Anda di halaman 1dari 16

OUTLINE SKRIPSI PENGARUH APLIKASI IMPLANTASI TRIKALSIUM FOSFAT-KITOSAN TERHADAP KECEPATAN PROSES PENYEMBUHAN CEDERA TULANG (Penelitian eksperimental

pada hewan coba)

Oleh: ARI WAHYUDA G1G009022

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU-ILMU KESEHATAN JURUSAN KEDOKTERAN GIGI PURWOKERTO 2013 A. Judul Pengaruh aplikasi implantasi Trikalsium Fosfat-Kitosan terhadap kecepatan proses penyembuhan cedera tulang (penelitian eksperimental pada hewan coba). B. Latar Belakang

Penyakit tulang terdiri dari berbagai kasus penyakit seperti kanker tulang, periodontis, trauma, patah tulang, dan lain-lain. Penyakit tulang diakibatkan oleh trauma, tumor, atau patah tulang sering dialami oleh manusia pada umumnya (Murugan & Ramakrishna, 2004). Dewasa ini kasus penyakit tulang seperti tumor tulang, patah tulang ataupun trauma semakin meningkat di Indonesia. Kehilangan tulang alveolar karena cidera yang diakibatkan oleh penyakit periodontal atau akibat pembedahan (trauma) merupakan komplikasi yang sering terjadi dalam tindakan kedokteran gigi khususnya dibidang bedah mulut dan periodontologi. Berdasarkan Laporan Survei Kesehatan Rumah Tangga (SKRT) Departemen Kesehatan Republik Indonesia Tahun 2001, penyakit periodontal memiliki prevalensi sebesar 70% dengan jumlah kasus sebanyak 72.223 kasus. Daerah Jawa Timur dan Jawa Tengah memiliki jumlah kasus 5.205 kasus (Kemenkes, 2010). Kabupaten Banyumas dilaporkan kasus tertinggi di Jawa Tengah dengan jumlah kasus 15.236 (Dinkes Banyumas, 2011). Banyaknya kasus kerusakan tulang ini membuat kebutuhan graft tulang atau biomaterial semakin meningkat (Darwis, 2008). Tindakan terapi yang biasanya diberikan pada kasus penyakit tulang adalah dengan teknik implantasi dengan tujuan untuk menggantikan jaringan tulang yang hilang atau rusak, sehingga kebutuhan akan bahan implan atau biomaterial semakin meningkatkan (Bhat, 2002). Graft tulang berperan penting dalam mendukung struktur struktur dan fungsi tulang alveolar. Secara garis besar terdapat dua fungsi utama graft terhadap tulang resepien yaitu mendorong terjadinya osteogenesis (pembentukan tulang) dan memberi dukungan mekanis pada kerangka resipien (mechanical support) (Caranza, 2002). Biomaterial merupakan suatu material, baik bersifat alamiah maupun buatan, yang dapat berinteraksi dengan sistem tubuh dengan tujuan untuk memperbaiki (repair), memulihkan (restore), dan menggantikan jaringan yang rusak (replace) atau sebagai penghubung (interface) dengan lingkungan fisiologis tubuh (Darwis, 2008). Penggunaan biomaterial sebaiknya yang

