Uso potencial de las especies de Rhizobium.

Para mejorar la condicin de plantas no fijadoras de nitrgeno

Introduccin

Un nmero de estudios han demostrado que la inoculacin de semillas con bacterias promotoras del crecimiento de las plantas (PGPR) puede resultar en el incremento de la germinacin y aparicin de plntulas y mejorar el crecimiento de varios cereales y cultivos no cereales (de freitasy germida, 1992; chen et al., 1994; javed y arshad, 1997, biswas et al., 2000, 2000b; dobbelaere et at., 2001; matiru y dakora, 2004; Wang et al., 2007). El efecto potencial y la contribucin exitosa de PGPR cepas de crecimiento de las plantas estn fuertemente influenciadas por el medio ambiente, incluyedo las caractersticas del suelo, especies de plantas incluso especies vegetales dentro de una especie, microflora y otros indgenas de la rizosfera( nowak, 1998). Condiciones subptimas o desfavorables pueden llevar a la sntesis de poco o nada de sustancias biolgicamente activas en la zona de la raz. Dando lugar al fallo de la PGPR para promover el crecimiento de platas (chanway y holl, 1992). Lo que dificulta el uso prctico del PGPR, ya que los efectos son impredecibles debido a las diversas condiciones del medio ambiente. Al mismo tiempo, un nmero creciente de informes muestran que los rizobios pueden actuar como PGPR en las plantas no leguminosas. Hflich (1994) obtuvo significantes aumentos en el rendimiento de brotes de forraje (78%) inoculando maz (Zea mays), trigo de primavera (Triticumaestivum), y cebada de primavera (Hordeumvulgare L.) con cepa R39 de R. leguminosarumbv. Trifolii en campos experimentales. Yanni (1997) tambin observ que cierta cepa eficaz de tipo salvaje de R. leguminosarumbv. Trifolii era capaz de establecer asociaciones naturales de plantas y bacterias que tenan el potencial de estimular el crecimiento de plantas de arroz (Oryza sativa) bajo condiciones del campo y el laboratorio, mientras Chabot (1996) report que la inoculacin de los campos de cosecha de maz y lechuga (lactuca sativa) incrementaba el rendimiento de los cultivos. Galleguillos (2000) report que la inoculacin de lechuga con la modificacin gentica Sinorhizobiummeliloti mejoraba la produccin de forraje cinco veces.Una serie de experimentos de laboratorio con inoculacin de rhizobium en trigo, llevado a cabo por Zahir (2004) tambin demostr un incremento en la elongacin de la raz (mas del 20%), peso seco de la raz (mas del 13 %), elongacin de las ramas (por encima del 38%), y peso seco de las ramas (por encima del 36%). Sin embargo, los mecanismos precisos por los cuales las cepas de Rhizobial estimulan el crecimiento de las plantas necesitan ser conocidos con el fin de

optimizar cada mecanismo. Ademas, un numero de reportes ha demostrado la habilidad de rhizobia para actuar como un endfito de plantas no fijadoras de nitrgeno (Spencer, 1994). El objetivo del presente estudio es identificar cepas de rhizobial con la capacidad de usarse como promotoras potenciales de crecimiento de plantas no fijadoras de nitrgeno.

Materiales Y Mtodos Materiales vegetales Las semillas de varias plantas no fijadoras de nitrgeno fueron obtenidas de la compaa de semillas Impecta AB, Julita, Suiza. Los datos y caractersticas de las especies seleccionadas son presentados en la Tabla I. Todas las especies vegetales fueron seleccionadas aleatoriamente como plantas no fijadoras de nitrgeno. Las plantas son de diferentes familias botnicas y tienen diferentes tamaos, estructura, color, sabor, forma, olor, tasa de crecimiento, tasa de germinacin, ciclo de vida, ecologa y presencia en la naturaleza.

Cepas Rhizobiales Ocho diferentes cepas rhizobiales fueron obtenidas de ElosmestariLtd, Finlandia (Originalmente de Rusia); en adicion una cepa (E-11) se obtuvo de Italia. Las diferentes cepas son presentadas en la Tabla II. La mayoria de esas cepas ya han sido probadas o examinadas con respeco a su potencial, para ambas plantas, leguminosas y no fijadoras de nitrgeno.

