Anda di halaman 1dari 9

HPLC

Posted on Juni 6, 2011 | Komentar Dimatikan Kromatografi Cair Berperforma Tinggi (high performance liquid chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fase diam tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan detektor serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatorgram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa. Prinsip Dasar HPLC HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Prinsip dasar dari HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Sebetulnya hanya ada dua hal utama yang menjadi krusial point dalam metode HPLC. Yang pertama adalah proses separasi/pemisahan dan yang kedua adalah proses identifikasi. Dua hal ini mejadi faktor yang sangat penting dalam keberhasilan proses analisa. Prinsip dari HPLC ini adalah dinamika dan migrasi dengan meggunakan dua fasa. HPLC biasanya digunakan untuk senyawa untuk yang berberat molekul tinggi dan tidak menguap, dimana penyerapan semakin baik jika molekul berada pada bentuk terkecil sehingga pemisahan semakin baik. Penentuan Kualitatif HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar. Penentuan Kuantitatif Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah:

ALAT DAN CARA KERJA HPLC A. Rangkaian Alat HPLC 1. Kolom

Kolom yang biasa digunakan untuk analisa adalah bentuk kolom fase balik. Kolom diisi dengan partikel silika yang dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol. Kolom Yang Baik : Jenis Kolom : Pemeliharan Kolom : 2. Komposisi Eluen Komposisi eluen meliputi jenis dan perbandingan eluen yang digunakan. Ada 2 macam eluen, yakni pelarut nonpolar untuk fase normal, seperti heksan, dan pelarut polar untuk fase balik, seperti campuran air dan alkohol, yakni metanol. Tempat Eluen berupa Botol yang tidak bereaksi dengan pelarut, dilengkapi penyaring. Eluen harus disaring dengan saringan membran 3. Volume Injeksi Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume (misalnya 20 500 L). Injeksi sampel dapat dilakukan melalui manual (menggunakan jarum suntik), step-flow injection, dan sampling value. 4. Detektor Detektor merupakan suatu bagian integral dari sebuah peralatan analitik kromatografi cair yang modern. HPLC mempunyai keunggulan dibanding kromatografi lain, yaitu mempunyai banyak pilihan detektor yang dapat digunakan. Detektor yang digunakan dalam HPLC dibedakan menjadi 3 macam, yaitu: 1. Detektor spektrofotometrik Detektor spektrofotometri , biasanya dalam daerah ultraviolet, digunakan secara luas. Idealnya, spektrofotometri yang nyata dengan pemilihan panjang gelombang yang sempurna akan memberikan fleksibilitas yang maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat terlarut dengan sensitivitas yang sangat baik, sel sampel yang biasa akan digantikan dengan suatu alir untuk melewatkan larutan eluen kolom guna menembus berkas sample dari peralatan tersebut. Spektrofotometer ultraviolet yang modern merupakan salah satu detektor yang sangat mahal. Biaya yang lebih rendah mencerminkan penggunaan spektrum garis lampu uap merkuri dan bukan suatu sumber kontinu dan monokromator, penyaring-penyaring yang sederhana mengisolasi garis yang diinginkan di dalam spektrum merkuri.

2. Detektor Fluorometrik Detektor-detektor yang didasarkan pada fluroresens sudah semakin biasa. Jenis yang paling serbaguna mampu menghasilkan eksitasi variable yang terus menerus di sepanjang suatu jangkauan panjang gelombang yang lebar dengan memanfaatkan sebuah sumber kontinu dan monokromator, biasanya penyaring-penyaring yang sederhana digunakan untuk mentransmisikan emisi pendaran pada foto detektor sambil menahan radiasi eksitasinya. 3. Detektor Elektrokimia Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik (konduktometri) dan polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya digunakan untuk mendeteksi solute-solute yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organik maupun anorganik. 4. Desain detector Desain detektor sangat penting. Apabila volumenya mati, termasuk hubungannya dengan kolom, harus sangat kecil, dan larutan harus mengalir dengan lancar melewati alat itu tanpa pencampuran yang turbulen. Pada umumnya, volume detektor hanya sebesar beberapa mikroliter. 5. Pemilihan detektor Ada beberapa jenis detektor yang digunakan, dengan pemilihan yang umumnya didasarkan pada persyaratan sebagai berikut : 6. Analisis Kuantitatif Detektor yang ideal pada HPLC ialah yang mampu menghasilkan sinyal yang mempunyai korelasi linier dengan konsentrasi komponen sampel. Dengan asumsi seperti tersebut, konsentrasi komponen sampel dapat diturunkan dari intensitas sinyal yang ditunjukkan dalam kromatogram. Dikenal dua cara pengukuran secara kuantitatif, yaitu dengan mengukur peak height dan peak area. Dikenal beberapa metode untuk merubah data peak height atau peak area dari suatu kromatogram menjadi konsentrasi dari komponen sampel yang sesuai, yaitu dengan membuat kurva baku dengan cara-cara external standard, internal standard dan standard addition. Syarat Detektor : B. Fase HPLC HPLC adalah suatu teknik kromatografi yang menggunakan fasa gerak cair, dapat digunakan untuk pemisahan sekaligus untuk analisis. Berdasarkan kekuatan / kepolaran fasa geraknya KCKT dibagi menjadi :