bersifat osteoinduktif, osteokonduktif, biokompatibel, bioaktif, stabil secara biomekanis, bebas penyakit, serta mengandung faktor antigen minimal (Kalfas, 2001), bioresorbabel (Samsiah, 2009) dan biodegradabel (Pane, 2008). Berbagai sifat tersebut terdapat dalam biomaterial alamiah atau biomaterial yang berasal dari bagian lain tubuh pasien itu sendiri (autograft) Namun penggunaan Autograft memiliki keterbatasan karena membuat luka baru pada pasien sehingga pasien akan kehilangan darah yang lebih banyak. Selain Autograft, terdapat biomaterial yang berasal dari spesies yang sama (allograft). Adapun jenis biomaterial pengganti tulang lainnya yaitu xenograft, yang berasal dari spesies berbeda misalnya sapi, memiliki keterbatasan dalam kemungkinan perbedaan karakter mineral tulangnya (Stavropoulos 2008). Oleh karena itu, diperlukan pengembangan biomaterial sintetik yang sesuai untuk mengatasi berbagai keterbatasan tersebut. Pengggunaan biomaterial sintetik pengganti tulang (synthetic bone graft) harus memiliki struktur serta komposisi yang mendekati tulang asli. Komposisi tulang terdiri dari mineral tulang dan bahan organik. Sebagai alternatif lain pengganti tulang (bone graft) juga dapat disintesis dari berbagai biomaterial, seperti hidroksiapatit, trikalsium fosfat, hidrogel dan lain-lain. Komponen utama senyawa apatit adalah kalsium fosfat. Kalsium fosfat terdiri dari beberapa fase yaitu oktakalsium fosfat, dikalsium fosfat dihidrat (DKFD), trikalsium fosfat (TKF) dan hidroksiapatit (HA). Komponen mineral apatit memiliki rumus kimia M10(ZO4)6X2. Trikalsium fosfat (TKF) merupakan salah satu jenis kalsium fosfat yang memiliki sifat biodegradabel dan memiliki struktur kimia Ca3(PO4)2 (Shi,2004). Senyawa ini dikenal sebagai tribasic calsium phosphate atau "abu tulang". TKF dapat berbentuk kristal alfa dan beta. Senyawa ini banyak ditemukan pada kerangka tulang maupun gigi hewan vertebrata. Senyawa ini di alam tidak sepenuhnya murni. Sebagian besar mengandung kadar fosfat 30% - 40%. Kandungan senyawa ini sering digunakan sebagai pengganti untuk memperbaiki kerusakan jaringan tulang (Anonim, 2009). Jika

dibandingkan dengan HA, TKF lebih bersifat bioresorbable (mudah diserap), tetapi kurang bersifat osteoinductive. Kitosan (K) merupakan polimer dari D-glucosamine yang terdapat dalam jumlah melimpah di alam, yang dapat dimanfaatkan sebagai komponen organik. Kitosan banyak terkandung dalam cangkang kepiting yang masih menjadi limbah di Indonesia. Penggabungan TKF dengan K (komposit HA-K) diharapkan dapat mendekati struktur asli tulang serta dapat meningkatkan sinergisme dari masing-masing bahan sehingga berpotensi sebagai biomaterial sintetik pengganti tulang yang ideal. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa penggunaan implan kombinasi antara Hidroksiapatit dengan kitosan terhadap morfologi proses persembuhan kerusakan segmental pada tulang domba tidak menunjukkan hasil yang lebih baik dibandingkan dengan kelompok perlakuan kontrol (Berlianti, 2011). Penelitian ini berbanding terbalik dengan penelitian yang dilakukan oleh menyatakan bahwa implantasi material -TKF ke dalam os femur kelinci menunjukkan bioresorbabel atau dapat diserap namun tidak pada HA (Takatoshi, 2007). Sehingga Peneliti tertarik untuk melakukan penelitian penggunaan implan Trikalsium fosfat-kitosan terhadap regenerasi cidera tulang pada kelinci. C. Rumusan Masalah Bagaimana pengaruh aplikasi implantasi Trikalsium Fosfat-Kitosan terhadap kecepatan proses penyembuhan cedera tulang (penelitian eksperimental pada hewan coba). D. Tujuan 1. Tujuan Umum Mengetahui pengaruh aplikasi implantasi Trikalsium Fosfat-Kitosan terhadap kecepatan proses penyembuhan cedera tulang (penelitian eksperimental pada hewan coba).

2. Tujuan Khusus a. b. Mendiskripsikan secara histologi proses regenerasi cidera tulang alveolar. Mendiskripsikan pengaruh aplikasi implantasi Trikalsium FosfatKitosan terhadap kecepatan proses penyembuhan cedera tulang. E. Manfaat 1. Manfaat Teoritis a. Menambah ilmu pengetahuan mengenai pengaruh aplikasi implantasi Trikalsium Fosfat-Kitosan terhadap kecepatan proses penyembuhan cedera tulang. b. a. b. Menambah ilmu pengetahuan mengenai proses penyembuhan tulang. Mahasiswa dapat menggunakan aplikasi implantasi Trikalsium FosfatKitosan terhadap kecepatan proses penyembuhan cedera tulang. Mahasiswa dapat melakukan perawatan penyembuhan tulang. 2. Manfaat Praktis

