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Il
IJ

INSTITUT FRANCAIS DE RECEHRCHE SCIENTIFIQUE POUR LE DEVELOPPaENT EN COOPERATION

(ORSTOM)
CENTRE D'ADIOPODOUME
B.P. V-51 ABIDJAN (Cte d'Ivoire)
Laboratoire de Biotechnologie
UR. 7
QUELQUES ASPECTS DE LA MORPHOGENESE
DES IGNAMES CULTIVEES IN VITRO
Alain PETERS
Mmoire de fin d'tudes de l'ISTOM
INSTITUT SUPERIEUR DES TECHNIQUES D'OUTRE-MER
74me Promotion
Rapport de stage ORSTOM
10.07.86 - 12.12.86
tt2 0CXJl11 0 \Y.
2 ~ f P \
N0 (', ~ J c.LN\ ~

Pendant son sjour, l'intress sera plac sous la t u t e l l ~ scienti-

fique du Centre DRSTQM d'Adiopodoum.
A l'issue de son stage et sous une forme qui, sera prcise
par sa structure de tutelle scientifique, Monsieur PETERS devra communiquer
mes services (DPR) son rapport de stage.
'JR'
1 \
Progr8lMlation,
-, " l'
J ~ ,.
..
....
COULIBALY
,
Abidjan, le
P/ Le Ministre et P.O.
REPUBLIQUE DE COTE D'IVOIRE
Union-Discipline-Travail
---'----
MRS/DPR-4/S N . ~ , /
STAGE DE AUTORISATION
-------------------------
-------------------------
LE MINISTRE DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE DE COTE D'IVOIRE, sous-
sign, autorise Monsieur PETERS, tudiant en 3e Anne (l'ISTDM en trance,
effectuer un stage au Laboratoire de Biotechnologie du Centre ORSTOM
d' Adiopodoum.
(
HINISTERE DE LA RECHERCHE
SCIENTIF"IQUE

~
DIRECTION GN!'\ALE 14. BAYARC . :SCC8 PA.RIS . . TLP'<e: .... E 11531.S2
Jean L t.. UNA y
Oirteteur du Cencrr ORS rOM
d'A OIOP:jLOL'.\i G
12 dcembre 1986
1
ADIOPODOUM!, le
ATTESTATION DE STAGE
Je soussign, Jean LAUNAY Directeur du Centre CRSTOM
certifie que Monsieur PETERS Alain tudiant de l'Institut
Suprieur Technique d'Outre Mer (ISTOM) a effectu un stage du 15 juillet
au 12 dcembre 1986 au laboratoire de Biotechnologie }Ur "la fusion pro-
toplasr.Jique de l'igname".
CENTRE O'AOIOPOOOU'-C
RPVBlIQUE FRAPIIAISE
Boite Postale n
D
V51 ABIDJAN
Rtpubl,quo do CIO d"olro
'"ory COUI Ellonbo,nkolo
HI. : (225) 33 24.45 . 37.44.45 . 37.41.70
1
orneE DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
ET TECHNIQUE OUTRE MER
REMERCIEMENTS
Ce stage a t effectu au laboratoire de Physiologie-Biotechnologie Vgtales
du Centre ORSTOM d'Adiopodoum (BP. V-51) ABIDJAN, en Cte d'Ivoire.
J'exprime toute ma gratitude Monsieur Ministre de la Recherche
Scientifique de Cte d'Ivoire, Monsieur le Directeur du Centre ORSTOM
d'Adiopodoum pour m'avoir autoris effectuer ce stage.
Je remercie vivement Mr. H. CHRESTIN, Docteur d'Etat, qui a bien voulu
m'accueillir au sein du laboratoire dont il est responsable. Je tiens remercier tout
particulirement Mr. B. MALAURIE, responsable du programme Igname, Mme. M.F.
TROUSLOT, Docteur d'Etat, pour la qualit de l'encadrement et les conseils qu'ils
m'ont prodigus ainsi que pour leur grande disponibilit moI'! gard durant tout le stage.
Je remercie galement Mr. ZADI KOUBI P. ; Mr. KASSE ZADI NESTOR et
Mr. TOLLAH CHARLES qui m'ont permis d'aborder certaines techniques de culture "in
vitro" , pour l'aide qu'ils m'ont procur et l'ensemble du personnel du laboratoire pour
l'excellente ambiance de travail que j'y ai rencontr.
Je remercie enfin, Monsieur K. BONFOU et P. DAVID qui ont eu la
gentillesse de dactylographier ce rapport avec beaucoup de comptence.
INTRODUCTION
1. GENERALITES
2. MATERIEL ET METHODES
1.1. L'igname
2.1. Le matriel vgtal
2.2. Les milieux de culture
1.2.1.
1.2.2. Dfinitions
1.2.3. Aperu des diffrentes techniques de
1.2.4. Conclusion
1.2. La culture in vitro
1.1.1. Dioscorea a/ara
1.1.2. Dioscorea cayenensis
1.1.3. Dioscorea escu/enla
1.1.4. Dioscorea dumerorum
1.1.5. Dioscorea bu/bifera
1.1.6. Conclusion
culture in vitro

2.2.1. Les lments minraux

2.2.2. Les lments organiques
2.2.3. Les rgulateurs de croissance
2.2.4. Conditionnement des milieux
2.3. Techniques et conditions de culture
2.3.1. La micropropagation
2.3.2. Le sevrage
2.3.3. La callogense
2.4. Mthodes d'analyse des rsultats
3. RESULTATS
3.1. Analyse de la morphogense in vitro chez les
ignames microboutures
3.1.1. Morphologie du dveloppement
3.1.2. Comparaison de la cintique de croissance
de 4 ignames microboutures sur M50
3.1.3. Influence du milieu
3.1.4. Influence du contenant
3.1.5. Conclusion

'
.'
~ .
. ~
.]

:
..
'
. ~

2
3.2. Le sevrage
3.2.1. Introduction
3.2.2. Rsultats et discussion
3.3. La caIJogense
3.3.1. Introduction
3.3.2. Les milieux de callogense
3.3.3. Rsultats
3.3.4. Conclusion et discussion
CONCLUSION GENERALE
BmLIOGRAPHIE
.'

.'
,:

. :
J
.'
.:
.J
.1

INTRODUCTION
L'igname, plante vivrire des rgions intertropicales humides, est une
monocotyldone appartenant la famille des Dioscoreaces. Cette famille de
plantes herbaces aux tiges volubiles produisent des tubercules, des rhizomes,
des bulbilles. Certaines espces d'ignames ont tt domestiques et cultives
pour leurs tubercules comestibles tandis que d'autres se sont rvles tre une
source de sapogtnines strodiques (Dioscorea composita , D. deltoidea )
exploitable en culture in vitro (KAUL et STABA 1967, 1969).
Le genre Dioscorea renferme plus de 600 espces. Mais, malgr
cette diversit, une dizaine seulement sont cultives :
Dioscorea alata, D. bulbilera, D. esculenta, D. batatas
originaires d'Asie;
D. cayenensis ,D. rotundata ,D. dumetorum originaires d'Afrique;
D. trifida originaire d'Amrique;
D. mumularia ,D. penraphylla originaires d'Ocanie.
Parmi ces espces, seules D. cayenensis ,D. rotundata ,D. alata
font l'objet d'une culture grande tchelle et prsentent une importance
conomique en Cte d1voire.
La production mondiale est estime entre 20 et 25 millions de tonnes
de tubercules par an. Elle couvre 12 % de l'alimentation de base des
populations des rgions intertropicales et arrive au 4me rang des plantes
tubercules aprs le manioc, la pomme de terre et la patate douce. Le premier
producteur mondial est le Nigria avec 14 millions de tonnes, la Cte d1voire
produit en moyenne 4 millions de tonnes par an.
Cependant. les difficults d'amlioration varitales et le mode de
culture astreignant de l'igname limitent son extension et s'opposent son
intgration dans un systme de culture mcanis.
L'amlioration de l'igname par les mthodes in vitro est une voie
pour rduire ces difficults. En effet, le recours aux techniques de culture in
vitro permet de pallier aux insuffisances de la reproduction sexue de l'igname
en provoquant une variabilit gntique ou en crant des hybrides somatiques.
1. GENERALITES
1.1. L'igname
L'igname est une. plante le plus souvent annuelle, quelquefois
prenne comme D. minutijlora ou D. mangenotiana . n prsente une
phylotaxie variable; les feuilles sont d'abord alternes puis opposes. L'igname
est principalement dioque. nexiste nanmoins des varits monoques et plus
rarement hennaphrodites. Les inflorescences sont des pis axillaires qui portent
des fleurs trs petites, de l'ordre du mm. Le fruit est une capsule triloculaire
contenant en moyenne 6 graines ailes.
3

fi

Les climats humides (1800 mm/an) saisons sches peu longues

conviennent bien all ignames. Ainsi, la production en Afrique de l'Ouest
s'tend longitudinalement de la Cte d1voire aux montagnes du Cameroun et
latitudinalement de la fort tropicale la savane.
L'aire gographique des Dioscorea comprend tous les continents de
la zone intertropicale et quelques rgions des continents climat tempr. Cette
large rpartition prouve leur grande capacit d'adaptation qui se traduit par une
htrognit morphologique et physiologique.
Les espces cultives sont dioques et possdent une floraison trs
irrgulire. La phase de reproduction est extrmement rduite au profit de la
phase vgtative. Aussi, la reproduction sexue est trs dlicate et difficile
obtenir en champ. De nombreux facteurs contribuent aux difficults
d'hybridation :
la floraison incertaine ;
la pollinisation prcaire du fait de la dioecie, de la petitesse des
fleurs, de la nature collante des grains de pollen, de leur faible variabilit
(SADIK, 1976) ;
l'incompatibilit inter ou intra spcifique qui peut exister.
La multiplication vgtative est le seul moyen d'assurer la continuit
de la culture. Elle se fait traditionnellement l'aide des tubercules.
Des fragments de tubercules sont enterrs au sommet des buttes
dbut avril avant la saison des pluies. Le port lianescent de l'igname ncessite
le tuteurage de la parcelle. L'arrt de la croissance vgtative et le
desschement du feuillage marquent le dbut de la rcolte. Elle intervient 6
Il mois aprs la plantation. Les tubercules rcolts ont des formes et des
couleurs trs variables selon les varits. Ils entrent en dormance aprs la
Les diffrentes espces se distinguent par leurs caractristiques
botaniques portant sur la tige, la feuille et le tubercule.
1.1.1. Dioscorea a/ara
Cette espce, largement rpandue dans toutes la zone intertropicale,
est originaire d'Asie.
Elle prsente une tige quadrangulaire, aile et des feuilles
cordiformes reconnaissables. Certains cultivars fleurissent abondamment en
formant des fleurs mles et femelles, mais la production de fruits est
extrmement rare. En plus du tubercule, des bulbilles apparaissent l'aisselle
des feuilles suprieures chez quelques cultivars: 'Brazo Fuert', 'Ouodouble',
n existe de nombreux types varitaux qui sont autant de formes
diffrentes de tubercule.
Cette espce est tardive et se rcolte 8 Il mois aprs la plantation.
4

