Universidade Federal de Santa Catarina UFSC Centro de Cincias Biolgicas CCB

Departamento de Microbiologia e Parasitologia - MIP

Aulas Prticas de Microbiologia

para Odontologia

Adriane Moro Mendes

Professora de Microbiologia

Camila Carvalho Kessler

Aluna da Graduao de Odontologia

2 FlorianpolisSC 2003

ndice

Aula I: Normas de segurana no trabalho ............................................................ 03 Aula II: Esterilizao e Desinfeco .................................................................... 04 Aula III: Microscopia a Fresco .............................................................................. 11 Aula IV: Meios de Cultivo e Tcnicas de Semeadura ....................................... 13 Aula V: Microscopia de Gram .............................................................................. 17 Aula VI: Antibiograma ......................................................................................... 19 Aula VII: Pesquisa de Microrganismos na Escova Dental ................................ 22

NORMAS DE SEGURANA NO TRABALHO NO LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA

As aulas prticas de Microbiologia tm como objetivo ensinar ao acadmico os princpios gerais e mtodos utilizados no estudo de microbiologia. Nestas aulas utilizaremos uma variedade de bactrias, sendo algumas patognicas para o homem, portanto essencial que as normas sejam seguidas, a fim de se evitar contaminaes acidentais. 12345678910111213141516O uso do guarda-p obrigatrio. Cabelos longos devem ser amarrados de forma a no interferir com reagentes e equipamentos. Limpar e desinfetar a superfcie das bancadas antes e depois de cada aula prtica. Lavar e sanificar as mos ao iniciar a anlise, ao sair do laboratrio e sempre que for necessrio. Se for portador de algum ferimento nas mos, procurar no tocar no material. Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado antes de iniciar a anlise. Utilizar exclusivamente material estril para a anlise. No caso de derramamento do material contaminado, proceder imediatamente a desinfeco e esterilizao. O mesmo procedimento dever ser repetido se ocorrer ferimentos ou cortes. No comer, beber ou fumar no laboratrio. Manter canetas, dedos e outros longe da boca. No utilizar material de uso pessoal para limpar os objetos de trabalho. Avisar ao professor em caso de contaminao acidental. Depositar todo o material utilizado em recipiente adequado, jamais deixando-os sobre a bancada. Flambar as alas, agulhas e pinas antes e aps o uso. Os cultivos aps a leitura devem ser esterilizados, portanto no os colocar na estufa ou despejar na pia. Ao acender o Bico de Bunsen, verificar se no h vazamento de gs ou substncias inflamveis por perto. Trabalhe sempre prximo ao fogo.

OBS: A utilizao do Bico de Bunsen essencial pois visa a diminuio de microrganismos no campo de trabalho atravs do calor. Para isso ele apresenta uma regulagem que torna possvel selecionar o tipo de chama ideal para o trabalho. No caso da Microbiologia deve ser utilizada a chama azul porque esta atinge maior temperatura e no forma fuligem. importante ressaltar que a chama apresenta diferentes zonas, e tal fato importante para que o processo de Flambagem seja executado adequadamente, j que certas zonas da chama devem ser evitadas. As zonas da chama so: Zona Neutra ( uma zona fria e, portanto, no deve ser utilizada para Flambagem), Zona Redutora e Zona Oxidante (so zonas onde j ocorre a combusto e, portanto, j podem ser usadas para a Flambagem). (fig. 1).

Figura 1 4

Aula Prtica II: Desinfeco e Esterilizao

ESTERILIZAO: Processo que visa a destruio total de todas as formas de vida de um material ou ambiente, atravs de mtodos fsicos ou qumicos. DESINFECO: Consiste na destruio, remoo ou reduo dos microrganismos presentes num material inanimado. Visa eliminar a potencialidade infecciosa do objeto, superfcie ou local. ASSEPSIA: Procedimentos que visam evitar o retorno da contaminao a um objeto, superfcie ou local. ANTI-SEPSSIA: Desinfeco de tecidos vivos, como pele e mucosas. Pode ser feita, por exemplo, atravs do Clorexidine a 0,12% para anti-sepsia intra bucal. LIMPEZA: Remoo de sujidades que indispensavelmente antecede os procedimentos de desinfeco ou esterilizao.