F. Landasan Teori Tulang merupakan jaringan ikat khusus yang berfungsi sebagai alat penyokong, pelekatan, perlindungan, dan penyimpanan mineral. Jaringan ini dilengkapi dengan rigiditas, kekuatan yang sangat besar, serta elastisitas yang sangat terbatas. Kemampuan jaringan ini untuk menyimpan mineral terutama kalsium (Ca), kebanyakan dalam bentuk kristal hidroksiapatit, merupakan sifat utama yang membedakan tulang dari jaringan ikat lainnya (Samuelson 2007). Tulang secara eksternal diselaputi oleh sebuah jaringan bernama

periosteum. Periosteum berisi pembuluh darah, lapisan tebal serabut kolagen yang tersusun padat tidak beraturan, dan sel-sel yang mampu berdiferensiasi menjadi osteoblas (sel osteogenik). Semua bagian tulang diselaputi oleh periosteum, kecuali bagian yang terdapat artikulasi dengan tulang lainnya. Tulang memiliki ruang internal di bagian tengahnya yaitu rongga sumsum, yang di dalamnya terdapat sel stem dari sel darah. Rongga sumsum dilapisi oleh selapis jaringan ikat tipis tervaskularisasi bernama endosteum. Endosteum juga memiliki sel-sel osteogenik seperti halnya periosteum (Kalfas 2001; Samuelson 2007). Tulang berperan dalam fungsi metabolik yaitu menyediakan sumber kalsium untuk memelihara keseimbangan kadar kalsium dalam darah serta menyediakan beberapa faktor pertumbuhan (growth factor) seperti transforming growth factor (TGF-) yang berperan dalam remodelling (Dellmann & Eurell 1998). Tulang memiliki komponen seluler yang terdiri dari berbagai macam sel tulang. Sel tersebut antara lain prekursor osteogenik atau osteoprogenitor, osteoblas, osteosit dan osteoklas serta elemen hematopoetik dari sumsum tulang (Kalfas 2001). Sedangkan komponen ekstraseluler terdiri dari bahan organik dan anorganik pembentuk matriks (Samuelson 2007). Osteoblas terletak dalam suatu garis di sepanjang permukaan jaringan tulang. Saat aktif, osteoblas cenderung berbentuk kubus dan bersifat basofilik. Sedangkan saat kurang aktif, maka bentuknya akan menjadi lebih kempis dan kurang basofilik. Ketika aktivitas sintesis matriks berhenti dan osteoblas telah memasuki matriks tersebut maka osteoblas berubah namanya menjadi osteosit. Sebagian besar jaringan tulang terdiri atas matriks ekstraseluler, yang kurang lebih 2/3 bagiannya berupa material anorganik dan sisanya berupa material organik. Sebagian besar material organik terdiri atas serabut kolagen tipe I dan sejumlah kecil bahan dasar (Samuelson 2007; IOF 2009). Secara umum tulang tersusun oleh 30% substansi organik, 55% substansi anorganik (mineral), dan 10% air (Aoki 1991). Material anorganik tulang seperti kalsium (Ca) dan fosfor (P) tersedia dalam jumlah yang sangat banyak. Sebagian besar

Ca dan P membentuk kristal hidroksiapatit, yang terletak berdampingan dengan serabut kolagen. Selain itu, beberapa mineral lain juga terdapat dalam jumlah sedikit antara lain: bikarbonat (HCO3-), magnesium (Mg), natrium (Na), kalium (K), tembaga (Cu), seng (Zn), mangan (Mn), dan lainnya (Samuelson 2007). Remodelling tulang merupakan reorganisasi atau renovasi struktur tulang lama. Terjadi resorpsi jaringan tulang dan deposisi simultan tulang baru pada tulang normal, kedua proses ini berada dalam keseimbangan yang dinamis (Dorland 2002). Kondisi ini sebagian besar terjadi pada kerangka hewan dewasa untuk mempertahankan massa tulang. Proses ini mencakup pembentukan dan resorpsi tulang secara bersamaan (berpasangan). Remodeling merupakan sebuah proses yang dinamis termasuk penggantian dan pengisian kembali baik tulang kompak maupun trabekular. Proses ini terus-menerus terjadi untuk mempertahankan massa tulang serta integritas dan fungsi kerangka. Proses ini kompleks dan dikendalikan oleh susunan syaraf pusat melalui hormon dan oleh tekanan mekanis. Proses ini bergantung pada keterpaduan aksi dari osteoblas, osteosit, dan osteoklas. Secara bersamaan, ketiga sel ini membentuk BMU (Basic Multicellular Unit) atau unit remodeling tulang yang berperan dalam proses remodeling pada hewan dewasa (Mills 2007). Proses remodeling tulang terjadi dalam beberapa fase yaitu: aktivasi, resorpsi, pembalikan, pembentukan, fase pasif. Remodeling terjadi dalam empat tahap antara lain: 1. Tahap Hemoragi dan Tahap Awal Inflamasi Ketika terjadi fraktur maka pembuluh darah akan mengalami kerusakan atau ruptur dan terjadi hemoragi di dalam daerah fraktur, jika darah merembes melewati periosteum di dalam otot. Kemudian darah mengalami koagulasi dan mengisi ruang terjadinya fraktur atau terjadi hematoma dalam ruang fraktur (Kalfas, 2001). Adanya trauma pada kejadian fraktur akan menginduksi tahap inflamasi . Pada tahap ini, selsel peradangan seperti monosit, limfosit, sel-sel polimorfonuklear dan

