UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

AISLAMIENTO, SELECCIN Y CONSERVACIN DE BACTERIAS PRODUCTORAS DE CIDO ACTICO A PARTIR DE BEBIDAS FERMENTADAS DE PLTANO Y MORA SILVESTRE.

Microbiologa Industrial
y y y y y

Avila Mireya Carrillo Isabel Corella Karla Montalvo Gabriela Reinoso Valeria

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INDICE 1. 2. 3. 4. 5. 6. TEMA3 PROBLEMTICA.........3 ANTECEDENTES...3 JUSTIFICACIN.4 HIPTESIS...5 OBJETIVOS.5 5.1 Objetivo general. 5.2 Objeticos especficos 7. MARCO TERICO.6 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 8. 8.1 8.2 8.3 9. Vinagre. Mora silvestre y pltano. Propiedades nutritivas, mora silvestre. Propiedades nutritivas, pltano. Composicin nutricional banano mora silvestre Compatibilidad del banano con la mora silvestre Bacterias acticas Requerimientos de las bacterias Formulacin del vinagre. Caracterizacin del vinagre. Determinaciones

MARCO METODOLGICO.9

AISLAMIENTO, SELECCIN Y CONSERVACIN DE LAS BACTERIAS ACTICAS..12 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 Muestreo Proceso del experimento Nutrientes necesarios para la fermentacin actica Aislamiento del microorganismo. Medio estndar Medios de enriquecimiento Medios especficos

10.

SELECCIN ...15 11.1 11.2 11.3 Anlisis de la morfologa micro y macroscpica Pruebas bioqumicas. Crecimiento en etanol.

11. IDENTIFICACIN DE LAS BACTERIAS.16

12.

CONSERVACIN DE BACTERIAS ACTICAS.17

13. FACTIBILIDAD.19 14. BIBLIOGRAFA20 15. ANEXOS22

1. TEMA AISLAMIENTO, SELECCIN Y CONSERVACIN DE BACTERIAS PRODUCTORAS DE CIDO ACTICO A PARTIR DE BEBIDAS FERMENTADAS DE PLTANO Y MORA SILVESTRE. 2. PROBLEMTICA.
La gran sobreproduccin de cultivos de mora silvestre y pltano (de rechazo) constituyen una prdida econmica para los agroproductores y por ende para el pas. En el Ecuador (Salinas de Guaranda), la mora silvestre solo se destina a la elaboracin de mermelada, sin embargo existe una sobre oferta por parte de los productores aledaos a la zona, por lo tanto, la mora silvestre no procesada es congelada por largos perodos de tiempo, lo cual conlleva a la prdida de las caractersticas organolpticas y fisicoqumicas, sobre todo con prdida de agua y con la alteracin en la cloracin de la mora silvestre. En el caso del banano es bien conocido que el pas es un gran exportador de este fruto, pero las exportaciones realizadas exigen una calidad determinada lo cual genera grandes cantidades de rechazo, que deben ser aprovechadas en beneficio de los productores. Lamentablemente la produccin de vinagre se ha visto afectada en algunos casos por el uso indiscriminado de cido actico sinttico derivado del petrleo. Es muy comn encontrar todava en varios pases la venta de cido actico sinttico, por ser mucho ms barato de producir. Sin embargo, el mismo contiene residuos que se consideran dainos a la salud a largo plazo.

3. ANTECEDENTES.
En el Ecuador existe la industria Bialcom que elabora vinagres afrutados. Segn Carolina Vargas, coordinadora sectorial de la Corporacin de Promocin de Exportaciones e Inversiones (CORPEI), en mayo del 2008, los productos de Bialcom se catalogaron como gourmet por CORPEI porque son de alta calidad, nicos en el mercado y aplican responsabilidad social y ambiental. En el 2009 esta iniciativa factur USD 180 000 y export a Brasil, Uruguay y Argentina. Existen numerosas investigaciones acerca de la fermentacin de frutas sobretodo tropicales entre la cuales se puede mencionar: Fermentacin slida del banano de rechazo Asperguillus niger para alimento animal (Universidad Tcnica de Ambato)

