Medios de cultivo.

Preparacin y clasificacin

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TEMA 3
MEDIOS DE CULTIVO. PREPARACIN Y CLASIFICACIN

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NDICE

1. INTRODUCCIN....................................................................pg. 3

2. CLASIFICACIN DE MEDIOS DE CULTIVO.............................pg. 3

3. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO...pg. 6

4. CAUSAS DE ERROR EN LA PREPARACIN.pg. 8

5. CONSERVACIN DE MEDIOS DE CULTIVOpg. 9

6. ELIMINACIN DE MEDIOS DE CULTIVOpg. 10

7. SUSTANCIAS INHIBIDORAS..pg. 10

8. FACTORES DE CRECIMIENTO (X, Y).pg. 11

9. BIBLIOGRAFA....pg. 12

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1. INTRODUCCIN
Se entiende por cultivo al crecimiento de una poblacin microbiana en un medio adecuado para ello, denominado medio de cultivo, el cual est formado por una serie de sustancias nutritivas y de soporte. Los medios de cultivo deben reunir una serie de requisitos para cumplir su funcin, los ms significativos son: Contener los productos necesarios para el crecimiento del microorganismo que se siembra y las sustancias soporte en la proporcin adecuada para no inhibir su desarrollo. Utilizarse estril. Encontrarse envasado en recipientes (tubos, placas, etc.) que permitan mantener su esterilidad y faciliten su manejo. Poseer los factores clave para el desarrollo de los microorganismos: pH, presin osmtica, temperatura, etc.

2. CLASIFICACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

Segn su CONSISTENCIA (estado fsico)

Medios lquidos: Son los que se presentan en este estado, denominndose por esta razn caldos. El medio lquido ms utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtencin de una suspensin bacteriana de una determinada concentracin. Medios slidos: Se preparan a partir de los medios lquidos, agregndoles un agente gelificante. Los ms utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina: Es una protena animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y adems su uso est muy limitado porque su punto de fusin es bajo (lica a temperatura ambiente) razn por la que no puede utilizarse para cultivos a 37C, que es la tempera ptima de crecimiento para muchos microorganismos. Agar-agar: Es un polmero de azcares obtenido de algas marinas. Se trata de una molcula insoluble en agua pero soluble en agua caliente. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se produce, se utiliza en trabajo microbiolgico, por lo que es importante la ausencia de metales txicos. Medios semislidos: Se preparan a partir de los medios lquidos, agregando a stos un agente solidificante en una proporcin menor que para preparar medios slidos. Uno de sus usos es la investigacin de la movilidad de las bacterias.

Medios de cultivo. Preparacin y clasificacin Segn su UTILIZACIN

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Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mnimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio ms conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar comn, que resulta de la adicin de agar al caldo nutritivo. Otros representantes de este grupo son el agar tripticase de soja, el agar Columbia, etc. Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, adems de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adicin de sangre u otros productos biolgicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible aadir suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo (p. ej. Polivitex, Isovitalex, etc). El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cistena para su crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada adicionada al medio de cultivo (agar chocolate). Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una poblacin polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una poblacin microbiana especfica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del resto de enterobacterias. Medios inhibidores: Cuando las sustancias aadidas a un medio selectivo impiden totalmente el crecimiento de una poblacin microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores podran considerarse como una variante ms restrictiva de los medios selectivos. Los medios inhibidores se consiguen habitualmente por adicin de sustancias antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba completamente el desarrollo de una poblacin determinada. Un medio inhibidor es el MacConkey que permite el crecimiento de los grmenes Gram negativos e impide el crecimiento de los Gram positivos. Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia caractersticas bioqumicas que ayuden a diferenciar gneros o especies. La adicin de un azcar fermentable o un sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los grmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. Tambin lo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemlisis), el SS (que es doblemente diferencial), etc. Medios de identificacin: Son los destinados a comprobar alguna cualidad especfica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los microorganismos, el sustrato especfico que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. El agar Kligler, el medio de Simmons y en general, cualquier medio al que se le haya aadido un elemento diferencial de un microorganismo, son medios utilizados en identificacin. Medios de multiplicacin: Sirven para obtener una gran cantidad de clulas a partir de un microorganismo ya aislado. Se emplean en la obtencin de vacunas, en la investigacin y en la industria. Los medios ms adecuados para la multiplicacin suelen