'.
1

1.1.2. Dioscorea cayenensis , D. rotundata

Originaires d'Afrique, ces deux espces sont difficiles dissocier.
Leurs tiges sont cylindriques, pineuses ou inennes, leurs feuilles
plus arrondies que D. alata . D. cayenensis fleurit quelquefois mais donne en
majorit des fleurs mles ce qui rduit les possibilits de fcondation. Quelques
D. rotundata multiplies par voie vgtative arrivent fleurir et produire des
graines (SADIK, 1976).
Le cycle vgtatif de D. cayenensis est identique celui de D. alata
tandis que D. rotundata possMe un cycle vgtatif plus court avec la
possibilit d'obtenir 2 rcoltes. En effet, si on coupe le tubercule 5 6 mois
aprs la plantation en laissant le sommet du tubercule bien en place dans la
butte, la plante poursuit sa croissance et produit une deuxime rcolte 3 4
mois aprs la premire.
1.1.3. Dioscorea escu/enla
ns'agit d'une espce tige cylindrique, pineuse et feuilles petites
en forme de curs.
Elle est originaire d'Asie du Sud Est et possde un cycle vgtatif
long de 8 Il mois.
Elle produit plusieurs petits tubercules (20 50) chair blanche par
pied.
1.1.4. Dioscorea dwnetorum
Cette espce africaine se rencontre frquemment l'tat sauvage.
Elle prsente des feuilles trilobes et une tige cylindrique non
pineuse. Elle est trs vigoureuse, fleurit et produit un groupe de gros
tubercules ainsi que des bulbilles. Les tubercules sauvages sont souvent
1.1.5. Dioscorea bu/bifera
Cette espce, d'origine asiatique ou africaine possde une tige
cylindrique, non pineuse qui porte de larges feuilles.
Elle a la particularit de produire de gros tubercules ariens ou
bulbilles qui sont les principaux organes de rserve. Celles-ci apparaissent
l'aisselle des feuilles suprieures en fin de cycle et assurent une propagation
vgtative dans les conditions naturelles.
1.1.6. Conclusion
Les ignames prsentent une diversit gntique qui gagnerait tre
exploite des fms agronomiques et alimentaires. Cependant, la mise en valeur
de la richesse du genre Dioscorea se heurte l'insuffisance de la reproduction
sexue. En effet, la Biologie florale des espces cultives ne permet pas
d'assurer aisment une slection classique par hybridation zygotique,
interdisant mme toute hybridation interspcifique. La culture in vitro permet
de contourner cet obstacle en ayant recours la voie somatique. Elle offre la
possibilit de progresser en matire de slection.
5
1.2. La culture in vitro
1.2. 1. Historique
Les premires cultures de tissus de Dicotyldones ont t ralises par
GAUTIIERET, NOBECOURT et WlllTE en 1939 tandis que celles de
Monocotyldones ont t mises au point par MOREL et WETMORE en 1950.
En ce qui concerne les Dioscoraces, les premiers travaux ont port
sur la formation de bulbilles in vitro. Les premires colonies tissulaires ont t
obtenues sur D. composita et D. sansibarensis (RAO, 1969). Plusieurs voies de
recherches sont suivies l'heure actuelle:
- Production de mtabolites secondaires;
- Production de semences artificielles(bulbilles, embryons somatiques)
- Recherche de variabilit ;
- Fusion de protoplastes.
1.2.2. Dfinitions
La culture in vitro recouvre toutes cultures de matriel vgtal
effectues en conditions aseptiques. Elle fait appel aux potentialits gntiques
des cellules vgtales. Celles-ci renfennent la totalit de l'infonnation gntique
d'une plante dans leurs noyaux et devraient, par consquent, pouvoir reproduire
cette plante. Cette aptitude des cellules exprimer la totalit du gnome est la
totipotence cellulaire. Elle se manifeste lors de la mise en culture in vitro ,
l'expIant tant libr des corrlations existant dans la plante entire.
La mise en culture in vitro s'accompagne gnralement d'une
ddiffrenciation et d'une reprise de l'activit mitotique. L'expIant peut voluer
dans diffrentes directions (callogne, organogne, embryogne... ) suivant
certains facteurs :
- le choix de l'expIant
- le milieu de culture
- les conditions de culture.
La culture in vitro vise orienter et contrler les processus
physiologiques qui commandent le devenir de l'expIant en modulant ces trois
facteurs.
1.2.2.1. Le choix de l'expIant
Le choix de l'expiant est primordial dans l'obtention de la rponse
dsire. C'est--dire que selon la nature de l'expIant (feuille, tige, racine), son
pass, son ge, sa taille, la rponse in vitro peut varier considrablement. Il
convient de choisir un expIant capable de ragir favorablement ("tissu
comptant") aux conditions in vitro .
6
1.2.2.2. Le milieu de culture
Le milieu de culture est une solution nutritive aqueuse qui sert de support
la croissance. Elle contient des macrolments, des oligolments, des lments
organiques (sucres, vitamines, acides amins, et des rgulateurs de croissance
selon les besoins). La solution est solidifie au moyen de glose que l'on ajoute au
milieu de culture.
Des auteurs ont mis au point des solutions bien dfinies de micro et
macrolments (MURASHIGE et SKOOG, 1962 ; HELLER, 1959) et de
vitamines (MOREL et WETMORE, 1950). Les rgulateurs de croissance peuvent
tre additionns des concentrations variables pour stimuler l'embryogense, la
rhizogense, la caulogense ou la callogense.
1.2.2.3. Les conditions de culture
Les conditions de culture comprennent le type de flaconnage, la lumire
et la temprature. Elles peuvent influer fortement sur le comportement de l'expIant
notamment par la photopriode, l'intensit et la qualit de l'clairement, les hautes
tempratures.
1.2.3. Aperu des diffrentes techniques de culture in vitro (Tableau 1)
1.2.3.1. La micropropagation
La micropropagation est une multiplication vgtative in vitro . Elle
utilise les capacits naturelles de multiplication d'une espce pour la reproduire un
grand nombre de fois. La reproduction tant conforme, on obtient ainsi des clones.
La vitrothque d'igname, constitue par Monsieur MALAURIE au laboratoire de
Biotechnologie de l'Institut franais de recherche scientifique pour le
dveloppement en coopration (ORSTOM) Adiopodoum est maintenue et
renouvele par microbouturage. La vitrothque sert de matriel vgtal de base
pour dvelopper diffrents programmes de recherche.
Cette technique prsente de srieux avantages:
- taux de multiplication lev ; au laboratoire de Biotechnologie
(ORSTOM Adiopodoum), D. a/ara cv 'Florido" possde un taux de
multiplication de 4 plants aprs n x 5 semaines, (2000 000 en 1 an) ;
- faible encombrement des vitroplants ce qui permet de conserver une
collection sur peu de surface ;
- indpendance vis--vis conditions climatiques externes.
De nombreuses espces horticoles sont ainsi multiplies (Saintpaulia,
Cymbidium, fraisier, rosier, geranium... ).
7
- ..

TABLEAU
Noeuds, bourgeons
Mristmes
: SCHEMA RECAPITUlANT LES DFFERENTES TECHNIQUES DE
CUlTURE IN VfTHO .
micropropagation
.......
culture de mristmes
.......
Plante entiere conforme
Plante Indemne de virus
cf , ?-
androgense,lJynogense
Plante haplode Gametophyte

+Igne pure homozygote

Emb<y0r somatique.
... Plante entire conforme
Cals

Plante contorme, variante, ou mutante

!
Embryons, cotyldons, ~
hypocotyles, tiges, feuilles ...
Suspension .c.ellulalre

Production de mtabolites \1 aires

!
Protoplastes

Hybride somatique

1.2.3.2. La culture de mristmes

L'inconvnient principal de la multiplication vgtative traditionnelle est
de transmettre les maladies virales aux plants fils. C'est le cas notamment des
ignames de Cte d'Ivoire chez lesquelles le mode de multiplication a contribu
l'expression des maladies virales. Les rgions mristmatiques ne comportant pas
de virus, les plantes entires issues de culture de mristmes sont galement
indemnes de virus. Un bon exemple d'assainissement est celui de la varit de
pomme de terre Belle de Fontenay (RAJNCHAPEL-MESSANI et GUERCHE,
1985).
1.2.3.3. La culture d'haplodes
Cette technique consiste rgnrer une plante entire par la culture in
vitro de grains de pollen, (androgense) ou d'une cellule de sac embryonnaire
(gynogense). Les plantes ainsi obtenues sont haplodes et trs souvent striles.
Elles sont des instruments de la slection, leur intrt est de faciliter l'tude des
caractres, ceux-ci s'exprimant tous chez les plantes haplodes, et de pouvoir
donner des lignes pures homo7,ygotes par doublement du stock chromosomique.
1.2.3.4. La callogense
La callogense est la noformation d'un cal, tissu cellulaire indiffrenci
en division mitotique, in vitro partir d'explants tels que des feuilles, des
hypocotyles. Cette formation rsulte de la leve des corrlations lors du
prlvement de l'expIant et d'un effet stimulant des substances trophiques (sucres,
azote... ) ainsi que des rgulateurs de croissance. Une auxine est souvent
ncessaire l'induction de la callogense.
Le stade cal est une tape importante en culture in vitro. Il offre de
nombreuses possibilits telles que .:
- constituer un matriel vgtal indiffrenci et en division,
avantageusement utilisable pour obtenir des protoplastes (cellules sans paroi pecto-
cellulosique). La principale difficult en matire de protoplastes issus de tissus
diffrencis (feuilles en gnral) est d'arriver provoquer la mitose.
L'amlioration de l'igname est le programme central de recherche du laboratoire de
Biotechnologie de l'ORSTOM d'Adiopodoum. n vise produire des hybrides
somatiques susceptibles de prsenter des caractres agronomiques ou de
rsistances intressants.
Le cal est galement une tape dans la mise au point de suspensions
cellulaires. Celles-ci sont recherches sur des plantes mdicinales afin de produire
des mtabolites secondaires pharmaceutiques;
- produire des massifs cellulaire caractres mristmatiques qui
volueront vers la nofonnation de racines et de tiges. Le passage par un stade
indiffrenci pouss, ncessaire l'organogense future, est source de variabilit.
Les plantes rgnres pourront prsenter des modifications morphologiques par
rapport la plante dont est extrait l'expIant Des traitements (rayons X, rayons 1)
sont parfois appliqus pour provoquer ces mutations ;
8
L...-__ __--1__ __1 CLONES J
D. alata
Namassou Blanc
CA 01
D. alata
Kinampay
CA 02
D. alata
Binugas
CA 03
D. alata
Dovokokore
CA 04
D. alata
Douoble forme plate
CA 05
D. alata
Vinoe CA 06
D. alata
Goroto
CA 07
D. esculenta Sea 20
CA 08
D. escul enta
Sea 32 CA 09
D. esculent..3 Sea 33
CA 10
D. esculenta
Sea 18
CA 11
D. yenensls
Gbangan CA 12
D. alata
Nza Lengbe
CA 13
D. yenensl s
Gorogodo CAU
D. alata
Farm Lisbon CA 15
D. alata
Brazo Fuerte CA 16
D. cayenensls Kpan
CA 17
D. yenensls Sp-dDuce CA 18
D. esculenta
Sea 97 CA 19
D. yenensls
Krengle CA 20
D. alat.s
Florido
CA 21
- -
-
D. yenensls Kingle
CA 22
D. alata Suid.i CA 23
D. alata Bodo
CA 24
D. alat.s Tikamo
CA 25
D. alata OUodoubl CA 26
D. alata Bt Bt
CA 27
D. alat.s White Lisbon
CA 28
D. alata Krodja CA 29
D. alata Forastero CA 30
D. cayenensls
Kopola CA 31
D. esculenta
Name De Pana CA 32
D. alata
Douoble CA 33
D. alata
Namassou CA 34
D. alata
Morado CA 35
D. alata
Rawai Branching CA 36
D. alata
Srnooth statia CA 37
D. h.1rt1flora inc.
EA 01
D. yenensls
Kpokpokpokpo EA 02
D. cayenensls
Kangba Djerou EA 03
D. cayenensls
Kangba Jaune EA04
D. cayenensls
Sopere
EA 05
D. cayenensls Lokpa
EA 06
D. cayenensls
I<rok.ropa
EA 07
D. praehensll1s
lnc.
EAOS
D. dl..lnetOl'UJl
varit cultive
EA 09
D. dtRDetOl'Ult
varit sauvage
EA 10
D. bulbltera
tnc.
U11
D. alata
Xl
Ne 01
D. "lata
X2
Ne 02

