Colgeno

04 2000 Molcula del mes por David Goodsell doi: 10.2210/rcsb_pdb/mom_2000_4 ( Versin PDF , ePub Version ) Palabras clave: vitamina C, el colgeno de triple hlice, hidroxiprolina, el colgeno fibrilar Estructuras Discutidos

colgeno idealizada

colgeno humano

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Su protena ms abundante
Alrededor de una cuarta parte del total de la protena en su cuerpo es colgeno. El colgeno es una protena estructural, formando cables moleculares que fortalecen los tendones y hojas grandes y resistentes que soportan la piel y rganos internos. Huesos y los dientes se hacen aadiendo cristales minerales al colgeno. El colgeno proporciona estructura a nuestro cuerpo, proteger y apoyar a los tejidos blandos y conectndolos con el esqueleto.Pero, a pesar de su funcin crtica en el cuerpo, el colgeno es una protena relativamente simple.

La Triple Hlice del colgeno

El colgeno se compone de tres cadenas, enrollados juntos en una triple hlice apretada. La ilustracin incluye aqu muestra slo un pequeo segmento de la molcula entera - cada cadena es de ms de 1400 aminocidos de longitud y slo sobre 20 se muestran aqu. Una secuencia repetida de tres aminocidos forma esta estructura robusta. Cada tercer aminocido es la glicina, un cido amino pequeo que encaja perfectamente en el interior de la hlice. Muchas de las posiciones restantes de la cadena estn ocupados por dos cidos inesperados aminocidos: prolina y una versin modificada de hidroxiprolina prolina,. No esperaramos prolina a ser esta comn, porque forma un estrechamiento en la cadena de polipptido que es difcil de acomodar en tpicas protenas globulares. Pero, como se puede ver en la pgina siguiente, que parece ser la forma correcta para esta protena estructural.

Vitamina C

Hidroxiprolina, que es crtico para la estabilidad del colgeno, se crea mediante la modificacin de los aminocidos prolina normales despus de la cadena de colgeno se construye. La reaccin requiere de la vitamina C para ayudar en la adicin de oxgeno. Por desgracia, no puede producir vitamina C dentro de nuestros cuerpos, y si no conseguimos suficiente en nuestra dieta, los resultados pueden ser desastrosos. La deficiencia de vitamina C disminuye la produccin de hidroxiprolina y detiene la construccin de colgeno nuevo, provocando finalmente que el escorbuto. Los sntomas de escorbuto - prdida de dientes y hematomas - son causados por la falta de colgeno para reparar el desgaste y desgaste causado por las actividades diarias.

El colgeno en la plataforma de comestibles

El colgeno de animales de ganado es un ingrediente familiar para cocinar. Como la mayora de las protenas, cuando el colgeno se calienta, pierde la totalidad de su estructura. Los desenrolla de triple hlice y las cadenas separadas. Luego, cuando esta masa desnaturalizado de las cadenas enredadas se enfra, se absorbe toda el agua que rodea como una esponja, formando gelatina.

Explorando la Estructura
Una secuencia especial de aminocidos hace que el colgeno de triple hlice apretada particularmente estable. Cada aminocido tercera es una glicina, y muchos de los aminocidos restantes son prolina o hidroxiprolina. Un triple hlice clsico se muestra aqu, y puede ser visto en el fichero PDB 1cag . Note como la glicina forma un codo pequeo lleno dentro de la hlice, y observe cmo la prolina y la hidroxiprolina suavemente doblar la cadena de vuelta alrededor de la hlice. En esta estructura, los investigadores colocaron una mayor aminocido alanina en la posicin normalmente ocupada por glicina, que muestra que no dejan las cadenas vecinas.

Esta hlice del colgeno contiene un segmento de colgeno humano, y puede verse en el archivo PDB 1bkv . Observe que la mitad superior es muy uniforme, donde la secuencia es la mezcla ideal de glicina y prolinas. En la parte inferior, la hlice es menos regular, porque muchos aminocidos diferentes se colocan entre las glicinas igualmente espaciados. Estas ilustraciones fueron creadas en RasMol. Puede crear imgenes similares haciendo clic en los cdigos PDB encima y luego elegir "Estructura View".

