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PRCTICAS DE TERMOBACTERIOLOGA

Queda prohibida su reproduccin total o parcial por cualquier medio sin el consentimiento expreso del autor

ENRIQUE ALFONSO CABEZA HERRERA


Ph.D., D.E.A. Ciencia y Tecnologa de alimentos Especialista en Proteccin de Alimentos Microbilogo

FACULTAD DE CIENCIAS BSICAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA PAMPLONA NORTE DE SANTANDER COLOMBIA 2011

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INTRODUCCION La Termobacteriologa surge como una disciplina alternativa a la microbiologa de los alimentos con el fin de entender los fundamentos que el uso del calor acaece sobre los microorganismos y los propios alimentos, as mismo busca desarrollar y aplicar nuevas metodologas que permitan elaborar y asegurar la calidad y seguridad de los alimentos. La determinacin de la vida til de un alimento puede establecerse de diversas maneras, algunas de ellas resultan ser un tanto ortodoxas por cuanto no aplican una metodologa cientfica y los resultados obtenidos son fruto de la experiencia y la cotidianeidad, en otros casos la vida til suele establecerse sobre la base de datos tericos o sobre referencias bien sean a partir de fuentes bibliogrficas o por observacin de los tiempos de vida til de productos similares que se encuentran en el mercado. A travs de este manual se explicaran las diferentes herramientas que pueden usarse de forma experimental para obtener resultados confiables en cuanto a la determinacin de los diferentes baremos de termodestruccin, as como al clculo de los tratamientos trmicos sin que afecten en gran medida los valores nutricionales y cualitativos de los alimentos. Se pretende que las personas que consulten esta obra adquieran los conocimientos fundamentales que les permita desempearse de la mejor forma en esta rea del que hacer cientfico aplicado a la agroindustria.

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NORMAS DE SEGURIDAD La bioseguridad comprende el conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger la salud del personal frente a riesgos por agentes, biolgicos, qumicos y/o fsicos en las reas de trabajo del laboratorio, as corro medidas de seguridad aplicables a los edificios e instalaciones donde se realicen las actividades. Su objetivo es crear un ambiente de trabajo SEGURO Y ORDENADO que permita alcanzar la productividad ptima. Reglas bsicas de seguridad: Usar ropa adecuada (bata manga larga abotonada y limpia, zapatos cerrados y limpios, uso de cofia y tapabocas). No permitir el acceso a las reas de trabajo sin la debida precaucin. Respetar las reas de acceso restringido; no ingresar inmediatamente a cuartos de siembra previamente esterilizados con radiacin ultravioleta. Al iniciar y finalizar las prcticas, lavarse las manos con agua y jabn Flamee el asa antes y despus de usarla. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada prctica es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes ms habituales para este propsito son la leja y el alcohol (etanol 96), o una solucin de hipoclorito a 15 - 20 ppm. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama. Se deben evitar los desplazamientos innecesarios con el asa bacteriolgica cargada con algn microorganismo por el laboratorio, ya que pueden crear corrientes que originen contaminaciones, aerosoles o producir accidentes. Durante las prcticas est prohibido comer, beber, fumar o mascar chicle. Cuando se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos, etc. No portar maquillaje o aplicarse cosmticos en el laboratorio. Emplear pipeteadores para la transferencia de volmenes y colocar algodn, est prohibido pipetear soluciones con la boca (reactivos, sueros y soluciones en general). Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la realizacin de la prctica deben estar apartados del lugar de trabajo. Para deshacernos del material contaminado utilizaremos los recipientes adecuados. Estos recipientes sern esterilizados posteriormente. Nunca se debe tirar nada por el fregadero o a la basura comn. Bajo ningn concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio. El suministro de gas para los mecheros Bunsen requiere las precauciones propias de estas instalaciones. Los escapes de gas son muy peligrosos, por lo que hay que cerrar todas las llaves de paso de gas al finalizar la prctica, evitar la presencia de sustancias inflamables y

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revisar peridicamente las conducciones. En las prcticas en que se trabaje con luz ultravioleta debe tenerse en cuenta que la exposicin a este tipo de radiacin es peligrosa, ya que tiene poder mutagnico. Por tanto, nunca se debe mirar directamente el foco emisor. Hay que protegerse los ojos y cualquier zona de la piel expuesta a la radiacin (gafas, guantes, mscaras, etc.). En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos, etc.) se comunicar inmediatamente al instructor. Trabaje solamente en su puesto. Marque cuidadosamente todos los cultivos y las preparaciones que de ellas se hacen. Incube en el lugar asignado por el instructor. Al terminar cada sesin de trabajo, limpie la superficie de la mesa. Descarte el material que no necesita ya sea usando los recipientes respectivos o entregndolos al instructor y/o monitor. Nunca retire los cultivos de microorganismos del lugar de trabajo sin previa autorizacin del instructor. No se toque la cara con las manos ya que los dedos y las uas se contaminan fcilmente, llevando grmenes patgenos. Los cultivos microbianos empleados para las prcticas solo se deben abrir durante el momento de ser usados. Trabaje con el cabello recogido, evite usar joyas (anillos, pulseras y cadenas largas por fuera de la blusa). Esterilizar todo el material de desecho. Deben establecerse reglas para la eliminacin de desechos slidos, incluyendo agujas hipodrmicas, que deben colocarse en envases sellados etiquetados como "material peligroso". Los medios de cultivo o muestras de suero que se sospecha que contienen un agente Infeccioso, o virus de la hepatitis, deben autoclavarse antes de su eliminacin final. Si se trabaja con material que no es desechable, tener las debidas precauciones. Etiquetar todos los frascos con fecha, nombre de la preparacin, concentracin y personal que elabor. Cada tubo de cultivo, placa de medio y reactivo debe tener una etiqueta que indique claramente el contenido y las fechas de preparacin y vencimiento. Los tubos, medios y reactivos "codificados por ser peligrosos" deben estar etiquetados de forma tal que incluso personal ajeno al laboratorio pueda interpretar el signo. Almacenar las sustancias voltiles en envases adecuados, ventilados y fros. Disponer de neutralizantes para usar en caso de accidente y extinguidores Deben utilizarse guantes adecuados cuando se manipulan instrumentos calientes, as como protectores faciales u oculares cuando se manipulan o mezclan sustancias custicas. Todas las sustancias corrosivas o custicas deben designarse con una etiqueta de color brillante y guardarse en gabinetes cerrados cerca del piso. Las soluciones corrosivas que se vierten en las piletas deben enjuagarse con abundante agua, antes de la eliminacin real y despus de ella.

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Todo el equipo elctrico debe estar apropiadamente conectado a tierra y debe tomarse la preocupacin de no sobrecargar los circuitos. No manipular con las manos hmedas o sin conocer adecuadamente su funcionamiento. En el laboratorio esta estrictamente prohibido el uso extensiones elctricas y artefactos domsticos, como cafeteras o calentadores elctricos. El personal de laboratorio debe informar al supervisor sobre cualquier choque elctrico con el uso del aparato. Nunca debe intentarse la reparacin mientras el dispositivo esta conectado con el circuito elctrico. Los tanques de gases comprimidos deben asegurarse bien a la pared y el nombre de su contenido debe estar claramente indicado en la etiqueta.

Recomendaciones antes y durante la prctica: Llegue siempre al laboratorio con un conocimiento completo de la prctica que va a realizar. Llegue a tiempo para la prctica, evite interrupciones. Atienda las explicaciones del profesor y pregunte lo que no entienda. Marque todos sus cultivos y especmenes del estudio siguiendo las indicaciones del instructor. Dicha marcacin debe contener por lo menos: Grupo de trabajo, Fecha, Nombre del microorganismo, Datos relativos al experimento como temperatura, medio de cultivo, tiempo de incubacin y otros que considere pertinente, Semestre y nombre de la asignatura Para estos rtulos usar marcador de vidrio, rtulos adhesivos o escriba en cinta de enmascarar, que usted debe llevar al laboratorio. No olvide llevar siempre el kit de trabajo elemental: porta y cubreobjetos, lanilla o toalla, jabn, marcador, cinta de enmascarar, cortapapel, asas de siembra reta, redonda, de Driglasky y todo lo dems que considere necesario.

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NIVEL DE RIESGO Para el desarrollo en general de este curso se han definido en cada una de las prcticas el nivel de riesgo, sin embargo de forma genrica para las actividades escritas en este manual se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya que se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algn momento por malas prcticas de laboratorio pueden conllevar algn peligro para los manipuladores. Por tanto, todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de este curso deber usar los siguientes equipamientos: Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo, Pantaln Largo Nota 1: el docente ser el responsable de velar por el cumplimiento de los elementos descritos anteriormente. Nota 2: cada estudiante deber portar un kit de trabajo conteniendo mnimo los siguientes elementos: Pipeteador, Tijeras, Cinta de enmascarar, Marcador para vidrio, Jabn lquido, en polvo o en barra antibacterial, Toalla absorbente, Porta y Cubre objetos, Guantes desechables de ltex, Gasa, Algodn, Asas de platino redonda, recta y de Driglasky (hockey), encendedor o fsforos.

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ACTIVIDAD 1. ESCALDADO DE VEGETALES: TUBRCULOS, FRUTAS, HORTALIZAS


1.1. OBJETIVOS Al finalizar la prctica el estudiante estar en capacidad de: Observar el efecto de un tratamiento trmico suave, ideado para inactivar enzimas, sobre la flora banal pero deteriorante, presente en los tejidos vegetales tanto de frutas como de hortalizas. Comparar y analizar el efecto de diferentes tratamientos trmicos, manejando variables de tiempo y temperatura, sobre el mismo vegetal, para llegar a una conclusin acerca del tratamiento ms indicado para dicho vegetal. 1.2. MARCO TERICO Cuando se cortan ciertas frutas o verduras y la superficie entra en contacto con el aire, en unos minutos adoptan un color oscuro. Es lo que se conoce como pardeamiento enzimtico, una alteracin que se manifiesta con la formacin de colores oscuros y la prdida de sabor, e incluso, de contenido nutricional. Por este motivo, se convierte en un problema para productos como frutas y hortalizas, as como para la industria del vino, ya que produce alteraciones en el color que reducen su valor comercial o lo hacen inaceptable para el consumidor. Los colores caractersticos del pardeamiento son muy variados, desde marrones, hasta rojizos, dorados o negros, en funcin del alimento y de las condiciones del proceso de produccin. Adems de la alteracin del color, los productos secundarios que se forman pueden reaccionar con las protenas, que insolubilizan, lo que contribuye a una prdida nutricional de vitamina C, entre otras. 1.2.1. Pardeamiento enzimtico: es una reaccin de oxidacin que produce un determinado grupo de enzimas y que afecta a casi todos los seres vivos. En los alimentos, este fenmeno se da al cortar algunas frutas como las manzanas, duraznos, banano, pera u otros vegetales como los esprragos o la papa. Al cabo de pocos minutos, la superficie cortada se vuelve ms oscura. Esto se debe a la accin de enzimas denominadas polifenoloxidasas que, en condiciones de humedad, producen una oxidacin de los compuestos que dan color a los alimentos. En las frutas, oxidan ciertos fenoles e introducen tomos de oxgeno en su composicin. Esto provoca que los fenoles se conviertan en quinonas, que causan los pigmentos marrones, rojos y negros que se aprecian. 1.2.2. Pardeamiento no enzimtico: es el resultado de reacciones originadas por los compuestos que contienen azcares reductores y los compuestos proteicos. stas
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conducen a la formacin de polmeros oscuros, en algunos casos deseables, como los destinados a los aromas de los crnicos sintticos o del caf tostado. Sin embargo, en la mayora de los casos, estas reacciones conllevan alteraciones organolpticas y prdidas del valor nutritivo. Las rutas para lograr el efecto del pardeamiento son varias, aunque la ms conocida es la accin del calor. La qumica de todas ellas est relacionada con la Reaccin de Maillard, que es el resultado de la unin de los azcares con las protenas. Esta combinacin provoca cambios irreversibles en las propiedades, tanto qumicas como fisiolgicas, de las protenas. La acumulacin de pigmentos de un color marrn indica que la reaccin se ha producido en alimentos que contienen hidratos de carbono y protenas. Uno de los usos ms extendidos de este tipo de reaccin se encuentra en la industria lctea, en la que se emplea como indicador de un excesivo procesado trmico. Cuando la reaccin de Maillard avanza, puede seguir diferentes rutas que variarn en funcin de las condiciones ambientales, del pH y de la temperatura. Una de las posibilidades es que aparezca la caramelizacin, llamada tambin pirolisis, una reaccin de oscurecimiento que tiene lugar cuando los azcares se calientan por encima de su punto de fusin. Su utilizacin ms importante se da en la produccin de caramelos comerciales. Esta reaccin se ve favorecida por condiciones alcalinas o cidas y puede ser conveniente o perjudicial para la calidad de un producto alimentario. Prevenir que se desarrolle pasa por aplicar en el proceso una elevada temperatura, adems de almacenar los alimentos a bajas temperaturas. 1.2.3. El escaldado: es en resumidas cuentas, una breve coccin en agua o vapor de agua, que se suele aplicar como un tratamiento previo a cualquier procedimiento industrial de transformacin y/o conservacin de vegetales. Este proceso tiene como finalidad bsica la inactivacin trmica de las enzimas autolticas naturales del vegetal, para que no intervengan en el deterioro del mismo y as evitar complicaciones en etapas posteriores en una lnea de produccin. Sin embargo, adems contribuye con una serie de efectos benficos para el producto, tales como: Eliminacin del oxgeno y otros gases de los espacios intercelulares del tejido, para reducir las reacciones de oxidacin (corrosin de envases, alteraciones sensoriales, etc.) y la presin interna de los botes en la esterilizacin. Ayuda a fijar el color natural del vegetal. Completar el lavado del producto, reduciendo de la misma manera la contaminacin qumica, as como tambin reduce la carga microbiana banal. Esto ltimo como consecuencia del tiempo y la temperatura empleados. Ablandar el tejido vegetal de modo que pueda soportar sin fracturas ni daos, posteriores manipulaciones (por ejemplo habichuelas y esprragos) y reducir su volumen aparente (por ejemplo espinacas, lechugas y otras hojas) para hacer posible su acondicionamiento y embalaje. En los casos de frutas que van a ser congeladas o deshidratadas y as sern

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comercializadas; este proceso aumenta la permeabilidad de las paredes celulares lo que incrementa la velocidad de deshidratacin y facilita la posterior rehidratacin. Limpiar los sabores acres (como en la col) y eliminar algunos pigmentos indeseables.

1.2.3.1. Coadyuvantes del escaldado: El efecto del calor puede ser acentuado por medio de sustancias qumicas, para mejorar su efecto sobre el vegetal. El tratamiento trmico debe ser lo suficientemente elevado para inactivar enzimas y lo suficientemente suave como para no alterar el tejido vegetal. En algunos casos stas sustancias protegen al vegetal. Las siguientes son algunos ejemplos de estas sustancias denominadas coadyuvantes del escaldado: Sal: eleva la presin osmtica del medio sensibilizando las bacterias. cido ascrbico: fuerte antioxidante que regulas las reacciones oxidativas de deterioro. cido ctrico: acidulante fuerte, reduce el pH lo que sensibiliza a las enzimas y de paso a los microorganismos. Sal soluble de calcio: endurece el tejido de algunos vegetales (trozos de manzana, tomate, etc.) por su reaccin con las pectinas. Carbonato de sodio: protege a la clorofila, pero afecta la tiamina y la vitamina C. Fosfatos: reducen la oxidacin de los carotenos. Sulfitos: evita el pardeamiento enzimtico durante la deshidratacin. 1.2.4. Enzimas alterantes de los alimentos: como hemos mencionado, el principal papel del escaldado es la inactivacin de enzimas que alteran el producto, sin interesar su origen. Estas enzimas alterantes puede ser tanto endocelulares como exocelulares y pueden provenir del tejido vegetal o enzimas microbianas, las cuales pueden actuar a pesar de que los microorganismos se hallen destruidos. Las enzimas dainas se pueden clasificar en tres grupos, as: OXIDATIVAS: Son poco especficas y alteran, generalmente, al mismo tiempo el color, aroma y otros caracteres del producto. Son las ms termorresistentes. Ejemplos: Catalasa: H2O2 H2O + 1/2O2 Peroxidasa: H2O + 2AH 2H2O + 2A Deshidrogenacin directa HIDROLTICAS: Originan la formacin especfica de olores o sabores indeseables. Como ejemplos encontramos: Lipasas: que generan cidos grasos libres. Proteasas: pptidos amargos, malos olores. Amilasas: sabores azucarados. Pectinohidrolasas: modifican la textura del producto.