i
TRBLERl.I 2.
LISTE DES ESPECES ET DES VARlETES

lS
9
10

10
6
10
6
14
10
27
31
10
6
10
18
7
32
43
46
43
43
51
7
10
11
10
10
5
10
8
5
16
3
13
10
l'
5

2

l
9
18
,
20
,
5
9

LISTE DES ESPECES ET DES VARJETES

ESPECES
VARIETES
1
CLONES
1
~
1nd.
l,
D. alata
X3 Ne 03 13

D alata
X4 Ne 04
l'
D. alata
XS Ne 05 22
D. Alata
X6 Ne 06 23
D. Alata
Brazo Fuerte lB 01 10
D. alata
Brazo Fuerte EA 12 14
D. alata
Hawai Branching lB 02 2
D. cayenensls
Bakaganon lB 04 5
D. cayenensls
Gada lB OS 15
D. cayenensls
lCouba lB 06 1'7
D. cayenensls
Malcpawa lB 07 4
D. cayenens1s
Douba Yesirou lB 08 5
D. cayenensls BaniaJcpa lB 09 5
D. cayenens1s
Mississim lB 12 3

D. alata
Floride> lB 11 23
D. cayenensls
Wacrou lB 12 11
D. scJmperiana
inc. lB 13 t
D. bulb1fera
inc. lB 14 14
D. Cdyenens1s
Jerengle lB 15 10
D. cayenens1s Gnan EA 13 11
D. Cdyenens1 s
Kponan EAH 25
D. cayenens1s
Kangba EA 15 4
D. cayenens1s
Kangba Ojerou EA 16 2
D. bulb1fera
varit cultive EA 17 26
D. bulb1fera
varit sauvage EA 18 It
D. dumetoIU1l
varit sauvage EA 19 3
D. dumetoIU1l
varit cultive EA 20 25
D. esculenta
inc. CA 39 21
D.alata
Floride> PR 01 t
D.alata Forastero PR 02 25
D.alata
Gemelos PR 03 '7
D.alata
Leone Globe PR 04 13
D.alata
.
Kinabayo PR 05 12
D.alata
Binugas PR 06 14
D.alata
Gunung PR 07 10
D.alata
Moresby PR 08 10
hybride C6 lB 16 1
D. Alata Poc lB 17 1
hybride
Cll lB 19 1
hybride
C4 lB 18 1
D. Alata cu lB 20 2
hybr1de
CS TB 21 5
D. alata
C13 lB 22 2
hybride
Cl lB 23
,
hybride
C40 lB 24 1
D. B1s. sauv.
BNC9 lB 25 1
D. cayenens1s
Morokourou PB 01
2
D. Cdyenens1s
Igname Guine PB 02
l'
D. cayenensls
Corossol
PB 03
'7
D. cayenens1s
Grosse Caille
PB 04
15
D. pra. .. I{rengle
J<Pl A !<Pll
lB 26-37
11
D. alata
X7
Ne 07
23

2.2. Les milieux de culture

lis contiennent des lments minraux, des lments organiques d ~
l'eau bidistille et de la glose.
2.2.1. Les lments minraux
2.2.1.1. Les macrolments
li s'agit des lments N, P, K, S, Mg, Ca. Nous avons utilis
essentiellement les macrolments de MURASIDGE et SKOOG (MS, 1962)
dont la composition est donne au tableau 3. Ce milieu a t mis au point
partir de travaux portant sur la croissance de cals de tabac. Cette solution des
macrolments de MURASIDGE et SKOOG est riche et bien quilibre ce qui
en fait une des plus utilises en culture in vitro. Elle est parfois dilue ou
modifie. Nous avons galement utilis une solution des macrolments de
MURASIDGE et SKOOG modifie (MSM) qui est donne au tableau 3.
2.2.1.2. Les oligolments
lis comprennent les ions B4+, Mn2+, Zn2+, J2-, Mo2+, Cu
2
+, c02+,
Fe
2
+ et sont apports des concentrations trs faibles, infrieures 1 mM. Les
solutions d'oligolments utilises sont celles de MURASIDGE et SKOOG
modifies (MSm et Oligo A) donnes au tableau 4.
La solution Oligo A ne contient pas d'iode, celui-ci est ajout la
concentration de 0,87 mglllors de la prparation de milieux. Le fer est apport
sparment sous forme chlat raison de 27,8 mgll afin d'en assurer une
meilleure assimilation.
En pratique, des solutions mres de macrolments et
d'oligolments sont prpares de fortes concentrations (MS x 10, MSM x 40,
MSm xl00, Oligo A x 1000) de telle sorte que quelques millilitres de solution
mre suffisent la fabrication d'un milieu.
2.2.2. Les lments organiques
2.2.2.1. Les glucides
Nous avons utilis le saccharose des concentrations variant de 30
gll 50 gIl. TI sert de source carbone.
2.2.2.2. Les vitamines
Certaines vitamines du g r o u ~ B semblent ncessaires au b ~ n
dveloppement des cultures. La composItion des vitannes mise au point par
MOREL et WETMORE en 1951 (tableau 5) a t utilise dans certains
milieux. Pour d'autre, une solution de composition similaire, organic Addenda
(tableau 5), a t employe.
10

-
..

,
TABLEAU 3 : COMPOSITION DES SOLUTIONS DE MACROELEMENTS
DE MURASHIGE
ET SKOOG (MS) ET DE MURASI-IIGE ET SKOOG MODIFIE (MSM)
Macrolments MS Macrolments MSM
mg Il mM mali mM
Nitrate d'ammonium
NH4N03 1650 20,6 650 8,12
Nitrate de potassium
KN03
1900 ~ 8,8 600 5,9
Sulfate de magnsium
MgS047H20 370 1,5 150 0,6
Chlorure de calcium
CaCI2, 2 H20 440 3 180 1,2
Phosphate de potassium
K P04 H2 170 1,25 350 2,6
1
TABLEAU 4 : COMPOSITI,ON DES SOLUTIONS D'OLIGOELEMENTS
DE MURASHIGE ET SKOOG MODIFIE (MSM. 01/00 Al
Oligolments MSm Oligo A
mali uM mali uM
Sulfate de manganse
MnS04 H20 18,9 84,7 18,9 84,7
Sulfate de zinc
ZnS04 7H20 10 34,8 10 34,8
Acide borique
H3803 10 161 ,3 10 161,3
Iodure de potassium
KI 0,83 5

Sulfate de cuivre
CuS04 0,025 0,1 0,025 0,1
Molybdate de sodium
Na2 Mo04 0,25 1 0,25 1
Bichromate de cobalt
Co C/2 6H20 0,25 1 o 025 0,1
TABLEAU 5 : COMPOSITION ,DES SOLUTIONS D'ORGANIC ADDENDA ET DES
VITAMINES DE MOREL ET WETMORE.
ORGANICADDENDA VITAMINES
mali uM mail uM
Panlholnate de calcium
. .
1 2,1
Myo Inositol 100 550 100 550
Blotine 0,05 0,2 1 0,04
Acide Nlcotinlque 5 .0 1 8
Pyridoxine 0,5 2,5 1 5
Thiamine 0,5 1,5 1 3
Glycine 2 26

Acide FoliQue 0,5 1

2.2.2.3. Les acides amins

Ils sont ajouts quelquefois comme source d'azote organique d'appoint
mais peuvent se rvler indispensables pour certaines cultures (protoplastes). La
glutarnine entre dans la composition de milieux de microbouturage(milieux B4,
401b - tableaux 7 et 8), mis au point au laboratoire.
2.2.3. Les rgulateurs de croissance
2.2.3.1. Les auxines
Elles sont essentiellement ajoutes au milieu de culture pour induire la
prolifration cellulaire. Nous avons utilis l'acide 2,4-dichlorophenoxyactique
(2,4-D) pour les essais de callogense sur D. a/ara cv. 'Florido' et D. cayenensis
cv. 'Krengle'.
A faibles doses, elles peuvent favoriser la rhizogense et la croissance
cellulaire. A ce titre, des milieux de microbouturage (B4, E2, tableau 7 et 9)
contiennent de l'acide naphtaline actique (ANA) ou du 2,4-D.
2.2.3.2. Les cytokinines
En gnral, elles ont un effet stimulant sur le mtabolisme et favorisent la
caulogense. Elles sont souvent associes aux auxines bien qu'elles aient des
effets antagonistes. Cependant, plus que la concentration de l'une ou de l'autre
sparment, c'est l'quilibre des deux qui influencera fortement le devenir de
l'expIant
La kinetine a t essaye au coun des expriences de callogense mais
est galement comprise faibles doses dans des milieux de microbouturage.
2.2.4. Conditionnement des milieux
Le pH est ajust l'aide de quelques gouttes de HCl 0,5 N ou de NaOH
pH 5,8 pour les milieux de microbouturage et pH 5,5 pour les milieux de
callogense.
Le charbon actif est ajout dans les milieux M50 et B4 (tableaux 6 et 7)
afin d'adsorber les composs pbnoliques. En effet, ces composs qui sont parfois
librs dans le milieu et dans lequel ils s'oxydent, sont des inhibiteurs des
ractions mtaboliques. Ils provoquent le brunissement du milieu et peuvent
entraver la croissance des vitroplants.
La glose est adjointe en dener lieu dans tous les milieux la
concentration de 8 gI1 pour le microbouturage et de 6,5 gI1 pour la ca11ogense. Le
milieu est glifi en le portant bullition .
Les milieux sont autoclavs 120 pendant 30 mn. L'autoclave prsente
l'inconvnient de dgrader des composs organiques tels que les acides amins.
En ce qui concerne les vitamines, les produits de l'hydrolyse semblent toujours
agir favorablement
11
TABLEAU 6 : MILIEUX M50 - M51
H
2
0 qsp 1 1