4 Obtencin de Condiciones de Elaboracin de Vinagre de Arndanos (Vaccinium corymbosum) utilizando Torta de Prensa (Universidad Austral de Chile) Elaboracin de vinagre a base de manzana para la eliminacin de manchas en la piel (Repblica Bolivariana de Venezuela, Ministerio del poder popular para la educacin) Proyecto de inversin sobre la elaboracin y comercializacin del vinagre de guineo en la ciudad de Guayaquil (Universidad ESPOL) Contribucin a la mejora del proceso de acetificacin para la produccin industrial de vinagre de vino (Universidad de Castilla) Las principales especies del gnero Acetobacter productoras de cido actico son Acetobacter aceti, xylinum y ascendens (LLAGUNO y POLO, 1991). (2) Segn diversos autores las bacterias acticas se clasifican en dos gneros: Acetobacter y Gluconobacter (De Ley, 1984 citado por LU, 1999; DEPPENMEIER, 2002 y Du TOIT y LAMBRECHETS, 2002). El tipo de bacteria utilizada en la industria del vinagre mayoritariamente es Acetobacter, sin embargo el gnero Gluconobacter, perteneciente al grupo de las bacterias acticas es usado en aplicaciones industriales como fermentacin de cido glucnico, sorbosa y dihydroxiacetona. Entre las especies de Acetobacter, se encuentran A. aceti, pasteurians, polyoxogenes y europaneus, que son los tipos ms populares usados en las industrias elaboradoras de vinagres.

4. JUSTIFICACIN.
Analizando la problemtica anteriormente expuesta el presente trabajo es importante para enfocar el proceso de fermentacin actica para la produccin de vinagre, utilizando la mora silvestre y el pltano que no es comercializado en su totalidad. La elaboracin de productos fermentados y especficamente la produccin de vinagre ha sido constatada y llevada a cabo como una manera de otorgar valor adicional, y proponer un uso efectivo de frutos que no han llegado a ser comercializados en su totalidad. La fermentacin es un proceso que emplea poca mano de obra, requiere una infraestructura mnima y poca energa. Adems de sus virtudes nutritivas, de inocuidad y conservacin, es un proceso que puede ser aprovechado por los productores de mora y/o pltano para aadir un valor a estos productos agropecuarios, que no se logran comercializar por diferentes motivos (por sobre produccin en caso de la mora o por no reunir caractersticas de exportacin en el caso del pltano), lo cual repercutira en beneficio de los productores.

5 En el pas tan solo existe una industria que produce vinagre biotecnolgicamente (Bialcom) y en Manab se da la produccin de vinagre de pltano de manera artesanal, donde dicho producto es muy comercial y tradicional para el consumo de sus habitantes. El vinagre en el pas es utilizado en las comidas para darle un sabor diferente, en encurtidos y en el aj como un buen persevante, por lo cual se puede decir que es un producto de amplio mercado en el Ecuador, y que no es producido en cantidades suficientes y a un costo bajo por causa de la poca produccin que aqu existe.

5. HIPTESIS
HIPTESIS NULA Las bacterias con capacidad para la obtencin de acido actico obtenidas a partir de bebidas fermentadas de Mora silvestre y pltano se podrn aislar de manera efectiva en el medio diseado utilizando como fuente de carbno etanol y de nitrgeno amonio. HIPTESIS ALTERNA Las bacterias con capacidad para la obtencin de acido actico obtenidas a partir de bebidas fermentadas de Mora silvestre y pltano no se podrn aislar de manera efectiva en el medio diseado utilizando como fuente de carbno etanol y de nitrgeno amonio

6. OBJETIVOS.
6.1 .OBJETIVO GENERAL.
y Aislar, seleccionar y conservar bacterias acticas con las mejores caractersticas para la elaboracin de vinagre de mora silvestre y pltano, a partir de vinagre elaborados mediante una fermentacin natural.