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Enzimas metablicas naturales: producen etanol a partir de los azcares. ALTERADORAS DEL COLOR: Especficamente contribuyen con modificar el color de los productos. Polifenoloxidasas: pardeamiento enzimtico. Clorofilasas: degradan la clorofila. Lipoxidasas: oxidan los beta carotenos.

1.2.5. Control del escaldado: Se efecta teniendo en cuenta el grupo de enzimas ms termorresistentes. Se realiza bsicamente para evitar inconvenientes como: Ablandamiento excesivo. Sabores a cocido y olores extraos. Prdidas de nutrientes, por su difusin en el agua. Transformacin de la clorofila en feofitina. Prdida del aroma tpico. Este control se hace mediante la verificacin de la subsistencia de enzimas tales como la catalasa y la peroxidasa que son las ms termorresistentes. La ms termorresistente de estas enzimas es la peroxidasa, pero esta es la menos daina. Por lo general, estos procesos aseguran la inactivacin total de la catalasa; pero solo la inactivacin parcial de la peroxidasa, ya que para inactivar sta ltima el tratamiento sera tan drstico para el vegetal que acarreara sobre coccin y algunos daos fsicos. Como la mayora de las enzimas, la peroxidasa puede ser inactivada por el calor, siendo una de las que precisan mayor temperatura y ms tiempo para su inactivacin. Posee, adems, la propiedad peculiar de la regeneracin enzimtica. Este fenmeno consiste en que al inactivarla por medio del calor recupera parcialmente su actividad despus de un cierto tiempo (Schmidt y Pennacchiotti, 2001b). Esto ha sido explicado, aduciendo que la fraccin proteica de la enzima sufre una desnaturalizacin slo parcial, con prdida de su estructura terciaria, si el calor se aplica un tiempo muy corto, producindose luego una reversin de la protena a su estado normal por recombinacin de sus grupos hidrgenos o sulfhidrlicos. 1.3. MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS 3 Bolsas de cierre fcil (tipo Ziploc) 400 ml de Agar estndar para recuento en placa SPC 20 Cajas de petri estriles 3 baos serolgicos ajustados a 75C, 80C y 85C. 14 pipetas de 1 ml estriles. 4 pipetas de 0,1 ml estriles. 3 termmetros de 0 C 100 C.

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6 tubos de ensayo grandes y estriles. 1 mortero con pistilo. 1 espectrofotmetro (opcional si se desea cuantificar la actividad peroxidasa). Celdas plsticas o de cuarzo para espectrofotometra (opcional si se desea cuantificar la actividad peroxidasa).

1.4. REACTIVOS 5 Tubos con 9 mL de agua peptona 0,1% estril. 1 vaso de precipitado con 200 ml de solucin acuosa de sal al 1,5% estril. 1 vaso de precipitado con 200 ml de solucin de cido ctrico al 0,8% estril. 1 vaso de precipitado con 200 ml de solucin de cido ascrbico al 0,5% estril. 1 ml de solucin de Guayacol al 1% en solucin de alcohol al 50%. 10 ml de solucin de perxido de hidrgeno al 3%. 4 fiolas con 225 ml de agua peptona 0,1% estril.

1.5. PROCEDIMIENTO Pesar aproximadamente 450 g de un vegetal debidamente troceado en cubos de 1 cm3. Dividir en tres grupos de 125 g cada uno, con otros 25 g hacer recuento de aerobios mesfilos de la dilucin 10-1, 10-2 y 10-3. Preparar en tres vasos de precipitado, una solucin acuosa de sal al 1,5%, cido ctrico al 0,8% y cido ascrbico al 0,5%. Calentar cada solucin hasta conseguir en cada vaso de precipitado las siguientes temperaturas: 75, 80 y 85C, respectivamente. Adicionar en cada vaso de precipitado los correspondientes 125 g de vegetal al alcanzar la temperatura propuesta. Dejar el vegetal, segn la temperatura, los siguientes tiempos*: 10 min (75C), 6 min (80C), 3 min (85C). Realizar a cada vaso de precipitado un recuento de aerobios mesfilos de la dilucin 10-1, 10-2 y 10-3. Escurrir y empacar 75 g en frasco o en bolsa transparente estril. Almacenar a temperatura de refrigeracin (4C) durante 2 o 3 semanas. Observar cada 48 horas los cambios ocurridos en color, olor, textura, apariencia, etc. Determinar la actividad de las enzimas peroxidasa (mtodo cualitativo descrito por Avallone et al., 2001) y catalasa (ver anexo 4) como control del escaldado, segn los mtodos descritos en el anexo 4.

1.6. NIVEL DE RIESGO

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Nivel 2: Riesgo Medio (Bata de Laboratorio, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo, Pantaln Largo). 1.7. BIBLIOGRAFA Arias, B.P., Gonzlez, M.C., Llanes, L.Y. (2003). Actividad peroxidasa, polifenoloxidasa, fenilalanina amonio liasa y Glucanasa en somaclones y mutantes de arroz. Rev. Proteccin Veg., vol. 18, No. 3: 183 188. Avallone, C.M., Cravzov, A.L., Montenegro, S.B., Pellizzari, E.E. (2001). Estudio de la actividad peroxidasa, pectinesterasa y polifeniloxidasa en extracto enzimtico de sanda (Citrullus vulgaris Schard). Resmen T-074. Ciencia y Tcnica, comunicaciones cientficas y tecnolgicas 2001. Universidad Nacional del Nordeste, Argentina. Disponible en: http://www.unne.ed.ar/Web/cyt/cyt/2001/cyt.htm, vnculo Tecnolgicas. Braverman, J.B.S. (1963). Introduction to the biochemistry of foods. Elsevier. Pennacchiotti, M. (1998). Captulo 2: Las Enzimas, apartado 3, aplicaciones de las enzimas. En: Las Protenas: generalidades y su importancia en nutricin y en la industria de alimentos. Edicin Digital, Universidad de Chile. Disponible en internet: http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/penacchiot tii01/. Fecha de acceso: 1 de marzo de 2008. Schmidt, H., Pennacchiotti, I. (2001a). Captulo 3: Determinacin de Catalasa en Vegetales. En: Las enzimas en los alimentos, su importancia en la qumica y la tecnologa de los alimentos. Edicin digital. Biblioteca digital, Universidad de Chile. Disponible en internet: http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth0 2/. Fecha de acceso: 1 de marzo de 2008 Schmidt, H., Pennacchiotti, I. (2001b). Captulo 2: Determinacin de Actividad Peroxisada y de su Regeneracin. En: Las enzimas en los alimentos, su importancia en la qumica y la tecnologa de los alimentos. Edicin digital. Biblioteca digital, Universidad de Chile. Disponible en internet: http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth0 2/. Fecha de acceso: 1 de marzo de 2008.

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ACTIVIDAD 2. DETERMINACIN DEL PUNTO FRO EN PRODUCTOS FLUIDOS Y SEMIFLUIDOS


2.1. OBJETIVOS Los objetivos que se buscan con esta prctica son: Disear modelos para el estudio de la penetracin de calor en productos lquidos, semislidos y slidos. Disear protocolos para el estudio y determinacin de puntos fros en cualquier producto. Comprender como estn constituidos los termopares y como se usan para la determinacin de puntos fros y estudios de penetracin de calor. 2.2. MARCO TERICO La temperatura es de lejos la variable ms frecuentemente medida en la ingeniera de procesos. En la produccin de alimentos, el registro y control de la temperatura es un factor importante para asegurar la calidad y seguridad del producto final. Aunque existen muchas aplicaciones para la medicin de la temperatura en el procesado de alimentos, las condiciones de proceso que va a encontrar no son particularmente hostiles. De este modo, las temperaturas se encuentran en el intervalo desde 50C en el almacenamiento en fro a + 150C en las aplicaciones de esterilizacin en continuo. Solamente en la generacin de vapor se encontrarn temperaturas ms altas (Berrie, P.G., 2001). 2.2.1. Medicin de la temperatura: En el momento en que se comenz a estudiar la penetracin de calor en alimentos, el nico instrumento de medida de temperatura que exista era el termmetro, aunque este daba unos resultados no muy precisos debido a que el bulbo del termmetro es ligeramente largo (aproximadamente 1 cm) y por tanto, la medicin de la temperatura se hace a lo largo de dicho bulbo. Con la necesidad de tener resultados verdaderamente satisfactorios se tuvo la urgencia de crear unos instrumentos que dieran resultados ms precisos, generndose una amplia gama de instrumentos como los termopares, detectores de resistencia de temperatura (RTDs), restatos, etc. En general, los dispositivos de medicin de la temperatura los podemos clasificar en dos grupos a saber: dispositivos de fuerza de temperatura (FTDs) y dispositivos elctricos de temperatura (ETDs). 2.2.1.1. Dispositivos de fuerza de temperatura: Los dispositivos FTDs se pueden dividir en FTDs bimetlicos y sistemas FTD llenados trmicamente, destacndose la cinta o termmetro bimetlico y los termmetros lquidos, respectivamente. Estos dispositivos hacen uso del hecho de que la longitud o el volumen de una masa determinada de materia cambia a medida que aumenta la temperatura. El cambio de longitud o volumen con la
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temperatura depende del material y viene caracterizado por el denominado coeficiente de expansin. Los termmetros BIMETALICOS se definen como un material compuesto que consta de tiras de dos o ms metales unidos entre s, por ejemplo remachados o unidos en espiral. Cuando la temperatura aumenta, cada metal se expande en una cantidad diferente provocando que la cinta entera se curve debido a los diferentes ndices de expansin de sus componentes. La cantidad de curvatura es una indicacin de la temperatura. Este principio se emplea para la fabricacin de termmetros y termostatos, los cuales se forman con un resorte espiralado que en el centro est unido a una aguja. Al calentarse, el espiral se deforma provocando la deflexin de la aguja. El bimetal termoesttico se cuando se mantiene fijo un extremo de la franja recta, y el otro sufre una deflexin proporcional al cambio de temperatura y el cuadrado de la longitud, y en sentido inverso al espesor, a lo largo de la porcin lineal de la curva caracterstica de deflexin. Figura 2.1. Dispositivos de fuerza de temperatura. a: Cinta bimetlica; b: Sistema trmico llenado (Termmetro).

2.2.1.2. Dispositivos elctricos de temperatura: en esta categora se incluye los denominados Termopares. El termopar es un dispositivo para la medicin de temperatura, basado en efectos termoelctricos (Medrano, 2002). Es un circuito formado por un conjunto de dos alambres de diferentes metales conductores o aleaciones de metales (Constantan: aleacin cobre y niquel; Cromel: niquel y cromo; Nicrosil: niquel, cromo y silicio; Alumel: nquel y aluminio; Misil: niquel y silicio) unidos en sus extremos y conectados a un voltmetro (potencimetro), el cual registra el diferencial del potencial elctrico que se genera cuando este conjunto de alambres son sometidos a calentamiento. Como explica Medrano (2002) la

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fuerza electromotriz generada por el termopar est en funcin de la diferencia entre la unin fra y caliente, pero ms especficamente, esta es generada como resultado de los gradientes de temperatura los cuales existen a lo largo de la longitud de los conductores. El termopar (Figura 2.2) fue inventado por el fsico y mdico alemn Thomas Johann Seebeck entre los aos 18211822. l descubri que una corriente elctrica flua a travs de un circuito cerrado formado por dos metales distintos cuando cada una de sus uniones son calentadas a distintas temperaturas, este se constituye como el fundamento de los termopares y a este evento se le denomina el efecto o tensin de Seebeck o Fuerza Electromotrz (FEM) (Figura 2.3, a y b). Figura 2.2. Representacin de un termopar

La magnitud y direccin de la corriente son funcin de la diferencia de temperatura de las uniones y de las propiedades trmicas de los metales usados en el circuito. A este fenmeno se le conoce como efecto Seebeck. Figura 2.3. Diseo bsico del circuito de Seebeck.

b Si abrimos este circuito, obtenemos una diferencia de potencial pequea (milivolts), la cual es directamente proporcional a la temperatura de la unin y a la composicin de los dos metales (Figura 2.4)

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Figura 2.4. Representacin del circuito abierto de un termopar.

Funcionamiento de un Termopar (Medicin): La diferencia de potencial (ddp) no puede ser medida directamente con un voltmetro debido a que la unin del termopar con el voltmetro crea un nuevo circuito termoelctrico. Figura 2.5. Representacin de un Termopar J aislado isotrmicamente en sus uniones U2 y U3.

Si el termistor o Pt100 determinan la temperatura de referencia de U2 y U3, se puede determinar entonces la tensin elctrica de referencia de esas uniones (Vref), por lo tanto V1 ser la diferencia de V menos la Vref. A este procedimiento se le conoce como de Compensacin por software, esto es debido a que el clculo de la tensin de referencia y a su vez el clculo de la diferencia de tensiones es realizado por un microprocesador alojado en el instrumento de medicin. ste es sin duda el procedimiento de medicin de termopares ms comn en la industria. En la tabla 2.1 puede verse los tipos de termopares ms comunes empleados en la industria.

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Tabla 2.1. Tipos de termopares (Denominacin, composicin, rango de temperatura y color base para identificacin).