Condiciones de crecimiento de las plantas El medio de crecimiento fue obtenido de la compaa Askania AB, Suiza. El medio es suelo arenoso completamente esterilizado y el nombre comercial del producto es Silversand and 55. La distribucin de las partculas es: 40% de las partculas son de 0.35mm, 30% de 0.50 mm, 16% de 0.25 mm, 10% de 0.707 mm. La composicin qumica es: 99.2% SiO2, 0.09% Al2O3, 0.058% Fe2O3 y 0.1% perdida al fuego.

Preparacin de Inoculantes rhizobiales Con una semana de edad, crecimiento satisfactorio y buen desarrollado, las colonias rhizobiales se mantienen en YM agar (1.5% agar) hecho de acuerdo a Somasegaran y Hoben (1994) donde se usaron para la preparacin de inoculantes. Para este propsito, los bucles de las colonias respectivas se

dispersaron en esteriles 0.02 M K2HPO4, pH 7 y la concentracin de rizobios en suspensin fue ajustada a 105 c.f.u. mL-1 al uso de un espectofotometro .nueve inoculaciones de una sola sepa se prepararon, una cepa mixta de inoculo y un tratamiento que consiste en una mezcla de la clula autoclave con la misma densidad celular inicial en los otros. Por lo tanto hubo 12 tratamientos en total (8 cada sepa, una mezcla de todas las cepas, un tratamiento de esterilizacin, y un control (YM solo agar)).

La inoculacin de plantas.

El diseo del experimento con plantas de mezcla que participan los seis tipos de semillas de plantas en una maceta (2 semillas por especie de planta) incluyendo 6 repeticiones para cada tratamiento. Por lo tanto hubo 2 (semillas dcada tipo de planta) x 6(repeticiones) x 12 (tratamientos), equivalente a 144 semillas por cada planta del cultivo. Para la esterilizacin de las semillas de la superficie, las semillas de cada especie de cultivo individuales fueron colocadas en un erlenmeyer y tratadas con hipoclorito de sodio al 1% por 2 minutos, seguido de un enjuague de seis veces con agua esteril. Despus de que, las semillas sellena de las suspensiones de rizobios diferentes. Las semillas tratadas solo con 0.02 M K2HPO4 de la solucin se utilizaron como control. Todos los matraces se arremolinaba suavemente para que las semillas y bacterias en contacto durante 30 minutos para obtener un inculo uniforme de 105c.f.u. Semillas -1. Experimento de efecto invernadero El experimento de efecto invernadero fue llevado a cabo a mediados de agosto de 2006. Las semillas tratadas y controladas (2 por especie de cultivo) se sembraron inmediatamente en macetas de plstico previamente preparadas (8 cm de dimetro y 11 cm de longitud) usando cucharas plsticas esterilizadas y ubicndolas en un invernadero donde la temperatura del aire y del suelo era de 27 y 30C, respectivamente. Las semillas fueron cubiertas con tierra a 1 cm de profundidad inmediatamente despus de la siembra. La germinacin de la semilla inicio a los tres das y contino por los siguientes dos das. En la segunda semana despus de la germinacin, las prcticas normales de cultivacin fueron aplicadas. Dichas prcticas incluan riego dos veces por semana en una dosis inicial de 100 mL por maceta, la cual fue incrementada a 200 mL de acuerdo al crecimiento y desarrollo de las plantas. Una planta por maceta de Zea maysy Helianthusannuus fueron podadas para producir una bien balanceada distribucin del follaje. La solucin liquida de