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ser lquidos. El caldo-infusin cerebro-corazn (BHI), es un ejemplo tpico de estos medios. Medios de conservacin: Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos interese mantener. Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las pruebas y reactivos utilizados en el Laboratorio de Microbiologa. En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas: haciendo pases peridicos de placa a placa mediante liofilizacin de una suspensin bacteriana congelando las cepas en leche descremada estril al 0,1%

Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clnicas que no pueden sembrarse inmediatamente. Su utilizacin debe hacerse introduciendo la torunda con la que se obtuvo la muestra en el interior del medio (generalmente en un tubo). Son ejemplos tpicos de este grupo los medios de Stuart-Amies,Cary-Blair, etc. Atendiendo a su COMPOSICIN Medios complejos: Fueron los primeros utilizados y los ms empleados, se preparan a partir de tejidos animales, y ms raramente de vegetales. Su composicin no es exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no podr ser exacta. En la prctica corriente estos medios dan excelentes resultados y son los ms empleados. Medios sintticos: Son aquellos que contienen en su composicin exclusivamente sustancias qumicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de composicin perfectamente definida. Medios semisintticos: El gran nmero de factores de crecimiento exigidos para ciertos grmenes hace que la fabricacin de un medio sinttico para estos grmenes sea imposible o demasiado caro. En este caso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgnico complejo (extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.).Ciertos grmenes no crecen en ningn medio por muy enriquecido que est ste, hacindolo exclusivamente en clulas vivas con unas caractersticas determinadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias, etc. Segn su ORIGEN: Naturales: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal, de composicin no rigurosamente constante. Ejemplo: el suero, la leche, etc. Sintticos: son medios compuestos por productos qumicos conocidos y se usan para estudios metablicos. Ejemplo: agar nutritivo, agar blando, caldo nutritivo,etc.

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3. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

La manipulacin adecuada de determinados ingredientes nutritivos, permite obtener una fuente de alimentacin y un ambiente adecuado para que puedan crecer y desarrollarse los microorganismos en las condiciones ms idneas. MATERIAL Vasos de precipitado de 250 500 ml Matraces Erlenmeyer de 250 500 ml Placas de Petri Pipetas de 10 25 ml de boca ancha o dosificador Pape indicador de pH o peachmetro Tubos de cultivo Autoclave Balanza Algodn graso Papel de aluminio

REACTIVOS Ingredientes para medios de cultivo o medio de cultivo deshidratado Hidrxido sdico al 1% Acido clorhdrico al 1%

TCNICA ELECCIN DE INGREDIENTES: slo cuando se elabora un medio de cultivo a partir de los elementos que lo componen. Este paso es poco frecuente (dadas las posibilidades comerciales). PESADA: bien de los ingredientes o del medio deshidratado ya preparado comercialmente. HIDRATACIN: el agua utilizada en la reconstitucin debe ser destilada o desionizada y calentada previamente a 50-60 C. Se coloca en un vaso de precipitados la mitad del agua, a la que se aaden los ingredientes o bien el medio, homogeneizando con una varilla agitadora y manteniendo la exposicin al calor. Este se debe aplicar suavemente. AJUSTE DEL pH: se hace imprescindible cuando se parte de los ingredientes por separado. Se mide el pH con un papel indicador o peachmetro. Si no es el requerido se ajustar con las soluciones de cido clorhdrico hidrxido sdico al 1%.

DISTRIBUCIN: para la esterilizacin se distribuir en recipientes que permitan un buen proceso y, cuando sea posible, sean los definitivos para llevar a cabo el cultivo. Se plantean dos posibilidades: Medios en tubo: con una pipeta de boca ancha o un dosificador se deposita en cada tubo la cantidad de medio correspondiente, se tapa con una torunda de algodn graso que se cubre, a su vez, con papel de aluminio y se lleva a esterilizar. Tambin se pueden utilizar tubos con tapn de rosca. Con ello se consigue esterilizar tanto recipiente como medio, por lo que ste estar

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dispuesto para ser sembrado o para almacenar hasta su uso, ya que los tubos constituyen el recipiente definitivo. Medios en placa: se vierte el medio en un matraz Erlenmeyer, no debe ocupar ms de 2/3 de la capacidad total, pues la ebullicin en el autoclave hara que ste rebosase. Antes de esterilizar se tapa de igual forma que los tubos.