* El color del polo negativo del termopar es Rojo. Otra forma de clasificacin de termopares de acuerdo al revestimiento de los mismos nos permite diferenciar dos clases: aquellos cuyos vstagos van protegidos por fundas metlicas y los que poseen fundas o cubiertas de materiales no conductores como la cermica o el polmero de baquelita. 2.2.2. Medicin de la penetracin del calor dentro de los alimentos enlatados: Aunque pueden usarse termmetros para seguir ciertas caractersticas en el calentamiento de los alimentos, el mtodo ms satisfactorio involucra el uso de termopares. Cuando el termopar es introducido en el recipiente y este se calienta en un autoclave o en otro dispositivo de calentamiento, se genera un diferencial de energa la cual es medida por un potencimetro y transformada en una grfica mediante la cual puede seguirse los cambios de temperatura dentro de la lata con respecto al tiempo, all podremos apreciar el punto ms difcil de esterilizacin de un alimento al cual llamaremos Punto Fro. Este punto vara en los alimentos segn la forma de calentamiento que estos reciban, siendo estas formas de calentamiento por conveccin y por conduccin. Como hemos comentado anteriormente, existen diversos tipos de termopares comerciales para seguir la velocidad de penetracin del calor en botes de alimentos. Uno de los ms corrientes es el que descubri ECKLUND en 1949 (Termocupla tipo T: cobre-constantan), de muelle a presin cuyo vstago se fija a la pared del cuerpo del bote. Una vez fijo e,

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vstago, la lata puede cerrarse fcilmente en todos los tipos de mquinas cerradoras. Son pocos los partidarios de usar termopares cuyos vstagos van protegidos por fundas metlicas, por lo que prefieren los que poseen fundas o cubiertas de material no conductor, lo que evita el riesgo de conduccin del calor desde el centro del bote a lo largo de la cubierta del termopar. En el calentamiento por conduccin de los botes pueden originarse errores al transmitirse el calor por los alambres del propio termopar. Para evitarlo ECKLUDED ha elaborado una tabla de factores de correccin que deben aplicarse a los valores J, sealando adems que los errores se originan en su mayor proporcin en las fases iniciales de calentamiento y enfriamiento, para trabajar con precisin se necesitan termopares construidos con alambres finos, aplicando cuando sea conveniente factores de correccin de temperatura. La posicin en que debe situarse el par caliente depende de las propiedades fsicas del alimento y para comprenderlo es necesario conocer a su travs. Como se ha explicado en la prctica anterior, en los alimentos slidos el calor se transmite por conduccin y el proceso es relativamente lento, mientras que en los lquidos el calor se transmite principalmente por conveccin y la elevacin trmica es ms rpida, puesto que existe un movimiento continuo del material, de tal modo que las diferencias trmicas dentro del bote son mnimas en cualquier instante del proceso. En contenidos slidos los alambres termopares, usualmente requieren soportes no especiales, pero en contenidos lquidos, es necesario soportar los alambres sobre una fibra de vidrio o pasando ellos a travs de sellos sobre los lados opuestos a la lata. Los alambres deben ser dejados algo flojos para permitir la expansin de la lata y abultamiento de las terminaciones durante el calentamiento. Estos mtodos por ajustamiento de termopares dentro de las latas permiten que las medidas sean hechas desde cualquier tamao y forma, con un mnimo de equipo y costo. 2.2.3. Medicin del punto fro en los alimentos enlatados: No todos los puntos de un recipiente que est siendo calentado se encuentra a la misma temperatura. La zona de calentamiento ms lenta es llamada el punto fro de un recipiente y es esta zona la ms difcil de esterilizar, debido al retraso en el calentamiento. En los productos calentados principalmente por conveccin el punto fro est sobre el eje vertical cerca del fondo del recipiente. Los productos calentados por conduccin tienen el punto de calentamiento ms lento aproximndose al centro del recipiente sobre el eje principal. Para determinar donde se encuentra el punto fro de un alimento puede seguirse la siguiente metodologa: Una abertura de 1,8 pulgadas (4,57 cm) de dimetro es perforada en la pared cilndrica de la lata opuesta al punto propuesto de medida. Un tubo de cobre de 3,4 pulgadas (8,64 cm) de longitud y 1,4 pulgadas (3,56 cm) de dimetro es soldado a la pared de la lata circundante a la abertura, los alambres termopares son pasados a travs

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del tubo y la abertura hacia el interior de la lata. Los alambres son entonces sellados dentro del tubo de cobre con una resina basada en epoxi que coloca la temperatura en el espacio cuando un endurecedor es agregado. Cuando alambres finos son usados, un sello hermtico al vacio puede ser obtenido sin el tubo de cobre simplemente con perforar la lata y colocando el alambre dentro de esta abertura con la resina. Las latas ajustadas con termopares por el segundo mtodo pueden ser pasadas a travs de muchos tipos de equipos exhaustivos y cerrados si los alambres son enrollados alrededor de la lata y mantenidos en esa posicin con cinta adhesiva. Las latas sometidas a experimentos pueden ser entonces incluidas en una extensa produccin de latas para reproducir condiciones comerciales tan cuidadosamente como sea posible. Las cajas de empaquetadoras son soldadas a la lata comenzando a pulgada (1,27 cm) del fondo de la primera lata, de pulgadas (1,91 cm) del fondo de la segunda lata, 1 pulgada (2,54 cm) del fondo de la tercera lata, 1 de pulgadas (3,18 cm) del fondo de la cuarta lata, y as sucesivamente cada de pulgada (0,635 cm) superior a la del termopar de la lata anterior. El producto se prepara y se mantiene un llenado uniforme en todos los recipientes, dejando un espacio de cabeza mnimo del 6% y mximo un 10% de la capacidad de la lata (medido en trminos de volumen). Las latas se sellan, y los termopares quedan fijados en cada recipiente, quedando disponibles con termopares localizados cada de pulgada del fondo de las latas comenzando con la primera a pulgada del fondo de la misma (Figura 2.6). Las latas son colocadas luego en una retorta (Autoclave), la cual es llevada a la temperatura deseada, con la debida precaucin para eliminar el aire. Las temperaturas son registradas cada minuto manualmente o de forma automtica si se dispone de algn software adecuado (por ejemplo irMOTIOM premium) o si se usa un potencimetro voltmetro registrador, los valores tiempo-temperatura sern graficados en papel semilogartmico, lo que da una lnea recta con desviaciones menores para la relacin entre el tiempo y la temperatura. Finalmente, una vez localizado el punto frio del alimento, todos los estudios subsecuentes de penetracin de calor, valores de esterilizacin o pasteurizacin, etc., se harn ubicando siempre los empalmes de los termopares en la distancia calculada como dicho punto. 2.3. MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS Para esta prctica no se utilizaran termopares sino 6 termmetros de 10 100C. 6 frascos de vidrio resistentes al calor con sus respectivas tapas. 1 bao serolgico ajustado a una temperatura de 70C, 80C o la indicada por el profesor. Papel milimetrado.

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Figura 2.6. Forma de insercin de los termopares para estudios de penetracin de calor.

2.4. REACTIVOS No requiere 2.5. PROCEDIMIENTO Se toman las tapas y se perforan justo en el centro de las mismas. Se adiciona un volumen conocido de agua o el producto que indique el profesor en los recipientes, dependiendo de la capacidad de los mismos. Se debe procurar dejar un espacio de cabeza que no sea menor al 6% del volumen del recipiente, ni mayor al 10%. En todos los botes deber adicionarse la misma cantidad. Se tapan los botes, se introducen los termmetros a distintas profundidades comenzando por ubicar el bulbo a 1,25 cm del fondo del primer bote. El segundo termmetro se ubica a 1,9 cm del fondo, el tercero a 2,5 cm, el cuarto termmetro a 3,13 cm, el quinto a 3,75 cm y el sexto termmetro a 4,38 cm del fondo. En la medida que se disponga de ms termmetros y botes, se ubicaran cada de altura a la inmediatamente anterior. Se introducen todos los botes en el bao serolgico y se toman los datos de temperatura en intervalos de 1 minuto hasta alcanzar la temperatura de proceso establecida. Construir la grfica Temperatura vs tiempo para cada bote en papel milimetrado y determinar la curva de ms lento calentamiento. En este punto se ubicara el punto frio del producto. 2.6. NIVEL DE RIESGO

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Para el desarrollo de la presente prctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2. Por tanto, todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deber usar los siguientes equipamientos: Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo, Pantaln Largo. 2.7. BIBLIOGRAFA Medrano, S. 2002. Termopares. En: La Gua MetAs, Ao 02, No 7. Julio, 2002. Board, R.G. 1988. Introduccin a la microbiologa moderna de los alimentos. Editorial Acribia S.A., Zaragoza, Espaa. Heldman, S. 1998. Introduccin a la ingeniera de los alimentos. Editorial Acribia S.A., Zaragoza, Espaa. Ress, G.A., Bettison, J. 1994. Procesado trmico y envasado de los alimentos. Editorial Acribia S.A., Zaragoza, Espaa. Berrie, P.G. 2001. Captulo 4: Medicin de la presin y temperatura en el control de procesos alimentarios. En: Tecnologas trmicas para el procesado de los alimentos. Philip Richardson Editor. Editorial Acribia S.A. Zaragoza, Espaa. Pgs. 55 79. ISBN: 84-200-1042-1. http://www.termocamara.com/software.htm http://www.thermoteknix.com/brochures/visir/VisIR_Spanish.pdf http://www.simca.com.mx/calif.htm

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ACTIVIDAD 3. ESTUDIO DE LA PENETRACIN DEL CALOR EN PRODUCTOS FLUIDOS


3.1. OBJETIVO Al finalizar la prctica el estudiante estar en capacidad de: Construir grficas de penetracin de calor para diversos productos e interpretar su comportamiento. Comparar las velocidades de penetracin de calor en los diferentes productos alimenticios. Determinar el grado de destruccin bacteriana durante el estudio y comparar la carga microbiana en diferentes momentos de la curva de penetracin de calor 3.2. MARCO TERICO Existen diferentes modos de transmisin del calor. Pero tericamente se habla del caso ideal en el que la temperatura del tratamiento trmico alcance instantneamente a todos los puntos del producto, mantenindose por un lapso de tiempo y luego descender otro tanto. Sin embargo, lo ms frecuente es que la temperatura de tratamiento no se logre instantneamente y no resulte homognea en toda la masa del producto. Por otro lado el mismo medio de calentamiento (como agua o vapor de agua en el autoclave) necesita un cierto tiempo para conseguir la temperatura deseada. Como se sabe el mtodo clsico (de Nicolas Appert) presupone: Introduccin del producto convenientemente preparado en un recipiente. Cierre hermticamente del envase. Tratamiento trmico del recipiente con su contenido. Enfriamiento.

Evidentemente, lo que interesa para establecer un clculo de esterilizacin adecuado, es conocer la evolucin de la temperatura en la parte del producto, que dentro del proceso total, es decir, comprendiendo tambin la fase de enfriamiento; tuviese la menor velocidad de penetracin de calor, se habla a ste propsito del punto fro que dependiendo de la forma como se transmita el calor puede ubicarse en el centro geomtrico de la masa del producto o bien sobre el eje central aproximndose a de la parte inferior del envase. La medida de las variaciones de la temperatura en diferentes puntos del producto y ms especialmente en el punto fro, en funcin del tiempo y de otros factores se realiza por medio de pares termoelctricos especiales, fijos en el recipiente y unidos a un potencimetro registrador, que detecta los cambios trmicos en el punto fro del producto (Figura 3.1).

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Figura 3.1. Mecanismos bsicos de la transmisin de calor en alimentos. a). Conduccin para alimentos slidos. b). Conveccin para alimentos lquidos.
a b

Termopares

Punto fro

En la figura 3.2 puede verse diversos ejemplos de las curvas tpicas de penetracin de calor dependiendo de la naturaleza de la matriz alimentaria, destacndo tres ejemplos: a. Producto muy mvil de viscosidad bastante baja, agitado enrgicamente (por ejemplo, un zumo de frutas calentado en capas finas y en circulacin rpida en un intercambiador de calor). la transmisin del calor ocurre por conveccin y la temperatura de tratamiento se consigue casi instantneamente, es decir, en un tiempo despreciable. b. Producto mvil poro no agitado (por ejemplo, frutas en almbar ligero o una crema de verduras). La trasferencia de calor tiene lugar especialmente por conveccin; en ste caso las corrientes de conveccin se deben a diferencias en la temperatura y, como consecuencia de esto, de densidad entre las capas del producto prximas a las paredes del recipiente y de las proporciones que estn ms alejadas. c. El producto est constituido por una masa slida compacta (ej.: pat de hgado) o por un lquido de muy alta viscosidad (ej.: solucin de almidn o soluciones pcticas por encima de determinadas concentraciones), aqu la propagacin del calor se hace por conduccin, es decir, por transmisin gradual de vibraciones trmicas de molcula a molcula en la masa del producto, desde las paredes del recipiente hasta el punto fro.

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Figura 3. 2. Curvas tpicas de penetracin de calor. a. Transmisin de calor por conveccin con agitacin; b. Transmisin de calor por conveccin sin agitacin; c. Transmisin de calor por conduccin.
Temperatura del medio calefactor

120 Temperatura (C) 110 100


b

10

20

30

40
Tiempo (min)

Los clculos de esterilizacin deben tener en cuenta las fases de calentamiento y de enfriamiento, ya que su contribucin a la esterilizacin es apreciable. Durante el ciclo: calentamiento mantenimiento enfriamiento, el punto fro adopta una sucesin de temperaturas de las cuales cada una posee un determinado valor letal, el efecto esterilizador del conjunto del ciclo es la suma de los efectos esterilizantes de cada temperatura sucesiva. 3.3. MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS (por grupo de trabajo) 400 ml de un producto fluido (sin leche). El instructor asignara a cada grupo un producto diferente, p.ej. Bebida de malta, jugo de fruta en agua, sopas, bebida gaseada, etc. 1 Fiola estril de 500 ml de capacidad. 1 Termmetro de 10 250 C. 1 Bao serolgico. Mnimo 10 pipetas estriles de 1 mL de capacidad. 12 Cajas de petri estriles. 3.4. REACTIVOS 7 tubos con 9 ml de agua peptonada 0,1%.
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240 ml de agar estndar para recuento en placa (SPC). Cultivo madre de E. coli o S. aureus en fase logartmica (mantenido en caldo BHI). 3.5. PROCEDIMIENTO Tomar aproximadamente 300 ml de producto en una fiola estril de 500 ml de capacidad. Realizar recuento de aerobios msofilos de las diluciones 10-2 y 10-3.. Si su producto se trata de una muestra comercial realizar recuento de las diluciones 10-1 y 102. Tomar la temperatura inicial e iniciar el calentamiento. Verificar la temperatura del producto en el punto frio, a intervalos de 2 minutos, segn sea la velocidad de transmisin de calor (puede ser ms amplio o ms reducido), hasta llegar a una temperatura constante que se repita 3 o 4 veces. En este punto se toma de la muestra 1 ml para realizar otro recuento de aerobios mesfilos a partir de las diluciones 10-1 y 10-2. Se siguen con el enfriamiento rpido en agitacin y ayudados con un chorro de agua fran, hasta llevar el producto a una temperatura aproximada de 35C, siempre haciendo seguimiento de la temperatura cada 2 minutos (o segn el intervalo establecido para cada producto). En este punto se hace un ltimo recuento de aerobios mesfilos de las diluciones 10-1 y 10-2. Construir la grfica de penetracin de calor para el producto, y comparar las cargas en cada uno de los tres puntos. Determine la velocidad de penetracin de calor para cada producto y discuta el porque de los resultados. 3.6. NIVEL DE RIESGO Para el desarrollo de la presente prctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya que se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algn momento por malas prcticas de laboratorio pueden conllevar algn peligro para los manipuladores. Por tanto, todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deber usar los siguientes equipamientos: Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo, Pantaln Largo. 3.7. BIBLIOGRAFA Board, R.G. (1998). Introduccin a la microbiologa moderna de los alimentos. Editorial Acribia S.A., Zaragoza, Espaa.

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Heldman, S. (1998). Introduccin a la ingeniera de los alimentos. Editorial Acribia S.A., Zaragoza, Espaa. Ress, G.A., Bettison, J. (1994). Procesado trmico y envasado de los alimentos. Editorial Acribia S.A., Zaragoza, Espaa. Mescle, J.F., Zucca, J. (1994). El comportamiento de los microorganismos en los alimentos, la temperatura. En: Microbiologa alimentaria, volumen 1. Aspectos microbiolgicos de la seguridad y calidad alimentaria. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. Pps. 7 50. ICMSF. (2000). Temperatura, Captulo 1. En: Ecologa microbiana de los alimentos 1. Factores que afectan a la supervivencia de los microorganismos en los alimentos. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. Pps. 1 38.