6.2. OBJETIVOS ESPECFICOS.

y Definir la composicin fisicoqumica de la mora silvestre y del pltano, para establecer el proceso de fermentacin adecuado en este tipo de frutas. Realizar diferentes formulaciones de vinagres para obtener bacterias acticas mediante una fermentacin natural. De las formulaciones realizadas establecer mediante sus caracterizaciones fisicoqumicas y organolpticas, los vinagres ms aptos para el aislamiento de las bacterias acticas. Establecer tcnicas de aislamiento adecuadas de tal manera que no se realice ms de un repique, para evitar mutaciones posteriores. Disear el medio de cultivo adecuado para el aislamiento y seleccin de las bacterias para la elaboracin del vinagre, a partir de la fermentacin natural. Establecer las condiciones de conservacin de las cepas aisladas y seleccionadas de tal manera que se lleve a cabo conservando sus caractersticas genticas.

y y

7. MARCO TERICO.
7.1. VINAGRE(4)
El vinagre es el vino transformado en un producto agrio por el desarrollo de bacterias acticas, la norma de Codex alimentarius define al vinagre como: Lquido apto para el consumo humano, producido exclusivamente con producto idneos que contienen almidn o azcares por el procedimiento de doble fermentacin, alcohlica y actica. Las bacterias acticas en contacto con el aire y en una superficie alcohlica forma un velo ms o menos denso denominado como madre del vinagre. Las bacterias acticas oxidan el alcohol a cido actico segn la siguiente reaccin:

La norma del CODEX alimentarius establece los siguientes requisitos para un vinagre: NORMA DEL CODEX (Codex stan 162-1987) (1) Contenido total de cido (calculado como cido 60 actico) g/L Contenido de alcohol residual %v/v 0,5% Slidos Solubles g/L 1,3 por 1% de cido actico

7.2. MORA SILVESTRE Y PLTANO. 7.2.1. Propiedades nutritivas, mora silvestre. (11)
Aporta grandes cantidades de fibra favoreciendo notablemente el trnsito intestinal. Con su ingestin estaremos integrando a nuestro cuerpo vitamina C, cido elgico, cido ctrico, folatos, flavonoides y distintos minerales. Es recomendado por mdicos y especialistas para distintas personas con problemas intestinales debido a sus acciones purificantes en el intestino. Por su contenido de cido flico la mora se encuentra en dietas para mujeres embarazadas. Magnesio, calcio y potasio son algunos de los minerales que aporta al organismo, stos son tiles en la formacin de huesos, dientes o colgeno, as como tambin impulsores del sistema nervioso ayudando a la transmisin y a la generacin del impulso nervioso. En casos de anemia, la frambuesa es una fruta indicada por sus grandes aportes de anticuerpos ayudando a la formacin tanto de glbulos rojos como blancos.

7.2.2. Propiedades Nutritivas, pltano.

Destaca su contenido de hidratos de carbono, por lo que su valor calrico es elevado. Los nutrientes ms representativos del pltano son el potasio, el magnesio, el cido flico y sustancias de accin astringente; sin despreciar su elevado aporte de fibra, del tipo fruto oligosacridos. Estas ltimas lo convierten en una fruta apropiada para quienes sufren de procesos diarreicos. El potasio es un mineral necesario para la transmisin y generacin del impulso nervioso y para la actividad muscular normal, interviene en el equilibrio de agua dentro y fuera de la clula. El magnesio se relaciona con el funcionamiento de intestino, nervios y msculos, forma parte de huesos y dientes, mejora la inmunidad y posee un suave efecto laxante. El cido flico interviene en la produccin de glbulos rojos y blancos, en la sntesis material gentico y la formacin anticuerpos del sistema inmunolgico. Contribuye a tratar o prevenir anemias y de espina bfida en el embarazo. (8)

8 Composicin Nutricional Porcin comestible Agua (ml) Energa (Kcal) Carbohidratos (g) Protenas (g) Lpidos (g) Colesterol (mg) Sodio (mg) Potasio (mg) Calcio (mg) Fsforo (mg) Hierro (mg) Retinol (mg) cido ascrbico (C) (mg) Riboflavina (B2) (mg) Tiamina (B1) (mg) cido flico (microgr) Fibra vegetal (g) c. Grasos Poliinsaturados (g) c. Grasos Monoinsaturados (g) cidos Grasos Saturados (g) BANANO 65 75,1 83 20 1,2 0,3 0 15 321 9 22 0,6 33 10 7 6 22 3,4 0,09 0,04 0,11 MORA SILVESTRE 0,91 89,6 34 7 0,7 0,5 0 2,5 180 25 31 0,8 5 60 0,04 0,02 20 0,82 0 0 0