I- ESTERILIZAO:
A esterilizao o processo que inativa todos os microrganismos presentes em determinado material ou ambiente, portanto o mtodo indicado para uso em itens que de forma alguma podem ser usados quando houver qualquer tipo de contaminao, classificados como crticos, ou seja, aqueles que durante o atendimento odontolgico penetraro em pele e mucosa, ou sero introduzidos diretamente na corrente sangnea, sendo portanto de alto risco (p. ex. sonda exploradora, sonda periodontal, gaze, fios, campos, tesouras, etc.) A melhor maneira de garantirmos a destruio de microrganismos presentes em instrumentos e equipamentos mediante o uso do calor. A maioria dos microrganismos que causam infeces em seres humanos desenvolvem-se em temperaturas prximas a do corpo, ou seja, 37C. Assim, ao serem expostos a altas temperaturas, so destrudos; o que no acontece quando os colocamos em contato com baixas temperaturas, pois nesse caso o microrganismo fica apenas inibido, e no destrudo. Alguns microrganismos produzem esporos, que so formas de resistncia, podendo permanecer inativos por longos perodos e depois voltar ao estgio inicial de infectividade. Portanto as tcnicas de esterilizao devem destruir tanto a clula bacteriana, como os esporos. Existem diversos mtodos de esterilizao: Fsicos ou Qumicos. Mas definitivamente os mtodos de esterilizao mais empregados em odontologia so os que utilizam o calor, seja este mido (autoclave) ou seco (estufa, ou forno de Pasteur), sendo que o desempenho do calor mido (autoclave) melhor. I.1- Esterilizao por calor seco (Estufa ou forno de Pasteur) Este tipo de esterilizao realizado a temperaturas de 140C a 180C, com tempo de exposio de 60 a 120 minutos em estufas eltricas equipadas com termostatos. O calor seco ou ar quente em temperatura suficientemente alta levam a desnaturao e oxidao das protenas, que resultam na morte dos microrganismos. A utilizao do calor seco leva mais tempo que o calor mido, mas como existem materiais que no podem ser esterilizados no calor mido, o calor seco o preferido. indicado para esterilizar vidrarias, instrumentos de corte ou de ponta, os quais podem oxidar na presena do vapor da autoclave, e materiais impermeveis como ceras, pomadas e leos. Para ser eficiente, este processo depende de: - Aquecimento da estufa at a temperatura desejada antes da colocao do material. - Os materiais devem estar rigorosamente limpos e adequadamente embalados.

- A colocao do material deve permitir a circulao do ar, portanto a estufa no pode estar abarrotada de material. Deve ser mantida uma distncia de 2 cm entre as caixas. - O tempo de esterilizao deve ser contado apenas aps a colocao do material na estufa, e a partir do momento em que a temperatura foi atingida novamente. I.2- Esterilizao pelo Calor mido O calor mido pode ser utilizado para destruir microrganismos presentes em materiais atravs das formas de: vapor dgua, gua fervente e gua aquecida abaixo de seu ponto de ebulio. gua fervente a gua levada ao ponto de ebulio: 100C, este procedimento destri os microrganismos vegetativos presentes no meio lquido. Entretanto, os materiais ou objetos contaminados no so esterilizados com segurana pois alguns esporos bacterianos podem resistir a 100C por mais de 1 hora. Vapor dgua O vapor dgua sob presso a mais prtica e segura aplicao do calor mido. O aparelho destinado a este fim a AUTOCLAVE. um processo mais eficiente para destruir os microrganismos e os esporos, que o calor seco. A autoclavao feita a 121 C com tempo de exposio de 15 a 30 minutos. A penetrao do vapor no material garante maior nvel de destruio dos microrganismos, e por este motivo mais rpido. Funcionamento da autoclave: 1- A cmara de parede dupla da autoclave lavada com vapor fluente para remover todo o ar; 2- ento preenchida com vapor puro e mantida a uma determinada temperatura e presso por um perodo especfico de tempo. essencial que todo o ar residual inicialmente presente na cmara seja completamente substitudo por vapor dgua, porque se o ar estiver presente reduzir a temperatura interna da autoclave; 3- A autoclave usualmente operada a uma presso de 15 lb./pol , na qual a temperatura do vapor de 121C.

A eficincia do processo de esterilizao depende de alguns fatores:

Os materiais devem ser limpos antes do processo, sendo adequadamente embalados. O tempo deve ser contado a partir do momento em que a temperatura de 121C atingida. A distribuio do material no interior da autoclave deve garantir que o vapor atinja todo o material por igual. Se o material sair mido da autoclave indica falhas no processo, neste caso deve ser novamente esterilizado.

Controle da Esterilizao
imprescindvel o controle de qualidade nos processos de esterilizao. Como se trata de um processo que inclui diversas variveis (tempo, temperatura, limpeza prvia, conhecimento da pessoa responsvel pelo processo, etc), se qualquer destas variveis for negligenciada, o processo no ser efetivo e o risco de contaminao eminente. O controle deve ser realizado atravs de mtodos qumicos e bacteriolgicos. Os mtodos qumicos utilizam uma fita especial que mostra, atravs da mudana de cor, se a temperatura desejada foi atingida. Os mtodos bacteriolgicos utilizam a bactria chamada Bacillus subtilis, que por ser produtora de esporos, uma eficiente indicadora da qualidade do processo.

Este controle deve fazer parte da rotina do consultrio para garantir a sade dos pacientes e de toda a equipe.