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ACTIVIDAD 4. DETERMINACIN DEL VALOR D PARA CULTIVOS ASPORGENOS


4.1. OBJETIVO Al finalizar la prctica el estudiante estar en capacidad de: Comprender el efecto de la temperatura en funcin del tiempo sobre la supervivencia microbiana. Construir grficas TDT (tiempo de destruccin trmica), para diversos microorganismos, las cuales describen el comportamiento de los mismos frente a una temperatura determinada. Calcular los respectivos valores D para cada microorganismo, segn la grfica TDT construida para ellos. 4.2. MARCO TERICO La mayor parte de las bacterias patgenas tienen una tolerancia limitada a las variaciones extremas en su medio ambiente fsico y escasa capacidad para sobrevivir fuera del organismo vivo. Otras, en cambio, producen esporas que son muy resistentes a las condiciones fsicas deletreas del medio ambiente y que dotan al microorganismo de un valor incrementado de supervivencia. En el vocabulario comn se emplea la palabra esterilizacin como un absoluto que implica la inactivacin total de todas las formas de vida microbiana en trminos de la capacidad del microorganismo para reproducirse. El sufijo cida se agrega cuando se hace alusin a una accin letal, en tanto que stasis se aade cuando simplemente se trata de inhibir el desarrollo o la multiplicacin del microorganismo. 4.2.1. ndice de letalidad de los microorganismos: la informacin referida a la cintica de la destruccin de una poblacin bacteriana es esencial para comprender las bases de la esterilizacin por agentes letales. Para los microorganismos el nico criterio vlido de muerte es la prdida irreversible de la capacidad de reproducirse. Esto en general est determinado por tcnicas de siembra en placas que cuantifican, por medio de recuento de colonias, el nmero de sobrevivientes. Cuando se expone una poblacin bacteriana a un agente letal con el tiempo tiene lugar una reduccin progresiva en el nmero de microorganismos sobrevivientes. La cintica de la destruccin de una poblacin microbiana suele ser exponencial: el nmero de sobrevivientes disminuye en funcin del tiempo. Si el logaritmo del nmero de sobrevivientes se representa como una funcin del tiempo de exposicin se obtiene una lnea recta (figura 4.1) cuya pendiente
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negativa define la velocidad de destruccin. Sin embargo, el ndice germicida solo nos dice que fraccin de la poblacin inicial sobrevive a un periodo determinado de exposicin al agente antimicrobiano. Para determinar el nmero real de sobrevivientes es necesario conocer el tamao inicial de la poblacin. Esta relacin se expresa de forma matemtica por la frmula: 1

Donde, N0 = nmero inicial de microorganismos Nf = nmero final de supervivientes despus del tiempo t. Tericamente se ha descrito que la destruccin de una poblacin bacteriana sigue un orden matemtico progresivo, que obedece a un descenso exponencial (o logartmico, si se desea linealizar). Esto es comn para todas las bacterias, pero cada una de ellas difiere en su velocidad de destruccin, la cual se halla reflejada en la pendiente de la grfica. Esta velocidad ser la que determine el grado de resistencia del microorganismo a las altas temperaturas, por lo tanto sta ser diferente para cada especie bacteriana; constituyndose en una importante herramienta para la medida de la termorresistencia bacteriana. Como puede observarse en la figura 4.1, la pendiente negativa de la curva obtenida refleja la tasa de destruccin a esa temperatura en especial; pero dicha tasa es independiente del nmero inicial de bacterias y se ve influenciada por un sinnmero de factores. Figura 4.1. Grfica de la velocidad de muerte bacteriana o TDT (Thermal Destruction Time).

Log No de sobrevivientes

0 10 20 30 40 Tiempo (min)

El calor es el mtodo de esterilizacin ms confiable y el de empleo ms difundido a nivel mundial; siempre que sea posible debe ser el mtodo de eleccin. Como ocurre con otros tipos de desinfeccin, la esterilizacin de una poblacin bacteriana por calor es un proceso gradual y

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la cintica de la accin germicida es exponencial. La inactivacin de primer orden por calor significa que una fraccin constante de los microorganismos sufre un cambio qumico inactivante por cada unidad de tiempo y que cada una de esas alteraciones es suficiente para inactivar un microorganismo. El tiempo necesario para la esterilizacin es inversamente proporcional a la temperatura de exposicin. Esta relacin se puede expresar por el trmino de tiempo de muerte trmica o valor D de inactivacin trmica (McDonald y Sun, 1999; Joklik y col., 1997; Brennan et al., 1990), que se refiere al tiempo mnimo necesario para destruir una suspensin de microorganismos a una temperatura predeterminada en un medio ambiente especificado (el concepto del valor D se define como el tiempo mnimo necesario a una temperatura constante para reducir el 90% de la poblacin (Harrigan, 1998), lo cual equivale a reducir la poblacin en una unidad logartmica. Este valor D, como veremos ms adelante es equivalente al valor del inverso de la pendiente de la curva TDT). Debido a los elevados coeficientes de temperatura implicados en la esterilizacin por calor, un cambio mnimo en la temperatura altera de manera significativa el tiempo de muerte trmica. De acuerdo con la ley de accin de masas, el tiempo de esterilizacin se relaciona de forma directa con el nmero de microorganismos en la suspensin. 4.2.2. Mecanismo de la lesin trmica: la inactivacin de las bacterias por calor no puede ser definida en trminos bioqumicos simples. Aunque el efecto letal del calor hmedo por encima de una temperatura determinada en general se atribuye a la desnaturalizacin y coagulacin de las protenas, el patrn del dao trmico es bastante complejo y la coagulacin sin duda enmascara otros cambios ms sutiles inducidos en la clula antes de que se evidencie la coagulacin. La produccin de rupturas en una hebra de DNA puede ser el primer episodio letal. La prdida de viabilidad de las clulas expuestas a una temperatura suave se puede correlacionar con la introduccin de estas rupturas. El dao al DNA parece ser de naturaleza enzimtica y es una consecuencia de la inactivacin de las nucleasas. La capacidad de la clula para reparar este dao y para recuperar la viabilidad depende del estado fisiolgico del microorganismo y de su conformacin gentica. El calor tambin ocasiona una prdida de la integridad funcional de la membrana y la filtracin de pequeas molculas y de material absorbente a 260 nm. Este material es de origen ribosmico y aparentemente proviene de la degradacin de los ribosomas por ribonucleasas activadas por el tratamiento trmico. Parece existir una correlacin entre la degradacin del RNA ribosmico y la prdida de viabilidad de las clulas expuestas a temperaturas elevadas. El mecanismo por el cual los microorganismos resultan destruidos por el calor seco es diferente al del calor hmedo. Los efectos letales del calor seco, o la desecacin en general, habitualmente se atribuyen a la desnaturalizacin proteica, al dao por oxidacin y a los efectos txicos de elevadas concentraciones de electrolitos. En ausencia de agua el nmero de grupos polares sobre las cadenas peptdicas disminuye y se requiere ms energa para abrir las

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molculas; de ah el aumento aparente de la estabilidad del microorganismo. En la tabla 4.1 se ilustran los tiempos mnimos necesarios para lograr una adecuada esterilizacin a distintas temperaturas y formas de calor, tanto hmedo como seco. Tabla 4.1. Tiempos mnimos requeridos para la esterilizacin por calor hmedo y calor seco a diferentes temperaturas. Calor hmedo Calor seco Temperatura (C) 121 126 134 140 150 160 170 Fuente: Joklik y col., 1997. Cuando se habla de termorresistencia, el arma principal con que se cuenta para inferir que tan susceptible es un microorganismo a un tratamiento trmico, es la grfica TDT o curva del tiempo de destruccin trmica; en la cual se verifica la poblacin de bacterias en funcin del tiempo de duracin de un proceso trmico, que se hace necesario se realice a una temperatura constante. La pendiente de la curva obtenida refleja la tasa de destruccin a esa temperatura en especial; pero dicha tasa es independiente del nmero inicial de bacterias y se ve influenciada por un sinnmero de factores. A partir de sta grfica surge un concepto que servir de parmetro para medir la termorresistencia de microorganismos, y es el tiempo de reduccin decimal o valor D, definido como el tiempo necesario para destruir el 90% de la poblacin total de bacterias (Rahman et al., 2004); lo cual equivale a reducir la poblacin en una unidad logartmica. Este valor D, como veremos ms adelante es equivalente al valor del inverso de la pendiente de la curva TDT. Debido a que cada ensayo para evaluar o determinar un valor D, se hace a una temperatura constante; sta temperatura debe indicarse como un subndice, as por ejemplo, valor D215F = 5 minutos, lo que quiere decir que el valor corresponde a 215F. Para hallar este valor, trabajamos con la ecuacin de la recta, especficamente con su pendiente, porque en estos trminos D, equivale al inverso de la pendiente de la grfica obtenida, as: Tiempo (min) 15 10 3 Presin (lb) 15 20 30 Tiempo (min) 180 150 120 60

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D=

1 ; m

m=

1 D

Ntese el signo negativo como una compensacin ya que la pendiente en todos los casos ser negativa, y por tanto el tiempo de reduccin positivo. La grfica TDT clsica, que se obtiene al realizar un estudio de termorresistencia a un microorganismo cualquiera, es la siguiente (Figura 4.2): Figura 4.2. Grfica TDT.
Log # m.o 7 6 5

b (punto de corte con el eje y) (xa; ya) y x


Y = mx + b y = -x/D + b

log a 4 log b 3
2 1 0 0 5

(xb; yb)

10

15

20

25

30

35

ta

tb
Tiempo (min)

De la figura 4.2 se infiere que:


m= y x

m=

yb ya xb xa

Donde m es la pendiente de la grfica TDT, la cual equivale a la razn existente entre un diferencial de valores en el eje y y el mismo diferencial en el eje x, los cuales estn delimitados por los puntos (xa;ya) y (xb;yb). Esta pendiente se puede, tambin, expresar de la siguiente forma: log b log a m= (4.1) tb ta Ahora, como tenemos que la pendiente (que siempre ser negativa, en estos casos) es igual al inverso del valor D, podemos reemplazar as:
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m=

1 D

(4.2)

1 log b log a = (4.3) D tb ta Despejando D, obtenemos: (1) * (tb ta ) D= (4.4) log b log a Donde (tb ta), es considerado como el tiempo en que la poblacin inicial que tena una concentracin de log a, se redujo a una poblacin final con una carga de log b; sta diferencia de tiempo, es decir, el tiempo en que disminuir el nmero de microorganismos desde una poblacin conocida hasta una poblacin final estipulada y debido a que siempre ser una diferencia as est como un producto se conoce como t. Este t, se puede hallar si se conoce el valor D del microorganismo en estudio, as (debemos recordar que t es negativo en la ecuacin del valor D, ya que se trata de un diferencial: tb ta): t D= (4.5) (log b log a )

Entonces,

O lo que es lo mismo:
t = D * (log a log b)

(4.6)

Ntese que en la anterior ecuacin el diferencial de la poblacin se ha invertido, de tal forma que el diferencial de tiempo es positivo. Si la diferencia de poblaciones log a log b es igual a uno, entonces el valor D ser igual a la duracin del tratamiento trmico t, as: D=
t ; es decri: D = t 1

(4.7)

En una grfica TDT, la recta tericamente, se puede prolongar por debajo del eje x, hasta la zona de los negativos en el eje y, as por ejemplo, luego de a minutos de proceso la curva se ubicar en el punto -2. Si lo anterior llega a suceder, debe interpretarse estadsticamente en trminos de probabilidad; es decir: Antilog de 2: log 1 2 = 0,01 Esto no indica que una centsima parte de una bacteria o endospora por gramo o mililitro ha sobrevivido en la muestra, como sera de suponer matemticamente; lo que esta cifra quiere decir, es que a esa temperatura y durante ese tiempo, existe la posibilidad de que en 100 g de producto, sobreviva una bacteria o endospora. De tal manera que cuando la grfica llega en el eje y hasta 3, una bacteria sobrevivir en 1000 g del producto.

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Por lo anterior es evidente que la poblacin no puede nunca quedar reducida a cero, de lo que se infiere que si se somete cierto nmero de recipientes conteniendo una poblacin conocida, a un determinado tratamiento trmico, siempre existir la probabilidad de supervivencia de al menos un microorganismo en alguna lata. Estos hechos son muy tiles en la elaboracin de los clculos del diseo de un tratamiento trmico, para un producto en especial que va a ser sometido a una appertizacin. Si bien el tiempo de reduccin decimal (valor D) resulta til como parmetro para evaluar la termorresistencia microbiana, presenta una serie de limitaciones, y entre ellas la ms importante es que restringe ver la supervivencia de los microorganismos frente a una sola temperatura, que es la que permanece constante durante el ensayo. Esta limitante conduce a la formulacin de un nuevo parmetro de termorresistencia denominado valor z, el cual permite realizar un seguimiento ms global del comportamiento microbiano durante diferentes temperaturas. As, si se conocen por lo menos dos valores de termorresistencia es posible determinar este nuevo valor como veremos en la siguiente actividad.

4.2.3. Determinacin del valor D para cultivos asporgenos por el mtodo de los tubos mltiples o de Bigelow: Este mtodo desarrollado por Bigelow en 1923 es denominado el mtodo de los tubos TDT consiste en la determinacin del nmero de supervivientes para cada intervalo de tiempo de exposicin a la temperatura de proceso, obteniendo as un recuento final para cada tiempo, y posteriormente graficando dichos recuentos en trminos de log10 versus tiempo. Se calcula la pendiente y el inverso de la misma corresponde al valor D del cultivo. Diluir un caldo de cultivo de 24 horas (por ejemplo de Escherichia coli), para obtener un recuento total alrededor de 3x108 clulas por ml. (Esto puede ser determinado por conteo microscpico, o por nefelometra o por la opacidad de tubos (McFarland) si estos han sido calibrados usando conteos microscpicos. Colocar 10 ml de esta dilucin en 90 ml de diluyente estril (por ejemplo agua peptonada al 0,1%) contenido en un recipiente de vidrio. Agitar bien para mezclar y romper los posibles agregados. Distribuir cantidades de 5 ml en 5 tubos de ensayo estriles de 150 x 16 mm (preferiblemente con tapa de rosca o de polipropileno). Colocar simultneamente los tubos preparados anteriormente en un bao de agua a 58C con un tubo control de temperatura conteniendo un termmetro y 5 ml de diluyente. Cuando la temperatura del contenido del tubo control alcance 1C por debajo de la temperatura del bao, remueva uno de los tubos (t0) e inmediatamente iniciar el conteo de tiempo desde este momento. Rpidamente enfriar el tubo removido en agua refrigerada. Preparar seis diluciones decimales y realizar un recuento total en placa con todas estas diluciones. Retirar otro tubo y repetir el paso 4 despus de cada una de los siguientes tiempos: 2 minutos, 5 minutos, 7 minutos y 10 minutos.
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Incubar las placas a 35C 2C durante 24 48 horas y determinar el nmero de supervivientes despus de varios periodos de calentamiento. Dibujar un grfico del log10 (nmero de supervivientes) contra el tiempo. A partir de este determine el D58C (en minutos) como el inverso de la pendiente de la mejor lnea de ajuste (Coeficientes de regresin R2 y de correlacin R) (Ver ejemplo en tabla 4.2. y figura 4.3a y 4.3b.).