2.3 APLIKASI HPLC DALAM KEHIDUPAN A. Keunggulan dan Kerugian HPLC KCKT adalah suatu metode yang menggabungkan koefisien kolom dan kecepatan analisis. KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Kelebihan KCKT antara lain adalah : Beberapa keunggulan HPLC dibanding alat lain: a). HPLC dilengkapi dengan adanya pompa, Pompa ini menghasilkan tekanan sekitar 400 atm untuk mengalirkan eluen dengan tekanan tinggi dan konstan sehingga memperingan kerja kolom dan juga pemisahan sehingga waktu lebih sedikit. pada pompa dikenal dua sistem dalam teknik pemisahan yaitu isokratik dan gradient,namun gradient lebih bersifat akurat karena masingmasing pompa mengatur laju alir larutan yang berbeda. b). HPLC memiliki keunggulan kolom, Dimana kolom HPLC ini lebih pendek dan lebih kecil dibanding GC misalnya. Diameter untuk internal kolom HPLC 4.6 mm sehingga dapat memberikan permukaan kontak yang lebih luas diman mempengaruhi sempurnanya pemisahan yang semakin baik. Dan panjang kolom HPLC adalah 150-250 mm. dan yang perlu diingat adalah kolom HPLC dapat digunakan kembali dengan cara direnerasi dengan mencucinya hingga bersih dengan pelarut yang sesuai. c). HPLC mempunyai detektor yang amat sangat sensitif dan peka. HPLC memiliki beberapa detector misalnya: Detektor ultraviolet, detektor fluorometrik, dan detektor elektrokimia. d). Waktu retensi, waktu yang dibutuhkan senyawa untuk melalui kolom hingga ke detektor disebut waktu retensi yang diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.biasanya dipengaruhi oleh : tekanan yang digunakan, kondisi dari fase diam, komposisi pelarut yang tepat, dan temperatur kolom. e). Kromatogram, kromatogram menunjukkan hasil yang didapat. Kromatogram yang diinginkan adalah kromatogram yang lurus tinggi dengan lebar sekecil mungkin. Bukan dengan bentuk lainnya,karena bentuk tersebut menandakan pemisahan dilakukan dengan sangat baik. Namun dalam kromatogram kita menemukan beberapa puncak kecil atau yang mengganggu dan disebut denga noise. Noise muncul jika sampel kita ataupun pelarut yang kita gunakan belum pure,belum murni dari pengotor-pengotor yang mungkin tidak sengaja masuk kedalamnya. Fasa gerak dalam HPLC memegang peranan penting karena sangat akan mempengaruhi kepada pemisahan,jadi ada beberapa kriteria yang harus dipenuhi fasa gerak :

Gas Chromatography: (1) Prinsip Kerja.


Posted by asro pada 3 Oktober 2008 Secara umum, chromatography merupakan suatu istilah yang menggambarkan teknik yang digunakan untuk memisahkan komponen-komponen dari suatu campuran/sample. Dalam gas chromatography (GC), gas (yang biasa disebut carrier gas) digunakan untuk membawa sample melewati lapisan (bed) material. Karena gas yang bergerak, maka disebut mobile phase (fasa bergerak), sebaliknya lapisan material yang diam disebut stationary phase (fasa diam). Ketika mobile phase membawa sample melewati stationary phase, sebagian komponen sample akan lebih cenderung menempel ke stationary phase dan bergerak lebih lama dari komponen lainnya, sehingga masing-masing komponen akan keluar dari stationary phase pada saat yang berbeda. Dengan cara ini komponen-komponen sample dipisahkan. Secara umum, peralatan GC terdiri dari: 1) Injection System; 2) Oven; 3) Control System; 4) Column; 5) Detector; dan 6) Data Acquisition System.