fibroblast menginfiltrasi tulang yang diperantarai oleh prostaglandin. Monosit yang masuk ke dalam daerah fraktur akan bertransformasi menjadi makrofag yang memainkan peranan penting dalam persembuhan tulang (Cheville, 2006). Hal ini akan menyebabkan pembentukan jaringan granulasi, pertumbuhan jaringan pembuluh darah (neovaskularisasi), dan migrasi dari sel-sel mesenkimal (Kalfas 2001). Tahap ini terjadi pada awal kerusakan yaitu satu sampai lima hari pertama setelah terjadi kerusakan. 2. Tahap Perbaikan (Pembentukan Kalus) Tahap perbaikan fraktur diawali dengan pembentukan kalus kemudian sampai 48 jam setelah fraktur, darah yang mengendap akan diinfiltrasi oleh sel osteogenik yang ada pada lapisan periosteum, endosteum dan sumsum tulang. Sel tersebut berproliferasi di pinggir fraktur dan dengan cepat menghampiri endapan dan perbatasan area nekrotik. Kalus merupakan jaringan baru antara dua ujung fraktur yang kemudian akan berubah menjadi jaringan tulang (Dorland 2002). Awalnya, terjadi jaringan granulasi (kalus lunak) dan kemudian berubah menjadi kartilago atau tulang (kalus keras). Fase jaringan granulasi diperpanjang dan formasi jaringan tulang rawan hialin akan menyokong sampai terjadi pembentukan tulang di kalus. 3. Tahap Pembentukan Tulang Rawan Tahap pembentukan tulang rawan terjadi dalam waktu satu minggu, proliferasi sel akan mulai berdeferensiasi menjadi khondroblas. Material matriks yang dilepaskan dari permukaan khondroblas yang tertimbun dalam lingkaran yang mengeliling sel. Dalam proses kalsifikasi tulang rawan, vesikel matriks kecil keluar dengan proses enzimatik (alkaline fosfatase dan enzim untuk ATP-dependent calcium transport) yang meningkatkan konsentrasi lokal dari orthofosfat yang akan berfungsi untuk membentuk hidroksiapatit. Pada hari ke 7-10, pH di dalam kalus meningkat dan akan menyokong endapan garam kalsium.

Tulang rawan yang terbentuk keberadaannya hanya sementara dan pada akhirnya akan digantikan dengan tulang sebenarnya (woven bone) melalui tahap remodelling, dan membutuhkan waktu untuk menjadi tulang lamellar (lamellar bone). Matriks ekstraseluler tulang rawan mengalami kalsifikasi, kemudian menyebabkan khondrosit mati. Tulang baru terbentuk sebagai tulang rawan yang disintegrasi. Osteosit berkembang dari pluripoten mesenkim sel, fibroblast, dan deposit osteoid. Selama tahap perbaikan, fibroblast menuju stroma yang akan membantu pertumbuhan pembuluh darah (vaskular). Tahap perubahan tulang rawan menjadi tulang terjadi melalui mekanisme osifikasi endokhondral. 4. Tahap Remodelling Persembuhan fraktur akan sempurna selama tahap remodelling. Pada tahap ini kerusakan tulang telah kembali mempunyai bentuk, struktur, dan kekuatan mekanik seperti semula. Remodelling tulang terjadi secara perlahan selama beberapa bulan bahkan tahun. Kekuatan tulang yang memadai akan dicapai dalam tiga sampai enam bulan (Kalfas 2001). Biomaterial merupakan suatu material, baik bersifat alamiah maupun buatan, yang dapat berinteraksi dengan sistem tubuh dengan tujuan untuk memperbaiki (repair), memulihkan (restore), dan menggantikan jaringan yang rusak (replace) atau sebagai penghubung (interface) dengan lingkungan fisiologis tubuh (Darwis 2008). Pemilihan biomaterial yang tepat sangatlah diperlukan dalam proses implantasi. Tentunya biomaterial yang dipilih adalah yang bersifat osteoinduktif, osteokonduktif, biokompatibel, bioaktif, stabil secara biomekanis, bebas penyakit, serta mengandung faktor antigen minimal (Kalfas 2001), bioresorbabel (Samsiah 2009) dan biodegradabel (Pane 2008). Osteoinduktif adalah kemampuan biomaterial untuk menginduksi sel-sel sumsum tulang atau osteoprogenitor berdiferensiasi menjadi sel-sel tulang dewasa (Laurencin 2009). Osteokonduktif adalah kemampuan biomaterial