7.2.3. COMPATIBILIDAD DEL BANANO CON LA MORA SILVESTRE

El banano combina bien con las frutas dulces, los jugos de frutas, las frutas desecadas, la leche, la nata, el yogur y el requesn. La mora es catalogada fruta cida pero el alto contenido de carbohidratos (azcares) de la mora de silvestre, la hace mucho ms dulce que la mora de castilla, lo que hace factible su mezcla con el banano. La combinacin de banano y mora silvestre no produce niveles altos de colesterol, el sabor producto de esta combinacin es muy agradable, da una coloracin fuerte debido a la presencia de la mora silvestre. No se ha realizado experimentacin sobre la toxicidad de esta mezcla ya que no se ha registrado casos que impliquen una reaccin anmala sobre el organismo al consumirla. (5)

7.3 BACTERIAS ACTICAS.

Son bacterias aerobias estrictas en forma de bastones gran negativas, hay especies inmviles con flagelos polares o pertricos.

9 Los principales gneros de son Acetobacter y gluconobacter. Se ha propuesto una clasificacin segn: catalasa, oxidacin del cido actico a CO2 y agua, oxidacin del lactato, oxidacin del glicerol, produccin de cido glucnico apartir de glucosa. Las necesidades nutricionales de ste grupo de bacterias depende de la fuente de carbono. La mayora de cepas son auxotrofas para algunas vitaminas y pueden utilizar el amonaco como fuente de nitrgeno. (2) (4)

7.3.1. Requerimientos de las bacterias

El pltano contiene tres azucares naturales, la sacarosa, fructosa y glucosa. Las bacterias acticas son organismos quimiheterotrofos que degradan estos sustratos produciendo etanol y oxidndolo a acido actico. Las bacterias acticas son aerobias necesitan de oxigeno a una temperatura de 27 a 28 grados a un pH mximo de entre 5 a 6 y un mnimo 3 a 3.5. Son auxotrofos para las vitaminas como cido paraminobenzoico, niacina,tiamina y acido pantotenico, necesitan nitrgeno y azufre cuya mejor fuente son los aminocidos como la valina, isoleucina, alaninina, cicteina, histidana, y prolina , requieren adems fosforo para formar sus paredes celulares resistente a los cidos. Figura N0 2 Caractersticas de las bacterias acticas
CARACTERISTICAS Flagelacion Crecimiento a pH 4.5 Etanol a acido acetico a pH 4.5 Aminoacidos por celulas en reposo Ciclo de Krebs Produccion de 5 cetogluconato Cetogenesis Lactosa y almidon Gelatina pigmentos verdosos y fluorecentes Acido Acetico a CO2 Lactato a CO2 Glucosa a Gluconato + + -D + + + D D + + D GLUCONOBACTER polar + +M ACETOBACTER Peritrica + +F

8. MARCO METODOLGICO.

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8.1. FORMULACIN DEL VINAGRE.

Segn la norma del CODEX ALIMENTARIUS (Codex stan 162-1987), la materia prima para la elaboracin del vinagre es: vino de uvas, frutas o bayas, que deben cumplir con una cantidad mxima de azcares reductores y de alcohol en cada uno de los vinos obtenidos, as como tambin segn la misma norma el vinagre obtenido debe cumplir con los siguientes requisitos:

Basndose en estos datos, el vinagre a partir del cual se aislaran las cepas de bacterias debe tener una formulacin que cumpla con los requisitos de la norma. El producto se obtuvo de la mezcla del vinagre de banano, con el vinagre de mora silvestre, en cumplimiento con la norma y de a cuerdo a pruebas sensoriales a las cuales se sometern las diferentes formulaciones. Se realizaron las siguientes formulaciones para el vinagre:

Para la eleccin de la formulacin a utilizarse en el aislamiento de bacterias acticas, se efectuaron pruebas sensoriales. Las pruebas se realizaron con 15 jueces semientrenados, los cuales evaluaron las siguientes caractersticas: y y y y y Aroma Color Sabor cido Grado de aceptacin Preferencia

11 Con el tratamiento de los datos obtenidos, se estableci que la formulacin 2 tiene mayor grado de aceptacin entre los consumidores, por lo que el proyecto se desarrolla a partir de esta formulacin. Segn las caracterizaciones fisicoqumicas realizadas en las tres formulaciones, la formulacin 2 presenta las caractersticas de un vinagre en conformidad con la norma del Codex.

8.2. CARACTERIZACIN DEL VINAGRE.

La formulacin nmero 2 al tener mayor grado de aceptacin entre algunos de los consumidores, fue tomado como muestra para realizar las respetivas caracterizaciones, y verificar si la formulacin realizada cumple con los requisitos que establece la norma. Se determin:

8.3. DETERMINACIONES: 8.3.1. DETERMINACIN DE pH.

El pH se determin usando un potencimetro, poner un volumen adecuado en un vaso precipitado y midiendo el pH con un potencimetro previamente calibrado.

8.3.2. DETERMINACIN DE ACIDZ (CALCULADO COMO CIDO ACTICO)

Acidez (Ac. Actico)= V x (N x peq Ac. Actico) Acidez (Ac. Actico)= 136,9 ml x 0,366 Acidez (Ac. Actico)= 50, 1 g/L

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8.3.3. DETERMINACIN DE SLIDOS SOLUBLES.

Los slidos solubles en la formulacin de vinagre realizado, fueron determinados usando un brixmetro obtenindose una medida directa.

9. AISLAMIENTO, SELECCIN Y CONSERVACIN DE LAS BACTERIAS ACTICAS.

9.1. MUESTREO
El muestreo es no probabilstico intencionado; es decir que las muestras fueron tomadas de la mezcla de vinagres de mora y banano. Los criterios para obtener la muestra fueron: y Los vinagres seleccionados deban presentar caractersticas similares. y Lugares: Las muestras se tomaron de tres fermentadores caseros elaborados por nosotros Tabla No 1 Determinacin de puntos de Muestreo y Parmetros a analizar Muestra % Acidez Muestras N0 de Muestras Parmetros a analizar t1 0 Vino madre (Nata) 1 Poblacin pH acidez etanol glucosa/fructosa SO2 t2 1 Vinagre Mezcla 1 Poblacin pH acidez etanol glucosa/fructosa

Adicionalmente se recogern muestras para el anlisis qumico y sensorial de la mezcla de vinagres.

9.2. PROCESO DEL EXPERIMENTO

a) Caractersticas de la materia prima: y Vino sano, sin olores ni sabores. y No existi antifermentos (antibiticos...). y Vino "Seco" : sin azcares que puedan desviar la fermentacin. y Mejor con Alcohlico bajo (9), como mximo 10-13. b) Temperatura y aireacin: y Rango de temperatura: 28-33C. Temperatura ptima 30 -31C.

13 y Al T se pierden alcohol y sustancias voltiles. y Precisa aire (puro o estril) +/- O2 al ser bact.aerbias. c) Sistema de fermentacin: y Cuba de Vidrio cubierta y Lmpara y Termmetro y Agitador magntico concentracin de Oxigeno apropiada 2 mg/l d) Control: y Temperatura. y Acidez e) Duracin: y 14- 21 das Cuadro N 1 Caractersticas del Vinagre de Frutas

Cuadro No 2 Nutrientes necesarios para la fermentacin Actica

9.3. METODO DE AISLAMIENTO DEL MICROORGANISMO.

Se comienza con el procedimiento a partir de una serie de vinagres mezcla y del vino madre (nata).