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Las cuerdas y escaleras

Hacemos muchos tipos diferentes de colgeno, que forman las cuerdas largas y hojas duras que se utilizan para el apoyo estructural en animales maduros y como rutas de movimiento celular durante el desarrollo.Todos contienen un largo tramo de triple hlice conectado a diferentes tipos de extremos. El ms simple es simplemente una hlice triple de largo, con extremos romos. Estos "tipo I" molculas de colgeno asociar lado a lado, como las fibras de un cable, para formar fibrillas difciles. Estos atraviesan el espacio entre las fibrillas de casi cada uno de nuestras clulas. Esta ilustracin representa una membrana basal, que forma una superficie dura que soporta la piel y muchos rganos. Un colgeno diferente - "Tipo IV" - forma la base estructural de esta membrana. El colgeno tipo IV tiene una cabeza globular en un extremo y una cola extra en el otro. Las cabezas se unen fuertemente juntos, de cabeza a cabeza, y cuatro molculas de colgeno se asocian juntos a travs de sus colas, formando un complejo en forma de X. El uso de estos dos tipos de interacciones, el colgeno tipo IV forma una red extendida, que se muestra aqu en azul claro. Dos otras molculas - en forma de cruz laminina (azul-verde) y proteoglicanos largos y serpenteantes (verde) - llenar los espacios, formando una lmina densa

Estructura microfibrilar de colgeno tipo I in situ

Joseph PRO Orgel , * Thomas C. Irving , * Andrew Miller , y Tim J. Wess
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ABSTRACTO
Los colgenos fibrosos son ubicuos en animales y forman la base estructural de todos los tejidos conectivos de mamferos, incluyendo las del corazn, los vasos sanguneos, piel, crnea, huesos y tendones. Sin embargo, en comparacin con lo que se sabe de su estructura de produccin, volumen de ventas y fisiolgicas, muy poco se sabe acerca de la disposicin tridimensional de las molculas de colgeno en forma natural fibrillas. Este conocimiento puede dar una idea de los principales procesos biolgicos como la fibrillo-gnesis y la remodelacin tisular y en enfermedades tales como enfermedad cardaca y el cncer. Aqu presentamos una determinacin cristalogrfica del colgeno de tipo I estructura supramolecular, donde ha sido la conformacin molecular de cada segmento de colgeno que se encuentra dentro de la celda unidad cristalogrfica de origen natural definido (P1, un 40,0 , b 27,0 , c 678 , 89,2 , 94,6 , 105,6 ; reflexiones: 414, superpuestos, 232, y no superpuestas, 182; resolucin, 5,16 axial y ecuatorial 11,1 a). Esta estructura muestra que la topologa de empaquetamiento molecular de la molcula de colgeno es tal que los vecinos de embalaje estn dispuestas para formar un supertwisted (discontinuo) de mano derecha de microfibrillas que interdigita con microfibrillas vecinos. Esta interdigitacin establece la superretcula cristalogrfica, que est formado de molculas de colgeno quasihexagonally envasados. Adems, la estructura molecular de embalaje de colgeno que se muestra aqu ofrece informacin relativa a los posibles modos de accin de dos molculas importantes implicados en la salud humana y la enfermedad: decorina y la matriz metaloproteinasa (MMP) de colagenasa. Palabras clave: x-ray, fibra, cristalografa, fibrilla, matriz extracelular Aunque las caractersticas generales de la estructura de colgeno de tipo I se han conocido durante mucho tiempo, la disposicin especfica de embalaje de molculas de colgeno in situ ha seguido siendo difcil de definir, a pesar de una gran cantidad de esfuerzo por muchos investigadores ( 1- 16 ) (a la organizacin general de colgeno de tipo I se resumen en la Fig. 5, que se publica como informacin de apoyo en el sitio web PNAS).. Recientemente, hemos abordado este problema estructural difcil mediante el empleo de tcnicas convencionales de cristalogrficos de rayos X en experimentos de difraccin de fibra ( 13 , 17 , 18 ), que culmina en un mapa de densidad electrnica inicial ( 13 , 19 ) que permite una mirada crudo en algunos aspectos de la disposicin supramolecular de las molculas de colgeno in situ . Desafortunadamente, el alto grado de desorden observado en la regin de hueco de la