MACRO MS (x10) 100ml

OLiGO A (x100) 10ml
1
K l(x1000) 1ml
Fe EDTA (5,6mg/l) 5ml
VITAMINES (x500) 2ml
..
SACCHAROSE 50g
GELOSE 6g
M51 M50

C ~ B O N 2g

TABLEAU 7 : MILIEU B4
1

H20 qSP 11
MACRO MSM (x40) 25ml
OLiGO MSm (x1000) 1ml
ORGA. ADDENDA (x1 00) 10ml
Fe EDTA (5,6mg/l) 5ml
GLUTAMINE 200mg
SACCHAROSE 50g
HYDROLYSAT CASEINE
19
2,4 0 (0,1 mg/I) 10ml
8 A P (0,1mg/l) 0,5ml
CHARBON 3g
GELE 8g
TABLEAU 8 : MillEU 401 b
H"O qsp
11
MACRO MS (x10) 100ml
.
OLlGO A (x100)
-
10ml
..
ORGA. ADDENDA (x100) 10mf
Fe EDTA (5.6 mg/I) Sml
GLUTAMINE '200mg
SACCHAROSE
i
30g
Gaose 8g
TABLEAU 9 : MillEU E2
MACRO KNOP (x20) 50 Il'I/
.
Dl/GO A (x1000) 1ml
ORGA. ADDENDA (x1 00) 10m/
1
Fe EDTA (S.6mg/l) Sml
GLUTAMINE 100mg
SACCHAROSE 50g
ANA (0,1 mg/I) 10ml
G8..OSE 4g
2.3. Techniques et conditions de culture
2.3.1. La
Toutes les oprations se droulent en conditions striles. Pour cela, les
manipulations s'effectuent sous hotte flux laminaire, les instruments de travail
sont rgulirement flambs l'alcool, les botes de Petri sont passes au four
Pasteur (140 pendant 12 heu:es) avant utilisation, la paillasse est nettoye
l'alcool.
Les explants prlevs sur les vitroplants sont des boutures uninodales.
Elles sont isoles et insres verticalement dans le milieu glos.
Les types de flaconnage employs pour le microbouturage sont des tubes
essai ou des bocaux (f =9 cm , h = 13 cm). Ils sont ferms l'aide de bouchons
ou de couvercles en verre ou en polycarbonate. Un film cellophane enroul autour
des bouchons vite les contaminations.
Les microboutures sont places en chambre de culture thermostate (27
+2) et photopriode contrle (16 h de lumire pour 8 h d'obscurit).
2.3.2. Le sevrage
La vitrothque du laboratoire constitue un "pool" gntique aux
potentialits diverses. Notamment, grce aux taux de multiplication levs, la
production, en grande quantit, de vitroplants serait possible dans des dlais assez
courts (6 mois). Ils pourraient, dans un avenir proche devenir un matriel
commercialisable et remplacer les tubercules semences qui empitent constamment
sur la rcolte. Dans cette optique, le passage des conditions aseptiques aux
conditions in vivo a t expriment sur 4 espces.
Les vitroplants D. alata ou 'Namassou Blanc' et D. dumetorum varit
sauvage ont t sevrs aprs 9 semaines de culture in vitro tandis que D.
cayenensis cv 'Kponan' et D. esculenta , cv 'Esculenta', l'ont t aprs Il
semaines.
Pour cela, les vitroplants sont soigneusement sortis des tubes et
dbarrasss du milieu de culture par rinage l'eau courante. Les plants sont
ensuite repiqus en miniserre (48 x 33 cm2) dans un mlange de terre du Bandama
et de parche de noix de coco strilis au four Pasteur (8h 110). Aprs arrosage,
la miniserre est place sous clairage artificiel.
2.3.3. La callogense
Les explants choisis pour induire la callogense sont des boutures
uninodales d'un centimtre environ.
M51 a t pris comme milieu de base. Des rgulateurs de croissance sont
additionns des concentrations variables.
Les contenants sont des piluliers et des bocaux ferms hermtiquement
par des bouchons vissables.
Des modalits diffrentes ont t suivies selon l'espce mise en culture.
12
Schma gnera/ de travail

/
C.II.,..... l
1

'.

2.3.3.1. D. a/ara cv. 'Florido'

Comme pour un microbouturage, les explants ont t insrs
verticalement dans le milieu glos contenu dans des piluliers.
Une gamme de concentration en 2,4 D a t teste (6 mgll, 12 mgfl, 15
mgfl) en association avec de la kintine 1 mgfl. Un fixateur des phnols
(polyvinylpyrrolidone PVP) a t facultativement additionn au milieu de culture
raison de 0,5 % et 2 %.
Les piluliers ont t placs pour moiti l'obscurit dans une enceinte
thermostate et pour l'autre moiti en chambre de culture.
Aprs 10 semaines, les explants prsentant un cal sont repiqus sur le
milieu d'entretien ME (ME =M.51 + 2 mgll de 2,4D + 0,5 mgll de kintine).
2.3.3.2. D. cayenensis cv'K.rengle'
Les bocaux ont servi de contenant pour cette exprience. Les explants
sont insrs dans le milieu glos raison de 8 par bocal.
Trois concentrations en 2,4 D ont t essayes (4 mgll, 6 mgll, 8 mgfl)
associes 1 mgll de kintine.
Cet essai s'est droul en chambre de culture; les cals apparus aprs 6
semaines sont repiqus sur le milieu d'entretien ME.
2.4. Mthode d'analyse des rsultats
2.4.1. La croissance des vitroplants
Elle sera mesure par le nombre moyen de feuilles des intervalles de
temps rguliers. Les effectifs des diffrents clones varient selon les expriences
entre 25 et 40 individus.
Les rsultats seront donns sous forme de courbes avec le nombre de
jours aprs la mise en culture en abscisse et le nombre moyen de feuilles en
ordonn. Les intervalles de confiance seront calculs au seuil 5 % afm de comparer
les diffrentes courbes. L'intervalle de confiance le est donn par la formule:
Ic =1,96 x s I..JE
s = Ecart type
E = Effectif
2.4.2. La callogense
Elle sera quantifie au moyen de pourcentages de cals obtenus par rapport
la population ensemence.
13

'.

3. RESULTATS
3.1. Analyse de la morphogense in vitro chez 4 ignames
microboutures
3.1.1. Morphologie du dveloppement
3.1.1.1. Description
Aprs la mise en culture sur le milieu glos, la premire manifestation
est l'apparition d'une prolifration tissulaire de couleur blanchtre la base du
nud. Cette protubrance axillaire est l'origine de la caulogense et de la
rhizogense chez l'Igname. En effet, au sommet du gonflement se trouve un
bourgeon se tenninant par une ou deux pointes qui sont les feuilles cailleuses.
Ces dernires s'cartent pour laisser sortir la tige feuille. A la base de la
protubrance apparait des pointements racinaires qui se dveloppent rapidement.
Le vitroplant poursuit son dveloppement par l'intermdiaire de l'apex qui met en
place les feuilles et les noeuds tandis que le systme racinaire se renforce.
Cette raction, commune aux ignames microboutures, peut sensiblement
varier d'une espce l'autre.
Pour D. alata cv. 'Florido' mis en culture sur 401 b, l'enracinement est
trs rapide, comme le dveloppement de l'appareil arien. Le mristme caulinaire
donne naissance un axe feuill sur lequel apparat l'apex, qui amorce une
nouvelle tige feuille (planche 1). L'architecture se met ainsi en pl ace, les feuilles
sont alternes, les ramifications nombreuses (4 en 5 semaines). Les racines sont
nombreuses et rmes.
La mise en culture de D. a/ata cv. 'Florido' s'accompagne d'une forte
phnolisation : oxydation des phnols, librs par l'expiant, qui se matrialise par
un brunissement du milieu.
Le dveloppement de D. cayenensis cv 'Kponan, sur 401b est similaire.
TI prsente Ia mme architecture. La rhizogense et la caulogense sont cependant
beaucoup plus lentes. Les racines sont nombreuses mais pntrent difficilement la
glose. On observe parfois un soulvement de l'expIant sous la pousse racinaire !
Les tiges sont anthocyanes et les feuilles petites; 1 cm
2
en moyenne (Planche 2).
D. escu/enta cv 'Sea 97' cultiv sur 401b, se caractrise par une faible
rhizogense. TI n'existe souvent qu'une seule racine ramifie et trapue. L'appareil
arien prsente une architecture en rosette du fait de la petitesse des entre-noeuds.
Les feuilles sont parfois nombreuses mais rduites; 0.,5 cm
2
(planche 3).
La mise en culture de D. dumetorum varit sauvage sur 401b provoque
un brunissement du milieu d l'oxydation des composs phnoliques. La
rhizogense est cependant bonne. Les racines sont prcoces et longues. L'appareil
arien est vigoureux; plusieurs tiges feuilles dmarrent de la protubrance
axillaire et donnent un aspect en touffe du vitroplant. L'longation domine
fortement, les entre-noeuds sont trs grands,les ramifications rduites (1er noeud
45 jours). Les feuilles sont trilobes, poilues comme Ia tige et assez grandes
(planche 4).
14
PLA N CHE l
o
F
c B
E
Premiers de d,ot'eloppement de O. !JMtt1 cv 'Florido' , cultiv
in et issu de microbouturage.
A: to Explont.
B: to+5j. Gonflement , feuilles ,
emergence d'une racine
c: to+7j. Protubrance , sortie de 10 tige,
allongement rocinoire.
0: to+9j. Dveloppement de l'oxe feuill, formation
'd'une nouvelle racine.
E: to. 11 j. Croissance de l'axe et des racines, premire
feuille ponouie , deuxime feuille ferme.
F: to+20j. Apparition du premier noeud, feuille olterne
nllongement rocinoire.
A