14 Se sembr 100 L de cada uno de los diferentes muestras en superficie sobre placas con medio de cultivo selectivo, denominado medio GYC cuya composicin se presenta en el CUADRO 3 y se incub en estufa 35 C por 48 horas. Al finalizar la incubacin, las cepas se someten a pruebas bioqumicas para la identificacin de las bacterias acticas.

CUADRO 3. Medio estndar de crecimiento de bacterias acticas. GYC

9.4. Medios de enriquecimiento para bacterias acticas (9) (10)

Sometimos a las muestras a medios de enriquecimiento para asegurar la seleccin de las bacterias acticas

9.4.1 Medio de Hoyer

Componentes 1.0 g (NH4)2SO4 0.9 g KH2PO4 0.25 g MgSO4*7H2O 0.1 g K2HPO4 0.02 g FeCl3*6H2O Cantidad, g 0,9 0,8 0,23 0,1 0,1

200.0 mL de una solucin de etanol. Aada 56 ml de etanol al agua destilada y lleve el volumen a 200.0 mL. Homogenice. Esterilice. Se aade todos los componentes, excepto la solucin de etanol, al agua destilada y consiga un volumen de 800.0 mL. Homogenice. Agregar volmenes de 4 mL en los tubos de ensayo. Colocarlos en el autoclave por 15 minutos a una 15 presin de psi. Dejar enfriar a 25 C. Agrgar aspticamente 1.0 mL de la solucin de etanol a cada tubo. Inocule las muestras en dos tubos del medio de Hoyer Incube a 30 C durante 48 horas, en sheiker orbital a 200 rpm. Observar los tubos de Hoyer. Si algo creci en ellos, estre para el aislamiento sobre el medio YGC. Incube a 30 C durante 48 horas.

15 Observe las morfologas de la colonia. Si hay tipos distintos de colonias sobre los platos, tome de cada colonia y estre para el aislamiento sobre los platos de YGC. Incube a 30 C durante 48 horas. Si hay un slo tipo de morfologa en las colonia, seguir a las pruebas.

9.5. MEDIOS ESPECFICOS PARA ACETOBACTER ACETI (15) (14)

9.5.1. Medio Manitol
Componentes D-Manitol Extracto levadura Peptona Agar Agua 1 Litro Cantidad, g 25 5 3 15

Para asegurar la mezcla y el aporte de oxgeno, el medio debe mantenerse agitado durante 48 horas una vez inoculada la bacteria. Acetobacter puede distinguirse en laboratorio por el crecimiento de colonias en un medio conteniendo 7 % etanol y suficiente carbonato de calcio para hacer al medio parcialmente opaco. Cuando las colonias de Acetobacter forman suficiente actico del etanol, el carbonato clcico (CO3Ca) alrededor de las colonias se disuelve, formando una zona clara muy apreciable.

10. SELECCIN DE LAS BACTERIAS ACETICAS

10.1 Parmetros de seleccin:
Parmetros de seleccin pH: 4.5 Temperatura: 26 +- 1 C. Se utilizar un pH de 5 y una temperatura de 30C, para las bacterias acticas de nuestro inters

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10.2. Mtodo de Seleccin

Para la seleccin de las cepas con mayor poder de oxidacin elaboraremos medios con las siguientes concentraciones de Etanol 0.2, 0.4, 0.6 y 0.8% respectivamente. Por lo tanto la seleccin se efectuar en el medio de cultivo con estas concentraciones. Los microorganismos seleccionados sern puestos nuevamente en un medio minimal lquido y slido, con la diferencia de que esta vez el medio base contendr como fuente de carbono Etanol que van a ser oxidado. Despus de sembrar los microorganismos seleccionados estos debern permanecer por lo menos cuatro o cinco das a temperatura ambiente para su crecimiento.

11. IDENTIFICACIN DE LAS BACTERIAS

11.1. Anlisis de la morfologa microscpica
A cada una de las cepas aisladas se les realizar tincin Gram para observarlas al microscopio. Y se observar como crecen en el medio de cultivo.