Injection system digunakan untuk memasukkan/menyemprot gas dan sample kedalam column. Ada beberapa jenis injection system: 1) Packed column injector; umumnya digunakan dengan package column atau capillary column dengan diameter yang agak besar; injeksi dilakukan secara langsung (direct injection). 2) Split/Splitless capillary injector, digunakan dengan capillary column; sebagian gas/sample dibuang melalui split valve. 3) Temperature programmable cool on-column, digunakan dengan cool capillary column, injeksi dilakukan secara langsung. Oven, digunakan untuk memanaskan column pada temperature tertentu sehingga mempermudah proses pemisahan komponen sample. Column, berisi stationary phase dimana mobile phase akan lewat didalamnya sambil membawa sample. Secara umum terdapat 2 jenis column, yaitu: 1) Packed column, umumnya terbuat dari glass atau stainless steel coil dengan panjang 1 5 m dan diameter kira-kira 5 mm. 2) Capillary column, umumnya terbuat dari purified silicate glass dengan panjang 10-100 m dan diameter kira-kira 250 m. Beberapa jenis stationary phase yang sering digunakan: a) Polysiloxanes
untuk nonpolar analytes/sample. b) Polyethylene glycol untuk polar analytes/sample. c) Inorganic atau polymer packing untuk sample bersifat small gaseous species.

Control system, berfungsi untuk: 1) Mengontrol pressure dan flow dari mobile phase yang masuk ke column. 2) Mengontrol temperature oven. Detector, berfungsi mendeteksi adanya komponen yang keluar dari column. Ada beberapa jenis detector, yaitu: 1) Atomic-Emission Detector (AED); cara kerjanya adalah: campuran sample-gas yang keluar dari column diberi tambahan energy dengan menggunakan microwave sehingga atom-atomnya bereksitasi; sinar eksitasi ini kemudian diuraikan oleh diffraction grating dan diukur oleh photodiode array; kehadiran komponen dalam sample dapat ditentukan dari adanya panjang gelombang eksitasi komponen tersebut yang diukur oleh photodiode array. 2) Atomic-Emission Spectroscopy (AES) atau Optical Emission Spectroscopy (OES); cara kerjanya: campuran sample-gas yang keluar dari column diberi tambahan energy sehingga atom-atomnya bereksitasi; sumber energy tambahan ini (excitation source) terdiri dari beberapa jenis yaitu direct-current-plasma (DCP), flame, inductively-coupled plasma (ICP) dan laser-induced breakdown (LIBS); sinar eksitasi dari berbagai atom ini kemudian diukur secara simultan oleh polychromator dan multiple detector; polychromator disini berfungsi sebagai wavelength selector. 3) Chemiluminescense Spectroscopy; cara kerjanya sama seperti pada AES yaitu mengukur sinar eksitasi dari sample yang diberi tambahan energy; perbedaan dari AES adalah eksitasi molekul sample bukan atom sample; selain itu, energy tambahan yang diberikan bukan berasal dari sumber energy luar seperti lampu atau laser tetapi dihasilkan dari reaksi kimia antara sample dan reagent; sinar eksitasi molekul sample ini kemudian diukur dengan photomultiplier detector (PTM). 4) Electron Capture Detector (ECD); menggunakan radioactive beta emitter (electron) untuk mengionisasi sebagian gas (carrier gas) dan menghasilkan arus antara biased pair of electron; ketika molekul organik yang mengandung electronegative functional groups seperti halogen, phosphorous dan nitro groups dilewati detector, mereka akan menangkap sebagian electron sehingga mengurangi arus yang diukur antara electrode. 5) Flame Ionization Detector (FID); terdiri dari hydrogen/air flame dan collector plate; sample yang keluar dari column dilewatkan ke flame yang akan menguraikan molekul organik dan menghasilkan ion-ion; ion-ion tersebut dihimpun pada biased electrode (collector plate) dan menghasilkan sinyal elektrik. 6) Flame Photometric Detector (FPD); digunakan untuk mendeteksi kandungan sulfur atau phosphorous pada sample. Peralatan ini menggunakan reaksi chemiluminescent sample dalam hydrogen/air flame; sinar eksitasi sebagai hasil reaksi ini kemudian diukur oleh PMT. 7) Mass Spectrometry (MS); mengukur perbedaan mass-to-charge ratio (m/e) dari ionisasi atom atau molekul untuk menentukan kuantitasi atom atau molekul tersebut. 8.) Nitrogen Phosphorus Detector (NPD); prinsip kerjanya hampir sama dengan FID, perbedaan utamanya adalah hydrogen/air flame pada FID diganti oleh heated rubidium silicate bead pada NPD; sample dari column dilewatkan ke hot bead; garam rubidium yang panas akan memancarkan ion ketika sample yang mengandung nitrogen dan phosphorous melewatinya; sama dengan pada FID, ion-ion tersebut dihimpun pada collector dan menghasilkan arus listrik. 9) Photoionization Detector (PID); digunakan untuk mendeteksi aromatic hydrocarbon atau organo-heteroatom pada sample; sample yang keluar dari column diberi sinar ultraviolet yang cukup sehingga terjadi eksitasi yang melepaskan electron (ionisasi); ion/electron ini kemudian dikumpulkan pada electroda sehingga menghasilkan arus listrik. 10) Thermal Conductivity Detector (TCD); TCD terdiri dari electrically-heated wire atau thermistor; temperature sensing element bergantung pada thermal conductivity dari gas yang mengalir disekitarnya; perubahan thermal conductivity seperti ketika adanya molekul organik dalam sample yang dibawah carrier gas, menyebabkan kenaikan temperature pada sensing element yang diukur sebagai perubahan resistansi. 11) Photodiode Array Detector (PAD); merupakan linear array discrete photodiode pada sebuah IC; pada spectroscopy, PAD ditempatkan pada image plane dari spectroscopy sehingga memungkinkan deteksi panjang gelombang pada rentang yang luas bisa dilakukan secara simultan.

