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RELATRIO DE FUNDAMENTOS DE TOXICOLOGIA

DETERMINAO DE CIDO HIPRICO EM URINA POR HPLC

Discentes:

Glaucia de Souza Silva Letcia Ramos de Menezes Mariana Cristina de Freitas Porto

Curso: Cincias Biolgicas (bacharelado)

Perodo: 4

Docente: Eduardo Costa

Alfenas Maro de 2013

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INTRODUO: O cido hiprico considerado um marcador de exposio ocupacional para o tolueno e o principal metablito urinrio do tolueno. A determinao urinria utilizada para monitorizao biolgica de trabalhadores expostos ocupacionalmente ao solvente. Os produtos metablicos do tolueno so o cresol (menos de 1%) e o metablito intermedirio benzaldedo. O benzaldedo metabolizado a cido benzico o qual se conjuga com a glicina e forma o cido hiprico. Cerca de 75% do tolueno inalado metabolizado a cido hiprico e excretado na urina 12 horas aps a exposio.

OBJETIVO: Determinar a quantidade de cido hiprico (AH) na urina para monitorizao de indivduos que possivelmente est exposto ocupacionalmente ao tolueno. Monitorizao onde a coleta da amostra por meio no invasivo, utiliza-se a urina, e para quantificao usa-se a tcnica de cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE ou, mais comumente, HPLC) que se trata de uma tcnica muito sensvel e, portanto de alta preciso.

MATERIAIS: Amostra - tratamento 1 ml de urina + 1 ml de etanol em tubo de centrfuga Homogeneizar Centrifugar 2000 RPM por 15 min Injetar 20L do sobrenadante no HPLC

MTODO: Condies do HPLC Fase mvel: gua/metano/cido actico (para 1L: 792/200/8)

Calibrao - Fazer 3 calibradores e branco da urina(em balo volumtrico) C1 = 0,1 mg/ml (adicionar 100L do padro 2 a 5ml de urina) - homogeneizar no sonicador, 10 min

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C2 = 0,5 mg/ml (adicionar 50L do padro 1 a 5ml de urina) - homegeneizar no sonicador,10 min C3 = 1,0 mg/ml (adicionar 100L do padro 1 a 5ml de urina) - homegeneizar no sonicador, 10 min Padro de cido Hiprico (AH) Sol. 1(50mg/ml) : Dissolver 0,2525g de H (Sigma, 99%) em 5 ml de metanol. Sonicar 10 min e deixar a 4C Sol2.(5mg/ml) : Diluir 1:10ml (balo de 10 ml) da sol.1

Tcnica de Cromatografia Lquida de Alta Presso A cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao. Ela est fundamentada na migrao diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interaes, entre duas fases imiscveis, a fase mvel e a fase estacionria. A grande variedade de combinaes entre fases mveis e estacionrias a torna uma tcnica extremamente verstil e de grande aplicao. A cromatografia pode ser utilizada para a identificao de compostos, por comparao com padres previamente existentes, para a purificao de compostos, separando-se as substncias indesejveis e para a separao dos componentes de uma mistura. O grande avano na cromatografia em coluna foi o desenvolvimento e a utilizao de suportes com Partculas diminutas responsveis pela alta eficincia, as quais tornam necessrio o uso de bombas de alta presso para a eluio da fase mvel, devido a sua baixa permeabilidade. A Figura 1 mostra um equipamento tpico de CLAE. As fases mveis utilizadas em CLAE devem possuir alto grau de pureza e estar livres de oxignio ou outros gases dissolvidos, sendo filtradas e desgaseificadas antes do uso.

Figura

Esquema

do

equipamento de CLAE (HPLC)

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A bomba deve proporcionar ao sistema vazo contnua sem pulsos com alta reprodutibilidade, possibilitando a eluio da fase mvel a um fluxo adequado. As vlvulas de injeo usadas possuem uma ala de amostragem para a introduo da amostra com uma seringa e duas posies, uma para o preenchimento da ala e outra para sua liberao para a coluna. Existem alas de diversos volumes, sendo utilizadas geralmente alas na faixa de 5-50 L para injees analticas e 0,5-2 mL para preparativas. As colunas utilizadas em CLAE so geralmente de ao inoxidvel, com dimetro interno de cerca de0, 45 cm para separaes analticas e na faixa de 2,2 cm para preparativas. O comprimento varivel, sendo comuns colunas analticas de 10-25 cm e preparativas em torno de 25-30 cm. Essas colunas so reaproveitveis, sendo empacotadas com suportes de alta resoluo, no sendo necessria sua regenerao aps cada separao. O detector mais utilizado para separaes por CLAE o detector de ultravioleta, sendo tambm empregados detectores de fluorescncia, de ndice de refrao, e eletroqumicos, entre outros. Detectores de polarimetria para CLAE, recentemente desenvolvidos, diferenciam compostos quirais, atravs da rotao de seus estereoismeros frente luz plano-polarizada.