D c B
A
y
E
Premiers st.:sdes de dye10ppement de D. CI" 'Kponn' .. cultiv
in vitro et issu de
A. ta Exp1ant.
B: to+7j. Gnflernent ,:l;<i113ire, feuilles t?c,:i11eus8s,
mergence d'une racine
C: to+ 12j. Protub8rnce .'Jxllloire ,srUe de la tige feuil1ee,
formation de 10 deuxime racine.
D: to+ 17). Dveloppement de l'axe et de 10 premire
feuille 1 formation d'une nouvelle racine.
E: to+24j. Apparition du premier noeud 1 premlre feuille
panouie 1 allongement racinaire.
F: to+40j. Dveloppement de l'oxe onthocyon 1 mise en ploce
de 10 deuxime feuille 1 renforcement rocinaire.
PLA N CHE 2

P L ~ N CHE 3
A
E
B
c
F
o
Premiers stades de dveloppement de D. esculent.J cv' SEA 91' J cultiv
in vitro et issu de microbouturage.
A to ExpIant.
8: to+ 1 j . Gonflement ax i llaire 1 f eui lles cai lleuses.
C: to+21 j. Apparition de la premire racine et des
premires feuilles.
0: to+28j. Sortie de la tige feuille 1 allongement racinaire.
E: to+40j. Apparition du premier noeud et d'une
nouvelle feuille.
F: to+56j. Dveloppement foliaire en rosette, allongement
et ramification racinaire.
o
F
c
Explant.
Gonflement axi llaire , feui lles cai lleuses ..
Mise en place de l'axe feui Il ,mergence d'une
racine.
Dveloppement de l'axe principal, premire
feui lie non panouie.
Allongement de l'axe principal ) premire
feuille trilobe panouie.
Apparition du premier noeud) formation de deux
autres tiges feuilles J prolifration raclnaire.
B
0: to+21 j.
F: to+42j.
E: to+28j.
A to
B: to+7j.
C: to+ 14J.
A
E
Premiers stades de dveloppement de D. dumetorum . cultiv in vitro
et issu de microbouturage.
PLANCHE 4
t

il

3.1.1.2. Discussion
Les microboutures nodales sont des organes de multiplication vgtative
qui font intervenir des bourgeons prforms. Leurs fonctionnement artificiels lors
de la mise en culture in vitro crent des sites de noformation. Les parties
promristmatiques entrent en action aprs la rupture des corrlations et des
inhibitions existant dans la plante entire et donnent naissance une
tissulaire. Cette protubrance axillaire s'avre le passage obligatoire de toute
germination d'organe vgtatif chez l'Igname (DEGRAS, 1982). Elle est
l'quivalent du primary nodal complex (FERGUSSON, 1973) qui drive de
l'hypocotyle aprs germination et du prtubercule, organe de liaison entre le
tubercule mre et le tubercule fils. Elle comprend d'aprs DEGRAS, 1982 :
- un apex organis au milieu d'bauche;
- un massif hypertrophi et vascularis ;
- des bauches et des pointements de racines.
Les conditions cologiques particulires de la culture in vitro peuvent
entraner des modifications du comportement morphogntique.
a) Sur le plan morphologique, cela se traduit chez l'igname, comme
chez de nombreuses plantes cultives in vitro telles que la vigne (NOZERAN et
BANCll..HON, 1972), les citrus (BOUZID, 1975), la pomme de terre
(GRENAN, 1976), par une miniaturisation et un rajeunissement On peut le
remarquer, outre par la rduction de taille des divers organes, par la phyllota.'te
particulire des ignames in vitro. Les feuilles sont uniquement alternes. D'autre
part, l'tude mene par ESPIAND en 1983 sur l'anatomie des ignames cultives in
vitro, apporte la preuve d'une diminution du nombre des faisceaux conducteurs
ainsi que du nombre de cellules du tissu mdu1aire chez D. a/ata cv 7ahiti'.
Plusieurs facteurs pourraient tre l'origine de ces phnomnes d'aprs
NOZERAN et coll. 1977 :
- les conditions cologiques ;
- la diapause lie l'implantation in vitro;
- la rduction de la taille du territoire assurant la nouvelle morphogense.
b) Sur le plan physiologique, certaines modifications sont remarquables.
Notamment, la capacit d'enracinement est beaucoup plus grande in vitro qu'in
vivo. L'enracinement de boutures classiques s'observe en serre au bout d'une
quinzaine de jours chez D. cayenensis cv 'Krengle' (BUFFARD-MOREL et
TOURE, 1980) tandis qu'il s'observe aprs S jours seulement in vitro. Pour D.
a/ata ,l'apparition des racines est encore plus prcoce; dans les deux jours qui
suivent le microbouturage, deux racines adventives apparaissent en situation
oppose.
Les qualits naturelles de multiplication vgtative des ignames
s'expriment pleinement in vitro sur des milieux sans rgulateur de croissance. Les
coefficients de multiplication permettent d'obtenir entre l.()(X).OOO et 2.000.000 de
vitroplants selon l'espce en un an.
IS
1

3.1.2. Comparaison de la cintique de croissance de 4 ignames

microboutures sur MSO
Les graphiques 1et 2 reprsentant la croissance in vitro des espces alata
cv 'Florido' (clone 021), cayenensis cv 'Kponan' (clone E275), esculenta cv
'Sea 97' (clone 019), et dumetorum (clone EDS), font apparatre diffrents
lments :
a) La croissance des ignames in vitro est linaire q u e l l ~ que soit l'espce.
En effet, les courbes d'volution du nombre de feuilles au cours du temps se
confondent avec des droites. Les coefficients directeurs de ces draites reprsentent
donc la vitesse moyenne de mise en place des feuilles et des noeuds
(plastochronie) et permettent de comparer le dveloppement des diffrentes
espces.
b) La diffrence de croissance entre le clone 021 et les autres est nette. La
vitesse d'mission foliaire est de 0,8 feuille par semaine pour le clone 021 alors
qu'elle est comprise entre 0,3 et 0,4 seulement pour les trois autres (La diffrence
de production en un an est gale 4
15
,2 - 2
15
,2 ) La rapidit de l'organogense est
une qualit gnrale des alara , elles rpondent le mieux aux conditions in vitro.
c) L'espce cayenensis qui possde la mme architecture que l'espce
a/ara, a une vitesse de croissance souvent rduite de moiti par rapport cette
dernire.
d) Les clones 019 et EDS sont ceux qui produisent le moins de pousses
feuilles. TI faut attendre 42 jours pour obtenir 2 feuilles ! La caulogense est
toujours en avance sur la rhizogense chez les escu/enra mais elle produit des
feuilles souvent petites. Malgr un dmarrage difficile (rhizogense tardive), le
clone 019 rattrape le niveau d'EDS aprs 6 semaines (graphique 1). Sa production
foliaire sera ensuite toujours suprieure avec 0,35 feuille par semaine tandis que le
clone EDS produit 0,3 feuille par semaine en moyenne.
Les espces a/ara et dumetorum , toutes deux sujettes la phnolisation,
ont le meilleur comportement in vitro ; la rhizogense et la caulogense sont
rapides. La vigueur des dumerorum s'exprime par leur hauteur mme s'ils
prsentent un nombre de feuilles rduit tandis que les a/ara ont un dveloppement
foliaire fourni.
Des problmes de lenteur de croissance sont apparus sur les espces
cayenensis et escuJenta . Leurs qualits de multiplication vgtative sont moindres
ce qui se traduit par une rhizogense et une caulogense difficiles, et par une
plastochronie assez lente. Le milieu MSO, sur lequel a t mene cette exprience
pourrait ne pas convenir ces deux espces et limiter leur dveloppement
16
,
GRAPHIQUE 1:COURBES DE CROISSANCE DES CLONES 021.E275.019,EDS SUR MSO
7
-e- 021
.()- E275
'.- 019
-c- EDS
1
56
1
49
1
42
4
6
2
5
3
/e


/e
/e __0
/'
0 O"e:::::::::.O
0 --""",0

o c 1 1 1
o 7 14 21 28 35
Nombre de jours
Nombre de feuilles
t
I-
i
GRAPHOUE 2:COURBES DE CROISSANCE DES CLONES 021 ,E275.019,EDS SUR M50
Nombre de noeuds
,e- 021
.()- E275
".- 019
.[J-EDS
3.1.3. Influence du milieu
3.1.3.1. Relation entre l'appareil arien et l'appareil racinaire
D. a/ara cv 'Florido' , D. cayenensis cv 'Kponan' , D. escu/enta cv
'Sea 97' , D. dzunerorum ont t mis en culture sur un mme milieu M50 et placs
dans les mmes conditions. Cependant, pour des raisons pigniques
(modification de l'expression du gnome), des diffrences de maturation sont
apparues au sein d'une mme population. On peut ainsi remarquer que parmi
l'effectif mis en culture, les vitroplants prsentant le meilleur dveloppement sont
ceux qui ont la plus grande surface racinaire. Outre les facteurs gntiques qui
rgissent l'organogense et la morphogense, des facteurs trophiques interviennent
dans la croissance des vitroplants.
Les courbes de corrlation entre la longueur racinaire et le nombre de
feuilles (graphiques 3, 4, 5, 6) mettent en vidence le rle des facteurs
nutritionnels. En effet, la croissance des parties ariennes est fortement tributaire
de l'enracinement des vitroplants et par cela de la quantit d'lments nutritifs
disponibles aux racines. Les coefficients de corrlation qui sont compris entre 0,8
et 0,9 font preuve de la relation troite qui existe entre l'appareil arien et racinaire.
D'autres enseignements peuvent tre tirs de ces courbes:
a) La caulogense est en avance sur la rhizogense pour toutes les
espces. Cela se dnote sur les courbes par une ordonne plus ou moins proche de
1 en O. Cela peut expliquer la petitesse des feuilles des esculenta chez lesquelles la
rhizogense tardive limite le dveloppement caulinaire qui ne repose, au dpart que
sur les changes entre l'expIant et le milieu.
b) La valeur du coefficient directeur des courbes de corrlation reflte
l'importance de l'appareil racinaire par rapport ceux de l'appareil arien. Plus la
pente de la droite est faible plus le systme racinaire est bien tablit. Ainsi, les
clones EDS et 021 pour lesquels les coefficients sont respectivement de 0,16 et
0,33, produisent un rseau racinaire fourni. Cela explique leur vigueur in vitro et
confume le fait qu'ils rpondent le n'jeux la culture in vitro.
La corrlation existant entre la longueur racinaire et le nombre de feuilles
laisse supposer que l'influence du milieu sur la cintique de la morphogense peut
tre assez grande.
3.1.3.2. Comparaison de la croissance de 2 ignames microboutures sur
MSO et 401b.
M50 (tableau 6) et 401b (tableau 8) sont deux milieux couramment
utiliss pour le maintien de la vitrothque d'igname. TI semble donc intressant de
comparer l'effet de ces deux milieux sur la croissance. D. a/ara cv 'Narnassou
Blanc' (clone Dl) et D. cayenensis cv 'Kponan, (clone E275) ont t mis en
culture en tube paralllement sur MSO et 401b. Ces deux milieux diffrent par la
composition et la concentration des composs organiques et par la prsence ou
l'absence de charbon actif.
17
GRAPHIQUE 3: COURBES DE CORRELATION ENTRE LA LONGUEUR RACINAIRE
ET LE NOMBRE DE FEUILLES CHEZ D. ALATA CV'FLORIDO'.
y .338x + 1.118 R-squared: .859