untuk mendukung pelekatan sel-sel osteoblas baru dan osteoprogenitor, menyediakan struktur saling berhubungan sehingga sel-sel baru dapat berpindah dan pembuluh darah baru dapat terbentuk (Laurencin 2009). Sifat biokompatibel adalah kemampuan biomaterial untuk menyesuaikan dengan kecocokan tubuh penerima, tidak mempunyai efek toksik maupun melukai fungsi biologis (Dorland 2002). Sedangkan bioaktif adalah kemampuan biomaterial untuk bereaksi dengan jaringan tubuh dan menghasilkan suatu ikatan yang sangat baik (Purnama 2006). Biomaterial sintetik pengganti tulang merupakan alternatif yang dapat mengatasi keterbatasan beberapa metode sebelumnya. Penggunaan biomaterial sintetik secara tepat untuk substitusi tulang tidak akan menimbulkan inflamasi serta tidak menyebabkan respon iritasi (Nurlaela 2009). Saat ini penggunaan biomaterial sintetik yang memiliki kemiripan dengan fase anorganik tulang telah mengalami peningkatan di bidang operasi rekonstruksi tulang karena sifat biokompatibilitasnya yang unggul (Schnettler et al. 2004). Secara umum penyusun utama komponen anorganik tulang adalah kalsium fosfat yang mempunyai dua fase yaitu amorf dan kristal. Senyawa kalsium fosfat kristal hadir dalam empat fase, yaitu dikalsium fosfat (DKF, CaHPO4.2H2O), okta kalsium fosfat (OKF, Ca8H2PO4.5H2O), trikalsium fosfat (TKF, Ca3(PO4)2) dan hidroksiapatit (HA, Ca10(PO4)6(OH)2). TKF memiliki 4 polymorph yaitu , , dan super-. polymorph adalah fase bertekanan tinggi dan super- polymorph dapat diobservasi pada temperatur kira-kira diatas 1500oC. Oleh karena itu, TKF polymorph yang sering digunakan dalam penelitian biokeramik adalah dan -TKF (Shi 2004). Beberapa penelitian menyatakan bahwa TKF memiliki sifat biodegradabel,walaupun sedikit berbeda dengan karakteristik material yang digunakan (Shi, 2004). Strukturnya juga berupa kristal, laju biodegradasi TKF lebih baik daripada HA. Bahkan dalam penelitian yang dilakukan oleh Takatoshi (2007) menyatakan bahwa implantasi material -TKF ke dalam os femur kelinci menunjukkan bioresorbabel atau dapat diserap namun tidak

pada HA. TKF mempunyai peranan penting sebagai bioresorbabel keramik. Bahan ini memperlihatkan tingginya daya larut dan bioaktifitas. Hasilnya menunjukkan mikrostrutur -TKF berefek pada aktifitas dari sel-sel tulang dan kemudian dapat menggantikan tulang. -TKF dapat diterima dan digunakan di dalam tubuh atau dikenal sebagai biokompatibel, bioresorbabel material untuk perbaikan tulang yang dibentuk menjadi keramik blok, granul, atau fosfat semen (Shi, 2004). Kitosan adalah biopolimer karbohidrat hasil ekstraksi kitin, yang merupakan biopolimer alami kedua disamping selulosa yang terdapat dalam jumlah melimpah. Kitin merupakan komponen struktural primer dari eksoskeleton hewan arthropoda (contohnya crustacean), dinding sel fungi, dan kutikula serangga. Kitin merupakan polisakarida dan polimer linear dari Nacetyl-Dglucosamine monomers yang bergabung dalam ikatan 1,4-glikosidik (Shin et al., 2009). Ketertarikan dalam pemanfaatan kitosan telah meningkat sehubungan dengan sifat biologisnya yang unggul, seperti biokompatibilitas, mudah terdegradasi tanpa meninggalkan racun, tidak karsinogenik terhadap hewan maupun manusia, bioaktif (Nurlaela 2009) serta memiliki efek anti bakterial dan efek persembuhan yang cepat bagi jaringan (Shin et al. 2009). Studi lain memperlihatkan bahwa kitosan mampu meningkatkan pembentukan jaringan tulang dan dapat digunakan sebagai matriks dalam teknik pembuatan jaringan gingival. G. Metode Penelitian 1. Jenis Penelitian Jenis 2. Variabel Penelitian a. Variabel Bebas Variabel bebas penelitian ini adalah Trikaslsium fosfat-Kitosan b. Variabel Terikat penelitian yang digunakan adalah laboratorium eksperimental dengan post test only control group design.