densidad de electrones asignar impedido la colocacin de un modelo molecular de la densidad de electrones, la regin de hueco era en gran medida no interpretable. Sin la estructura de la regin de hueco, que era imposible determinar la disposicin global molecular de molculas de colgeno in situ , y por lo tanto su potencial para mejorar nuestra comprensin de la funcin estructural, de desarrollo y patolgica de la fibrilla de colgeno a nivel molecular permaneci no realizada . Posteriormente hemos integrado adicionales (no superpuestos) datos de intensidad en el proceso de determinacin estructural (por reemplazo isomorfo mltiple), que, junto con la escala de mejora de los datos de intensidad y, por lo tanto, mejores estimaciones de fase, produjo una densidad de electrones mucho mejor y ahora claramente interpretable mapa de molculas de colgeno in situ . Un modelo que incluye todos los residuos de aminocidos de la molcula de colgeno a continuacin, se ajust a este mapa de densidad de electrones determinado experimentalmente, que verific la correcta solucin del problema de la fase y la ayuda en la interpretacin del mapa nativo. Colectivamente, este trabajo presenta una estructura de resolucin molecular de molculas de colgeno enteros in situ que no se ha descrito previamente. Ir a:

RESULTADOS Y DISCUSIN
Resumen de los resultados.

El mapa de densidad electrnica nuevo ahora muestra claramente todos los segmentos moleculares dentro de una clula sola unidad [de la longitud axial D , donde D es uno 670-una repeticin tal como se define por el axial Hodge-Petruska esquema ( 20 )], incluyendo la molecular cuatro segmentos dentro de la regin brecha previamente sin resolver. Este mapa no slo permite que la ruta completa de cada cadena de colgeno para ser visualizados y as determinar la naturaleza de la topologa de empaquetamiento molecular (que se describe aqu como interdigitada microfibrillas), pero proporciona datos especficos espaciales relevantes para posibles interacciones moleculares dentro de la matriz de mamfero extracelular (ECM ). Un modelo de acompaamiento que describe esta estructura fue ajustado a la densidad de electrones de una manera directa y tiene un total de R factor de 9,55% ( Fig. 1. ; vase tambin la Tabla 1, que se publica como informacin de apoyo en el sitio web PNAS). Aunque anteriores, de alta resolucin de los estudios cristalogrficos describir con precisin las caractersticas electrostticas de triple hlice y el potencial dentro de la molcula, y han sido muy importantes en estos aspectos, ( 15 , 16 ), este trabajo proporciona una visualizacin de la general, la estructura nativa, molecular y su arreglo de empaque.

La figura. 1. Antecedentes resta fuera de meridiano patrn de difraccin de tendn de la cola de rata ( superior ) y el patrn de difraccin de modelo simulado derivados de intensidades

( Baja ). R sim ( R factor de entre el modelo generado y observ patrn de difraccin) se determin que el 16,7%, ... Aunque de baja resolucin, el mapa de densidad de electrones permite la asignacin de la secuencia de aminocidos a las coordenadas molecular de cada cadena ( Fig. 2 ), debido a que el N y C se pueden identificar por el etiquetado tomo pesado ( 13 ). Identificacin de los segmentos restantes moleculares (2- 4 ) se consigue siguiendo una sola molcula de colgeno desde el trmino N a travs de varias clulas unitarias sucesivas a la terminal C ( Fig. 3. ), los resultados de los cuales se encontr que de acuerdo con las posiciones del retculo determinados a partir de los mapas de diferencia de Fourier ( 13 ) .

La figura. 2. Mapas de densidad electrnica. Elementos de mapa de A y B han sido comprimidos cinco veces a lo largo de la direccin paralela a lac -eje para mayor claridad. ( A ) Superposicin regin de repeticin 1D, que muestra la inclinacin comn de los cinco segmentos de colgeno dentro de la regin de solapamiento. La ...

La figura. 3. El colgeno organizacin y estructura. Los segmentos de colgeno estn etiquetados como sigue para B , C , y E : 1, gris, amarillo 5,; 2, rojo; 3, verde; 4, azul. Parte del segmento 1 es de color cian (el extremo N), y parte del segmento 5 es de color magenta (el extremo C terminal) ... La extensin de las regiones ordenadas (los cristalitos) dentro de las fibrillas de colgeno se ha medido desde el pico de Bragg ampliacin en el plano lateral del patrn de difraccin de tendn, despus de que el mtodo de Williamson-Hall ( 21 ) (vase la fig. 6, que se publica como informacin de apoyo en el sitio web PNAS). El tamao de los cristalitos se muestra como 429 , un valor que se corresponde bien con el valor deducido por Hulmes et al. ( 22 ) de 450 .