16
40 35 15 20 25 30
Longueur racinaire &1\ """
10 5
4
2
d
e
N
o
m
b
r

f
e
u
i
1
1

s
GRAPHIQUE 4 : COURBES DE CORRELATION ENTRE LA LONGUEUR RACINAJRE
ET LE NOMBRE DE FEUILLES CHEZ D. ESCULENTA CV 'SEA 97'.
y .75x + 10.938 R-squared: .834
-70

60 30 40 50
Longueur racinaire ln ... In
20 10
N
80
0
m 70
b
r
60
e
d
50

XiO
f 40
e
u
30
i
1
1
20
e

10
0

F
OW test:
X Longueur raclnalre
Analysis of Variance Table
S S M S
R-sguared: Std. Err.: Coet. Var.:
1. 737 110.991 1...;;;..2-'-5.-'-86"""'-2__.......
8eta Coefficient Table
Value' Std Err' Variance' T-Value'
OF
SImple y Nombre de feuilles
Residual Information Table
SS[e(i)e(i.l)J: e ~ 0: e < 0:
..
INTERCEPT 17.168 4.33 18.749 3.965
SlOPE 1.723 .243 .059 7.106
Parameter'
Source um >quares: ean )quare: -test:
R E ~ S S 1 6100.477 6100.477 50.498
RESIOUAl 18 2174.523 120.807 p S .0001
TOTAL 19 8275
GRAPHIQUE 5: COURBES DE CORRELATION ENTRE LA LONGUEUR RACINA/RE
ET LE NOMBRE DE FEUILLES CHEZ D. DUMETODUM.
y .16x + 5.437 Rsquared: .877
N
501

0
45
m
b
40
r
e
35
d
30

e
l(.fO
25
f
e
20
u
1
15
1
1
10
e
s
5
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250
longueur racinaire Mm
GRAPHIQUE 6 : COURBES DE CORRELATION ENTRE LA LONGUEUR RACINAIRE
ET LE NOMBRE DE FEUILLES CHEZ D. CA YENENSIS CV'KPONAN' .
35 30 15 20 25
longueur racinaire C 1\ .... m
10 5
y 1.748x + 15.303 R squared: .807
O+----.--r--.----....--r----.-.......-..-----r-oy-----,,.....---r--..--..,
o
80
d
e
"fo
f
e
u
1
1
1
e

N
o
m
b
r
e

.'
, .

--

Les graphiques 7 et 8 reprsentent la croissance compare des

clones 01 et E275 sur ces deux milieux. n ne ressort, la vue de ces
graphiques. aucune diffrence significatiye de croissance. Le.s de
confiance se recoupent, les deux populatIons ne sont pas vraIment dlsnncts.
On peut cependant noter la constante supriorit de la courbe MSO sur celle
de 401b. Cette tendance peut s'expliquer par la dose de sucre qui est de 5%
pour MSO et de 3% pour 401 b ou par l'action adsorbante du charbon. Cette
dernire est nuancer car les clones 01 et E275 n'ont pas t sujets une
phnolisation prononce.
Nous avons poursuivi en menant l'tude sur un seul clone et en
largissant l'essai deux autres milieux.
3.1.3.3. Comparaison de la croissance de D. a/ata cv Rorido'
microbouture en bocaux sur MSO, 401b, B4 et E2.
Dans le but de mettre en vidence l'effet du milieu, nous avons
choisi un clone croissance rapide et sujet la phnolisation (021) et l'avons
mis en culture en bocaux sur M50, 401b, B4 et E2.
Le graphique 9 reprsente l'volution du nombre de feuilles du
clone 021 au cours du temps sur les 4 milieux prcits. On peut constater les
diffrences de croissance du clone 021 suivant le milieu de culture.
Le milieu M50 assure une croissance plus rapide que les trois
autres. La richesse et l'quilibre des macrolments MS ainsi que la dose de
sucre conviennent parfaitement au dveloppement du clone 021. La plus
grande amplitude s'observe aprs 30 jours entre MSO et E2, elle atteind 2
feuilles. Le coefficient de multiplication est rduit d'autant aprs 5 semaines
de culture in vitro . Cela ne va pas sans consquence sur la production
annuelle de vitroplants, car au lieu de 2.000.000 de vitroplants, on en
obtiendrait seulement 1500 sur E2.
La faiblesse du milieu E2 (tableau 9) se situe dans les
macrolments de KNOP qui sont pauvres compar aux macrolments de
MURASl-llGE et SKOOG. La prsence d'ANA la concentration de 1 mgll a
un effet stimulant sur la rhizogense. Les vitroplants prsentent de longues
racines, anormalement dveloppes et ramifies mais cela ne suffit pas
amliorer la plastochronie.
La dose de sucre est pour une grande part responsable du lger
retard de croissance enregistr sur 401 b par rapport MSO. Son rle est
important car il fournit la plante des restes de glucose et fructose qui entrent
dans la constitution des parois cellulaires mais qui sont galement les
composs initiaux de la glycolyse. Le charbon qui agit en fixant les composs
phnoliques contribue au meilleur dveloppement du vitroplant sur M50.
Le milieu B4 (tableau 7) ne semble pas particulirement favorable
la croissance acclre du clone 021. Malgr la prsence de charbon, de
nombreux composs organiques, et de rgulateurs de croissance, il est moins
performant que MSO et 401b. Deux raisons principales peuvent l'expliquer:
- l'action fortement attnue du 2,4-D par la prsence de charbon.
En effet, celui-ci adsorbe tous les composs cycliques et le 2,4-D n'y chappe
pas. On estime qu'il est pig 90 %;
18
GRAPHIQUE 7 : COURBES DE CROISSANCE DU CLONE 01 SUR MSO ET 401 b
Nombre de feuilles
4
3,5
3
2,5
2
1,5
0,5
1
21 28 35
Nombre de jours
42
1
49
1
56
-.- M50
-0- 401 b
GRAPHIQUE 8 : COURBES DE CROISSANCE DU CLONE E275 SUR MSO ET 401 b
y .336x + 1.165 R-squared: .818
N
16

0
m 14
b
r
12
e
d 10
e
f
8
e
u
6
i
1
1 4
e
s
2

5 10 15 20 25 30 35 40
Longueur racinaire

- le dficit en azote des macrotlments de MURASillGE et

SKOOG modifi (MSM tableau 3). La concentration d'azote totale passe de 60
mM pour le MS 22 mM pour le MSM. Cette forte baisse est l'origine des
diffrences de croissance enregistres sur MSO et B4.
3.1.3.4. Conclusion
Le laboratoire de Biotechnologie l'ORSTOM d'Adiopodoum
cherche mettre au point deux ou trois milieux de microbouturage convenant
toutes les espces. Dans ce but nous avons test 4 milieux sur D. a/ara cv
'Florido' et montr que le milieu MSO de composition relativement simple
(sans phytohonnones) est le plus performant pour cette espce. Les qualits de
multiplication vgtative dont fait preuve les a/ara ne se retrouvent pas chez
les esculenra et les cayenensis . Des milieux particuliers ces espces restent
mettre au point. n serait intressant d'additionner aux milieux M51 et 401b
des rgulateurs de croissance afIn de trouver un quilibre auxine/cytokinine
stimulant la rhizogense et la caulogense. Une gibberelline pourrait
galement tre ajoute dans le cas des escu/enra qui prsentent des entre-
3.1.4. Influence du contenant
Nous avons mis en culture deux alata cv 'Florido' (021) et cv
'Forestero' (P2), une escu/enta cv' Sea 97' (019) et une dumetorum (EB4)
paralllement en tube et en bocaux. Le milieu MSO a t choisi pour cette
exprience. Les bocaux contiennent 9 explants.
Les graphiques 10 et 11, reprsentant l'volution du nombre de
feuilles des clones 021 et P2 au cours du temps, font apparatre une diffrence
marque de la croissance selon la fonne du contenant
Les vitroplants cultivs en tubes accusent un retard de croissance
d'une feuille en moyenne sur ceux cultivs en bocaux. Cette diffrence se met
en place dans les 4 premires semaines et reste ensuite constante. A cela
s'ajoute une autre constatation ; les feuilles sont toujours beaucoup plus
grandes en bocaux. La surface foliaire moyenne est de 6 cm
2
environ chez le
cv 'Florido' en bocaux alors qu'elle est de 3 cm
2
seulement en tubes.
TI est donc indniable qu'un effet d'encombrement strique
intervient avec l'emploi de tubes pour le microbouturage des a/ata . Celui-ci
explique la diminution des surfaces des limbes foliaires et du nombre de
feuilles. Le diamtre rduit des tubes essai (diam. 2,6 cm) est un obstacle au
dveloppement, il provoque une comptition des feuilles pour l'espace et la
lumire qui nuit leur q,anouissement.
TI faut galement noter que les bocaux bnficient d'un effet serre
(CHASSERIAUX, 1986). Le verre et les matires plastiques absorbent une
partie du rayonnement ce qui rehausse la temprature l'intrieur des bocaux.
La vitesse de croissance leve en bocaux est attribue cet effet serre qui agit
en activant la vitesse des ractions mtaboliques.
19

GRAPHQUE '0: COlIRBES DE CROISSANCE DU CLONE 021 SUR M50

~
~
1
49
1
42
1
35
1
21 28
Nombre de jours
2
7
5
6

:
.-
GRAPHIQUE 11 : COURBES DE CROISSANCE DU CLONE P2 SUR MSO
Nombre de feuilles
7
6
5
4
3
2
1
21 28
Nombre de jours
1
35
1
42 49
.- BOCAUX
<>- ruBES

