ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ASAM LAKTAT A. Isolasi Bakteri Asam Laktat 1.

Tujuan Tujuan praktikum ini adalah untuk mendapatkan biakan murni BAL asal bahan hewani (Ikan Gurame) 2. Alat dan Bahan a. Bahan 1. Saluran pencernaan ikan Gurame 2. Media GYP cair dan GYP agar+CaCO3 3. Larutan sikloheksimid 4. Larutan sodium azida 5. Kultur Lactobacillus sp. 6. Larutan garam fisiologis b. Alat 1. Cawan petri steril 2. Jarum inokulum 3. Lampu Bunsen 4. Laminar air flow 5. Pipet mikro dan tip 6. Spatula steril 7. Pisau bedah 8. Tabung dan rak tabung reaksi 3. Cara Kerja 1. Metode Isolasi Ikan Gurame dibedah dan diambil saluran pencernaannya dipindah dalam larutan garfish steril secara aseptis Saluran pencernaan diambil dan dibedah, isinya dibuang kemudian permukaan dalam usus ikan dikerik dengan spatula steril Hasil kerikan lapisan mukosa usus ikan ditingkatkan populasi mikrobianya dengan ditumbuhkan dalam medium GYP selama 24 jam dalam suhu 300C Dilanjutkan dengan menumbuhkan isolat dalam GYP + CaCO3 dengan metode pour-plate Isolat yang positif (Menghasilkan zona bening) ditumbuhkan pada medium GYP+CaCO3 tegak untuk pengujian lanjutan. 9. Mortar

B. Identifikasi Bakteri Asam Laktat BAL diidentifikasi dengan cara konvensional dengan pendekatan pada karakter morfologi, uji biokimia, uji fisiologi, tipe fermentasi dan asam laktat yang dihasilkan. 1. Tujuan Identifikasi Untuk mengetahui secara parsial karakter BAL pada isolat yang meliputi karakter morfologi (Sifat pewarnaan gram, bentuk, ukuran, rangkaian dan motilitas sel), karakter biokimia (katalase, pembentukan dekstran dari sukrosa, pembentukan asam dari berbagai sumber karbon), karakter fisiologis (pengaruh suhu dan pH) serta tipe fermentasi. Untuk menentukan genus dari bakteri yang diisolasi dari saluran pencernaan ikan Gurame a. Karakter Morfologi a.1 Pewarnaan Gram 1. Alat dan Bahan - Jarum ose - Isolat BAL hasil isolasi tahap sebelumnya - Cat gram A (Kristal violet), B (Lugols Iodine), C (Alkohol asam), dan D (Safranin) - Pembakar Bunsen - Kaca benda dan gelas penutup - mikroskop - Tabung seprot air 2. Cara Kerja Pada gelas benda, dibuat apusan tipis isolat BAL kemudian difiksasi selama beberapa saat diatas nyala Bunsen Kemudian ditetesi cat Gram A (Kristal violet) sebanyak 2-3 tetes dan diamkan selama 1 menit selanjutnya dicuci perlahan dengan air mengalir Dilanjutkan dengan cat Gram B (Lugols Iodine) sebanyak 2-3 tetes dan diamkan selama 1 menit dan dilanjutkan penyucian dengan air mengalir Selanjutnya dekolorisasi dengan cat gram B sebanyak 2-3 tetes dan diamkan 30 detik. Setelah 30 detik, dicuci air mengalir secara perlahan Langkah terakhir ditetesi Safranin (cat gram D) 2-3 tetes selama 2 menit dan dilanjutkan penyucian dengan air mengalir

Preparat dikering anginkan dan diamati dengan mikroskop pembesaran kuat. Untuk memperjelas objek yang diamati, gunakan minyak emersi sebelum pengamatan

a.2 Bentuk, ukuran dan cell arrangement BAL a. Alat dan Bahan - Isolat BAL asal saluran pencernaan ikan Gurame pada tahap isolasi sebelumnya - Media GYP cair - Tabung reaksi - Jarum inokulum dan ose - Bunsens burner - Metillen blue - Kaca benda dan objek

b. Cara Kerja - Satu ose isolat BAL ditumbuhkan dalam medium GYP cair, diinkubasi selama 24 jam dalam suhu 30oC - Kultur yang tumbuh diambil satu ose kemudian dibuat apusan tipis pada gelas benda setipis mungkin dan difiksasi diatas nyala Bunsen dengan hati-hati agar apusan tidak terbakar - Tetesi apusan pasca-fiksasi dengan metillene blue secukupnya dan tutup dengan kaca penutup - Setelah beberapa saat, tetesi pinggiran gelas penutup dengan air untuk membilas sisa cat yang tidak diserap sel dengan hati-hati, keringkan dengan tisu - Preparat diamati dengan mikroskop a.3 Uji Motilitas 1. Alat dan bahan - Isolat BAL asal saluran pencernaan gurame - GYP agar lunak (media tegak) - Jarum inokulum - Bunsens burner