Data Aquisition, berfungsi sebagai: 1) Control automatic calibration; 2) Gas analysis; dan 3) Graphics & Reporting. Data aquisition merupakan perangkat gabungan dari Software dan Hardware (PC, Interface & Communication). Technical Specification; Beberapa parameter yang menjadi ukuran spesifikasi teknis GC, antara lain: 1) Analytes; menyatakan komponen-komponen yang akan dianalisa/dideteksi. 2) Quantification limit (detectability); menyatakan kemampuan deteksi terkecil, dinyatakan dalam persen. 3) Measurement range; menyatakan kemampuan rentang pengukuran GC. 4) Communication Port ; digital port untuk komunikasi dengan PC atau perangkat digital lainnya. 5) Electrical Power Supply (voltage, phase, frequency, power).

Autoanalyser
Autoanaliser adalah suatu alat yang pada prinsipnya diciptakan manusia untuk memudahkan pekerjaan manusia. Autoanaliser didesign untuk bekerja dengan ketelitian tinggi dan dengan waktu yang cepat serta dapat menangani banyak sampel sekaligus. Pada laboratorium klinik terdapat 2 macam autoanaliser, yaitu: a. Autoanaliser untuk pemeriksaan hematologi Adalah alat yang digunakan untuk memeriksa darah lengkap dengan cara menghitung dan mengukur sel-sel darah secara otomatis berdasarkan variasi impedansi aliran listrik atau berkas cahaya terhadap sel-sel yang dilewatkan. Alat ini bekerja berdasarkan prinsip flow cytometer. Flow cytometri adalah metode pengukuran [= metri] jumlah dan sifat-sifat sel [= cyto] yang dibungkus oleh aliran cairan [= flow] melalui celah sempit. Ribuan sel dialirkan melalui celah tersebut sedemikian rupa sehingga sel dapat lewat satu per satu, kemudian dilakukan penghitungan jumlah sel dan ukurannya. Alat ini juga dapat memberikan informasi intraseluler, termasuk inti sel. Pemeriksaan yang bisa dilakukan oleh autoanaliser jenis ini adalah kadar Hb, Jumlah sel-sel darah ( eritrosit, lekosit, trombosit) , Jenis lekosit, hematokrit, dsb. b. Autoanaliser untuk pemeriksaan kimia klinik Autoanaliser ini digunakan untuk pemeriksaan kimia klinik, yaitu mengukur kadar zatzat yang terkandung dalam darah, contohnya adalah glukosa, asam urat, SGOT, SGPT, kolesterol, trigliserid, gamma GT, albumin,dsb.

Prinsip dari alat ini adalah melakukan prosedur pemeriksaan kimia klinik secara otomatis mulai dari pemipetan sampel, penambahan reagen, inkubasi, serta pembacaan serapan cahayanya. Kelebihan autoanaliser adalah bahwa tahapan analitik dapat dilakukan dengan cepat dan bisa digunakan untuk memeriksa sampel dengan jumlah banyak secara bersamaan.

Autoanaliser memang sangat membantu analis dalam mengerjakan tahapan analitik namun perlu diperhatikan, setiap hari baik autoanaliser hematologi atau kimia klinik harus selalu dikalibrasi untuk menjamin keakuratan hasil. Untuk autoanaliser kimia klinik, cara kalibrasinya adalah dengan menggunakan serum control. Serum yang sudah diketahui komposisi dan kadarnya diperiksa dengan menggunakan autoanaliser seperti memeriksa sampel. Hasil yang didapat

dibandingkan dengan kadar serum control. Jika masih dalam range, maka autoanaliser masih memberikan hasil yang valid sehingga dapat digunakan untuk memeriksa sampel. Begitu juga untuk autoanaliser hematologi, digunakan darah yang konsentrasinya sudah diketahui dengan pasti. Darah control tersebut dilakukan pemeriksaan sama seperti pemeriksaan sampel lalu hasilnya dibandingkan dengan kadar darah control sebenarnya. Kalibrasi yang seperti dijelaskan di atas dilakukan setiap hari sebelum melakukan pemeriksaan pada sampel sehingga hasil yang didapatkan akurat. Berikut ini adalah beberapa contoh dari autoanaliser:

Mindray

Sysmex

ABX Pentra