Les graphiques 12 et 13, reprsentant les courbes de croissance

des clones 019 et EB4, montrent que la diffrence de croissance est plus
nuance pour les espces escu/enta et dumerorum
Les vitesses de croissance en tube et en bocaux ne diffrent pas
normment chez les escu/enta . Les intervalles de confiance se recoupent par
endroits mais il ex.iste une relle tendance l'acclration de la croissance en
bocaux. La lenteur de croissance des esculenta ne permet pas de la mettre en
vidence de manire significative.
Le clone EB4 prsente un nombre de feuilles d'abord gal en
tubes et en bocaux puis toujours suprieur en bocaux. Cette diffrence apparat
et s'amplifie progressivement au cours du temps, sans jamais excder une
feuille. Cependant, le nombre moyen de feuilles du clone EB4 est de 2,8 49
jours tandis qu'il est de 6 la mme date par le clone 021. La diffrence de
croissance reprsente alors en population 21 % de l'mission foliaire chez D.
dumetorum et 15 % chez D. alata cv 'Florido'. L'effet serre a jou un rle
qu'il faudra prendre en compte dans une optique de multiplication vgtative
acclre un stade prindustriel.
Nous avons travaill avec en moyenne 9 vitroplants par bocal. Le
facteur densit n'est pas ngliger car des expriences prliminaires ont
montr que l'effet du contenant s'estompait quand la densit augmentait Ainsi,
le dveloppement la densit de 15 explants par bocal est quivalent au
dveloppement en tubes chez D. a/ara cv 'Brazo Fuert'.
3.1.5. Conclusion
Nous venons de voire combien le choix d'un milieu et d'un
contenant dtermine la russite en culture in vitro. TI est primordiale dans le
cadre d'une production soutenue. Ce choix est au point pour l'espce alata
avec l'emploi du milieu MSO et des bocaux. Le microbouturage ainsi matris,
permet d'alimenter le programme protoplaste qui s'appuie sur le matriel
vgtal produit.
TI semble que le milieu MSO convienne galement trs bien aux
dumetorum dont la hauteur excessive pose cependant un problme de
contenant La premire feuille atteint le sommet du tube aprs 45 jours alors
que le vitroplant possde tout juste un nud. Des produits nanifiants,
antagonistes des gibbrellines, qui freinent l'longation des entre-nuds tels
que l'acimydal ou le chlorure de chlorocholine pourraient tre essays afin
d'augmenter leur taux de multiplication.
En ce qui concerne les espces cayenensis et esculenra , peu de
travaux en culture in vitro ont t faits. Des milieux plus appropris ces
espces devraient amliorer leur comportement in vitro.
La meilleure connaissance de la morphogense et de la cintique
de croissance des ignames in vitro est un instrument indispensable la gestion
de la vitrothque. Elle permet de faire des prvisions court terme et d'adapter
les milieux et les contenants aux particularits de chaque espce.

20

GRAPHIQUE 12 : COURBES DE CROISSANCE DU CLONE 019 SUR MSO

3
2,5
2
Nombre de feuilles 1,5
1
21 28 35
Nombre de jours
1
42 49
1
56
'.- BOCAUX
-0- TUBES
GRAPHIQUE 13: COURBES DE CROISSANCE DU CLONE EB4 SUR MSO
3
2,5
2
Nombre de feuilles 1,5
0,5
1
21 28 35
Nombre de jours
1
42
1
49
1
56
'.- OC>CAUX
-0- TUBES

3.2. Le sevrage
3.2.1. Introduction
Le sevrage est le passage des conditions aseptiques de la culture in vitro
aux conditions naturelles de culture des ignames. Ce passage doit se faire par
tapes en prenant de multiples prcautions afIn de ne pas risquer de perdre les
plants fragiliss par la culture in vitro.
Dans le cadre d'une production de vitroplants envisage par le laboratoire
moyen terme, nous avons le sevrage de 4 espces: D. alara cv
'Namassou Blanc', D. dumerorum ,D. cayenensis cv. 'Kponan', D. esculenra .
Les espces alara et dumerorum ont sevres aprs 9 semaines de culture in
vitro. Elles prsentaient alors un dveloppement jug suffisant pour les repiquer
en miniserre. La faiblesse du systme racinaire nous a oblig d'attendre deux
semaines supplmentaires pour les varits esculenta .
3.2.2. Rsultats et discussion
3.2.2.1. Acclimatation et reprise
Nous avons obtenu 100% de reprise chez les alara ,dumerorum et
cayenensis et avons perdu un plant chez les esculenra . Le sevrage est donc
russit et ne semble pas poser de problmes majeurs. L'atmosphre sature en
vapeur d'eau des miniserres est proche de celle des tubes in vitro et a pennis une
bonne acclimatation progressive des plants. La miniserre a t ensuite entrouverte
une semaine aprs le repiquage. Le couvercle a t supprim deux semaines plus
tard. La terre du Bandama mlang au parche de noix de coco convient trs bien
aux vitroplants repiqus. La strilisation a vit toutes attaques prmatures de
microorganismes. Le parche de noix de coco en allgeant et en arant la terre a jou
un rle important en raison de la frquence des arrosages et de la forte humidit du
sol. Les 4 espces ont fait preuve d'une grande vivacit et d'une grande capacit
d'adaptation. Certains vitroplants des espces esculenra et cayenensis ;le
prsentaient au repiquage qu'une ou deux faibles racines. C'est la raison pour
laquelle nous avons perdu un plant de l'espce esculenla . Pour plus de scurit et
de facilit, il faudrait l'avenir attendre une quinzaine de semaines pour les
espces esculenra et cayenensis moins d'amliorer leurs organogense in vitro
et une dizaine de semaines pour les espces a/ara et dumetorum .
3.2.2.2. Croissance aprs repiquage
Les graphiques 14 et 15 reprsente l'volution du nombre de feuilles des
clones 01, EOS, 039, E275 au cours du temps, avant et aprs le sevrage. On
retrouve la croissance linaire des 4 espces pendant la priode in virro . La
plastochronie est alors de 0,5 et 0,34 feuille par semaine pour les clones 01 et
EDS. Elle est de 0,6 et 0,4 feuille par semaine pour les clones 039 et E275.
21
Il

.-

..
Nombre de feuilles
Nombre de feuilles
GRAPHIQUE 14 : COURBES DE CROISSANCE DES CLONES 01 ET ms
Nombre de semaines
GRAPHIQUE 15 : COURBES DE CROISSANCE DES CLONES 039 ET E275
9
8
7
6
5
4
3
2
1 1 1 1 1 4
6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Nombre de semaines
~
~
'.- 039
'0- E275
On remarque l'irrgularit des courbes qui apparait immdiatement aprs
le sevrage. L'acclimatation en miniserre est marque dans les premiers temps par
une phase de latence qui est plus ou moins accentue selon les clones. Cette phase
n'apparait pas exactement au mme moment pour tous les clones. elle est
immdiate dans le cas de D. escu/enta cv. 'Sea 97' tandis qu'elle se manifeste une
semaine aprs le passage en miniserre chez D. dumetorum et D. cayenensis cv.
"Kponan". La dure de cette phase varie de une deux semaines et rend peut tre
compte de la facult d'acclimatation des diffrents clones.
On peut supposer que cette priode correspond un remaniement des
quilibres physiologiques engendrs par les nouvelles conditions cologiques. En
particulier. la photosynthse ralentie in vitro par la prsence de sucre dans le
milieu, doit se rquilibrer et fournir tous les substrats carbons dont la plante a
besoin. D'autre part, le systme racinaire accoutum au milieu glos n'est pas
capable d'absorber immdiatement les lments minraux disponibles dans la terre.
Le dveloppement est par consquent frein pendant cette priode de remaniement
ce qui cre la phase de latence.
A la suite de cette phase, l'mission foliaire reprend de manire plus
intensive. En effet. la plastochronie passe de 0,34 in vitro une feuille par
semaine en miniserre pour le clone EDS, de 0,6 0,8 feuille par semaine pour le
clone 039 et de 0,4 0,5 feuille par semaine pour le clone E275 (graphiques 14 et
15). Les conditions naturelles de culture permettent la plante d'exprimer
pleinement sa capacit morphologique. En ce qui concerne le clone 01,
l'interprtation des courbes est fausse car les plants sont atteints d'une virose qui
entrave fortement leur dveloppement
3.3. La callogense
3.3.1. Introduction
Nous avons test deux espces en vue d'obtenir des prolifrations
tissulaires d'igname. Les cals qui sont constitus de cellules indiffrencies en
divisions mitotiques, seraient particulirement intressant pour le programme que
dveloppe le laboratoire. En effet, les cals permettent de mettre en place des
suspensions cellulaires qui seraient un matriel vgtal idal pour obtenir des
protoplastes.
Des travaux ont dj t effectus sur la callogense d'igname partir de
tubercules chez D. de/toidea (ABROSHNIKOVA et al., 1971, CHATIJRVEDI et
CHOWDURY. 1980), d'hypocotyles chez D. det/oidea (GREWAL et ATAL,
1976), partir de noeuds chez D. composita (OATEGA-PACHECO, 1970). En
nous appuyant sur ces travaux, nous avons essay plusieurs milieux pour induire
la callogense.
22
3.3.2. Les milieux de callogense
M51 a pris comme milieu de base auquel des rgulateurs de
croissance ont ajouts. Pour D. a/ara cv 'Florido', trois concentrations en 2,4-
D ont t testes: 6 mgll, 12 mgfl, 15 mgll tandis que la kintine reste 1 mgll.
Pour D. cayenensis cv 'Krengl', le 2,4-D a plus modrment avec 4
mgll et 8 mgll en association avec 1 mgll de kintine. Nous avons ajout aux
milieux de callogense de D. a/ara cv 'Florido' un fixateur des phnols : le
polyvinylpyrrolidone (pVP) la concentration de 0%, 0,5%, 2%.
3.3.3. Rsultats
3.3.3.1. D. a/ara cv. 'Florido'
Les milieux contenant 12 mgll et 15 mgll de 2,4-D n'ont donn aucun
cal. La dose trop leve de 2,4-D qui est une auxine forte a toxique. La
callogense difficile obtenir sur des monocotyldones et notamment sur l'igname
justifiait ces essais de concentration.
Seul le milieu M51 additionn de 6 mgll de 2,4-D et 1 mgll de kintine a
donn des rsultats. Vingt trente jours aprs l'ensemencement, le cal se
dveloppe partir du gonflement axillaire que l'on observe lors d'un
microbouturage tandis que l'extrmit sectionne de l'expIant insr dans le milieu
rejette des composs phnoliques qui s'oxydent et brunissent le milieu. Le tableau
10 prsente les rsultats obtenus sur ce milieu deux mois aprs ensemencement
Nous avons uniquement compt les cals susceptibles d'tre repiqus et avons
obtenu 47 %de callogense. Ce rsultat a t obtenu indiffremment l'obscurit
et la lumire signifiant que le rle de cette dernire dans l'induction du
phnomne n'est pas primordiale. Par ailleurs, que ce soit la lumire ou
l'obscurit, les cals d'ignames sont de couleur blanchtre. Des cals chlorophyliens
n'ont jamais t obtenus.
L'influence du PVP est difficilement interprtable mais il ne semble pas
avoir un effet vraiment marqu. On peut cependant noter que la phnolisation
toujours existante chez les a/ara est localise en prsence de PVP. On observe une
tache noire se rpartissant autour de l'expIant tandis que les composs phnoliques
oxyds diffusent dans tout le milieu en l'absence de PVP.
La phnolisation est l'obstacle principale la formation des cals chez D.
a/ara cv. 'Florido'. Tous les milieux se sont noircis du fait de la libration de
composs phnoliques qui s'oxydent en contact de la polyphnol oxydase prsente
dans le cytoplasme, inhibant ainsi toute prolifration cellulaire. La moiti des
explants n'ont pu voluer, ils se sont ncross. Les cals que nous avons obtenus
sont difficilement exploitables, ils sont petits et ncross. Les meilleurs
sont noduleux, non friables et par consquent difficiles passer en suspension.
23