Consideraes importantes
1. importante lembrar que necessria uma limpeza perfeita dos instrumentais antes de serem submetidos esterilizao. A presena de matria orgnica (leo, gordura, pus, sangue, e outras secrees) protege o microrganismo da ao esterilizante. adequado lavar manualmente os instrumentos com detergente e gua morna antes da esterilizao. 2. Depois de esterilizados, os equipamentos devem ser conservados em embalagens apropriadas, caso contrrio voltam a se recontaminar com microrganismos presentes no ambiente. 3. Estudos recentes mostraram que os termmetros e termostatos embutidos na estufas em consultrios odontolgicos no so confiveis, portanto, sugere-se que sejam utilizados termmetros calibrados de acordo com as especificaes do INMETRO. Se no for possvel, deve-se considerar que o termmetro de mercrio tem uma incerteza na medio da faixa de 5C a 10C. 4. Deve-se realizar o controle peridico da qualidade do processo, atravs de profissionais preparados para tal procedimento.

II- DESINFECO
Este processo pode ser realizado de forma fsica (Pasteurizao) e qumica (Desinfectantes), e pode ser classificado como sendo uma desinfeco de alto, intermedirio ou de baixo nvel, dependendo da quantidade de microrganismos inativados. 1- Desinfeco de alto nvel: inativa todos os microrganismos, exceto esporos. Ex: HBV, HIV e M. tuberculosis. Este tipo de desinfeco indicado para itens classificados como semicrticos, ou seja, que entram em contato com mucosas ntegras e pele no ntegra (p. ex. abridor de boca, condensadores de amlgama, esptulas para insero de resinas, etc.) 2- Desinfeco de nvel intermedirio: aquela que inativa bactrias na forma vegetativa ( M. tuberculosis), fungos e a maioria dos vrus. indicada para uso em itens classificados como no-crticos, ou seja, aqueles materiais que entram em contato apenas com a pele ntegra. (p. ex. estetoscpios, termmetros, esfigmomanmetros, gorro, mscara, refletor, etc.) 3- Desinfeco de baixo nvel: inativa a maioria das bactrias na forma vegetativa, exceto M. tuberculosis, alguns fungos e vrus. indicada tambm para itens de uso no-crtico. II.1- Desinfeco por agentes fsicos: Temperaturas abaixo de seu ponto de ebulio (100 C) Pasteurizao: o aquecimento lento a baixas temperaturas, suficiente para eliminar as clulas vegetativas de microrganismos, mas no os esporos, portanto, um mtodo de desinfeco de alto nvel. indicado o uso de temperatura de 77C por 30 minutos.

II.2- Desinfeco por agentes qumicos: 11.2.a) Mtodo de Desinfeco de alto nvel:
Glutaraldedo: indicado qualquer objeto sensvel ao calor, e para rpida desinfeco de itens reutilizados. utilizado em soluo a 2% com pH alcalino (7,5-8,5) por 30 minutos. Formaldedo: Pode ser encontrado na forma slida (pastilhas formalina) ou como soluo aquosa 37-40% (diludo em lcool ou gua). A soluo deve ser usada por30 minutos sendo a concentrao de 8% em soluo alcolica e 10% em soluo aquosa.

Perxido de Hidrognio: Age em presena de matria orgnica e deve-se fazer a imerso do material em soluo com concentrao de 3-6% por 15-30 minutos. cido Peractico: A concentrao de uso varivel para a desinfeco, sendo que o tempo de exposio deve ser no mnimo de 20 minutos.

11.2.b) Mtodo de Desinfeco de nvel intermedirio:

Compostos Clorados: Causam a inibio de reaes enzimticas intracelulares, desnaturao de protenas, e inativao de cidos nuclicos.Apresentam atividade antimicrobiana de amplo espectro, tem baixo custo e ao rpida, entretanto seu uso limitado, pois irritante, instvel por 24 horas, fotossensvel e voltil, alm de ser corrosivo para metais. Seu uso indicado para artigos de vidro e borracha, sendo contra-indicado para metais ( corrosivo). Apresenta-se na forma lquida (ex: Hipoclorito de sdio) e na forma slida (ex: Hipoclorito de Clcio), e o tempo de exposio dos artigos a estes compostos de aproximadamente 10 minutos. lcoois(Etlicos e Isoproplicos): Seu mecanismo de ao atravs da desnaturao de protenas. So usados em concentrao de 70% peso por 10 minutos, para a desinfeco de superfcies. O uso destas substncias contra-indicado para materiais mdico-cirrgicos, borracha, plsticos e acrlico. Fenlicos: Seu mecanismo de ao atravs do rompimento da parede celular, precipitando protenas, quando usado em alta concentrao, e alterao dos sistemas enzimticos fundamentais, quando utilizado em baixa concentrao. Sua concentrao para uso de 0,4-5% sendo que o tempo de exposio deve ser menor ou igual a 10 minutos. Seu uso indicado para descontaminao de ambiente hospitalar, itens cirrgicos e mdicos no-crticos, sendo que devem ser consideradas as limitaes devido a toxicidade (hiperbilirrubinemia crianas berrios), e ao residual em materiais porosos. Iodforos: Sua ao atravs de seu alto poder de penetrao na parede celular, levando a ruptura de protenas. So utilizados em concentrao de 30 a 50 ppm por um tempo menor ou igual a 10 minutos.