nutrientes para plantas (Compaa Bayer), que contiene 7.0% N, 2.2% P, 5.0% K, 0.04% S, 0.01% B, 0.02% Fe, 0.01% Cu, 0.01% Mn, 0.005% Mo, 0.005% Zn, y 0.006% Mg, fue introducida en una dosis inicial de 1 mL en 2 L de agua destilada despus de dos semanas.La concentracin de nutrientes fue duplicada cada semana durante cuatro semanas hasta una constante de 4 mL de solucin de nutrientes en 2 L de agua destilada, aplicndolo durante el riego. Todas las macetas fueron movidas e un invernadero con una temperatura promedio en el dia de 25C, en la oche de 22C, iluminacin de 30 klx, y un promedio de humedad relativa de 85% despus de tres semanas. Todas las races de las plantas fueron re-inoculadas dos veces con el mismo tratamiento en la misma concentracin usando un cuentagotas de vidrio esterilizado para aplicar el liquido a la superficie del suelo. La primera reinoculacin fue dos semanas despus de la siembra y la segunda fue cinco semanas despus de la siembra. La posicin de las macetas fue reordenada cada semana para lograr una distribucin uniforme de la luz en todos los tratamientos. Todas las plantas fueron cosechadas con sus races intactas despus de 58 dias y el suelo fue removido cuidadosamente de las plantas usando un corriente de agua. Todas las plantas limpias fueron etiquetadas y ubicadas en un secador a 60C por 48 horas para la determinacin del peso seco de la biomasa. Las races de las plantas y los brotes fueron separados y pesados separadamente por una balanza digital y la informacin fue registrada.

Efectos de la densidad de inoculo en la germinacion y desarrollo de Linumusitatissimum En un experimento adicional, el impacto de la densidad de inoculo bacterial en la germinacin y desarrollo fue investigado usando linaza (Linumusitatissimum) como la planta de prueba. Un total de 60 semillas viables de linaza esterilizadas con 1% de hipoclorito de sodio fueron preparadas. Esas semillas fueron dividadas en cinco grupos iguales, tres de los cuales fueron inoculados con el aumento de concentraciones de cepas de Sinorhizobiummeliloti (c.f.u. ). El tratamiento de esterilizacin en autoclave involucro una solucin de cepas Sinorhizobiummeliloti a 121 C por 20 minutos y 0.02 M K2HPO4 utilizada como control. El procedimiento para la inoculacin de las semillas fue el mismo que el anterior y la inoculacin de las semillas fue inmediatamente sembrada en macetas plsticas (4 semillas por maceta, 3 repeticiones por tratamiento, y 5 tratamientos) previamente preparadas en el invernadero y cubierto con 1 cm de suelo. El promedio de temperatura del aire fue de 20.3C, del suelo (5 cm de profundidad) fue de 20.6C, iluminacin de 30 klx, y humedad relativa de 85%. La germinacin de las semillas comenz a los tres das. Despus de dos semanas, las plntulas fueron tratadas otra vez con la concentracin previa de solucin de cepas Sinorhizobiummeliloti usando goteros de vidrio esterilizado. Practicas de cultivo tales como riego, aplicacin

de nutrientes vegetales, y reorganizacin de las posiciones de las macetas llevado a cabo como antes, pero no hubo poda. Todas las plantas fueron cosechadas a los 56 dias con cuidado removiendo la tierra de la zona de las races mediante corrientes de agua, secadas a 60C por 48 horas y el peso seco de las races y fitomasa fueron determinados separadamente usando una balanza digital.

Interaccion entre rhizobia y hongos patgenos Ocho diferentes cepas rhizobiales y dos tipos de hongos (Fusarium oxysporum y Rhizoctoniasolani)fueron usados para este propsito. El experimento fue realizado en un medio de nutrientes YMA. Una pequea cantidad de colonia de rhizobial exponencial puro de cada uno de las ocho cepas fue recogida con un lazo plstico del tubo de cultivo bacteriano puro y rallado en una nica lnea de 8 cm de longitud en la superficie superior de separadas placas de YMA. Esas placas fueron mantenidas por siete das a 25C para su crecimiento y desarrollo. Despus de 7 dias, tapones de agar del cultivo de 14 dias de Fusarium oxysporumy Rhizoctoniasolani mantenidos en agar depapa-dextrosa, fueron colocados a una distancia de 2 cm de cada lnea rhizobial. Las placas fueron incubadas a 25C. El crecimiento horizontal de hongos hacia la lnea bacterial fue documentado diariamente.