Fluxograma dos Mtodos

Fundamento qumico: O cido hiprico considerado um marcador de exposio ocupacional para o tolueno estando a sua concentrao relacionada exposio ocupacional, durante a jornada de trabalho do dia. O tolueno um composto aromtico tambm chamado de metilbenzeno por sua estrutura qumica. um lquido incolor, voltil quando em presso de vapor a 25C, com propriedade significativa de lipossolubilidade e que apresenta traos de benzeno de at25%, quando utilizado para fins comerciais. A absoro ocorre principalmente pela via pulmonar, sendo que cerca de 40% do tolueno inalado absorvido pelos pulmes. A absoro ocorre principalmente pela via pulmonar, sendo que cerca de 40% do tolueno inalado absorvido pelos pulmes. A principal via de biotransformao a oxidao do grupamento metila. O primeiro passo corresponde formao do lcool benzlico, mediado pelo citocromo P450.Segue-se a oxidao a benzaldedo, pela ao de lcool desidrogenase e finalmente a formao do cido benzico, etapa catalisada

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pela enzima aldedo desidrogenase . Este cido se conjuga principalmente com a glicina, formando o cido hiprico e em menor proporo com o cido glicurnico, produzindo benzoilglicuronatos. O Etanol utilizado no tratamento da amostra tem funo de precipitar cristais de urina.

RESULTADOS: VR=1,5 g/g de creatinina IBMP = 2,5 g/g de creatinina Para as amostras, adotar: Urina 24 horas Amostras 1200 ml de urina Excreo de creatinina =1,5 g de creatinina/ dia

Y= 3.224.147 x + 188.950 (Grfico)

0 0,1 726.596,50 0,5 1.413.607 1 3.585.282,50

4,000,000.00 y = 3,224,147x + 188,950 3,500,000.00 3,000,000.00 2,500,000.00 2,000,000.00 1,500,000.00 1,000,000.00 500,000.00 0.00 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Series1 Linear (Series1)

Mdia das amostras:

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A1 = 3.092.192,75 A2 = 4.558.451,00 Substituindo em A1: 3.092.192,75 = 3.224.147 x + 188.950 3.092.192,75 188.950 = 3.224.147 x 2.903.242,75 = 3.224.147 x 3.224.147 x = 2.903.242,75 X= x= 0,900468 Substituindo em A2: 4.558.451,00 = 3.224.147 x +188.950 4.558.451,00 -188.950 = 3.224.147x 4.369.501 = 3.224.147 x X= X=1,3552 Amostra 1: 0,900468 mg -----1 ml x--------------------1200 ml x=1080 mg de cido hiprico Amostra 2: 1,3552 mg ---------1 ml x---------------------1200 ml x= 1626 mg de cido hiprico Para amostra 1:

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1080 1,5 = 720 mg de cido hiprico /g de creatinina ou 0,720 g de cido hiprico/g de creatinina Para amostra 2: 1626 1,5 = 1084 mg de cido hiprico/g de creatinina ou 1,084 g de cido hiprico/g de creatinina

INTERPRETAO: VR=1,5 g/g de creatinina IBMP = 2,5 g/g de creatinina Pode-se interpretar que a quantidade de cido hiprico/creatinina na urina tanto na amostra 1, que equivale a 0,720 g de cido hiprico/g de creatinina, assim como na amostra 2 que equivale a 1,084 g de cido hiprico/g de creatinina, esto abaixo do Valor de Referncia e abaixo do IBMP estabelecidos. Portanto, o valor est dentro do esperado. A creatinina uma substncia incua no sangue, sendo produzida e eliminada de forma constante pelo organismo. Se o paciente mantm sua massa muscular mais ou menos estvel, mas apresenta um aumento dos nveis de creatinina sangunea, isso um forte sinal de que o seu processo de eliminao do corpo est comprometido, ou seja, os rins esto com algum problema para excret-la. Se os rins no esto conseguindo eliminar a creatinina produzida diariamente pelos msculos, eles provavelmente tambm estaro tendo problemas para eliminar diversas outras substncias do nosso metabolismo, incluindo toxinas. Portanto, um aumento da concentrao de creatinina no sangue um sinal de um possvel problema. No caso dos resultados obtidos, no obteve-se um aumento da concentrao de creatinina no sangue, ento no se prev um possvel problema.

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CONCLUSO: Conclui-se que pelo mtodo de HPLC, que a quantidade de cido hiprico na urina est abaixo do estabelecido, portanto dentro do padro (VR=1,5g/g de creatinina e IBMP= 2,5g/g de creatinina). Atravs do grfico, pode-se concluir que ele crescente, porque quanto maior a concentrao do calibrador, maior o sinal. Este aumento linear, porque respeita a equao de uma reta.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS: OGA, S Fundamentos de toxicologia. 3 edio. So Paulo: ateneu Editora, 2008

LORENZETTI, G. G.; LETTIERI, M. T. Avaliao de cido hiprico como biomarcador de exposio ocupacional em trabalhadores de postos de combustveis. Revista Sade e Pesquisa, v. 2, n.3, p. 319-324, 2009.

SILVA, Z. L.; NICCIO, J. S.; JACINTO, M.; AMORIN, L. C. A.; ALVAREZLEITE, E. M. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. Vol. 38, n. 2, 2002.

SIQUEIRA, M. E. P. B.; PAIVA, M. J. N. Hippuric acid in urine: reference values. Revista Sade Pblica, 36 (6), p. 723-727, 2002.