ESTERILIZACIN: salvo para medios de gran termolabilidad, se lleva a cabo en el autoclave a 12 atmsferas (121 C) durante 15 minutos. Para volmenes de 250 ml o superiores, se debe prolongar unos minutos ms el tiempo de esterilizacin. Temperaturas ms altas y calentamientos excesivamente prolongados perjudican la calidad del medio de cultivo. VERTIDO EN PLACAS: tras la esterilizacin, se extrae del autoclave el recipiente con el medio de cultivo y se homogeneiza movindolo en sentido rotatorio. El vertido en placas se debe realizar cuando el medio se encuentra a una temperatura prxima a la gelificacin (45-55 C), con ello se evita la excesiva formacin de agua de condensacin sobre la tapa de las placas. Para el llenado se utilizan pipetas estriles de 10 25 ml de boca ancha o un dosificador estril, ste es ms adecuado para evitar la obturacin por el agar. Las placas estn estriles, por lo que la tcnica de vertido debe realizarse manteniendo dichas condiciones. El volumen del medio que se debe depositar en una placa, segn el espesor de capa deseado y las dimensiones de la misma son:

Dimetro de la placa (cm)

Espesor (mm) 2 4 25 60 6 37,5 90

9 15

12,5 60

ENFRIAMIENTO: Medios lquidos: tal y como se extraen del autoclave, se dejan enfriar a temperatura ambiente. Medios slidos: Tubos: se dejan solidificar a temperatura ambiente en posicin vertical (agar horizontal) u oblicua (agar inclinado). Placas: tras el vertido en la placa, debe asegurarse que no existen burbujas mediante movimiento rotatorio de la placa mientras el medio est todava lquido. Durante el enfriamiento se encontrarn sobre superficies perfectamente horizontales para que el medio, al solidificar, tenga el mismo espesor en toda su extensin.

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4. CAUSAS DE ERROR EN LA PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

ALTERACIN Variacin de pH POSIBLES CAUSAS Sobrecalentamiento Agua no neutra Recipientes contaminados Determinacin del pH con el medio caliente Error de pH Sobrecalentamiento Refundidos repetidos Recipientes contaminados Sobrecalentamiento Agua insuficientemente desionizada pH desajustado Naturaleza del medio Uso de recipientes demasiados pequeos que no permitan una buena mezcla. Proporcin medio de cultivo deshidratado-agua inadecuada Medio mal disuelto Sobrecalentamiento sobretodo en los medios de pH cido Homogeneizacin insuficiente Refundidos repetidos Sobrecalentamiento Refundidos repetidos Proporcin descompensada de ingredientes Mala esterilizacin Utilizacin de material no estril Tcnica de preparacin inadecuada Conservacin deficiente Proporcin medio de cultivo deshidratado-agua inadecuada Conservacin deficiente Refundidos repetidos

Variacin de color

Solubilizacin completa (turbidez, precipitacin, grumos, etc.)

Gelificacin incompleta

Incapacidad nutritiva o diferencial

Contaminacin

Deshidratacin

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5. CONSERVACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

Si no se dispone de autoclave, se pueden esterilizar los medios en bao Mara hirviente o en una olla a presin durante 30 minutos, repitiendo la operacin durante das consecutivos. Los ingredientes o medios deshidratados se conservarn protegidos de la humedad, la luz y calor en armarios o estanteras adecuados. Los recipientes deben de ser de plstico o vidrio opaco y con cierre hermtico, no deben abrirse en ambientes hmedos y deben desecharse cuando se apelmacen. Se controlar peridicamente su fecha de caducidad. Los medios hidratados y esterilizados tienen un tiempo limitado de conservacin. En general, si no se indica lo contrario, pueden conservarse hasta 4-6 semanas en condiciones adecuadas. El problema ms frecuente es la deshidratacin. Se tendrn en cuenta las siguientes recomendaciones: Almacenarlos en nevera a 4 C. Tambin se pueden conservar a temperatura ambiente, aunque su duracin es ms limitada (1-2 semanas). No deben guardarse a temperaturas por debajo de 0 C, pues se altera la estructura de gel. Protegerlos de la luz, para ello puede envolverse el recipiente en papel de aluminio. Los tubos con cierre hermtico (tapn o rosca), son ms recomendables que las torundas de algodn. Los medios para verter en placa, se conservan mejor en el frasco original, aunque pueden guardarse en ellas teniendo en cuenta que: Se deben refrigerar inmediatamente despus de su solidificacin Se protegern contra la desecacin precintando con cinta adhesiva su borde lateral o envolviendo varias en bolsas de plstico. Se recomienda mantenerlas en posicin invertida, para evitar la cada al medio del agua de condensacin que favorece la contaminacin.