3.3.3.2. D. cayenensis cv 'Krengl'

Nous avons voulu prendre un matriel vgtal moins sujet la
phnolisation et encore inexpriment.
Le tableau Il rcapitule les rsultats obtenus un mois aprs
ensemencement. Le milieu contenant 6 mg/l de 2,4-D donne le meilleur
pourcentage mais les nlieux avec 4 mgn et 8 mgn sont nanmoins trs proches.
Les cals se sont dvelopps partir de la base du noeud et sont
blanchtres. TI existe des cals de couleur rose chez les varits comportant une
forte pigmentation anthocyane telle que D. a/ara cv 'Brazo Fuert'. Autour de
l'expIant et sur le contour des cals se produit une lgre phnolisation.
L'observation a t ralise un mois aprs ensemencement ce qui est un peu tt
pour prvoir l'volution dfinitive des cals.
3.3.4. Conclusion - Discussion
Les screenings raliss pour la dtennination de milieux de callogense
laissent penser que ces derniers sont plus ou moins au point. Avec des
concentrations comprises entre 4 mgn et 8 mgn, nous avons obtenu des cals. Nos
rsultats sont cependant infrieurs ceux obtenus sur D. alara cv 'Brazo Fuert' et
cv 'Florido' par FAUTRET en 1985. Ses travaux ne font pas mention de gros
problmes de phnolisation ce qui expliquerait la diffrence des rponses.
Des antioxydants du type acide ascorbique et acide citrique ont t
essays sans succs. Nous pensons nanmoins que la callogense peut tre
fortement amliore en portant une plus grande attention la qualit de l'expIant
Les prolifrations tissulaires obtenues partir de nuds ont pour origine
les bourgeons prforms prsents dans cet organe ce niveau ou l'apex dans le cas
des derniers nuds. Les massifs promristmatiques maintenus sous la dominance
apicale chez les vitroplants entiers, entrent en division mitotique anarchique, sous
l'effet du 2,4-D et de la leve des corrlations et inhibitions. Les forces de
corrlation varient suivant le niveau du nud dans le vitroplant et modifient la
ractivit de l'expIant. Cela s'est confirm ultrieurement dans des expriences
menes sur D. a/ara cv 'Florido'. Des nuds ont t ensemencs en tenant compte
de leur niveau de prlvement sur le vitroplant TI s'est avr que les noeuds
suprieurs taient moins sujet la phnolisation. TI pourrait exister un gradient
dcroissant des phnols dans la plante de la base vers le sommet. Cette hypothse
demande tre vrifie sur un nombre significatif de vitroplants. Car les noeuds
suprieurs, librant moins de phnols, seraient plus mme de dvelopper un cal,
d'autant plus qu'ils sont galement les derniers forms, donc les plus jeunes. La
plus grande ractivit des matriaux a souvent t dmontre en
culture in vitro (NOZERAN 1977, MARGARA 1982, TARDIEU 1984).
24
,
!

TABLEAU 10: APTITUDE A LA CALlOGENESE CHEZ D.I.ta CV 'FLORIDO'

CONDIT1ONS DE
MILIEUX ( MS1 + 2,40 EFFECTIF MIS -t. DE
aJLnJRE
6mQ/1 +Kinline 1mali) CALS
PVP ()Ok 7 2
PVP 0,5"- 7

lUMlERE
PVP 2'% 7

.
.
TOTAL 21 10
47'"
PVP 0% 7 4
PVP 0.5"- 7 2
OOSCURITE
PVP 2"- 7 4
TOTAL 21 10 .7%
TABLEAU 11: APTITUDE A LA CALLOOENESE CHEZ 0 cayenensis cv 'KINGLE'
CONOITONS DE MILIEUX ( MS1 ) EFFECTF CALS %OE CALS
<::U.n.RE
2,4 0 4 mgII
Kintine 1mg/1 16 8 50%
lUMIERE
2.4 0 6 mg"
Kinline 1mg/1 16 9 56%
2,4 0 8mgll
Kintln. 1mgll 8 47%

MURASmGE 1974, les caractristiques de l'expIant

initial qui influencera ses capacits de callogense sont:
- l'espce et le gnotype de la plante mre
- l'ge et la position de l'organe sur la plante mre
-la nature de l'organe dont il est issu
- la taille de l'expiant
- la prparation de la plante mre.
Nous venons de voir comment l'ge et la position de l'expIant qui
est dans notre tude le nud pourraient modifier la rponse dans le sens d'une
meilleure
En ce qui concerne la nature de l'organe, nous avons choisi
arbitrairement le nud car il nous semblait l'expIant le plus susceptible de
donner un cal, du fait qu'il contient des rgions promristmatiques.
MALAURIE et TARDIEU ont expriment divers explants qui se sont rvls
"comptents" : microtubercules, fragments de tiges, feuilles coupes
transversalement Les rondelles de microtubercules ont donn des cals qui se
dveloppent en priphrie peut-tre partir des tissus cambiaux responsables
de la croissance en paisseur du tubercule. Les fragments de tige comme les
feuilles ont donn des cals blancs, friables. Toutes ces expriences ont t
isoles et demandent tre lances grande chelle pour une tude
Dans le cas des noeuds, la taille de l'expIant qui est d'un
centimtre environ, semble bonne. Nous avons essay de rduire la taille des
explants en pensant augmenter l'influence du milieu sur les quilibres
endognes des noeuds et favoriser ainsi la callogense. La dimension trop
rduite des nuds n'a pas permit leur survie sur un milieu de callogense,
ceux-ci se sont ncross dans un bain de phnol!
Quand au gnotype, nous nous sommes penchs sur deux espces
d'origine diffrente. Les a/ara, originaires d'Asie, ont fait l'objet de
nombreuses tudes tant morphognes que callognes, qui nous ont servis de
base pour notre travail. L'espce cayenensis , typiquement africaine, a trs
rarement t tudie in vitro mais prsente cependant des potentialits de
callogense au moins quivalente l'espce a/ara.
De nombreuses possibilits sont offertes tant au niveau de
l'expIant que des espces maintenues en vitrothque, qui sont varies et
d'origines diverses.
25

CONCLUSION GENERALE
La culture de l'igname se heurte l'heure actuelle de
nombreuses difficults tant agronomiques que phytosanitaires.
- La slection par hybridation classique chez l'igname comestible
est trs limite cause de la dficience de leur appareil reproducteur. Le
dveloppement d'un programme d'amlioration gntique risque d'tre
confront de nombreux problmes.
- Le besoin en main d'uvre est norme tout au long de l'anne
car il faut assurer la confection des buttes, le tuteurage de la parcelle, le
dsherbage rgulier, et la rcolte.
- L'emploi du tubercule comme organe de multiplication
vgtative ncessite qu'une partie de la rcolte soit rserve cet effet.
- L'htrognit des tubercules au sein mme d'une varit
entrave toute mcanisation de la rcolte et nuit l'expansion de la culture qui
reste localise sur de petites parcelles entretenues familialement
- Les maladies cryptogamiques comme l'antrachnose commence
se rpandre et occasionner des pertes. Plus graves encore, certaines ignames
prsentent des signes de viroses qu'il est impossible de combattre. Le
tubercule semence transmettra obligatoirement la maladie. Ces viroses
rduisent fortement la production annuelle.
La culture de tissus pourrait permettre d'chapper ces
contraintes. Un programme d'amlioration gntique a t lanc au laboratoire
en vue d'obtenir des hybrides somatiques intra ou interspcifiques. Mais avant
de pouvoir envisager une telle possibilit, il est ncessaire de matriser les
diffrentes voies qui fournissent le matriel vgtal ncessaire l'obtention de
protoplastes. C'est pourquoi, l'tude de la morphogense et de la callogense
in vitro a retenu notre attention.
La morphogense des ignames in vitro apparat donc trs variable
selon les espces. L'espce a/ara se dmarque des autres par la rapidit de son
organogense et sa plastochronie leve. Les cayenensis ont une rponse plus
irrgulire selon les cultivars mais possdent une vitesse de croissance
relativement lente. L'organogense semble difficile. Les escu/enra se
caractrisent par une architecture en rosette avec des entre-nuds courts. La
rhizogense est gnralement tardive. L'espce dumerorum se reconnait
facilement par son aspect en touffe, ses feuilles trilobes et ses entre-nuds
exagrment longs.
Les essais de callogense sur D. a/ara cv. 'Florido' et D.
cayenensis cv 'Krengle' n'ont pas t concluants. Ils demandent tre
poursuivis et approfondis afin de rgler les problmes de phnolisation que
nous avons rencontrs. Diffrentes approches sont possibles dans la mise au
point de la callogense. En effet il faudra jouer sur la nature de l'organe
ensemence. son stade physiologique, son pass. Notamment, le nombre des
repiquages qui augmentera au fur et mesure de l'avancement des travaux,
pourrait accrotre la juvnilit du matriel et donc sa rponse aux conditions
de culture.
26
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1
D'autres voies de recherche sur l'igname prsentent un intrt
certain et devront tre exploites :
- la production de semences artificielles in vitro par
l'intermdiaire des bulbilles ou des embryons somatiques
- la culture de mristmes afin d'assainir les varits cultives
viroses.
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Microbouture de Dioscorea a/ata

CV "FLORI DO"
Rhizogense la mise en culture sur bouture nodale
(O. alata)
:,
Il

.-

Dioscorea cayenensis-rotundata
CV "KPONAN"
Dveloppement la mise en culture sur bouture nodale
Caulogense bloque par un gonflement de la feuille caille
(D. cayenensis-rotundata )
Dveloppement la mise en culture sur bouture nodale
Dioscorea dumetorum
Dveloppement la mise en culture sur bouture nodale

1
Microbouture de Dioscorea esculenta
CV "8EA 97"
1
1
1
1

' ..
. -..
Il .
1 .. ; . ~ ~ ... ~ ~
~ ~
Callogense spontane sur noeud
(D. esculenta )
Callogense spontane sur feuille
(D. esculenta )