em 4 4. gua corrente ou destilada 5. Esptula de madeira (tipo abaixador de lngua) 6. Lmina e lamnula Tomar cerca de 2 g de fezes recm emitidas, dissolv-las no prprio recipiente de coleta (frasco padro para coleta de amostra) utilizando um pouco de gua. Transferir o material dissolvido para um clice de decantao fazendo filtrar em peneira contendo gaze em 4. Completar at do volume de gua e deixar repousar em superfcie firme e livre de vibraes por no mnimo 2 horas. Retirar o sedimento com um canudo ou pipeta Pasteur e transferir para lmina de vidro adicionando 2 gotas de soluo de Lugol e cobrindo com lamnula. Observar ao microscpio em objetiva de 10x.

Taenia sp 19

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Desenhos das Lminas

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Hymenolepis nana

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Ascaris sp

Ovo

Ovo

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Desenhos das Lminas

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FLUTUAO SIMPLES - WILLIS (flutuao em salina saturada)

Essa tcnica se baseia na propriedade que alguns ovos de helmintos apresentam de flutuarem na superfcie de uma soluo de densidade elevada e de aderirem ao vidro. Este procedimento especfico para a pesquisa de ovos de Ancilostomdeos. 1. A soluo saturada de cloreto de sdio feita adicionando aproximadamente 40g de NaCl a 100mL de gua sob aquecimento at o ponto em que o sal no se dissolva mais na gua. A densidade desta soluo deve ser de aproximadamente 1,20g/mL. 2. Colocar uma quantidade de fezes (aproximadamente 2 g) coletadas de vrias partes do bolo fecal em uma pequena cuba contendo uma parte de soluo saturada de cloreto de sdio, dissolver as fezes nesta soluo e acrescentar gua at a borda. 3. Colocar sob a borda da cuba uma lmina de vidro quase tocando a soluo saturada e deixar de 30 a 45 minutos . Aps este tempo, inverter a lmina rapidamente e observar ao microscpio.

Ancylostoma sp

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Desenhos das Lminas

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Rugai e cols

Barmann Moraes

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Strongyloides stercoralis

Desenhos das Lminas

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COLETA PARA PESQUISA DE ENTEROBIUS VERMICULARIS (TCNICA DA FITA ADESIVA OU SWAB PERIANAL NOTURNO) Material necessrio

1. Fita de celofane adesiva e transparente (tipo Durex) 2. Toluol (tolueno), Xilol (xileno) ou Iodo-xilol 3. Lmina para microscopia. Tcnica

1. Colocar um pedao de fita adesiva transparente em uma esptula de madeira tipo abaixador de lngua com a parte adesiva voltada para fora 2. Pressionar firmemente a esptula contendo a fita adesiva contra as pregas anais e perianais 3. Colar a fita adesiva em lmina devidamente identificada 4. No momento da execuo do exame, levantar cuidadosamente a fita da lmina e pingar uma gota de toluol ou xileno e pressionar novamente a fita contra a lmina. A preparao ficar clara ou levemente corada, tornando os ovos bem visveis. Caso o material no seja examinado imediatamente, no acrescentar o toluol.

Fita gomada ou anal swab

Ovos da coleta do anal swab

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Enterobius vermiculares

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Trichuris trichiura

Wuchereria bancrofti 32

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Desenhos das lminas

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Ectoparasitos

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DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA INSTITUTO DE BIOLOGIA / UNICAMP PROTOZORIOS INTESTINAIS E CAVITRIOS

AMEBAS PARASITAS E COMENSAIS

Entamoeba histolytica cisto

Entamoeba histolytica cisto (corado pelo lugol)

Entamoeba histolytica cisto

Entamoeba histolytica trofozota

Entamoeba histolytica trofozota

Entamoeba histolytica trofozota

Entamoeba coli cisto (corado pelo lugol)

Entamoeba coli cisto (corado pelo lugol)