Ejemplo determinacin del valor D por el mtodo de los tubos TDT: Tabla 4.2. Ejemplo del recuento de supervivientes a 58C durante 10 minutos. Recuento supervivientes Tiempo (minutos) 0 2 5 7 10 UFC/ml 10000000 6900000 540000 23000 1000 Log10 UFC/ml 7,00 6,84 5,73 4,36 3

Figura 4.3a. Grfica TDT para la determinacin del valor D del ejemplo de la tabla 4.2.
8,00 7,00 6,00 Log10 ufc/ml 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0 2 4 6 Tiempo (min) 8 10 12

m = -0,4191 R2 = 0,9481 R = 0,9737

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Figura 4.3b. Grfica TDT para la determinacin del valor D del ejemplo de la tabla 4.2.
8,00 7,00 6,00 Log10 ufc/ml 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0 2 4 6 Tiempo (min) 8 10 12

m = -0,5155 R2 = 0,9976 R = 0,9988

Tal y como puede verse en la figura 4.3a el coeficiente de correlacin para todos los datos de supervivientes vs tiempo es de 0,9737 mientras que para los datos de la figura 4.3b (tiempos 2 hasta 10 min) dicho valor fue 0,9988. De acuerdo con lo anterior, el valor D se establecer como el recproco de la pendiente para la figura 4.3b; correspondiendo este valor D58C a 1,94 minutos. 4.2.4. Determinacin del valor D por el mtodo de presencia ausencia o de Halvorson y Ziegler: Tambin existe otra metodologa para calcular el valor D en aquellos casos donde, se emplee un mtodo semi-cuantitativo (Nmero ms Probable). Para dicho procedimiento se empleara una serie de tubos expuestos a diferentes temperaturas y tiempos, para posteriormente incubarlos y determinar ausencia o presencia de crecimiento. Esta tcnica fue descrita por Halvorson y Ziegler en 1933, la cual es ampliamente utilizada en Termobacteriologa. Cuando una gran cantidad de unidades de un lote que contienen N0 de microorganismos vivos se somete a un tratamiento letal, la letalidad del tratamiento es medida por comparacin del N0 y el nivel de organismos supervivientes Ns. De acuerdo con Halvorson y Ziegler (1933) el nmero promedio esperado de microorganismos por unidad experimental [sometidos a tratamientos letales o no] puede ser calculado solo si una fraccin de las unidades experimentales [tubos, latas, tarros, frascos, etc.] es estril, es decir, no contiene organismos vivos. La relacin de Halvorson y Ziegler [Hz] para determinar el nmero de supervivientes es la siguiente (ecuacin 4.8a y 4.8b):

2,303 (4.8a)

Donde P0 = relacin entre el nmero total de muestras sometidas a calentamiento (n) y el nmero total de muestras sin crecimiento (r). Reemplazando n y r en P0, tenemos la siguiente expresin:

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2,303 (4.8b)
Donde: n = nmero total de muestras sometidas a calentamiento r = nmero de muestras sin crecimiento Hz = nmero promedio esperado de microorganismos/unidad de muestra, cuando la fraccin de muestras estriles [es decir, los que no presentaron crecimiento] es igual a Po. Para este tipo de ensayo es necesario conocer la poblacin inicial antes de iniciado el tiempo de sostenimiento del calentamiento. Despus de obtener el Hz para cada tiempo se calcula el valor D para la temperatura en cuestin con la ecuacin 4.9 (la cual es una modificacin de la ecuacin 4.4).
(4.9) La ecuacin 4.9 tiene una aplicacin muy amplia en Termobacteriologa, donde usualmente muchas unidades simples [tubos, tubos capilares, viales, frascos, latas, etc.] se someten de una a un tratamiento trmico y la supervivencia se mide por la frecuencia de alteracin de las unidades almacenadas y sin abrir despus de un tiempo y temperatura adecuada. Esta tcnica es muy valiosa porque permite evaluar la probabilidad de supervivencia a un tratamiento dado en el mismo sustrato donde se aplica la condicin letal. Es decir que refleja lo que ocurre en la prctica.

El mtodo: Diluir un caldo de cultivo de 24 horas (por ejemplo de Escherichia coli), para obtener un recuento total alrededor de 3x108 clulas por ml. (Esto puede ser determinado por conteo microscpico, o por nefelometra o por la opacidad de tubos (McFarland) si estos han sido calibrados usando conteos microscpicos. Colocar 10 ml de esta dilucin en 5 sets de 5 tubos de ensayo estriles de 150 x 16 mm (preferiblemente con tapa de rosca o de polipropileno) cada uno. Adicionalmente colocar 10 ml de la dilucin de trabajo en otro tubo de ensayo estril y marcarlo como N0. Colocar simultneamente los tubos preparados anteriormente en un bao de agua a 58C con un tubo control de temperatura conteniendo un termmetro y 10 ml de diluyente. Cuando la temperatura del contenido del tubo control alcance 1C por debajo de la temperatura del bao, remueva uno de los sets de 5 tubos (t0) e inmediatamente iniciar el conteo de tiempo desde este momento. Al mismo tiempo retire el tubo marcado como N0 y enfriar todos los tubos removidos en agua refrigerada. A partir del tubo N0 preparar seis diluciones decimales y realizar un recuento total en placa con todas estas diluciones, de esta forma determinamos la poblacin al inicio del calentamiento.

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Retirar otro set de 5 tubos despus de cada una de los siguientes tiempos: 2 minutos, 5 minutos, 7 minutos y 10 minutos. Incubar tanto las placas como los 5 sets de 5 tubos a 35C 2C durante 24 48 horas. Con los recuentos obtenidos en las placas calcular la poblacin inicial (t0). Determinar para cada set de tubos en cuntos de ellos se presenta crecimiento (turbidez) y en cuntos de ellos no hay crecimiento. A partir de la ecuacin 4.8 determine la relacin Hz para cada tiempo, y con estos datos cuantifique el valor D58C (en minutos) a travs de la ecuacin 4.9.

Con los datos ilustrados en la tabla 4.3., vamos a calcular el valor D con este segundo mtodo. Tabla 4.3. Ejemplo para el clculo del valor D por el mtodo de Halvorson y Ziegler.
Temperatura (C) Tiempo de calentamiento (min) 0 2,5 58 5 7,5 10 Nmero de tubos Calentadas 5 5 5 5 5 Crecimiento 5 4 3 2 1 Ausencia 0 1 2 3 4

Para el clculo del valor D vamos a partir con el supuesto de que la poblacin inicial (tubo N0) es 1*107 ufc/ml (7,00 log10 ufc/ml). Para el tiempo 0 minutos se obtuvo 5 tubos con crecimiento (P0 = 5/5). Para el tiempo 2,5 minutos se obtuvo 4 de 5 tubos con crecimiento (P0 = 5/1). Para el tiempo 5 minutos se observa que 3 de 5 tubos presentaron crecimiento (P0 = 5/2). Para el tiempo 7,5 minutos se observa que 2 de 5 tubos presentaron crecimiento (P0 = 5/3). Para el tiempo 10 minutos se observa que 1 de 5 tubos presentaron crecimiento (P0 = 5/4).

5 , 2,303 1
Hz (2,5min) = 1,61

5 2,303 2
Hz (5min) = 0,917

5 , 2,303 3
Hz (7,5min) = 0,511

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5 2,303 4
Hz (10min) = 0,223 En segundo lugar, procedemos a calcular el log10 para cada Hz: Log10Hz (2,5min) = 0,207 Log10Hz (5min) = -0,038 Log10Hz (7,5min) = -0,292 Log10Hz (10min) = -0,652 Para calcular el valor D usaremos la ecuacin 4.9 para el primer intervalo de tiempo. 2,5 min 0 min 10000000 1,61 2,5 min 7 0,207

0,368 Repetimos la operacin anterior con cada intervalo de tiempo faltante: 5 0 0,71 7 0,038 7,5 0 1,03 7 0,292 10 0 1,31 7 0,652

4.3. MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS 30 tubos con 9 ml de caldo BHI (opcional agua peptonada estril 0.1%). 2 fiolas con 99 ml de caldo BHI 1120 ml de agar BHI fundido y mantenido a una temperatura de 55C. Cepas de bacterias mantenidas a 35C en caldo BHI (en fase exponencial). 56 cajas de petri estriles. 40 pipetas estriles de 1 ml. 2 pipetas de 5 ml estril. 2 Baos serolgicos ajustados a diferentes temperaturas.

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4.4. REACTIVOS Patrn de McFarland No 0,5. Cepas de bacterias mantenidas a 35C en caldo BHI (en fase exponencial). 4.5. PROCEDIMIENTO A partir de la cepa mantenida en caldo BHI se prepara una solucin patrn 0,5 de McFarland (equivalente a una poblacin terica de 1,5x108 bact/ml). A partir del patrn se toma una alicuota de 11 ml que se suspende y homogeniza en 99 ml de solucin diluyente para disminuir 10 veces la concentracin y preparar una suspensin de una poblacin terica aproximada de 1,5x107 bact/ml. Se pasa 1 ml exacto de la suspensin, previamente homogenizada, a cada uno de los 6 tubos con 9 ml de agua peptona estril. De sta manera reducimos 10 veces la anterior poblacin, es decir que supuestamente cada tubo tendr una concentracin de 1,5x106 bact/ml. Cada tubo se rotula con 9, 18, 27, 36, 45 y 54 minutos. Se toma el tubo rotulado para 9 minutos, y se le realiza un recuento inicial para verificar la concentracin de las suspensiones. El recuento se hace de la dilucin 103, por duplicado en agar BHI. En un bao serolgico, mantenido a una temperatura constante, indicada por el profesor para cada microorganismo, se introducen los 6 tubos, manteniendo la temperatura constante. Transcurridos los primeros 9 minutos, se toma el respectivo tubo, con la debida asepsia, y se le realiza el correspondiente recuento de la siguiente manera: se lleva hasta la dilucin 10-1, tomndose 1 y 0,1 ml para inocular en las placas de Petri estriles, cubriendo con agar BHI fundido. El procedimiento anterior se repite para cada tubo cuando se cumpla el tiempo respectivo de exposicin a la temperatura indicada. Se incuban las placas durante 24 48 horas a 37C, segn el microorganismo a ensayar. Se hace la lectura correspondiente y se construye la grfica para especificar el valor D del mismo. 4.6. NIVEL DE RIESGO Para el desarrollo de la presente prctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya que se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algn momento por malas prcticas de laboratorio pueden conllevar algn peligro para los manipuladores. Por tanto, todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deber usar los siguientes equipamientos: Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo, Pantaln Largo.

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4.7. BIBLIOGRAFA Brennan, J.G., Butters, J.R., Cowell, N.D. (1990). Heat processing 2. In: Food Engineering Operations, Elsevier, UK, pp 297-302. Mescle, J.F., Zucca, J. (1994). El comportamiento de los microorganismos en los alimentos, la temperatura. En: Microbiologa alimentaria, volumen 1. Aspectos microbiolgicos de la seguridad y calidad alimentaria. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. Pps. 7-50. ICMSF. (2000). Temperatura, Captulo 1. En: Ecologa microbiana de los alimentos 1. Factores que afectan a la supervivencia de los microorganismos en los alimentos. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. Pgs. 1-38. Rahman, S.M., Guizani, N., Al-Ruzeiki, M.H. (2004). D- and Z-values of microflora in tuna mince during moist- and dry-heating. Lebensm.-Wiss, u.-Technol., 37: 93-98. Harrigan, W.F. (1998). Chapter 12, Section 12.4: Effect of heat on microorganisms: the determination of decimal reduction times (D values) and z values. In: Laboratory Methods in Food Microbiology. 3rd Edition. Academic Press, San Diego, California, USA. Pgs. 123127. Halvorson, H.O., Ziegler, N.R. (1933). Applications of statistics to problems in bacteriology. I. A means of determining bacterial populations by the dilution method. Journal of Bacteriology, 25: 101-121.

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ACTIVIDAD 5. DETERMINACIN DEL VALOR z PARA CULTIVOS ASPORGENOS POR EL MTODO DE LA FRACCIN NEGATIVA DE BROWN (Ausencia Presencia)
5.1. OBJETIVO Al finalizar la prctica el estudiante estar en capacidad de: Determinar el respectivo valor z del microorganismo asignado y compararlo con las referencias bibliogrficas. Manejar y emplear el valor z como otra herramienta de medida de la termorresistencia bacteriana, que complementa al valor D. Examinar diferentes estrategias existentes para hallar el valor z para un microorganismo y explorar los clculos para su determinacin 5.2. MARCO TERICO Con el devenir de la termobacteriologa se ha hecho necesario el empleo de ms y diferentes herramientas para el manejo y cuantificacin de la termorresistencia de un microorganismo. De sta manera, y como hemos comentado en la actividad anterior, se observa que el tiempo de reduccin decimal (valor D) como parmetro para evaluar la termorresistencia bacteriana, presenta una serie de limitaciones, y entre ellas la ms importante es que restringe ver el comportamiento de la bacteria nicamente con respecto a una sola temperatura, que es la que permanece constante durante el ensayo. Esto genera una necesidad de crear o utilizar otro parmetro de cualificacin y cuantificacin ms amplio. Para realizar un seguimiento ms global, es decir, observar el comportamiento del microorganismo durante diferentes temperaturas; se llega a construir una grfica donde se confrontan: la "termorresistencia" medida en tiempo (valor D, en minutos) en escala logartmica (porque su comportamiento es exponencial), contra las temperaturas a las que corresponde cada tiempo de reduccin decimal. Esta grfica, nuevamente, se comporta como una recta y nos muestra como vara la termorresistencia (valor D) del microorganismo a medida que aumenta o desciende la temperatura, de tal manera que nos da una visin del comportamiento general de la bacteria con respecto a todo un espectro de temperaturas. Esta lnea recta genera una pendiente que nos indica la tasa con la cual disminuye la termorresistencia (o podramos hablar en trminos de que su termosensibilidad aumenta), segn aumenta la temperatura a la que se expone.

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A partir de sta pendiente se deriva un ndice, que nos servir como otra herramienta para evaluar la termorresistencia bacteriana, que al igual que el valor D, equivale al inverso de la pendiente de la curva. Este ndice se conoce como Valor z o Constante de Resistencia Trmica y se define, como la cantidad de calor (medida en F o C) que debe ser aumentado necesaria para que la termorresistencia (medida en minutos, unidades del valor D), disminuya 10 veces; o dicho de otra manera, es el nmero en F o C que se necesita para que la curva mencionada anteriormente, atraviese un ciclo logartmico, o que el tiempo de reduccin decimal disminuya un 90% (ver figura 5.1). Figura 5.1. Grfica TDT para determinacin del valor z. Log Tiempo (log D)
Log Da y Log Db

Y = mx + b

Tb Temperatura (F o C) La construccin de sta curva puede llevarse a cabo, como se ve es ms factible, realizando diferentes estudios de termorresistencia a diversas temperaturas, para determinar los correspondientes valores D, y posteriormente con estos datos construir la grfica, corregirla estadsticamente, hallar su pendiente y determinar el correspondiente valor z, el cual es diferente para cada microorganismo. A pesar de presentar una gran confiabilidad y ser ms exacto, ste procedimiento implica tiempo y dinero. Como podemos apreciar en la figura 5.1. la pendiente ser igual a: y m= x Ta m=
log Db log Da T b T a

(5.1a)

Donde IogDb representa el logaritmo base 10 del valor D obtenido (en minutos) en un ensayo a la temperatura a. Debido a que la pendiente es el trmino que genera el valor z, tenemos que:

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z= De donde, podemos obtener que:

1 m

(5.1b)

1 log Db log Da = z T b T a

(5.2)

Despejando z, obtenemos
Z= (1) * (T b T a ) (log Db log Da )

(5.3, descrita por Van Asselt y Zwieterin, 2006)

Donde (Tb Ta) es el rango de temperatura en el cual el valor D desciende desde Da hasta Db, y dado que sta expresin a pesar de la introduccin del trmino (-1) no deja de ser una diferencia, se considera como una T, cuya ecuacin seria: T z= (5.4) (log Db log Da ) Esta diferencia de temperaturas, puede llegar a equivaler al valor z, siempre y cuando Db sea 10 veces menor que Da , ya que entonces la diferencia logartmica sera de 1, as : (log Db log Da) = 1 , y, dado que.

T = z * (log Db log Da) (5.5)


Tendremos lo siguiente:
T = z

(5.6)

El mtodo: Existe un procedimiento mucho ms corto y sencillo, pero menos exacto, aunque preciso, ya que, podramos decir, es semi cuantitativo (no se basa en recuentos totales para cada tiempo). Este mtodo se conoce con el nombre de la fraccin negativa de Brown o "Presencia Ausencia" del crecimiento de microorganismos y se basa en la exposicin de un nmero determinado de tubos con un medio de cultivo lquido con la misma concentracin del microorganismo, a una temperatura determinada por varios periodos de tiempo. Estos tubos se exponen, como ya se coment, durante un tiempo dado, existiendo diversos tiempos estimados y cada grupo de tiempos corresponden a una determinada temperatura, ensayndose varias temperaturas al mismo tiempo. En este procedimiento, en especial, se tienen en cuenta los tiempos lmite a los cuales los tubos expuestos dejan de presentar crecimiento.
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En la tabla 5.1, se ofrece un ejemplo obtenido con Clostridium sporogenes (PA 3679), en el que se emplearon 6 tubos por cada tiempo y se ensayaron 6 tiempos de exposicin por cada temperatura trabajada. Tabla 5.1. Resultados obtenidos para la determinacin del valor Z de Cl. sporogenes (PA 3679) por el mtodo ausencia-presencia.
Temperatura (F) Tiempo de calentamiento (min) 25 40 230 60 80 110 140 10 14 240 18 22 28 36 3 4 250 5,5 7,5 10 13 Nmero de muestras Calentadas 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Positivas 6 6 6 5 0 0 6 6 6 2 0 0 6 6 2 0 0 0

As, en este ejemplo, a 230F se observa que al finalizar los 110 minutos no existe supervivencia en ningn tubo, pero s la hay, luego de 80 minutos de calentamiento a la misma temperatura; de tal manera que el tiempo exacto de destruccin trmica es superior a 80 minutos pero inferior a 110, sin tener un sealamiento exacto entre estos dos datos. Para representar esto, los datos obtenidos se ubican en el plano cartesiano que relaciona el logaritmo del tiempo de exposicin contra las temperaturas ensayadas; de sta manera, se ubican los dos tiempos correspondientes a la misma temperatura, procediendo de igual modo con cada temperatura ensayada, tal como se aprecia en la grfica 5.2.