2. Cara Kerja - Dilakukan inolulasi tusuk BAL asal saluran pencernaan gurame pada media tegak GYP agar lunak - Diinkubasi selama 1-2 hari dalam suhu 30oC dan diamati pola pertumbuhannya (+: tumbuh menyebar pada bekas tusukan -: Hanya tumbuh dibekas tusukan)

a.3 Uji Biokimiawi 1. Uji pembentukan dekstran dari glukosa a. Alat dan bahan Isolat BAL asal saluran pencernaan gurame Media SYP dalam petri Jarum inokulum Bunsens burner Alkohol 70% dan tisu

b. Cara Kerja Tusukkan satu ose isolat BAL pada medium SYP Inkubasi pada suhu 30oC selama 24 jam

2. Uji Katalase a. Alat dan Bahan Kultur muda BAL saluran pencernaan gurame H2O2 Hidrogen peroksida diteteskan pada kultur muda BAL (+: bergelembung -: tanpa gelembung)

b. Cara kerja -

3. Pembentukan asam dari berbagai jenis sumber karbon a. Alat dan Bahan Isolat BAL saluran pencernaan gurame umur 24 jam Sumber karbon: L-arabinosa, D-Selobiosa, D-fruktosa, D-Galaktosa,

glukosa, glukonat, laktosa, D-maltosa, D-mannitol, D-mannosa, Dmelibiosa, D-melezitosa, rafinosa, L-rhamnosa, D-ribosa, salisin, Dsorbitol, pati, D-trehalosa dan D-xilosa Basal media YP (yeast extract peptone) pH: 6.8

Aquades steril Tabung reaksi Bunsens burner Alcohol 70% dan tissue Mikropipet dan tip 0,1 M NaOH Indikator BTB dan NR dalam ethanol Jarum ose

b. Cara kerja Ditambahkan 25ml YP dan 20mg sumber karbon, kemudian dimasukkan masing-masing 2ml pada tabung reaksi 500l isolat BAL diambil dan diencerkan dalam akuades/larutan garam fisiologis sebanyak 5ml Ditumbuhkan dengan teknik drop pipet dan diinkubasi pada suhu 30oC selama beberapa hari hingga kultur tumbuh Kultur kemudian dititrasi dengan NaOH dan BTB dan NR dalam ethanol sebagai indikator Titrasi dihentikan ketika warna merah dari kultur+indikator berubah hijau (homofermentatif: 2ml NaOh sedang heterofermentatif dapat < 2ml NaOH). Asam yang dihasilkan dihitung dengan rumus:

9,0 ml NaOH titrasi

F 2

4. Test produksi H2S a. Alat dan Bahan Isolat BAL ikan Gurame Medium TSIA tegak Jarum inokulum Bunsens burner, alkohol dan tisu

b. Cara kerja BAL diinokulasikan tusuk ke medium TSIA dan diinkubasi selama 2 hari dalam suhu 300C Perubahan warna medium diamati (Positif: timbul warna kehitaman disekitar koloni)

a.4 Uji Fisiologis 1. Pengaruh Suhu a. Alat dan bahan - Medium GYP cair - Isolat BAL ikan gurame - Jarum inokulum - Bunsens burner - Alkohol dan tisu b. Cara kerja - Satu ose BAL ditumbuhkan dalam 5 tabung GYP cair - Diinkubasi pada suhu 15, 25, 30, 45, 50 dan 300C selama 1-5 hari tergantung kecepatan tumbuh BAL - Pertumbuhan diamati dengan menggunakan Spektofotometer (700nm) dengan mengamati sebuah kertas bergaris melalui tabung kultur atau

2. Pengaruh pH a. Alat dan bahan - Media GYP dengan variasi pH (3,5-9,5) - Isolat BAL Gurame - Jarum inokulum, Bunsen, alkohol dan tissue

b. Cara kerja - Isolat ditumbuhkan dalam GYP dengan variasi pH kemudian di inkubasi selama 13 hari dengan suhu 300C - Pertumbuhan diamati dan dibandingkan

DAFTAR PUSTAKA

Bucio A, Hartemink R, Schrama JW, Rombouts FM. Screening of lactobacilli From fish intestines to select a probiotic for warm freshwater fish. Biosci Microflora 2004;23(1):21e30.

Nursyirwani1, W. Asmara, A.E.T.H. Wahyuni, dan Triyanto. 2011. Solasi Bakteri Asam Laktat Dari Usus Ikan Kerapu Macan (Epinephelus Fuscoguttatus) Dan Potensinya Sebagai Antivibrio. ISSN 0853-7291