Entamoeba coli trofozota

Entamoeba coli trofozota

Iodamoeba btchlii cisto

Endolimax nana cisto

Endolimax nana trofozota

FLAGELADOS INTESTINAIS E CAVITRIOS

Giardia lamblia trofozota

Giardia lamblia trofozota

Giardia lamblia cisto

Giardia lamblia cisto

Trichomonas vaginalis

CILIADOS INTESTINAIS

Balantidium coli cisto

Balantidium coli trofozota

Balantidium coli em corte de intestino

Balantidium coli em corte do intestino grosso

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DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA INSTITUTO DE BIOLOGIA / UNICAMP PROTOZORIOS DO SANGUE E OUTROS TECIDOS

Plasmodium falciparum trofozota

Plasmodium falciparum gametcitos

Plasmodium falciparum microgametcito

Plasmodium falciparum macrogametcito

Plasmodium vivax trofozota

Plasmodium vivax esquizonte

Plasmodium vivax merozoto

Plasmodium vivax microgametcito

Plasmodium vivax macrogametcito

Trypanosoma cruzi epimastigota

Trypanosoma cruzi tripomastigota

Trypanosoma cruzi tripomastigota

Trypanosoma cruzi amastigota

Leishmania sp. amastigota

Leishmania sp. amastigota

Leishmania sp. promastigota

Toxoplasma gondii trofozota

Toxoplasma gondii cisto

VETORES Barbeiros

Triatoma

Panstrongylus

Rhodnius
Anophelini

Ovos

Larva

Pupa

Macho Fmea Adultos

Posio de pouso do adulto

Culicini

Ovos

Larvas

Pupa

Macho Fmea Adultos

Posio de pouso do adulto

DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA
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INSTITUTO DE BIOLOGIA / UNICAMP HELMINTOS INTESTINAIS

Ovo de Ancilostomatdeo

Ovo larvado de Ancilostomatdeo

Ovo de Ancilostomatdeo

Ovo de Enterobius vermicularis

Ovos de Enterobius vermicularis

Ovo de Ascaris (fertilizado)

Ovo de Ascaris (fertilizado) Ovo de Ascaris (larvado e decorticado)

Ovo de Ascaris (infrtil)

Ovo de Ascaris (infrtil)

Ovo de Schistosoma mansoni

Ovo de Fasciola hepatica

Ovos de Taenia

Ovo de Taenia

Proglote grvido Taenia solium

Ovo de Hymenolepis diminuta

Ovo de Hymenolepis nana

Ovo de Trichuris trichiura

Ovo larvado de Trichuris trichiura

Proglote grvido Taenia saginata

Cpsula bucal Ancilostoma duodenale

Cpsula bucal Ancilostoma duodenale

Cpsula bucal Necator americanus

Cpsula bucal Necator Bolsa copuladora de A. americanus duodenale

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Bibliografia Consultada
- DE CARLI, G.A. Parasitologia Clnica Seleo de Mtodos e Tcnicas de Laboratrio para o Diagnstico das Parasitoses Humanas Editora Atheneu, So Paulo, 2001. - CIMERMAN, B. & FRANCO, M.A. - Atlas de parasitologia: artrpodes, protozorios e helmintos. So Paulo, Ed. Atheneu, 1999. - LEVENTHAL, R. & CHEADLE, R.- Parasitologia Mdica. Texto e Atlas. 4ed. Editora Premiere, 2000. - NEVES, D.P. - Parasitologia humana. 10 ed. Editora Atheneu (SP), 2003 - REY, L. - Bases da parasitologia mdica. 2 ed. Guanabara Koogan (RJ), 2002. - VALLADA, E.P.; -Manual de Exames de Fezes - coprologa e parasitologia. Editora Atheneu So Paulo, 1993 - NEVES, D.P. - Parasitologia dinmica. 1 ed. Editora Atheneu (SP), 2003. - FERREIRA, M.U. e SCHHUMAKER, T.T.S. Fundamentos Biolgicos da Parasitologia Humana. Editora Manole, So Paulo, 2003. - VERONESI, R. & FOCACCIA, R. - Tratado de Infectologia. So Paulo, Editora Atheneu, 1999

Pginas de internet: WWW.dpd.cdc.gov/dpdx/Default.htm : pgina do Center for Disease Control and Prevention com imagens e textos sobre parasitos de importncia em sade pblica. www.cdfound.to.it/html/atlas.htm www.fcfrp.usp.br/dactb/Parasitologia/ATLAS_DE_PARASITOLOGIA.htm www.farmacia.ufmg.br/ACT/atlas/

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