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Para hallar el valor z, se puede recurrir a varios procedimientos; uno que consiste en trazar una lnea recta sobre todos los puntos originados por los datos que se encuentran por encima del ptimo y otra recta por todos los puntos que se encuentren debajo, trazando un recta final que pasar por el centro de todos los puntos y la cual ser la que se tome como referencia para hallar z (como se aprecia en la figura 5.2). El otro procedimiento es ms fiable, y consiste, en hallar el punto medio de los dos datos de tiempo obtenidos y con esos puntos medios trazar una nica recta, que servir de referencia para determinar su pendiente y el correspondiente valor z, como se observa en la figura 5.3. Figura 5.2. Grfica TDT para determinacin del valor z por el mtodo ausencia presencia (trazando las rectas para cada punto).
2,10 1,90 1,70 1,50 1,30 1,10 0,90

Log10 tiempo (min)

A
0,70 110 112 114 116 Temperatura (C) 118 120 122

De la grfica anterior podemos observar que: Para una temperatura de 110C se grafican los tiempos (en unidades log10) 2,04 y 1,90 min (que corresponden a los tiempos de 110 min y 80 min del ejemplo anterior), para luego ubicar un punto medio entre los dos tiempos. Para la temperatura de 115C se grafican los tiempos 1,45 y 1,34 min (correspondientes a los tiempos 28 min y 22 min). Para la temperatura de 121C se grafican los tiempos 0,88 y 0,74 (que corresponden a los tiempos 7,5 min y 5,5 min).

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Figura 5.3. Grfica TDT para determinacin del valor z por el mtodo ausencia presencia (empleando el punto medio de los datos).
2,10 1,90 1,70 1,50 1,30 1,10 0,90

Log10 tiempo (min)

B
0,70 110 112 114 116 118 120 122

Temperatura (C) y = -0,1056x + 13,571 R = 0,9977

De la grfica 5.3 podemos observar que: Para una temperatura de 110C se ubican los tiempos (en unidades log10) 2,04 y 1,90 min (que corresponden a los tiempos de 110 min y 80 min del ejemplo anterior), para luego graficar el punto medio entre los dos tiempos (log10 1,97 min). Para la temperatura de 115C se ubican los tiempos 1,45 y 1,34 min (correspondientes a los tiempos 28 min y 22 min), para luego graficar el punto medio entre los dos tiempos (log10 1,40 min). Para la temperatura de 121C se ubican los tiempos 0,88 y 0,74 (que corresponden a los tiempos 7,5 min y 5,5 min), para luego graficar el punto medio entre los dos tiempos (log10 0,81 min). Con estos datos se calcula la pendiente por el mtodo de mnimos cuadrados o si se dispone de un software de clculo, se emplea una tcnica de regresin lineal para obtener el valor de la pendiente. Con el dato de la pendiente, se procede a calcular el valor z empleando la ecuacin 5.1b, lo que nos da para este ejemplo un valor z de 9,52 C. Tambin existe otra metodologa para calcular el valor z en aquellos casos que, despus de la exposicin de los tubos a diferentes temperaturas y tiempos no se logra obtener intervalos con ausencia total de crecimiento, pero si se observan tubos con ausencia y presencia del mismo. En este caso se puede trabajar con un mtodo del Nmero Ms Probable de supervivientes estimando el valor D para cada temperatura ensayada, a travs de la relacin de Halvorson y Ziegler (1933) y la ecuacin 5.7 modificada de la ecuacin del valor D. Para este tipo de ensayo

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es necesario conocer la poblacin inicial antes de iniciado el tiempo de sostenimiento de la temperatura.

2,303 (5.7)
Donde: Hz = Nmero ms probable de supervivientes n = Nmero de tubos o muestras calentadas r = Nmero de tubos o muestras sin crecimiento Despus de obtener el Hz para cada temperatura se calcula el valor D para la misma (ecuacin 5.8), y posteriormente se calcula el valor z graficando el Log10D vs Temperatura. En esta grfica se obtiene la pendiente y posteriormente con la ecuacin 5.1b se estima el valor z. 5.8 Con los datos ilustrados en la tabla 5.1., vamos a calcular el valor z con este segundo mtodo, y suponiendo que partimos de una poblacin inicial de 1,5*107 esp/ml (7,176 log10bact/ml). Para una temperatura de 110C, despus de 80 minutos de proceso se observa que 5 de los 6 tubos presentaron crecimiento. Para una temperatura de 115C, despus de 22 minutos de proceso se observa que 2 de 6 seis tubos presentaron crecimiento. Para una temperatura de 121C, despus de 5,5 minutos de proceso se observa que 2 de 6 seis tubos presentaron crecimiento.

6 2,303 1
Hz (110C) = 1,792

6 2,303 4
Hz (115C) = 0,406

6 2,303 4
Hz (121C) = 0,406 En segundo lugar, procedemos a calcular el valor D aproximado para cada temperatura: Log10Hz (110C) = 0,253 Log10Hz (115C) = -0,392 Log10Hz (121C) = -0,392

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80 0 11,56 7,176 0,253 22 0 2,91 7,176 0,392 5,5 0 0,73 7,176 0,392

Como tercer paso, graficamos el Log10D vs Temperatura, hallamos la pendiente y calculamos el valor z. Figura 5.4. Grfica TDT para determinacin del valor z por el mtodo nmero ms probable.
1,20 1,00 0,80 Log10 D (min) 0,60 0,40 0,20 0,00 108 -0,20 110 112 114 116 118 120 122 Temperatura (C) y = -0,1081x + 12,949 R = 1

Con los datos de la pendiente se procede a calcular el valor z empleando la ecuacin 5.1b, lo que nos da para este ejemplo un valor z de 9,25 C. Como podemos apreciar, este valor z es muy aproximado al obtenido por el mtodo de la fraccin negativa de Brown. Como ya hemos visto, el valor z es definido como el nmero de grados que la temperatura tiene que subir (o bajar) para lograr una reduccin (aumento) del 90% en el valor D, o para que el valor D disminuya (o aumente) por un factor de 10 veces. La forma ms comn de calcularlo es a travs de la ecuacin 5.4. o 5.1b.

Sin embargo, la representacin que se utiliza con mayor frecuencia entre los industriales es una representacin del valor D basado en el modelo de Arrhenius, el cual se trata de un modelo
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usado inicialmente en cintica qumica para describir la influencia de la temperatura en la constante de velocidad de reaccin enzimtica (Singh y Heldman, 1997); sin embargo, este modelo se ha empleado en aquellos casos donde se quiera evaluar la influencia de la temperatura sobre la velocidad de reaccin, en este caso se relaciona el logaritmo neperiano de D en funcin de la inversa de la temperatura absoluta (en grados Kelvin K). En esta grfica la exactitud es tan buena o mejor que la de la ecuacin del valor z descrita anteriormente, con la ventaja de que en la recta de Arrhenius uno puede hacer ligeras extrapolaciones y en la de la ecuacin del valor z el hacerlo resultara en una imprudencia (Cerf et al., 1988). La pendiente en la recta de Arrhenius es igual a Ea/R; Ea es la energa de activacin (expresada en J/mol) y R la constante de los gases ideales (8,314 J/molK). Existe una relacin sencilla entre Ea y z:
19,15

5.9

La ecuacin anterior puede utilizarse usando un valor de T que corresponda a la temperatura absoluta media experimental. Con los datos del ejemplo anterior vamos a calcular z empleando la cintica de Arrhenius. En este caso la temperatura de referencia a usar es la correspondiente al valor promedio de las temperaturas ensayadas ((110C + 115C + 121C) / 3 = 115,5C), la cual la expresaremos en trminos de temperatura absoluta: 388,5K. Procedemos a graficar el LnD vs 1/TA (1 sobre las temperaturas absolutas para cada valor D) (Figura 5.5). Posteriormente hallamos la pendiente y procedemos a calcular la energa de activacin (Ea), sabiendo que esta es igual al producto de la pendiente por la constante de los gases ideales; en este caso la Ea = 312288,2 J/mol. Figura 5.5. Grfica del LnD vs 1/TA empleando la cintica de Arrhenius para la determinacin del valor z.
3 2,5 2 LnD (min) 1,5 1 0,5 0 0,00252 -0,5 0,00254 0,00256 0,00258 0,0026 0,00262 y = 37561x - 95,621 R = 1

1/Temperatura (K)

Finalmente reemplazamos los datos en la ecuacin de Arrhenius y hallamos z.

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388,5 19,15 312288,2

9,26

En este caso vemos que el resultado es muy similar al obtenido con el mtodo de Halvorson y Ziegler. Con los dos ltimos mtodos se obtienen regresiones con mejor ajuste (en este caso ambos con R2 = 1), sin embargo, por experiencia el mtodo de Arrhenius es el que mejor bondad presenta y de all la razn de su uso mayoritario en la industria. 5.3. MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS (por grupo de laboratorio) Cepas de bacterias mantenidas a 35C en caldo nutritivo o BHI (en fase exponencial). 3 pipetas estriles de 1 ml. 1 pipeta de 5 ml estril. 3 Baos serolgicos ajustados a diferentes temperaturas. 5.4. REACTIVOS 30 tubos con 9 ml de caldo nutritivo estril (puede usarse tambin caldo BHI). 1 fiola con 99 ml de caldo nutritivo o BHI Patrn de McFarland No 0,5. 1 tubo con 9 ml de agua peptonada 0,1%. 5.5. PROCEDIMIENTO Se prepara una suspensin bacteriana equivalente a un patrn N 0,5 de McFarland. A partir del patrn se toma una alcuota de 11 ml que se suspende y homogeniza en 99 ml de solucin diluyente para disminuir 10 veces la concentracin y preparar una suspensin de una poblacin terica aproximada de 1,5x107 bact/ml. Se pasa 1 ml exacto de la suspensin de 107 bact/ml, previamente homogenizada, a cada uno de los 30 tubos que contienen 9 ml de caldo nutritivo estril (se puede usar tambin BHI), de sta manera reducimos 10 veces la anterior poblacin. Cada grupo de laboratorio trabajar en una temperatura determinada, para la cual se ensayarn 6 tiempos, los cuales sern indicados por el instructor, segn la temperatura y el microorganismo a probar. Para cada tiempo se emplearn 5 tubos de ensayo, por lo cual cada grupo trabajar en total con 30 tubos. Toda la clase trabajar en conjunto para determinar el valor Z a un microorganismo, repartindose a los grupos una cepa del microorganismo y a cada grupo una temperatura diferente. Las temperaturas a trabajar sern indicadas por el instructor, de tal manera que un grupo de laboratorio trabajar con la misma temperatura. En caso de trabajar con dos microorganismos, dos grupos tendrn la misma temperatura pero un microorganismo diferente (pensado para 6 o ms grupos).

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Se exponen los 5 tubos a calentamiento a temperatura constante durante el tiempo estimado, repitiendo la misma metodologa para cada tiempo de exposicin. Se dejan enfriar a temperatura ambiente. Se incuban a 37C durante 24 48 horas, y se realiza la lectura, confrontando la turbidez frente a un tubo con caldo nutritivo o BHI (segn el caldo empleado) patrn que estar sin sembrar. De esta forma se determina la turbidez de los tubos, signo de la existencia de microorganismos sobrevivientes al tratamiento trmico. Realizar la grfica y los clculos correspondientes para hallar el valor Z. 5.6. NIVEL DE RIESGO Para el desarrollo de la presente prctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya que se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algn momento por malas prcticas de laboratorio pueden conllevar algn peligro para los manipuladores. Por tanto, todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deber usar los siguientes equipamientos: Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo, Pantaln Largo. 5.7. BIBLIOGRAFA Cerf, O., Dousset, X., Brossard, J. (1988). Parte VI: Destruccin de los microorganismos, Captulo 2: Pasteurizacin y Esterilizacin Trmica. En: Microbiologa alimentaria, Vol. 1., Aspectos microbiolgicos de la seguridad y calidad alimentaria. Burgeois, C.M., Mescle, J.F., Zucca, J., Editores. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. Pgs. 323 344. ICMSF. (2000). Temperatura, Captulo 1. En: Ecologa microbiana de los alimentos 1. Factores que afectan a la supervivencia de los microorganismos en los alimentos. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. Pgs. 1 38. Mescle, J.F., Zucca, J. (1994). Parte II: El comportamiento de los microorganismos en los alimentos. En: Microbiologa alimentaria, Vol. 1. Aspectos microbiolgicos de la seguridad y calidad alimentaria. Burgeois, C.M., Mescle, J.F., Zucca, J., Editores. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. Pgs. 7 50. Rahman, S.M., Guizani, N., Al-Ruzeiki, M.H. (2004). D- and Z-values of microflora in tuna mince during moist- and dry-heating. Lebensm.-Wiss, u.-Technol., 37: 93 98. Singh, R.P., Heldman, D.R. (1997). Captulo 5: Procesado trmico. En: Introduccin a la Ingeniera de los alimentos. 1 edicin. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. Pgs.245 265. Van Asselt, E.D., Zwietering, M.H. (2006). A systematic approach to determine global thermal inactivation parameters for various food pathogens. Int. Journal Food Microbiol., 107: 73 82.