11.2. Pruebas bioqumicas.

Entre las pruebas bioqumicas ms comunes, se encuentran: Catalasa. En portaobjeto, se extiende una porcin de la cepa con aza previamente esterilizada y se agrega H202 oxigenada. Oxidasa. En papel filtro, se deposita una porcin de la cepa con rastrillo y sobre sta se agrega reactivo oxidasa. Tincin de Gram. Para esta tincin, se utiliza portaobjeto, donde se extiende una pequea porcin de la cepa. Luego se tie con: violeta genciana o cristal violeta, lugol (yodo-yodurada), alcohol acetona y finalmente fucsina. Indol. La bacteria se cultiva durante 48 h, en un caldo triptona con NaCl 0,5% y se utiliza reactivo de Kovacs para observar si se cumple o no la prueba.

11.3. Crecimiento en etanol.

Para verificar el crecimiento sobre etanol de las bacterias acticas, afirma que el cido actico formado disuelve el carbonato y se forma una zona clara, de hasta 12 mm desde el borde de la colonia hacia afuera. Este proceso tiene por nombre irisacin. En la FIGURA 1 se observa la reaccin de las bacterias acticas aisladas. Figura No 1 Irisacin de bacterias acticas

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12. CONSERVACIN DE BACTERIAS ACTICAS. (3)

Los tres objetivos que hay que alcanzar para conservar correctamente las cepas microbianas en los laboratorios de microbiologa son: que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de conservacin; que durante el tiempo de conservacin sobrevivan al menos el 70-80% de las clulas, y por ltimo, que estas clulas permanezcan genticamente estables.

12.1 CONSERVACIN POR CONGELACIN.

Se congelan las clulas en suspensin en un lquido con un agente crioprotector y se guardan a temperaturas inferiores a cero grados centgrados, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no disponer las clulas de agua en forma lquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las clulas as conservadas, se recuperan subiendo la temperatura. Este es el mejor mtodo de conservacin desde todos los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales, y adems existe el peligro de que algn fallo del sistema produzca una subida no deseada de la temperatura durante el almacenamiento. Los cuatro factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de las clulas conservadas por este mtodo son los siguientes: A.- Edad de las clulas: En la mayora de los casos conviene utilizar clulas maduras del inicio de la fase estacionaria de la curva de crecimiento, pero cuando se trate de organismos que presenten en su ciclo vital algn estado que les prepare para la resistencia a condiciones adversas, es preferible alcanzar este estado. Esto sucede en el caso de microorganismos que esporulan, en algunos pleomrficos e incluso en algunos ms sencillos. B.- Velocidad en la congelacin y descongelacin: Aunque hay programas de congelacin bien estandarizados para determinados casos o circunstancias, en general es mejor que las variaciones de la temperatura sean rpidas, tanto para la

18 congelacin como para la descongelacin, por lo que para descongelar conviene poner las clulas a 37C. C.- Temperatura de almacenamiento: Debe ser lo ms baja posible. Lo mejor es guardar tubos cerrados o sellados, que contengan las clulas microbianas, sumergidos en nitrgeno lquido, que tiene una temperatura de 195C, o bien en la fase gaseosa del nitrgeno lquido, con una temperatura de 140C.

El dao que se puede producir en las clulas es debido a que a estas temperaturas hay frecuentes congelaciones y descongelaciones. Si se aade un crioprotector no inico, como por ejemplo el glicerol, se reduce la cantidad de hielo que se produce y se evita el aumento de la concentracin inica. Para la conservacin en armarios congeladores, las clulas se almacenan en criotubos (tubos de plstico esterilizables resistentes a la congelacin que cierran hermticamente), preparando lotes de varios tubos para cada cepa a conservar y utilizando en su totalidad un tubo para cada ocasin. De esta manera se evita que las cepas se congelen y se descongelen varias veces. Esto tambin se puede evitar empleando tubos con criobolas (bolas de tipo abalorio que se impregnan con la solucin celular a congelar), ya que para tomar una muestra basta con emplear una o varias bolitas sin necesidad de descongelar el resto. Este mtodo no se debe emplear para la conservacin de microorganismos anaerobios

12.2. Empleo de agentes crioprotectores

Estas sustancias protegen del dao que se pueda producir en las clulas microbianas en el momento de la congelacin. Existen muchos compuestos que se pueden utilizar como crioprotectores, pero el que se utiliza con ms frecuencia es el glicerol, a una concentracin del 15 al 20%. Tambin se pueden utilizar el dimetilsulfxido, la leche descremada y carbohidratos como glucosa, lactosa, sacarosa, inositol, etc. En su eleccin influye el tipo de microorganismo que se quiera conservar.