Hulmes et al. ( 22 ) propusieron un modelo de cristal lquido de fibrillas compuestas de dominios de cristalitos bien ordenados organizados aleatoriamente dentro de cada fibrilla de colgeno. El tamao del cristalito sugiere que hay un promedio de 10 o 11 clulas por unidad de dominio organizada, y dado el rango normal de tamao de fibrillas siendo 3,000 -5,000 , habra 10 dominios de cristalitos por fibrillas. El mtodo de Williamson-Hall tambin proporciona una estimacin de la distorsin de celosa, que en este caso se calcula para ser 1,55 (Fig. 6). Este resultado puede interpretarse en el sentido de un factor general de la temperatura media de 190 2 de la molcula de colgeno, aunque este valor no es uniforme debido a que la regin de diferencia es relativamente ms desordenado que el solapamiento (aproximadamente dos veces; promedio q factor de solapamiento es 0,89 y 0,49 para la regin de hueco).
Caractersticas de la estructura y su interpretacin.

La inspeccin del mapa de densidad electrnica y modelo ajustado muestra que cada molcula de colgeno est dispuesto dentro de un enrejado quasihexagonal largo de la superposicin y regiones de interfaz (el nivel axial de los telopptidos) y se observa que se inclina a travs de la regin de solapamiento ( 11 , 13 ) ( las Figs. 2 y y 3).3 ). Un hallazgo inesperado es que esta disposicin quasihexagonal ( Fig. 3 A ) se ve que contine en y en toda la regin de hueco, a pesar de la ausencia de la molcula de colgeno uno por celda unidad y el hecho de que, en esta regin, cada uno de los cuatro segmentos moleculares adopta una conformacin nica ( Fig. 2 D ), mientras que en la regin de superposicin de los segmentos tienen prcticamente la misma conformacin ( Fig. 2 A ). Adems, hay un cambio general de la direccin entre solapamiento y regiones brecha, dando lugar a una disposicin de plegado de las molculas de colgeno 1D escalonados ( Fig. 3 Ey F ). El punto de inflexin para cada "pliegue" se encuentra dentro de ambas regiones telopptido, los lugares donde se cree que se produzca unin intermolecular enlaces cruzados a travs de la lisina y la hidroxi-lisina. Esta estructura soporta esta hiptesis, aunque la resolucin del estudio no permite una delimitacin especfica de la larga lisina / hidroxi-lisina cadenas laterales. Varios grupos de lisina / hidroxi-lisina residuos que se encuentran dentro de los telopptidos se encontraron dentro de distancias de enlace plausibles entre los telopptidos y sus vecinos helicoidales ( Fig. 2. C , vase tambin la Tabla 2, que se publica como informacin de apoyo en el sitio web de PNAS ).
El colgeno Molecular embalaje y la Estructura microfibrilar.

A "microfibrilla" se cree que es el bloque de construccin bsico de la fibrilla de colgeno. La disposicin especfica de las molculas de colgeno que constituyen la supuesta microfibrilla mucho tiempo se ha buscado, y numerosos modelos que se han propuesto describir su estructura sea posible (ver ms abajo y las Figs. 7 y 8, que se publican como informacin de apoyo en el sitio web PNAS). Podemos identificar la estructura microfibrilar en nuestra determinacin mltiple sustitucin isomorfa de la in situ estructura de embalaje de colgeno mediante el trazado de la ruta completa de una sola molcula de colgeno a travs de varias celdas unitarias sucesivos y observando el eje central que l y sus vecinos girar alrededor ( Fig. 3 B y E ). Se puede observar que las molculas de colgeno de cuatro (plano lateral) clulas