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ACTIVIDAD 6. DETERMINACIN DEL VALOR F0 REAL POR EL MTODO GENERAL: METODO GRFICO
1.1. OBJETIVO Al finalizar la prctica el estudiante estar en capacidad de: Considerar las diferentes estrategias existentes para determinar el F0 de un proceso trmico esterilizante. Integrar y colocar en prctica algunos de los conceptos adquiridos en las prcticas anteriores para el clculo del proceso de esterilizacin usado en alimentos. Hallar el F0 experimental, para el producto alimenticio ensayado en la prctica empleando el mtodo grfico, determinando la importancia de su consideracin en el tratamiento trmico de los alimentos. 1.2. MARCO TERICO Los alimentos envasados y los productos UHT, se denominan comercialmente estriles y usualmente tienen una duracin de por lo menos 6 meses. La esterilidad comercial describe la situacin en la que pueden encontrarse microorganismos viables en el producto, pero las condiciones no son favorables para el crecimiento y los microorganismos presentes no causarn toxicidad, ni tendrn efecto alguno sobre la calidad del producto durante su periodo estimado de vida til. El microorganismo referencia que se utiliza para efectos de los clculos de esterilidad en alimentos, es el Cl. botulinum, ya que es la bacteria patgena (es una de las ms patgenas hasta ahora conocidas), que presenta mayor tolerancia a las elevadas temperaturas, esto gracias a sus esporas que le permiten sobrevivir a diversos tratamientos trmicos, especialmente a aquellos en los que logran temperaturas superiores a los 100C. Cl. botulinum, tiene como caracterstica de crecimiento que sus esporas no germinan a pHs menores a 4,5 y sus estructuras vegetativas tienen un comportamiento similar. Por esta razn el tratamiento trmico aplicado a un alimento depende del pH del mismo. Los productos o alimentos poco cidos deben ser tratados a presiones superiores a la atmosfrica para lograr un tratamiento adecuado, mientras que los cidos requieren de un proceso menos drstico, ya que su pH se constituye en factor limitante para el crecimiento de la mayora de los microorganismos patgenos y alterantes. Es as como ste tipo de alimentos (baja acidez, pH mayor a 4,5) sometidos a un tratamiento trmico, se asegura por lo menos 12 reducciones decimales (12D) para las esporas de Cl. botulinum, esto quiere decir que las probabilidades de supervivencia del microorganismo en cuestin ser de 1 x 1012 veces. Este proceso se conoce como coccin mnima para Cl. botulinum o coccin botulnica y tericamente suele lograrse con un
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tratamiento trmico a 250F durante 3 4 minutos. El concepto 12D, supera en varias unidades logartmicas los rangos experimentales actualmente usados para determinar la resistencia de las endosporas de Cl. botulinum; afortunadamente, la efectividad de stos parmetros se ha demostrado en la prctica. Normalmente en alimentos enlatados, la temperatura se controla en el punto fro del producto, cuya ubicacin depende de la naturaleza del mismo. La temperatura de 250F se usa como temperatura referencia para la comparacin de los diversos tratamientos trmicos. En 1923, Ball introduce el smbolo F, para designar el equivalente en minutos, a una temperatura dada, de la sumatoria de las letalidades de cada una de las combinaciones tiempotemperatura, en el punto fro de un producto cualquiera. De sta manera y teniendo en cuenta las ecuaciones desprendidas de la curva TDT (Prctica 4), podemos traer a consideracin la ecuacin 4.6: t = D (log a log b). Donde t es el tiempo de duracin del tratamiento trmico, por lo cual podemos expresarlo as: F = D (log a log b) (6.1)

Los procesos trmicos para alimentos se evalan y se comparan en trminos de valores F, donde el ms ampliamente utilizado es el valor F0, el cual se define como el efecto letal integrado total, expresado en forma de minutos a 250F, de un tratamiento trmico. Este valor depende del valor Z del microorganismo usado como referencia (usualmente es 18F, o de 10C). Como el F0, emplea una temperatura ya establecida (250F), como referencia, tenemos que: F0 = D250 (log a log b) (6.2)

Estas expresiones nos sern tiles en el momento de establecer los clculos reales para evaluar el tratamiento trmico. Hemos mencionado frecuentemente, el trmino letalidad o efecto letal, pero.en qu consiste ste trmino?. El efecto letal total ejercido por una determinada temperatura sobre el microorganismo referencia, es un valor numrico sin unidades; un coeficiente que se deduce a partir de los conceptos de valor Z, as: a)
Z= (Ta Tb) log Da log Db

(6.3)

b)

log

Da (Ta Tb) = Db Z

(6.4)

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Como existe una temperatura referencia (250F), la usaremos reemplazndola como nuestra Ta, a la cual existir un determinado valor D. c)
log D250 (250 Tb) = Db Z

Si se quiere saber cual es el valor de la razn entre los valores D a cualquier temperatura y el valor D a 250F, tenemos que elevar ambos lados de la ecuacin a una base de 10, para eliminar los log de la misma. Esta relacin es la que nos determina la Letalidad.
D250 = 10 Db
( 250 Tb ) Z

d)

Dado que esta relacin entre valores D es la Letalidad:


L= D250 = 10 Db
( 250 Tb ) Z

(6.5)

Los valores de letalidad se hallan en tablas ya elaboradas, especificndose su valor y el valor Z (en F o C) del microorganismo que se use como referencia. Las letalidades acumuladas a diferentes temperaturas son aditivas, es decir, se suman a medida que progresa el tratamiento trmico y sta sumatoria de todas esas letalidades en un proceso trmico a 250F, es lo que se denomina F0 real. Este valor es el que nos permite determinar si un proceso trmico est siendo efectivo o no para asegurar que el producto consiga una esterilidad comercial y su periodo de vida til sea estimado. Esto se consigue comparando el valor real obtenido en el tratamiento trmico aplicado con el F0 terico (que debe ser superado por el real) estimado por las tablas que expide la NCA (Nacional Canners Association), como el ejemplo que se aprecia en la tabla 1. Tabla 1. Valores de F0 tericos para diferentes tipos de alimentos enlatados. PRODUCTO F0 (min) Judas en salsa de tomate 46 Zanahorias 45 Carnes en salsa 12 15 Postres de leche 4 10 Comida para mascotas 15 18 Algunos alimentos requieren valores de F0 muy superiores a 3 4 minutos, lo cual se debe a que cambia el microorganismo referencia por uno ms termoresistente ya que la NCA tiene en

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cuenta el efecto protector que ejerce el alimento, ya sea su estado fsico, presencia de grasas, almidones, etc. Metodologa: Para determinar el valor F0, existen diferentes mecanismos y mtodos, pero tal vez el ms extendido y utilizado gracias a su facilidad de clculo y ejecucin, es el mtodo general, donde el proceso comienza con la construccin de una curva de penetracin de calor (calentamiento, sostenimiento, enfriamiento), usando termopares ubicados en el punto frio del producto. De esta forma se logra construir la respectiva historia de la penetracin de calor en el alimento. Este procedimiento se lleva a cabo de sta manera dado que se puede llegar de manera directa a establecer las letalidades que cada temperatura ejerce sobre los microorganismos del alimento. En un tratamiento esterilizante, la premisa a cumplir, es que la poblacin final sobreviviente (Nf) debe ser inferior o igual a una poblacin de seguridad (Ns) establecida, la cual depende de la intensidad del tratamiento y de la poblacin inicial (No). Esto establece una desigualdad:
Nf Ns

Esta desigualdad puede ser transformada dividiendo ambos lados de la desigualdad por No: Nf Ns No No Y tomar logaritmos en ambos lados de la ecuacin para obtener:
log Nf Ns log No No

(6.6)

La primera expresin de la desigualdad, corresponde a otra expresin, tal como se muestra a continuacin

log

Nf = m * dt No 0

(6.7)

Reemplazando en 6.6, obtenemos una expresin as:

m * dt log
0

Ns No

(6.8)

Si se analiza, la segunda expresin de la desigualdad representa la diferencia en unidades logartmicas que debe existir entre la poblacin inicial del alimento y la poblacin de seguridad
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que se debe establecer. A decir verdad, es muy difcil de establecer tanto la una como la otra debido a la variabilidad tanto de la materia prima como de algunas condiciones del proceso. Para esto se han establecido valores tericos de reduccin decimal de la carga microbiana en los alimentos enlatados, son valores conocidos como coeficientes de reduccin (M). Si: y Entonces: t = log No log Ns M = log (No/Ns) -M = log (Ns/No), Que representan el nmero de unidades logartmicas que un proceso trmico debe reducir. En la actualidad y como se coment anteriormente, se considera que para un alimento el coeficiente de reduccin debe ser de 12. Teniendo en consideracin lo anterior, la ecuacin 6.8 quedara:

m * dt M
0

Como ambas expresiones se encuentran negativas, multiplicamos por -1 ambos miembros de la ecuacin, cambiando el sentido de la desigualdad:

m * dt M
0

(6.9)

Donde m es la pendiente de la curva TDT. Como sabemos, la pendiente equivale al inverso del valor D, segn la expresin:
1 m= D

Reemplazando en 7.8 tenemos:

* dt M D
0

(6.10)

De esta expresin se deduce que un tratamiento trmico que asegure una esterilidad comercial debe ser aquel cuya rea, debajo de la curva, (eso lo indica la integral) construida graficando el inverso del valor D vs tiempo de proceso, sea mayor o igual a 12 (que es el valor de M para alimentos con pH > 4.5).

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Para ilustrar lo anterior obsrvese la figura 1. En otras palabras, el rea (sombreada) bajo la curva debe ser mayor a M. Esta grfica se podra construir si se conociera como evoluciona el valor D en el punto fro del producto, con la temperatura y a medida que transcurre el tiempo. Figura 1. Ejemplo de una grfica de penetracin de calor.

(1/D) min-1

Area M Area 12

Tiempo (min)

Esa variacin del valor D es muy difcil de determinar, adems de costoso y poco prctico. Debido a esto, la expresin anterior debe modificarse para encontrar otra equivalencia que permita una determinacin emprica ms prctica y eficiente. Para esto, podemos recordar por un momento la ecuacin 6.5, que determina el valor letal de una temperatura.
D250 = 10 Db
( 250 Tb ) Z

Reorganizando la ecuacin, tenemos que:


( 250 Tb )

1 10 Z = Db D250

(6.11)

Este trmino es el mismo que se encuentra dentro de la integral, en 6.9; de tal manera que podemos reemplazar 6.11 en 6.9, de lo cual se obtiene:

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( 250 Tb )

10

D250

* dt M

(6.12)

Como D250 es un valor constante (ya predeterminado), puede salir de la integral como 1/D250, pasando a multiplicar al otro lado de la desigualdad:
Tb ) ( 250 10 Z * dt M * D250 0 t

(6.13)

De tal manera, tenemos que la expresin dentro de la integral, es la equivalencia de la ecuacin 6.5 de letalidad. Reemplazando:

L * dt M * D
0

250

(6.14)

Si analizamos la ecuacin, nos encontramos que ambos lados de la desigualdad, las unidades, son minutos. Por ejemplo, en la segunda expresin, el valor D viene dado en minutos y M carece de unidades, por lo cual sus resultados sern minutos. Si nos detenemos un poco ms, veremos que esa segunda expresin se puede transformar, si recordamos la equivalencia que tiene M = log No log Ns. De tal manera, que si reemplazamos, obtenemos: M * D250 = t( log No log Ns)* D250 Esta expresin corresponde, a la ecuacin 6.2, que define de manera terica el valor F0, por lo cual: F0 = D250 (log No log Ns) Reemplazando en 6.13, se obtiene la ecuacin 6.15:

L * dt F
0

(6.15)

Esta ecuacin final nos indica que si graficamos la letalidad obtenida a cada temperatura, contra el tiempo de tratamiento trmico, obtendremos una curva (figura 2), cuya rea (con unidades en minutos, debido a que la letalidad es un valor numrico), debe ser igual o mayor a un F0 dado. De sta manera, el F0 obtenido por el rea de la grfica ser denominado real y el F0 contra el cual se va a comparar se llamar terico. La mejor manera y la ms exacta para determinar el valor del rea bajo la curva de letalidad, es por medio de un software matemtico que recibe los

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datos y la funcin, construyendo la grfica y resolviendo la integral dando como un dato el valor numrico del rea en minutos. Figura 2. Curva resultante de letalidad contra el tiempo de exposicin.

Letalidad

L * dt F
0

Area > F0 terico

Tiempo (min)

El mtodo grfico: Segn lo anterior, los datos de la curva de penetracin de calor obtenida, pueden ser transformados para generar una grfica de letalidad vs. tiempo, para que luego de su construccin se proceda a determinar el rea de la curva generada por el proceso calentamientosostenimiento-enfriamiento, y luego determinar si esta rea hallada obedece a la ecuacin 6.15, s decir, que sea mayor al F0 terico estimado por la NCA. Este valor debe superar en ms de un 10% de su valor al F0 terico, para considerar al tratamiento como seguro. Es una precaucin que se toma para poder asegurar una esterilidad comercial en los productos alimenticios. La diferencia consiste en que ste mtodo contempla una manera diferente de hallar el rea bajo la curva y es realizando la grfica sobre un papel milimetrado como se muestra en la figura 6.3, en el cual, posteriormente se sealarn los cuadros y se procede a contar el nmero de ellos que se encuentran debajo de la curva, multiplicando luego este nmero por el rea que presenta cada cuadro seleccionado. El resultado de sta multiplicacin se interpreta como el valor F0 real del proceso. Este mtodo, aunque poco exacto, si es bastante preciso y adecuado, segn el tratamiento; se considera cuando carezca del software necesario para procesar la informacin obtenida. 1.3. MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS 1 vaso de precipitado de 250 mL de capacidad estril. 1 termmetro. 1 bao serolgico (o en su defecto malla, aro, soporte con pinzas y mechero). 250 mL de producto lquido o semilquido sin leche.
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1.4. REACTIVOS No requiere

1.5. PROCEDIMIENTO Cada grupo procesar trmicamente un producto diferente (asignado por el instructor), tomando la temperatura durante el proceso, en el punto frio del producto. Construir la curva de penetracin de calor del producto respectivo. Basados en la tabla del anexo 1, usar los datos de la historia de la temperatura en el punto frio, para determinar los respectivos valores de letalidad. Construir la grfica de letalidad vs. tiempo en un papel milimetrado. Escoger un cuadrado del papel y usarlo como referencia, de la siguiente manera: Determinar el rea del cuadrado escogido (LxL), la cual se dar en minutos (letalidad x minutos = minutos). Determinar el nmero exacto de cuadrados con igual rea al de referencia existente dentro de la curva. Determinar por aproximacin el nmero de cuadrados restantes bajo la curva (completar los cuadrados incompletos por aproximacin con los otros faltantes). Sumar el nmero total de cuadrados bajo la curva, estableciendo posteriormente el rea total bajo la curva mediante la multiplicacin del nmero de cuadrados por el rea de cada uno. Este resultado final sera el F0 del proceso trmico. Lo anterior, lo podemos ilustrar con un ejemplo como el que se muestra mediante la figura 3, all se establece un tratamiento trmico para un enlatado de zanahorias con arveja (en porciones personales). Cada cuadrcula de la grfica, tiene un rea de 0,2 minutos (Lado = 0,1 x Lado 2 minutos). Haciendo el estimado del conteo total de cuadrculas contenidas en la grfica, se establecen que hay 49,5 cuadrados. De tal manera que el F0 real para el proceso ser de 9,9 minutos (0,2 minutos x 49,5). Este valor as obtenido, debe ser superior al F0 terico establecido por lo menos en un 10% del valor de ste ltimo, para considerar el tratamiento seguro. Por ejemplo si el F0 terico era de 8 minutos, para el ejemplo anterior, el F0 real debera ser igual o superior a 8,8 minutos, lo cual nos indica que el proceso trmico que se est llevando a cabo es satisfactorio.

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Figura 3. Curva de Letalidad vs. tiempo, para determinar el valor F0

Letalida 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2

rea bajo la curva = F0


0,1 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Tiempo

1.6. NIVEL DE RIESGO Para el desarrollo de la presente prctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya que se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algn momento por malas prcticas de laboratorio pueden conllevar algn peligro para los manipuladores. Por tanto, todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deber usar los siguientes equipamientos: Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo, Pantaln Largo. 1.7. BIBLIOGRAFA SINGH, R.P., HELDMAN, D.R. (1997). Captulo 5: Procesado trmico. En: Introduccin a la Ingeniera de los alimentos. 1ra edicin. Editorial Acribia S.A. Zaragoza, Espaa. Pgs. 245-265. BROWN, K.L. (1994). Captulo 2: Principios de la conservacin mediante el calor. En: Procesado trmico y envasado de los alimentos. Ress, J.A.G., Bettison, J. Editores. Editorial Acribia S.A. Zaragoza, Espaa. Pgs. 17-55.

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LEWIS, M.J. (1993). Captulo 10: Transferencia de calor en estado no estacionario. En: Propiedades fsicas de los alimentos y de los sistemas de procesado. 1ra edicin. Editorial Acribia S.A. Zaragoza, Espaa. Pgs. 307-340. MESCLE, J.F., ZUCCA, J. (1994). El comportamiento de los microorganismos en los alimentos, la temperatura. En: Microbiologa alimentaria, volumen 1. Aspectos microbiolgicos de la seguridad y calidad alimentaria. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. Pps. 7 50. ICMSF. (2000). Temperatura, Captulo 1. En: Ecologa microbiana de los alimentos 1. Factores que afectan a la supervivencia de los microorganismos en los alimentos. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. Pps. 1 38.