11.2.c) Mtodo de Desinfeco de baixo nvel

lcoois Compostos Clorados Fenlicos: em concentrao menor que 5% Iodforos: em concentrao menor que 30 ppm Compostos de Amnio Quaternrio: Age atravs da inativao de enzimas, desnaturao de protenas essenciais, ruptura da membrana celular. Sua concentrao para uso de 0,4 a 0,6% por um tempo de no mnimo 10 minutos. indicado para a limpeza de ambiente hospitalar (pisos, paredes e superfcies) Detergentes: So agentes tensoativos, com ao detergente, umectante e emulsionante. Podem ser classificados como Catinicos (p. ex. Quaternrios de Amnio), Aninicos (p. ex. sabes, detergentes sulfatados ou sulfonados), e Enzimticos. Este ltimo tem como princpio ativo enzimas proteinases, amilase e lpases, e,portanto, causam transformaes em protenas, polissacardeos e gorduras (ex: Endozime)

Principais Compostos Utilizados em Desinfeco e Assepsia

Agente lcoois (7080%) Espectro de ao* Grampositivas Gramnegativas BAAR** Grampositivas Gramnegativas BAAR Grampositivas Gramnegativas Grampositivas Gramnegativas BAAR Grampositivas Gramnegativas BAAR Grampositivas Gramnegativas BAAR Grampositivas Gramnegativas BAAR Grampositivas Gramnegativas Modo de ao Antisspticos Desnaturao Desinfectantes protica dissoluo de lipdeos Desinfectantes Desnaturao protica Uso Tempo de exposio Curto (10-15 min) Desvantagens Pouco ativo contra esporos

Fenis

Efeito imediato

Fenol puro corrosivo e de odor desagradvel No age sobre BAAR e esporos

Compostos Quaternrios de amnio Cloro

Antisspticos Sanitizantes Desinfectantes (instrumentos cirrgicos) Tratamento da gua

Alterao da membrana celular bacteriana Inativao enzimtica agente oxidante

Curto (10-30 min)

Efeito imediato

Odor irritante pouco ativo contra esporos Odor irritante pouco ativo contra esporos Pouco ativo contra esporos

Iodo

Antisspticos Inativao Desinfectantes enzimtica

Efeito imediato

Iodforos

Antisspticos Inativao Desinfectantes enzimtica

Efeito imediato

Aldedos***

Desinfectantes Desnaturao (instrumentos protica e superfcies) agente alquilante Antisspticos Inativao enzimtica

Curto (formas Tempo de vegetativas) exposio longo Prolongado (esporos) S agem enquanto em contato No atuam sobre BAAR e esporos

Metais pesados

*- Formas vegetativas; Fonte: Trabulsi, L.R., Microbiologia. Livraria Atheneu, R.J., 1991. **- Bacilos lcool-cido resistentes; ***- Ativos contra esporos Tcnica I: O experimento que ser realizado tem por objetivo verificar a ao de antisspticos sobre a microbiota das mos, para tanto devem ser seguidas as seguintes etapas: 1- Pegar uma placa de Petri contendo gar, e dividi-la em 4 partes iguais. Utilizar para isso a caneta de retroprojetor, fazendo a diviso na parte de baixo da placa. 2- Identificar cada quadrante com os respectivos ttulos: Controle ( C), Mo Suja (MS), Detergente (Det), lcool 70% (A), e lcool Iodado (AI ). Devem ser preparadas 2 placas seguindo o esquema abaixo.

3- No quadrante identificado como Mo Suja o aluno deve encostar o dedo (sem lavar) no gar por 1 minuto. 4- A seguir o mesmo aluno deve lavar as mos com detergente, sec-las levemente e encostar o mesmo dedo no quadrante do gar identificado como Detergente por 1 minuto. 5- O mesmo aluno deve ento lavar as mos com lcool, sec-las e encostar o mesmo dedo no quadrante do gar identificado como lcool por 1 minuto. 6- A placa deve ser levada para incubao. OBS: Nada deve encostar no quadrante identificado como Controle.

Tcnica II: Este procedimento tem por finalidade observar a efetividade do processo de esterilizao por autoclave, atravs da comparao entre material contaminado levado para o processo de esterilizao e aquele que no passa por esse processo.
23451- Retire um fio de cabelo (ou um pedao de unha), e divida o material em duas partes. Coloque uma parte do material em cada tubo de ensaio. Identifique os tubos, destinando um para a autoclave ( A) e o outro para a estufa (E). O tubo E deve ser imediatamente incubado. O tubo A deve ser encaminhado a autoclave, sendo a seguir tambm incubado (pela equipe de tcnicos do departamento).

Para ajudar voc a fixar o contedo, foram elaboradas algumas perguntas a respeito desta
aula. Responda-as e entregue ao seu professor de laboratrio. 1- Faa uma representao esquemtica dos resultados obtidos na avaliao da microbiota das mos.

Controle Mo Suja Placa I Detergente lcool 70% Controle Mo Suja Placa II Detergente lcool Iodado

Crescimento Bacteriano + ++ +++ ++++

2- Como voc interpreta os resultados obtidos? Qual a importncia da antissepsia das mos na odontologia?