DISCUSIN
en este estudio, la intencin fue seleccionar el potencial de rhizobia ms efectivo para la fijacin de las plantas. algunos de los resultados no fueron significativos. por ejemplo, cepa PAR-207 pertenecientes al gnero Sinorhizobiummeliloti demostr una amplia gama de capacidades para mejorar todos los tipos de plantas no fijadoras de nitrgeno (cuadro 3), pero no mostr diferencias estadsticamente significativas para materia seca PAR cepa-201, tambin pertenecientes a Sinorhizobiummeliloti, se finalmente que el crecimiento de las plantas mejor significativamente en todos los casos, pero no mejoro el crecimiento de las races de papaverrhoeas (tabla 3), aunque los valores medios obtenidos parecen ser sustancialmente diferentes. la mayora de las cepas de Sinorhizobiummelilotirizhobial se reportan para producir cido indol-3actico, que es una planta de conocer la hormona estimulante. tambin son conocidos por producir siderforos, que tambin promueven el crecimiento de plantas. Galleguillos et al (2000) tambin ha informado de los efectos beneficiosos de Sinorhizobiummeliloti en la lechuga. se ha demostrado que las cepas de Rhizobium

tienen un buen efecto en el arroz durante la produccin de cido indol-3-actico. Hilali et al (2000) demostraron que trifoliiRhizobium leguminosa tienen un mayor rendimiento de grano de trigo en un 18%. Sin embargo, en el stady presentar una respuesta de crecimiento positivo se obtuvo en slo dos casos.

msrizhobia se sienten atrados hacia los aminocidos, cidos orgnicos, azcares y por una respuesta quimiotctica. Sin embargo, las cepas de Rhizobium loti no se sienten atrados por estos compuestos. Desde esta perspectiva, el estudio cepa PAR804, que pertenece a este grupo, no es adecuado para no plantas fijadoras de nitrgeno, ya que no se activaatrados por su rizosfera, que es un requisito previo que se ha funcionado como RPCP. adems, esta cepa no dio lugar a en las

respuestas positivas de plantas, excepto para el caso de aumentar la biomasa de races de papaver rhoeas. se puede concluir que la cepa PAR-804 no es adecuado para la inoculacin de las plantas no fijadoras de nitrgeno. por ejemplo, se ha demostrado que lumichrome y LCOS

publicado por rizobios estimular la germinacin de las semillas y el crecimiento de las plantas de cultivo diferentes. muy probablemente, la planta de estimulantes efectos dependen de la densidad de inoculante de rizobios, que a su vez regula las concentraciones de sustancias de la planta estimulante. en el presente sub-estudiosobre el efecto de la densidad

de inculo en el crecimiento de las plantas, se encontr que una concentracin de 10 UFC de la cepa PAR-207 dio la tasa ms alta de semillas de germinacin y el crecimiento de la planta de prueba, Linum usitatissimum. en el estudio de las interacciones entre los rizobios y hongos patgenos de plantas, los experimentos realizados mostraron que ninguno de los nueve cepas de rizobiosla prueba fue capaz de prevenir el crecimiento de hongos directa hacia la lnea de

bacterias y el contacto con xito entre los dos. Sin embargo, despus de un par de das de siete de las nueve cepas disolvi y se fusion el micelio esteefecto vara del hongo hacia el micelio denso de disponibilidad edad. la gravedad de de nutrientes en

de cepa a cepa y con la

el medio. Elmecanismo posible delcontacto con el hongo, rizobios contenido nutricional delos micelios de comenz

razn es que, despus a utilizar el

hongos, que hidrolizo la

reaccin enzimtica para su crecimiento y desarrollo, y por lo tanto la lnea hacia el micelio del hongo. aument significativamente la biomasa vegetal indica que los rizobios tienen

unahabilidad innata para promover el crecimiento de la no-plantas fijadoras de nitrgeno.Sin embargo, la realizacin de esta capacidad depende de la

asociacin adecuadaentre las especies de plantas. La

cepas de

rizobios y

la no fijacin de

nitrgeno, las otro

concentracin del inculo germinacin y crecimiento que

de Rhizobium es de indica las que

factor importante para la

plantas. Los ciertas de

resultados confirman anteriores estudios lo cepas de rizobios pueden promover el

crecimiento de plantas

no fijadoras

nitrgeno, posiblemente a travs de mecanismos que implican cambios en la fisiologa del crecimiento y serexaminados a la morfologa de la travs raz. ms cepas de rizobios deben de experimentos de la produccin

laboratorio yde campo para explotar supotencial como RPCP para vegetal sostenible.