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13. FACTIBILIDAD:
Para aislar y seleccionar Acetobacter Aceti, los clculos de las cantidades que se van a utilizar en la realizacin de la prctica, estos clculos son para la determinacin solo de la bacteria. MEDIOS Y MATERIALES
Cantidad Medios Preparacin ml 25 80 200 250 250 Cantidad 6 2 2 10 8 1 Gramos --------0,1 2,13 28 66 Costo por unidad en dlares 3 3 2,5 0,15 0,25 1 Costo frasco en dlares 12,88 46 107,18 200 25,75 Costo total 18 6 5 1,5 2 1 Costo por anlisis en dlares 1,61 0,01 0,23 5,6 1,7

Etanol Caldo de enriquecimiento Medio Hoyer Medio Manitol Medio GYC Materiales Erlenmeyers Pipetas Pipetas Cajas petri Tubos de ensayo Criovial

100ml 0,1g/100ml 2.13g/200ml 28g/250ml 66g/250ml Unidades 500 ml 10 ml 0,1 ml ------15ml 5 ml

14. BIBLIOGRAFA:
1. Norma del Codex para el vinagre stan 162-1987 2. LLAGUNO C. y POLO C. 1991. El vinagre de vino. Consejo Superior de Investigaciones Cientficas. Madrid. Espaa. 238 p. 3. MARA DOLORES GARCA LPEZ Y FEDERICO URUBURU FERNNDEZ. La conservacin de cepas microbianasColeccin Espaola de Cultivos Tipo (CECT). Universitat de Valncia. 46100 Burjassot (Valencia) 4. http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S156130032005000200005&script=sci_arttext&tlng=en 5. http://www.alimentacion-sana.com.ar/informaciones/chef/banana.htm

20 6. 7. 8. 9. http://nutriguia.com/?id=frambuesa;t=STORY;topic=alimentos http://nutriguia.com/?id=pltano;t=STORY;topic=alimentos http://frutas.consumer.es/documentos/frescas/mora/intro.php ANDALAUER W., STUMPF C., FRST P. 2000. Influence of the acetification process on phenolic compounds. Journal Agricultural Food Chemistry. 48: 3533-3536. 10. ADAMS M. y MOSS M. 2000. Food microbiology second edition. Publisher by the Royal Society of Chemistry. Cambridge. 479 p. 11. ALADREN F. y CRESPO I. 1999. Estudio de la relacin entre el color de la mora y el color del vino. Viticultura / Enologa profesional. (63): 23 34. 12. ASSOCIATION OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTRY. AOAC. 1995. Official Methods of Anlisis of AOAC Internacional. Food composition; Additives; Natural contaminants. Vol II. 16 th Ed. Cap. 43. 13. ARTHEY D. y ASHURT P.1996. Procesos de conservacin de alimentos. Editorial Acribia.S.A., Zaragoza, Espaa.273p. 14. BELTRAN J. 1994. Microbiologa alimentaria. Editorial Acribia Zaragoza. Espaa. 366 p. 15. BERNAL DE RAMIREZ I. 1993. Anlisis de alimentos. Academia colombiana de ciencias exactas, fsicas y naturales, Bogot, Colombia. 335p. 16. BUZETA A. 1997. Chile: Berries para el 2000. Fundacin Chile Departamento Agroindustrial. Santiago. Chile. 133 p.

21 ANEXOS Figura N0 2 Diagrama de Elaboracin del Vinagre de frutas

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AISLAMIENTO, SELECCIN Y CONSERVACION DE CEPAS DE ACETOBACTER

Diagrama N01 Aislamiento seleccin y conservacin de cepas de Acetobacter aceti