Nome do(a) acadmico(a): __________________________________________________

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Nome do(a) professor(a): _________________________________________________________

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Aula Prtica III: Microscopia a Fresco

Sabemos que as bactrias so seres microscpicos, portanto a sua observao direta depende do uso do microscpio. Essa observao pode ser feita mediante o uso de corantes ou a fresco, sem colorao. A microscopia a fresco permite verificar viabilidade, tamanho, forma natural das bactrias e atividades celulares como a motilidade bacteriana. A respeito da motilidade possvel observar dois movimentos: o movimento flagelar, que ativo e caracterstico de bactrias dotadas de flagelos, e o movimento browniano, o qual passivo e ocorre na direo das correntes lquidas que se formam nas preparaes. Tcnica: Ser utilizada a tcnica denominada Gota Pendente, na qual o inculo fica suspenso em uma lmina escavada (lmina de Koch). Retire com uma ala esterilizada uma gotcula da cultura-teste. Deposite esta gotcula no centro de uma lamnula previamente limpa e seca. Coloque um pouco de vaselina nas bordas da concavidade da lmina escavada, tambm limpa e seca. Inverta a lmina cncava sobre a lamnula de forma que a gotcula ocupe o centro da concavidade. Inverta novamente a posio da lmina, de forma que a gotcula fique pendente no centro da concavidade. 6- Leve a preparao ao microscpio e focalize a gota com objetiva de 40x com luz reduzida (as bactrias possuem ndice de refrao prximo ao da gua). Diferencie os dois tipos de movimento: ativo (flagelar) e passivo (browniano). O movimento flagelar caracterizado pelo deslocamento, pela mudana da posio da bactria, enquanto que o browniano no acarreta mudana na posio, no h deslocamento autnomo da bactria. 12345-

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Para ajudar voc a fixar o contedo, foram elaboradas algumas perguntas a respeito desta
aula. Responda-as e entregue ao seu professor de laboratrio. 1- Desenhe o que foi visualizado na observao direta de microrganismos, exemplificando o movimento observado.

2- Qual a finalidade da utilizao da tcnica de gota pendente?

Nome do(a) acadmico(a): __________________________________________________

Nome do(a) professor(a): ________________________________________________________ 13

Aula Prtica IV: Meios de Cultivo e Tcnicas de Semeadura

Meios de Cultivo Os meios de cultivo, tambm chamados meios de cultura, so complexos que se destinam ao cultivo artificial de microrganismos. As tcnicas de semeadura permitem que o cultivo destes microrganismos nos meios de cultura seja eficiente e que as seguintes finalidades sejam atingidas: crescimento bacteriano; isolamento bacteriano; estudo da morfologia colonial; pesquisa de patogenicidade; pesquisa das caractersticas bioqumicas.

Os meios de cultivo devem conter as substncias exigidas pelas bactrias para o seu crescimento e multiplicao. Para que possam fazer a sntese de sua prpria matria nutritiva devem dispor de fontes de carbono (protenas, acares), fontes de nitrognio (peptonas) e fontes de energia. So tambm necessrios alguns sais inorgnicos, vitaminas e outras substncias favorecedoras do crescimento. Classificao dos meios de cultivo: - Quanto consistncia: Meios lquidos: so aqueles em que os nutrientes esto dissolvidos em uma soluo aquosa. O crescimento bacteriano nesse meio muda seu aspecto, ou seja o meio sofre uma turvao. Meios semi-slidos: so aqueles que possuem na sua composio, alm dos nutrientes, uma pequena porcentagem de um polissacardeo proveniente de algas marinhas, chamado gar. So geralmente utilizados em tubos e a partir desse tipo de cultura possvel observar a motilidade bacteriana. Meios slidos: so aqueles que possuem uma porcentagem maior de gar (cerca de 15 g/litro de gua destilada), alm dos nutrientes. Podem ser dispostos em tubos ou em Placas de Petri, dependendo da finalidade. Atravs do meio slido em placas de Petri possvel, utilizando-se a tcnica do esgotamento, conseguir o isolamento de colnias bacterianas e, portanto, o meio ideal para que seja feito o estudo da morfologia colonial. J a cultura em gar inclinado fornece somente o crescimento bacteriano com a obteno de uma biomassa de microrganismos. - Quanto funo: Meios simples: possuem os componentes essenciais para o crescimento de microrganismos pouco exigentes. Ex: caldo simples. Meios de enriquecimento: so adicionadas ao meio simples substncias enriquecedoras como sangue, soro, ovo, extrato de leveduras, etc. Ex: gar sangue. Meios seletivos: aqueles que favorecem o desenvolvimento de determinados microrganismos em detrimento de outros, geralmente pela adio de substncias inibidoras. Ex: gar SalmonellaShigella. Meios diferenciais: permitem o desenvolvimento de grupos de microrganismos com caractersticas relativamente definidas, o que permite diferenciar um grupo ou uma espcie de microrganismo. Ex: gar MacConkey. Meios de manuteno: so aqueles destinados a manter a viabilidade de uma cultura bacteriana. Ex: gar Nutriente.