vecinas unitarias comprenden una auto-contenido, cuerda-como unidad que se repite ( Fig. 3 E ). De las diferentes hiptesis anteriormente, las disposiciones estructurales, la que ms se parece esta estructura observada es la microfibrilla comprimido ( 7 , 9 , 11 , 13 ). Sin embargo, este modelo terico se ve que es ligeramente simplista, porque no se puede obtener una unidad pentamrica autnomo de acuerdo con las definiciones anteriores, cclicos ( 7 , 9 , 11 , 13 ) (debido a la progresin molecular, aunque de carcter cclico, se se describe mejor como espiral) sin la adicin de al menos una molcula "extra" colgeno para llenar posiciones no ocupadas dentro de la red (vase la fig. 8 y tambin la fig. 9, que se publica como informacin de apoyo en el sitio web PNAS). En contraste, la disposicin repetitiva de molculas de colgeno pentamricos presentados aqu es consistentemente auto-satisfactorio con respecto a la red de colgeno de envasado y puede describirse con precisin como una microfibrilla, que consta de cinco 1D escalonados, las molculas de colgeno plisadas, con un supertwist diestro . Microfibrillas vecinos estn entrelazados uno con el otro ( figuras. 3 F , 6 D , 8 F , y 9 D ).Especficamente, el embalaje quasihexagonal de las molculas de colgeno es continua y sin interrupciones porque la vecina N-y C-terminales que contienen segmentos moleculares estn contenidas dentro de las microfibrillas de vecinos, en lugar de ser dirigido internamente dentro de la microfibrilla. Esta disposicin indica por qu microfibrilla-como las estructuras an no se han extrado de muestras de tejido ( 23 ), porque, a pesar de que pueden ser identificados como entidades topolgicas, no son separables unidades estructurales en la forma madura. Cada microfibrilla contiene por lo menos dos a tres intermicrofibrillar reticulacin ( 7 , 24 ), sino tambin una unin intramicrofibrillar; por lo tanto, la interrupcin de los N-y Cterminal bonos durante la extraccin de colgeno no slo altera la fibrilar sino tambin la estructura microfibrilar de la muestra . Esta caracterstica tambin puede ayudar a explicar la capacidad de los tejidos fibrilares de absorber y transmitir fuerza mecnica, es decir, puede ser la estructura de colgeno considera que una cuerda de red en el que cada elemento de la matriz transmite la fuerza para el resto de la matriz a travs de la lisina-hidroxi -lisina reticulaciones mediadas ( Figs. 2 C y AND33 F ), mientras que los elementos microfibrilar mismos mantienen la estabilidad estructural a travs de la supertwist de mano derecha ( la fig. 3 ). Esta supertwist (que parece muy exagerada en estas figuras, debido a la compresin a lo largo de la c -eje, aproximadamente paralelo al colgeno de triple hlice, vase la Fig. 10, que se publica como informacin de apoyo en el sitio web PNAS, para no comprimida de vista. una nica molcula de colgeno) puede permitir que la estructura para absorber los efectos de torsin, sin interferir con la superhlice de la molcula de colgeno en s. La torsin sobre el supertwist se transforma en una fuerza que se transmite en tres dimensiones a travs de la matriz reticulada molecular de molculas de colgeno vecinos en cables vecinos microfibrilar. Estas reticulaciones se encuentran tanto en el N (axialmente contrado) - telopptido y la (doblado) telopptido C-terminal, que se reticula con el vecino 1D escalonados C-y N-terminal de los segmentos de colgeno, respectivamente ( 7 , 25 ) ( figuras. 2 C , , 33 D , y and44 ).

La figura. 4. Mapas de densidad electrnica. Los elementos de mapa han sido comprimidos cinco veces en la direccin paralela a la c -eje. El colgeno de triple hlice se muestra como un estilizado C rastro. (A ) La densidad de electrones (2 F o - F c P m ) Mapa y el modelo de estructura ...
Implicaciones para interacciones moleculares dentro de la ECM.