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ACTIVIDAD 7: FACTORES QUE INCREMENTAN LA TERMORRESISTENCIA BACTERIANA Y EN LA GENERACIN DE ESPORAS


1.1. OBJETIVO Al finalizar la prctica el estudiante estar en capacidad de: Hallar los valores D para cada medio de cultivo y temperatura de incubacin que corresponda a cada grupo de laboratorio. Comparar todos los valores de termorresistencia obtenidos por clase, para determinar el grado de influencia ejercido por la temperatura y el medio de cultivo de incubacin. Concluir acerca de este efecto y observar si corresponde o no con la bibliografa, tratando de profundizar en el tema. 1.2. MARCO TERICO Se cree que la destruccin de los microorganismos por el calor es consecuencia de la desnaturalizacin de sus protenas y sobre todo de la inactivacin de sus enzimas que necesitan para desarrollar sus actividades metablicas. La intensidad del tratamiento trmico necesaria para destruir los microorganismos o sus esporas depende de la especie del microorganismo, de su estado fisiolgico, y de las condiciones del medio en el momento de efectuar el tratamiento. Segn el tratamiento trmico que se emplee, es posible que se destruyan slo algunas clulas vegetativas, la mayora de las clulas o todas las clulas, parte de las esporas bacterianas o la totalidad de las mismas. El tratamiento trmico elegido depender de las especies de microorganismos que sea preciso destruir, de otros procedimientos de conservacin que sea preciso emplear, y del efecto que produzca el calor en el alimento. Tanto las clulas como las esporas de los microorganismos difieren mucho en cuanto a su resistencia a las temperaturas elevadas. Algunas de estas diferencias son debidas a factores que puedan ser controlados, aunque otras son propias de los microorganismos y no siempre pueden ser explicadas. De stos factores que se pueden controlar tenemos dos de los ms influyentes en la termorresistencia de microorganismos cuando se realizan ensayos de estudio termobacteriolgico, ellos son. La temperatura de incubacin y el medio de cultivo en que se mantengan las esporas o el microorganismo. Temperatura de incubacin: Tanto la temperatura a la que crecen las clulas, como la temperatura a la que se originan las esporas, influyen en sus respectivas termorresistencias. En general, la termorresistencia aumenta conforme la temperatura de incubacin aumenta, aproximndose a la temperatura ptima de crecimiento del microorganismo y, en algunos microorganismos, la termorresistencia aumenta conforme la temperatura se aproxime a su temperatura mxima de crecimiento. Cuando E. coli crece a 38,5C, que es una temperatura
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prxima a su temperatura ptima de crecimiento, es bastante ms termoresistente que cuando crece a 28C. Una suspensin de esporas de B. subtilis en agua peptonada al 1%, que se haban originado a temperaturas distintas, fueron sometidas a calentamiento, obtenindose los resultados que son mostrados en la tabla 1. Tabla 1. Tiempo de destruccin de esporas de B. subtilis en agua peptona 1%. Temperatura de incubacin (C) 21 23 37 (ptima) 41 Tiempo de destruccin a 100C (min) 11 16 18

Medio de cultivo: El medio en el que tiene lugar el crecimiento tiene una gran importancia. La influencia que ejercen los nutrientes del medio, su tipo, y su concentracin, ser diferente para cada microorganismo, aunque, en general, cuanto ms rico es el medio de crecimiento ms termoresistente son las clulas vegetativas o las esporas. La existencia en el medio de un aporte apropiado de factores accesorios de crecimiento suele favorecer la aparicin de clulas o de esporas termorresistentes. Esta probablemente sea la causa de las infusiones de hortalizas y los extractos de hgado aumenten la termorresistencia de los microorganismos que crecen en ellos. Las esporas que se han originado y envejecido en la tierra o en los granos de avena son ms termorresistentes que las que se han originado en el caldo nutritivo o en el agar nutritivo. Los carbohidratos, aminocidos y radicales de cidos orgnicos tambin influyen en la termorresistencia, aunque en stos casos resulta difcil pronosticar en qu sentido influirn. Una baja concentracin de glucosa en el medio puede determinar un leve aumento de la termorresistencia, pero una alta concentracin de azcar puede dar lugar a la formacin de suficiente cido como para que la endospora, en stas condiciones generada, tenga una menor termorresistencia. Parece ser que algunas sales influyen de alguna manera sobre la termorresistencia, se dice que los iones fosfato y magnesio la reducen, cuando se genera la endospora en presencia de una concentracin suficiente. La prolongada exposicin a productos metablicos provoca la disminucin de la termorresistencia, tanto de las clulas vegetativas como de las esporas. 1.3. MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS 32 pipetas estriles de 1 mL de capacidad. 80 cajas de petri estriles. 10 tubos con 9 ml de caldo BHI. 1 bao serolgico ajustado a una temperatura de 70C, 80C o la indicada por el profesor.

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1 cepa de S. aureus incubada a 25C en agar nutritivo. 1 cepa de S. aureus incubada a 37C en agar nutritivo. 1 cepa de S. aureus incubada a 45C en agar nutritivo. 1 cepa de S. aureus incubada a 25C en agar BHI. 1 cepa de S. aureus incubada a 37C en agar BHI. 1 cepa de S. aureus incubada a 45C en agar BHI. 1.4. REACTIVOS 10 tubos con 9 ml de caldo nutritivo. 8 tubos con 9 ml de agua peptonada 0.1%. 800 mL de Agar BHI. 1.5. PROCEDIMIENTO Se inoculan tubos de ensayo con caldo nutritivo y BHI, con los microorganismos a ser probados. Estos tubos se dividen en tres grupos iguales incubndose cada uno a una temperatura diferente: 25, 37 y 45C. Cada grupo recibir 10 tubos de ensayo con 10 mL, ya sea de caldo BHI o de caldo nutritivo. Los tubos de cada grupo correspondern a dos grupos de 5 cada uno, los cuales representan a dos microorganismos diferentes, que han sido preincubados a la misma temperatura (25, 37 o 45C). Las dos series de 5 tubos se someten a un calentamiento a 70C (80C o a la temperatura indicada por el profesor), para determinar su respectivo valor D. Cada tubo ser retirado a intervalos de 2 minutos realizando diluciones 10-1, 10-2 y 10-3 y depositando por duplicado 1 mL de cada dilucin en cajas de petri estriles adicionndo entre 15 20 mL de agar BHI. Homogenice las placas e incube a 35 +/- 2C por 24 48 horas haciendo el respectivo recuento. Hallar el valor D para cada microorganismo y compararlo con el obtenido por todos los grupos para concluir acerca del efecto que se observ tanto del medio de cultivo como de la temperatura de incubacin. 1.6. NIVEL DE RIESGO Para el desarrollo de la presente prctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya que se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algn momento por malas prcticas de laboratorio pueden conllevar algn peligro para los manipuladores. Por tanto, todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deber usar los siguientes equipamientos:

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Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo, Pantaln Largo. 1.7. BIBLIOGRAFA SINGH, R.P., HELDMAN, D.R. (1997). Captulo 5: Procesado trmico. En: Introduccin a la Ingeniera de los alimentos. 1ra edicin. Editorial Acribia S.A. Zaragoza, Espaa. Pgs. 245-265. BROWN, K.L. (1994). Captulo 2: Principios de la conservacin mediante el calor. En: Procesado trmico y envasado de los alimentos. Ress, J.A.G., Bettison, J. Editores. Editorial Acribia S.A. Zaragoza, Espaa. Pgs. 17-55. LEWIS, M.J. (1993). Captulo 10: Transferencia de calor en estado no estacionario. En: Propiedades fsicas de los alimentos y de los sistemas de procesado. 1ra edicin. Editorial Acribia S.A. Zaragoza, Espaa. Pgs. 307-340. MESCLE, J.F., ZUCCA, J. (1994). El comportamiento de los microorganismos en los alimentos, la temperatura. En: Microbiologa alimentaria, volumen 1. Aspectos microbiolgicos de la seguridad y calidad alimentaria. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. Pps. 7 50. ICMSF. (2000). Temperatura, Captulo 1. En: Ecologa microbiana de los alimentos 1. Factores que afectan a la supervivencia de los microorganismos en los alimentos. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. Pps. 1 38.

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ACTIVIDAD 8: FACTORES AMBIENTALES QUE INFLUYEN EN LA RECUPERACIN DE ESPORAS Y MICROORGANISMOS VIABLES SOMETIDOS A TRATAMIENTO TRMICO
8.1. OBJETIVO Al finalizar la prctica el estudiante estar en capacidad de: Evaluar la influencia que posee la temperatura de incubacin, sobre el nivel de colonias desarrolladas en el medio de cultivo. Comparar la eficiencia de recuperacin de microorganismos en los diferentes medios de cultivos empleados en la prctica. Determinar la influencia de todos estos factores sobre el valor de termorresistencia (valor D) y estimar su variacin segn las condiciones establecidas en el laboratorio. 8.2. MARCO TERICO En un estudio termobacteriolgico, es de vita importancia el manejo y la precisin de los datos obtenidos. Estos datos se ven influenciados por un sinnmero de factores que deben ser tenidos en cuenta en el momento de realizar los ensayos. Algunos de estos factores actan en la parte final de un ensayo, es decir, en la fase de recuperacin de las esporas y/o los microorganismos, afectando el recuento y por lo tanto los resultados o datos finales. Los dos factores ms importantes en sta etapa son: El medio de cultivo: La composicin del medio de recuperacin, ejerce un efecto considerable en los resultaos finales. Se ha demostrado que las bacterias luego de un tratamiento subletal, son ms exigentes en sus necesidades de crecimiento. As mismo se sabe que la sensibilidad de las esporas a inhibidores de la germinacin, aumenta al aumentar sus pre tratamientos trmicos. Para lograr una recuperacin mxima el medio debe ser: 1. Adecuado para iniciar el proceso de germinacin esporal, y 2. Capaz de estimular y permitir el crecimiento vegetativo. Luego de la germinacin la espora debe disponer de un medio nutritivamente conveniente; por ejemplo se conoce que las esporas de B. stearothermophilus germinan en un medio con glucosa y sales minerales, pero que para su crecimiento posterior requiere de diversos factores de crecimiento. Al respecto se han realizado diversos estudios, de los cuales se concluye acerca de la necesidad de la presencia de ciertas sustancias en los medios de cultivo para obtener una mejor recuperacin de la poblacin esporal y bacteriana, indicando que entre ms complejo era el medio de cultivo, mayor era la evidencia de la exigencia nutritiva de los microorganismos, para su desarrollo.

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La temperatura de incubacin: Se ha demostrado con suficiencia que la temperatura empleada para la recuperacin de esporas, afectan los resultados finales, tenindose como consecuencia una variedad de termoresistencias aparentes, que confunden a los investigadores. En los estudios realizados al respecto se observa claramente que, trabajando con mesfilos, que temperaturas de incubacin de 24, 27 y hasta de 31C, ofrecen una mejor recuperacin que a 37C. Esto se ha confirmado tambin para los microorganismos termfilos, donde al trabajar con B. stearothermophilus, se cambia su temperatura ptima de recuperacin, que normalmente oscila alrededor de los 57 2C, disminuyndola, aproximadamente 10C, (45 50C) luego del tratamiento trmico. Algunos investigadores sugieren que esto depende de la temperatura del tratamiento trmico y se debe a grandes diferencias entre los procesos de crecimiento bacteriano y el de germinacin.

8.3. MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS 1 tubo de ensayo con una suspenin de esporas en agua destilada estril. 2 pipetas estriles de 1mL. 1 pipeta estril de 0,1 mL. 6 cajas de petri estriles. Autoclave. Incubadoras a 25, 35 y 45C. 8.4. REACTIVOS 1 tubo de ensayo con 9 ml de agua peptonada 0.1%. Agar estndar para recuento en placa (SPC). Agar Nutritivo. Agar infusin Cerebro Corazn (BHI). Agar Tripticasa de Soya (TSA). 8.5. PROCEDIMIENTO Cada grupo recibir un tubo de ensayo con una suspensin de esporas en agua destilada estril. Cada suspensin corresponder a un determinado microorganismo. Se someter, el tubo de ensayo, a un tratamiento trmico en el autoclave durante 6 minutos a 121C, para destruir esporas. Una vez finalizado el tratamiento trmico, se procede a realizar una dilucin decimal 10-1 en 9 mL de diluyente. Inocular 1 mL a partir de 100, 1 mL de 10-1 y 0,1 mL de 10-1 en profundidad en 6 cajas de petri estriles.

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Los grupos se distribuirn los medios de cultivo y las temperaturas posteriores de incubacin segn la tabla 1 (Anexos). Realizar la respectiva lectura. Comparar los diferentes recuentos obtenidos para establecer los ttulos de recuperacin que presenta cada medio de cultivo y cada temperatura. 8.6. NIVEL DE RIESGO Para el desarrollo de la presente prctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya que se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algn momento por malas prcticas de laboratorio pueden conllevar algn peligro para los manipuladores. Por tanto, todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deber usar los siguientes equipamientos: Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo, Pantaln Largo. 8.7. BIBLIOGRAFA SINGH, R.P., HELDMAN, D.R. (1997). Captulo 5: Procesado trmico. En: Introduccin a la Ingeniera de los alimentos. 1ra edicin. Editorial Acribia S.A. Zaragoza, Espaa. Pgs. 245-265. BROWN, K.L. (1994). Captulo 2: Principios de la conservacin mediante el calor. En: Procesado trmico y envasado de los alimentos. Ress, J.A.G., Bettison, J. Editores. Editorial Acribia S.A. Zaragoza, Espaa. Pgs. 17-55. LEWIS, M.J. (1993). Captulo 10: Transferencia de calor en estado no estacionario. En: Propiedades fsicas de los alimentos y de los sistemas de procesado. 1ra edicin. Editorial Acribia S.A. Zaragoza, Espaa. Pgs. 307-340. MESCLE, J.F., ZUCCA, J. (1994). El comportamiento de los microorganismos en los alimentos, la temperatura. En: Microbiologa alimentaria, volumen 1. Aspectos microbiolgicos de la seguridad y calidad alimentaria. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. Pps. 7 50. ICMSF. (2000). Temperatura, Captulo 1. En: Ecologa microbiana de los alimentos 1. Factores que afectan a la supervivencia de los microorganismos en los alimentos. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. Pps. 1 38. ALLAERT, C., ESCOL, R. 2002. Mtodos de Anlisis Microbiolgicos de Alimentos. Editorial Diaz de Santos S.A., Madrid, Espaa. HARRIGAN, W.F. 1998. Laboratory Methods in Food Microbiology. 3rd Edition. Academic Press, San Diego, California, USA. HELDMAN, S. Introduccin a la ingeniera de los alimentos. Editorial Acribia S.A., Zaragoza, Espaa. 1998. ICMSF. Ecologa Microbiana de los alimentos Vol. 1 y 2. Editorial Acribia S.A., Zaragoza,

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Espaa. 1989. ICMSF. Microorganismos de los alimentos Vol. 1 y 2. Editorial Acribia S.A., Zaragoza, Espaa. 1989. MADIGAN, M.T., y otros. BROCK, Biologa de los microorganismos. 8 edicin revisada. Prentice Hall. 3 reimpresin. Madrid, Espaa, 2000. NICKERSON, J.T., SINSKEY, A.J. Microbiologa de los alimentos y sus procesos de elaboracin. Editorial Acribia S.A., Zragoza, Espaa. 1978. RESS, G.A., BETTISON, J. 1994. Procesado trmico y envasado de los alimentos. Editorial Acribia S.A., Zaragoza, Espaa. STUMBO, C.R. Thermobacteriology in food procesing. 3rd edition. Academic Press. New York, 1976. 8.8. ANEXOS Tabla 1. Variables a tener en cuenta para el desarrollo de la actividad prctica. Grupo Nmero de cajas 3 1 3 3 2 3 3 3 3 3 4 3 3 5 3 3 6 3 Agar TSA 45C Agar TSA Agar TSA 25C 35C Agar Nutritivo Agar Nutritivo 35C 45C Agar BHI Agar Nutritivo 45C 25C Agar BHI Agar BHI 25C 35C Agar SPC Agar SPC 35C 45C Medio de Cultivo Agar SPC Temperatura de Incubacin 25C

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