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-Quanto natureza: Meios animados: so constitudos de clulas vivas, como animais de laboratrio, tecidos vivos ou ovo embrionado. Meios inanimados: no possuem clulas vivas. Podem ser naturais ou sintticos. Naturais so aqueles que possuem substncias provenientes da natureza, e o sinttico contm substncias obtidas em laboratrio. Ainda podemos obter meios de cultivo semi-sintticos, que so resultantes da unio dos dois anteriores. Os meios de cultivo so preparados e armazenados seguindo um rigoroso controle de qualidade, pois devem ser mantidas todas as suas propriedades nutricionais e garantida a esterilidade at o momento de sua utilizao. Tcnica de Semeadura A escolha da tcnica para o cultivo de microrganismos varia de acordo com o tipo de meio de cultura e a finalidade do cultivo, porm algumas regras devem ser seguidas nas inoculaes: -A agulha e ala de nquel-cromo (tambm chamada de agulha e ala de platina) devem ser esterilizadas por flambagem antes e aps qualquer cultivo. Tome cuidado de esfri-las antes da coleta. -Os recipientes devem sempre ser abertos prximos chama do bico de Bunsen. -Deve-se evitar ao mximo que as tampas dos tubos e placas fiquem sob a bancada durante o cultivo. Para garantir uma semeadura correta, deve-se evitar ao mximo perfurar ou rasgar o gar, pois poder ocorrer acmulo de bactrias neste setor do meio alm de alterar as condies de crescimento bacteriano. Tcnica I: Meio Lquido 1- Mergulhe a Ala de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe apresentada. 2- Mergulhe a ala carregada de bactrias no tubo com o meio de cultivo e agite a ala.

Figura 1

Tcnica II: Meio semi-slido 1- Mergulhe a Agulha de nquel-cromo esterilizada na cultura bacteriana que lhe fornecida. 2- Faa uma injeo com a agulha carregada com bactrias no meio de cultivo semi-slido.

Figura 2

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Tcnica III: Meio slido (gar inclinado) 1- Mergulhe a Ala de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe apresentada. 2- Encoste levemente a ala na parte mais baixa do plano inclinado e suba fazendo estrias na superfcie do gar.

Figura 3

Tcnica IV: Meio slido (Placa de Petri tcnica do esgotamento) 1- Divida a Placa de Petri em trs partes, fazendo linhas com a caneta retroprogetor na parte de baixo da placa. 2- Mergulhe a Ala de Platina esterilizada na cultura bacteriana que lhe apresentada. 3- Faa estrias em cada diviso, respeitando as linhas e utilizando da melhor forma possvel toda a superfcie da placa.

Figura 4

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Para ajudar voc a fixar o contedo, foram elaboradas algumas perguntas a respeito desta
aula. Responda-as e entregue ao seu professor de laboratrio. 1- Cite os trs tipos de meio de cultivo utilizados na aula prtica e suas finalidades.

2- Qual a finalidade do cultivo em meio slido em placa atravs de estrias de esgotamento? Explique.

3- Como se analisa o resultado obtido no crescimento do meio semi-slido?

Nome do(a) acadmico(a): __________________________________________________

Nome do(a) professor(a): ________________________________________________________ 17

Aula Prtica V: Microscopia de Gram

A parede celular de bactrias Gram-positivas difere-se das bactrias Gram-negativas pela presena de uma espessa camada de peptidoglicano e pela ausncia de uma membrana externa. Esta diferena de constituio da parede celular a base da colorao de Gram, uma tcnica primordial no diagnstico microbiolgico, visto que atravs dela se definem caractersticas morfolgicas e tintoriais da bactria em pesquisa. A colorao de Gram consiste em tratar bactrias sucessivamente com cristal violeta, lugol, lcoolacetona e fuccina (ou safranina). O cristal vioeta e o lugol formam um complexo denominado iodopararosanilina, o qual confere colorao roxa tanto pelas bactrias Gram-positivas, quanto as Gramnegativas. Com a adio de lcool-acetona, as bactrias Gram-negaticas liberam o complexo formado, pois a camada de peptidoglicano de pequena espessura, enquanto que as Gram-positivas retm o complexo, permanecendo roxas. A adio de fuccina (ou safranina) no altera a cor das Gram-positivas, mas confere a cor avermelhada as bactrias Gram-negativas, que foram descoloridas pelo lcool-acetona. Tcnica: -Esfregao da cultura bacteriana lquida: 1- Flambe uma ala, deixe esfriar, mantendo-a prximo a chama. 2- Retire uma amostra da cultura com a ala e deposite no centro da lmina. 3- Espalhe o material com a ala em movimento circular, obtendo um esfregao de forma oval, uniforme e fino. 4- Fixe o esfregao, passando a lmina na chama do bico de Bunsen, como se cortando a chama, repetindo este procedimento 3 vezes, para que o material fique bem aderido. -Esfregao de cultura bacteriana slida: 1- Flambe uma ala, deixa esfriar, mantendo-a prximo a chama. 2- Retire uma gota da gua estril e deposite sobre a lmina. 3- Flambe novamente a ala, espere esfriar, e retire uma amostra da cultura slida. 4- Leve a amostra at a gota de gua depositada sobre a lmina, e homogeinize com movimentos circulares, para obter um esfregao de forma oval, uniforme e fino. 5- Fixe o esfregao, passando a lmina na chama do bico de Bunsen, como se cortando a chama, repetindo este procedimento 3 vezes, para que o material fique bem aderido. - Adio de Corantes: 1- Coloque a lmina com o esfregao sobre um suporte. 2- Cubra a lmina com cristal violeta (Gram I) e deixe agir por 1 minuto. 3- Lave a lmina em jato fraco de gua corrente, do lado contrrio ao esfregao. 4- Cubra a lmina com lugol (Gram II), deixe agir por 1 minuto e depois lave novamente a lmina. 5- Cubra a lmina com a soluo de lcool-acetona (Gram III), verifique a descolorao que deve ocorrer em cerca de 20 segundos. 6- Cubra a lmina com fuccina Gram IV), deixe agir por 30 segundos, e, novamente lave a lmina. 7- Seque inicialmente o lado da lmina oposto ao esfregao com papel toalha, e a seguir seque o restante da lmina na chama do bico de Bunsen (como se estivesse cortando a chama). 8- Leve a lmina ao microscpio e observe em objetiva de imerso. (No esquea de colocar uma gota de leo para imerso sobre o esfregao)