La estructura de embalaje de colgeno tal como se presenta aqu ofrece la penetracin en la unin de macromolculas importantes, tales como el arquetipo de pequeos ricos en leucina proteoglicanos (SLLP) decorina con colgeno de tipo I. La decorina se ha encontrado que es un potente regulador de colgeno fibrilar-gnesis, al parecer por la inhibicin de la asociacin lateral de molculas de colgeno por su unin anterior ( 26- 28 ). En un modelo animal de enfermedad donde se interrumpi el gen de la decorina, los ratones por lo dems viables posea piel frgil con resistencia a la traccin reducida, y fibrillas de colgeno anormalmente grandes y de forma irregular se observaron ( 29 ), rasgos similares a los observados en la enfermedad de tejido conectivo humano Ehlers- Danlos. Estos datos han sido aceptados como una clara demostracin de la importancia de la interaccin colgeno-decorina en el desarrollo y mantenimiento del tejido conjuntivo sano, y cualquier visin ofrecida en la naturaleza de la interaccin de decorina-colgeno in situ es probable que sea valioso para comprender la patologa de estas enfermedades del tejido conectivo. En el mapa de densidad electrnica, dos segmentos de colgeno (segmentos moleculares 2 y 3 de nuestro modelo) hacer giros relativamente agudos en la regin de hueco, desocupar dos grandes espacios moleculares en el arreglo de empaque a 0,6 D y 0,8 D ( Figs. 2 B y y 4).4 ). Estos segmentos contienen dos de los varios sitios que han sido implicados para decorina unin, a 0,8 D y 0,6 D (1,6 y D ) de la longitud molecular colgenos '( 30 , 31 ) (tambin equivalente a 0,8 D y 0,6 D dentro de la 1 D tambale embalaje del sistema). Si las molculas de colgeno en la superficie de la fibrilla tienen una estructura similar, entonces estos lugares estn claramente adecuado para acomodar el gran ncleo decorina protena, ya sea en forma monomrica ( 32 ) o dimrica ( 25 , 33 ) forma, aunque este hallazgo ciertamente no excluye la viabilidad de otros sitios propuestos de unin a lo largo de la superficie de la fibrilla de colgeno. La importancia de la 0,6 D y 0,8 D sitios reveladas por el mapa de densidad de electrones y el modelo presentado aqu es que cada uno puede proporcionar un "nicho" (agujero poco profundo) en el crecimiento de fibrillas de superficie que proporcione una mayor protenaprotena rea de contacto , y por lo tanto potencialmente la asociacin ms fuerte entre la decorina y el colgeno, que en otros sitios de decorina posible (y ms plana) de unin, mientras que todava permite decorina a "sobresalir" de la superficie de la fibrilla suficiente como para ser eficaces en la regulacin del dimetro de las fibrillas. Dos pequeos parches de densidad de electrones se observaron inicialmente en el 0,6 D y 0,8 D sitios en el mapa de densidad de electrones determinado experimentalmente ( Fig. 2 B ). Ninguno de los parches descritos constituyen cualquier parte de la ruta de las molculas de colgeno, pero ambos son lo suficientemente grandes como para acomodar dos o ms repeticiones ricas en leucina (LRR) del ncleo de la protena decorina. Dos LRRs, IV-VI, han

sido previamente implicadas en la unin a colgeno ( 34). Sin embargo, no hay evidencia directa conocida de la decorina se encuentra dentro de la fibrilla de colgeno, y este escenario parece poco probable, ya que requerira un reordenamiento pequeo pero significativo de la disposicin de embalaje en al menos 4% de las clulas de la unidad dentro de cada fibrilla de colgeno [hay 0,043 son molculas de decorina por colgeno monmero ( 35 )]. O este escenario pueda interrumpir el crystallineity del sistema o formaran parte del mecanismo que limita el dimetro de las fibrillas durante el crecimiento normal. Tambin es posible que la densidad a 0,6 D y 0,8D representa alguna otra molcula unido a baja ocupacin. La colagenasa (MMP1) interviene en la regulacin homeosttica de la ECM y est fuertemente implicado en la patologa de la enfermedad cardaca y el cncer (metstasis) y una serie de otras enfermedades. El mecanismo de reconocimiento del sitio de escisin por colagenasa no se entiende completamente, pero se cree que depender de los aspectos de la disposicin supramolecular del sustrato, es decir, colgeno nativo, adems de reconocer la secuencia de escisin tripptido ( 36 ). Su expresin tambin est regulado por la presencia de colgeno fibrilar nativo ( 37 ). El sitio de escisin de sustrato se encuentra dentro de la regin de solapamiento a 0,316 D , pero no hay espacio suficiente para la enzima para entrar en esta matriz de empaquetamiento denso en el interior de la fibrilla de colgeno.Dependiendo de la naturaleza de la unin trimolecular complejo (dominios catalticos y la hemopexina de MMP1 y el sustrato de colgeno molcula), el acceso al sitio tambin puede estar restringido a la enzima en el exterior de la fibrilla de colgeno debido a la proximidad de la bulbosa C- terminal de telopptido ( 18 , 38 ) para el sitio de escisin. Una escisin antes de la plegado C-telopptido ( Figs. 2 C yAND33 D ) reducira esta constriccin, aunque las molculas de colgeno todava tendra que ser movido a un lado al menos 10 para el dominio cataltico y un 20 por la hemopexina dominio similar para acomodar la enzima en el interior de la fibrilla. Alternativamente, parece muy posible que el modo de accin de la enzima es proteolyse cadenas de colgeno exclusivamente desde el exterior hacia el interior de las fibrillas. En ambos casos, la estructura 3D de la disposicin de colgeno todava sera determinar la unin al sustrato y el sitio de reconocimiento para la enzima, ya que proteolyses desde el exterior hacia el interior de la fibrilla. En conclusin, hemos presentado aqu una no descrita previamente, la estructura objetivamente determinado que muestra el embalaje de la molcula de colgeno completo in situ . Esta estructura proporciona una fuerte evidencia de una subestructura especfica para microfibrilar la fibrilla de colgeno y conocimientos importantes con respecto a la unin de colgeno por las macromolculas de ECM tales como decorina y colagenasa. La disponibilidad de este modelo determinado experimentalmente deben ser muy til para los investigadores que investigan la organizacin y la biologa molecular de la ECM. Ir a:

MTODOS
Recopilacin de datos, Estimacin Intensidad y Validacin.

Los mtodos utilizados para la preparacin de muestras, etiquetado derivado, y de rayos X de difraccin de protocolos se han descrito (11 , 13 , 18 ), al igual que los de la sustraccin de fondo y la intensidad de estimacin ( 13 , 19 ).Brevemente, datos de rayos X de difraccin de fibras se obtuvieron a partir de tendones enteros, intactos de cola de rata a temperatura ambiente, y los tendones se mantuvieron en un estado hidratado bien dentro de una celda de muestra sellada. Los datos fueron recogidos a partir de dos muestras nativas y aquellos derivados utilizando cloruro de oro y yoduro de potasio. Debido a un nmero significativo de superposicin de reflexiones, las intensidades de reflexin individuales se calcularon mediante el ajuste de un modelo de difraccin simulado a la observada fondo-resta patrn de difraccin utilizando un procedimiento de recocido simulado ( 13 , 19 ). Debido a que el 677,9 - c -eje de la celda unidad 3D es aproximadamente paralelo con el eje de la fibra (vase la Tabla 1), tanto las intensidades meridional y ecuatorial de los tendones derivados contienen informacin complementaria con respecto a la separacin axial entre los sitios de tomos pesados de etiquetado en el N-y C-telopptido regiones. Un estudio anterior ( 18 ) usando slo datos meridionales (001 ndices) produjo una estructura 1D detallado de la estructura de embalaje del colgeno mediante reemplazo isomorfo mltiple y dio la separacin especfica axial de los sitios de etiquetado tomos pesados (una unidad de distancia clulas fraccionadas de w = 0,330,41). Por lo tanto, la contribucin vectorial para el mapa de Patterson correspondiente a lac direccin del eje, que se calcula a partir de los datos de intensidad cercanas al ecuador, que se correlacionan con los vectores observados de la serie meridional. Este hallazgo ayud a verificar que los procedimientos de ajuste de indexacin y la intensidad producido una estimacin precisa de los datos, y no slo una casualidad que produce un bajo valor rms residual.
Las fases iniciales.

Las fases iniciales se obtuvieron mediante la bsqueda a travs de una matriz dispersa de posibles sitios de tomos pesados etiquetado, basndose en la diferencia 3D Patterson y el conocimiento de la estructura 1D. Bidimensional diferencia Patterson mapas ( 13 ) se generaron a nivel axial de los sitios de unin de tomos pesados determinados a partir de la estructura 1D ( 18 ). Estos fueron comparados con los nativos mapas de Patterson de las escalas misma longitud axial y, utilizados en conjunto, proporcionan una matriz de posiciones posibles de etiquetado en tres dimensiones. Dos principales vectores se utilizaron en la determinacin de la ubicacin de los tomos pesados: el vector de yoduro de ( U = 0,2, v = 0,4) y el vector de oro ( u = 0,05, v = 0,25), lo que representa la distancia 2D (uv plano) entre el tomo pesado etiquetado telopptidos no helicoidal. Las posiciones de los tomos pesados de etiquetado se mantuvo constante despus de varias rondas de clculos de fase: yoduro de estar centrado en las ubicaciones N-y C-telopptido ( U = 0,23, V = 0,51, W = 0,04, y U = 0,45, V = 0,93, W = 0,45, los segmentos 1 y 5, respectivamente) y el oro en esencialmente los lugares opuestos ( U= 0,37, V = 0,09, W = 0,04, y U = 0,31, V = 0,31, W = 0,45, segmentos 5 y 1, respectivamente). Otros detalles de la construccin de modelos, refinamiento y validacin se describen en los mtodos de apoyo , que se publica como informacin de apoyo en el sitio web de PNAS (ver

tambin Figs. 11 y 12 y en la Tabla 3, que se publican como informacin de apoyo en el sitio web de PNAS ).
Modelo de Validacin.