Variabel terikat penelitian ini adalah jumlah osteoblast pasca cedera tulang c. Variabel terkendali 1) Galur tikus (Galur Wistar) 2) Umur tikus 3) Jenis kelamin tikus 4) Suhu lingkungan 5) Makanan tikus d. Variabel Tidak Terkendali Variabel tidak terkendali penelitian ini adalah kondisi umum, kondisi tulang. Kondisi sistemik, dan variasi genetik hewan coba. 3. Subjek Penelitian Subjek penelitian menggunakan sekelompok tikus putih (Rattus norvegicus Strain Wistar) karena mempunyai struktur kulit dan hemostatis yang hampir sama dengan manusia (Wibisono dalam Ratih,2009). Dengan menggunakan rumus Federer maka jumlah kelinci yang digunakan dalam penelitian sebanyak 5 ekor (www.lontar.ui.ac.id, 2012). Subjek dibagi menjadi 4 kelompok yaitu kelompok perlakuan I, kelompok perlakuan II, kelompok perlakuan III, dan kelompok kontrol. Semua subjek penelitian akan di bur pada tulang femur dengan diameter 3cm 5mm. Setiap kelinci akan dibuat bur sebanyak 4 untuk pemberian perlakuan I, perlakuan II, perlakuan III, dan kontrol dari 5 ekor kelinci. Kelompok perlakuan I diberi aplikasi aplikasi Trikalsium fosfat, kelompok perlakuan II diberi aplikasi Kitosan, kelompok perlakuan III diberi aplikasi kombinasi antara Trikalsium fosfat dengan kitosan, dan kelompok kontrol aplikasi bone graft. 4. Lokasi Penelitian Penelitian ini dilakukan di LPPT IV Universitas Gadjah Mada dan Lab

Histologi dan Biologi Sel Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada. 5. Instrumen Penelitian a. Alat 1) Timbangan elektrik 2) Gelas Beker 3) Pipet 4) pH meter 5) Magnetic stirrer (IKA RCT Basic, model ETS-D4?ETS-D5) 6) Freeza dryer 7) Autoclve 8) EOG sterilizer 9) Spuit injeksi 10) Eksavator 11) Pinset 12) Jarum bedah 13) Needle holder 14) Block Cetak 15) Mikrotom 16) Waterbath 17) Gelas Objek 18) Drying plate 19) Kaca Penutup 20) Mikroskop cahaya dilengkapi dengan kamera digital merk Nikon, model E600W b. Bahan 1) 2) 3) 4) Kitosan Trikalsium Anestesi Aquadest

5) 6) 7) 8) 9)

Bone graft Palet (makanan mencit jantan) Povidon iodine Benang jahit (catgut) Alkohol 70%