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Para ajudar voc a fixar o contedo, foram elaboradas algumas perguntas a respeito desta
aula. Responda-as e entregue ao seu professor de laboratrio. 1- Faa um desenho esquemtico do que foi visualizado no microscpio, mostrando a morfologia bacteriana e a reao tintorial.

2- Fale sobre o fundamento da tcnica de Gram.

Nome do(a) acadmico(a): __________________________________________________

Nome do(a) professor(a): ________________________________________________________ 19

Aula Prtica VI: Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (ANTIBIOGRAMA)

Antibiogramas so bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a sensibilidade de bactrias aos antimicrobianos. A proposta primria deste teste guiar o clnico na escolha do agente apropriado para a terapia. Os testes de rotina fornecem dados acumulados, que so informaes sobre os agentes para uso emprico. Alm disso, estes testes so utilizados para avaliar in vitro a atividade de novos agentes, e auxiliar no mapeamento da emergncia de bactrias resistentes. A suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensvel, intermedirio ou resistente; ou quantitativamente em termos de MIC (minimun inhibitory concentration) ou MBC (minimun bactericidal concentration). 1- Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Mtodo de diluio: consiste em preparar sucessivas diluies dos antibiticos em meio slido ou lquido e em seguida semear a bactria em estudo. Aps incubao determina-se MIC e/ou MBC. 2- Mtodo de difuso de Bawer e Kirk (modificado pela FDA): um teste qualitativo, no qual discos de papel impregnados com o antibitico so colocados na superfcie do gar uniformemente semeado com o microrganismo. A droga se difunde no gar e produz inibio do agente sensvel, formando um halo de inibio que deve ser medido e comparado com tabelas padronizadas. Para a garantia desta tcnica, alguns fatores so essenciais: Meio de Cultura: normalmente utilizado o meio Muller-Hinton, que se caracteriza por ser um meio enriquecedor e com ausncia de substncias antagnicas. Cultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactrias, devendo-se realizar a colorao de Gram. A densidade do inculo deve corresponder a turbidez 0,5 na escala padro de turbidez (Escala de Mac-Farland). Tcnica: Para cumprir os objetivos desta aula ser utilizado o mtodo de difuso: 1- Sature um swab de algodo com a suspenso bacteriana (Fig 1). Remova o excesso de umidade girando o swab contra a parede do tubo. 2- Semeie a suspenso sobre a superfcie estril de uma SWAB placa contendo gar Muller-Hinton, utilizando sucessivamente trs direes para obter um inculo

Figura 1
uniformemente espalhado sobre toda a superfcie do gar ( Fig 2 ).

Figura 2
3- Distribua cinco discos de antibitico, sendo cada um de um antimicrobiano diferente, sobre a superfcie do gar inoculado, seguindo o esquema abaixo (Fig 3). Deixe uma distncia de aproximadamente 1 cm entre a borda da placa e o disco.

Figura 3

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4- Pressione levemente os discos para que no se desprendam durante a incubao. 5- Incube as placas por 24 horas a 37C.

Anlise dos Resultados

Atravs da anlise dos resultados poderemos classificar os microrganismos testados em: resistente, intermedirio, moderadamente sensvel, e sensvel, dependendo da formao ou no de halo inibitrio e tambm de seu dimetro(Fig 4).