El R factor para las amplitudes integrados y amplitudes finales del modelo se encontr que era 9,55% y 16,7%, respectivamente, por comparacin de los patrones de difraccin observados y simulados ( R factor y R sim ; ver la figura 1. ; R w era 21,73%). El modelo es claramente consistente con el mapa de densidad de electrones determinado experimentalmente ( Figs. 2 y y 4),4 ), y las fases experimentales y el modelo se diferencian por 62 [equivalente a una figura de mrito (FOM) de 0,47]. Las coordenadas para el modelo monomrico decorin ( 39 ), el dmero recombinante decorina [Protein Data Bank (PDB) Identificacin cdigos 1XKU , 1XEC y 1XCD ] ( 25 ), y el modelo de fibroblastos colagenasa (AP cdigo ID 1FBL ) ( 40 ) se utilizaron para llevar a cabo estudios iniciales de colgeno y decorina interacciones de colagenasa de colgeno dentro del contexto de la estructura presentada aqu.Todas las estructuras del modelo fueron vistos usando SPOCK ( http://quorum.tamu.edu ) ( 41 ) y X -FIT (42 ). Ambos modelos de colgeno (pasos 3 y 4) comunicados a la AP han sido depositadas como C traza como se muestra en las Figs. 22- 4 debido a la relativamente baja resolucin de este estudio (5.16/11.1 ). Los factores de estructura observados acompaar la entrada de AP cdigo ID 1Y0F . Ir a:

MATERIAL COMPLEMENTARIO
Informacin de apoyo: Haga clic aqu para ver. Ir a:

AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a los Dres. Reed y Iozzo de proporcionar una copia de las coordenadas de su modelo de decorina, Olga Antipova para la comprobacin de secuencia crtica, el personal del Equipo de Acceso Biofsica en colaboracin (Biocat) (Institutos Nacionales de la Salud con apoyo del Centro de Investigacin RR08630), y el personal del Equipo de Biologa Estructural del Centro de Colaboracin de acceso (SBC-CAT) (apoyado por el Departamento de Energa de Grant W-31-109-ES-38) y el sureste del Equipo Regional de Acceso colaboracin (SERCAT) (instituciones de apoyo se puede encontrar enwww. ser-cat.org/members.html ) lneas de luz por su ayuda en el desarrollo de este proyecto. Este trabajo fue apoyado por la American Heart Association Gran Medio Oeste afiliado 0435339Z Grant (a JPROO). AM fue apoyado por una beca Leverhulme Investigador Emrito. TJW recibi el apoyo de la Biotecnologa y Ciencias Biolgicas de Investigacin Beca BBS/B/09643. El uso de la Fuente Avanzada de Fotones fue apoyada por el Departamento de Energa de EE.UU., Ciencias Bsicas de Energa, Oficina de Investigacin de la Energa, en virtud del Contrato W-31-109-SP-38. Ir a:

ABREVIATURA
ECM matriz extracelular. Ir a:

NOTAS AL PIE
Declaracin de conflicto de intereses: No hay conflictos declarados. Este documento fue presentado directamente (Track II) a la oficina de PNAS. Depsito de datos: Factores de las coordenadas atmicas y estructura han sido depositadas en el Protein Data Bank,www.pdb.org (AP ID cdigos 1Y0F y 1YGV ).

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NOTAS AL PIE

Estos dos parches aislados de densidad a 0,6 D y 0,8 D se observaron en el mapa de densidad electrnica inicial ( F o P o ) y no forma parte alguna de las molculas de colgeno. Sin embargo, los intentos de construir en esta densidad (utilizando dos ricas en leucina de las protenas de la estructura del modelo de decorina como un modelo genrico para esta densidad; datos no mostrados) result en un deterioro significativo de la R factor cuando se modela dentro de los rangos normales de ocupacin, y la disminucin de la efectos de las ocupaciones moleculares significativamente ms bajos haca difcil evaluar la precisin de la posicin relativa del modelado repeticiones ricas en leucina y la orientacin dentro de la matriz de colgeno de embalaje. Estos parches de densidad disminuyen en tamao en la 2 Fo - F c mapa. Ir a:

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