10) Formalin 10% 11) Parafin 12) Bahan pengecatan mayer hematixylin dan eosin (HE) 6. Cara Penelitian a. Persiapan Pembuatan Kavitas Defek Tulang Persiapan yang dilakukan sebelum prosedur pembuatan kavitas defek tulang pada tikus adalah mensterilkan alat dan bahan yang akan digunakan untuk prosedur pembuatan kavitas dan aplikasi graft tulang. Peralatan yang digunakan antara lain ekskavator, pinset, bor tulang, dan needle holder. Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan autoclave pada suhu 121 C selama 30 menit. b. Pembuatan Kavitas Defek Tulang Prosedur pembuatan kavitas pada hewan coba diawali dengan pemberian anestei intramuscular dengan ketamin hidroklorida (Ketamine, 8mg/100g berat badan). Kavitas dibuat dengan mengebor bagian tibia hewan coba. Setelah kavitas terbentuk dibersihkan dengan Nacl fisiologis. c. Aplikasi Trikalsium fosfat-Kitosan Aplikasi Trikalsium fosfat-Kitosan pada devek tulang dengan ekskavator. Kavitas dijait dengan menggunakan jarum bedah dan benang jahit, kemudian diolesin dengan povidone iodine sebagai antiseptik d. Pembuatan Preparat Histologi a) Fikasi, dilakukan dengan cara memasukan jaringan tulang yang telah diambil kedalam formalin 10% untuk mempertahankan

struktur sel. b) Dekalsifikasi, dilakukan selama 24 jam dengan metode Plank dan Rychlo menggunakan bahan-bahan: alumunium klorida 7 gram, HCl 37% sebanyak 8,5 ml, asam forminat pekat sejumlah 5,0 ml, akuades steril yang digunakan untuk pengenceran hingga volume mencapai 100 ml. c) Dehidrasi yaitu proses mengambil seluruh air yang terkandung dalam jaringan dan membersihkan sisa-sisa fiksatif. Dehidrasi dilakukan dalam alkohol 70%, 80%, 95% dan alkohol absolut masing-masing selama 1,5 jam. d) Penjernihan yaitu aplikasi xylol selama 1-1,5 jam umtuk menghilangkan alkohol dalam jaringan. e) Infiltrasi parafin dan pembuatan blok parafin, dilakukan dengan cara memasukan jaringan kedalam parafin cair dengan suhu 5759 C selama 1,5 jam agar rongga atau pori-pori jaringan terisi parafin sehingga mudah dipotong. Jaringan dimasukan dalam blok cetakan selama 30 menit sampai parafin mengeras, kemudian dilepas dari cetakan dan diberi label. f) Pemotongan jaringan dengan menggunakan mikrotom dengan ketebalan 6. Hasil irisan dimasukan kedalam waterbath berisi air dengan suhu 50, krmudian diambil menggunakan kaca objek dan dibri label. g) Penempelan pada kaca objek, dilakukan dengan meletakan kaca objek irisan diatas drying plate bersuhu 40 selama 20 menit untuk menguapkan kandungan air pada kaca objek sehingga jaringan dapat menempel dengan baik. h) Deparafinisasi dan rehidrasi, dilakukan dengan memasukan sediaan kedalam xylol selama 3 menit, kemudian sediaan dimasukan kedalam alkohol absolut, alkohol 95%, alkohol 80%, alkohol 70% selama 2 menit. Kemudian dicuci dengan air selama

3 menit untuk menghilangkan alkohol. Deparafinisasi dilakuka untuk menghilankan parafin agar jaringan dapat diisi dengan air yang selanjutnya dapat dicat dengan yang larut air. Rehidrasi bertujuan untuk menghilangkan xylol pada sediaan karena tidak bisa bercampur dengan air. i) Pengecatan dilakukan dengan aplikasi cat Mayer-Hematoksilin sebagai initialstain untuk memberikan warna biru pada inti sel. Sediaan dimasukan dalam Mayer-Hematoksilin selama 7 menit kemudian dibasuh dengan air mengalir untuk menghilangkan sisa cat. j) Penjernihan dan penempelan dilakukan dengan memasukan sediaan kedalam xylol selama 5 menit, kemudian siteteskan balsam Canada 1 tetes ditutup dengan kaca penutup serta diberi label. e. Perhitungan Jumlah Osteoblast Parameter yang dipakai untuk mengetahui pengaruh tulang dengan trikalsiun fosfat-kitosan terhadap pembentukan jaringan tulang baru adala se osteoblas. Penghitungan jumlah osteoblas dilakukukan dengan menggunakan mikroskof cahaya dan kamera dengan pembesaan 400x pada 3 lapang pandang dengan diameter tiap lapang pandang 065 kemudian data dijumlah. 7. Analisa Hasil Untuk menilai normalitas dari variabel tergantung dilakukan uji Kolmogorov-smirnov Data hasil pemeriksaan dilakukan uji hipotesis dengan One-Way ANOVA. Batas derajat kemaknaan adalah apabila p< 0,05 dengan 95 % interval kepercayaan. Analisa data dilakukan dengan program komputer SPSS 19.