Figura 4
No caso de formao de um halo inibitrio, este deve ter seu dimetro medido, e a medida encontrada deve ser comparada com tabelas padronizadas (Fig 5) . De modo geral, estas tabelas determinam medidas de dimetro, e dessa forma a medida encontrada em cada caso pode ento ser enquadrada em uma das quatro categorias supracitadas. FIGURA 5: Exemplo de Tabela de Halos de Sensibilidade Antimicrobiano Bacitracina Cefotaxima Gentamicina Tetraciclina Vancomicina Cdigo BAC CTX GEN TET VAN [g] 10 30 10 30 30 Halos de Inibio (mm) Moderadamente Intermedirio sensvel 9 a 12 15 a 22 13 a 14 15 a 18 10 a 11 -

Resistente <8 < 14 < 12 < 14 <9

Sensvel > 13 > 23 > 15 > 19 > 12

EXEMPLO: Se para um determinado microrganismo, utilizando-se o antimicrobiano Gentamicina, foi medido o dimetro de um halo de inibio e constatou-se que este era de 16 mm, tal microrganismo deve ser classificado como sensvel para a Gentamicina. Entretanto se o dimetro do halo fosse de 13 mm o microrganismo seria classificado como intermedirio a Gentamicina. No caso de no formao de um halo de inibio, o microrganismo seria considerado resistente.

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Para ajudar voc a fixar o contedo, foram elaboradas algumas perguntas a respeito desta
aula. Responda-as e entregue ao seu professor de laboratrio. 3- Descreva os resultados obtidos, indicando qual a bactria utilizada, a formao ou no do halo de inibio para cada antimicrobiano utilizado, indicando o tamanho do halo, caso este tenha se formado, e a classificao da bactria a respeito de sua sensibilidade a cada antimicrobiano.

2- Explique como se forma um halo de inibio.

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Aula Prtica VII : Contagem de Microrganismos na Escova Dental

A cavidade bucal um ambiente densamente povoado por microrganismos. Portanto considerando o ntimo contato da escova dental com tal ambiente de se imaginar que este objeto de higiene pessoal seja especialmente contaminado com os diversos tipos de microrganismos que habitam a cavidade bucal. O experimento a ser realizado, tem por objetivo a verificao da presena de microrganismos na escova dental, atravs de procedimentos quantitativo (contagem) e qualitativo (colorao de Gram). Tcnica: 1- Mergulhar a escova dental em balo ou erlenmeyer com caldo nutritivo estril (trabalhe prximo chama do Bico de Bunsen). 2- Agite a soluo por 5 minutos. 3- Retire a escova. 4- Faa a diluio, retirando, com auxlio de uma pipeta esterilizada, 1ml da soluo e transferindo para um tubo contendo 9 ml de soluo salina. 5- Agite bem o tubo. 6- Repita os procedimentos 4 e 5 para cada nova diluio sempre pegando uma amostra de 1 ml da ltima soluo preparada, e no esquecendo de a cada nova diluio utilizar uma nova pipeta esterilizada. 7- Retire 0,1 ml, utilizando uma pipeta esterilizada, da soluo com diluio de 10 -1. 8- Espalhe por toda a superfcie da placa de gar, utilizando a ala de Drigalski (de vidro). 9- Repita os procedimentos 7 e 8 para as diluies de 10 -2, 10-3, 10-4 e 10-5 , no esquecendo de identificar as placas com as diluies correspondentes a cada uma. 10- Leve as placas para incubar.

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Anlise dos Resultados

1- Anlise quantitativa: O objetivo desta anlise determinar o nmero de bactrias por ml, para isso: - Selecione uma das placas incubadas, que contenha entre 30 e 300 colnias; - Conte o nmero de colnias; - Calcule, no espao abaixo reservado, a quantidade de microrganismos utilizando a seguinte frmula: UFC* = (n de colnias) x 10** x (diluio utilizada para contagem) * UFC significa Unidade Formadora de Colnia, uma vez que a contagem feita referente s colnias e no s clulas presentes. ** 10 um fator de correo. EXEMPLO: Se so contadas 105 colnias em uma placa onde foi feita diluio de 10 -2 , o clculo final ser: UFC= 105 x 10 x 102 = 1,05 x 105 UFC/ml 2- Anlise dos microrganismos atravs do mtodo de Gram. O objetivo desta anlise verificar o tipo de microrganismos presentes segundo: forma, arranjo e reao tintorial (Gram positivo ou Gram negativo). - Com a ala esterilizada, retire uma gota do tubo de ensaio com gua destilada e deposite sobre a lmina. - Com a ala esterilizada, retire 2 a 3 colnias da placa com as culturas bacterianas.

- Leve a massa bacteriana at a gota previamente depositada sobre a lmina, e misture com movimentos circulares, formando um esfregao de forma aproximadamente oval.
- Seque a lmina na chama do bico de Bunsen. - Core a lmina, atravs do mtodo de Gram. (siga as instrues da Tcnica de adio de corantes, pg. 16). CLCULO DA UFC

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Para ajudar voc a fixar o contedo, foram elaboradas algumas perguntas a respeito desta
aula. Responda-as e entregue ao seu professor de laboratrio. 4- Calcule a quantidade de microrganismos (UFC), seguindo as instrues da Anlise Quantitativa, dos cultivos feitos a partir de microrganismos da escova dental.

5- O que se pode concluir a respeito da quantidade de microrganismos encontrados na escova dental ?

6- Utilizando o mtodo de Gram, quais os tipos bacterianos foram predominantemente observados dentre os microrganismos encontrados na escova dental?

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