Los medios conservados en refrigerador deben ser atemperados antes de su empleo, a temperatura ambiente o en estufa de cultivo. Ello evitar la condensacin de humedad ambiental en la superficie del medio y el retraso del crecimiento microbiano. No se utiliza nunca medios con excesiva deshidratacin, la cual se manifiesta por: Medios lquidos: disminucin de volumen o aumento de concentracin. Medios slidos: disminucin de espesor, agrietamiento, retraccin, cambio aparente de color, etc.

Algunos medios son conservados en estado slido en el recipiente original, y despus son refundidos para su distribucin. Las precauciones a tener en cuenta en este proceso son: No debe realizarse con medios cidos (pH < 5), ya que se alteran sus caractersticas (el agar-agar se hidroliza al calentarse en medio cido) Si se mantienen fundidos periodos de tiempo superiores a 60 minutos, la calidad del medio puede disminuir considerablemente. Se aconseja refundir a bao Mara o en autoclave a vapor fluente durante 30 minutos. Nunca aplicar calor directo.

Se dispone comercialmente de medios hidratados listos para su uso. En ocasiones se presentan en su recipiente definitivo, mientras que en otros casos hay que refundirlos y distribuirlos.

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6. ELIMINACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

Cualquier medio de cultivo, sobre todo si ha sido sembrado, es un posible foco de contaminacin. Por tanto, siempre se debe descontaminar tras su utilizacin. Se puede realizar mediante: Inundacin con una solucin desinfectante: se cubre su superficie con la solucin desinfectante y se deja actuar, como mnimo, durante 6 horas (se recomienda de 12-24 horas). Se utiliza, sobre todo, cuando no se dispone de autoclave. Esterilizacin en autoclave. Incineracin: se debe disponer de incineradores adecuados. Se utiliza para microorganismos muy patgenos. Slo despus de la descontaminacin del medio de cultivo se proceder a la limpieza de sus recipientes (cuando stos sean recuperables).

7. SUSTANCIAS INHIBIDORAS
Un compuesto puede actuar como inhibidor para algunos microorganismos y para otros no. Entre los factores que inhiben el crecimiento de bacterias indeseables tenemos: Antispticos: sustancias antibacterianas inespecficas que pueden actuar como inhibidores. Por ejemplo: el medio de cultivo comercial S S (Salmonella Shigella) que contiene verde brillante (inhibe las bacterias grampositivas) y sales biliares (que inhiben un gran nmero de gramnegativas menos enterobacterias). Otro ejemplo es el medio de Mc Conkey que contiene cristal violeta (inhibe las grampositivas pero no las enterobacterias) Antibiticos: sustancias antibacterianas especficas que impiden el crecimiento de aquellos microorganismos que no nos interesa que crezcan en ese medio. Un ejemplo es el medio de Thayer-Martin con VCN (vancomicina, colistina y nistatina) que se utiliza para el aislamiento de gonococos. La penicilina en una concentracin de 5,50 unidades/ml inhibe la mayora de las grampositivas. Otro ejemplo es el medio de Sbourand-cloranfenicol para el aislamiento de Cndida albicans.

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8. FACTORES DE CRECIMIENTO (X, Y)

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial este debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuadas, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. Es importante elaborar una curva de crecimiento para determinar las caractersticas de crecimiento de las clulas que se estn cultivando. Dan informacin sobre la frecuencia de los pases y permiten predecir el nmero de clulas viables disponibles para necesidades futuras. Las curvas de crecimiento se pueden realizar utilizando papel estndar o semilogartmico. El nmero de clulas se registra sobre el eje y , y el tiempo transcurrido sobre el eje x. El grfico puede presentar una fase de eclipse inicial en la que el crecimiento celular es escaso, y posteriormente la concentracin se incrementar de forma logartmica (fase exponencial). Tras varios das, la tasa de incremento celular se frena y en ocasiones ya no aumenta (fase de meseta) e incluso puede comenzar a disminuir.

- La fase lag es la de adaptacin al cultivo, donde las clulas no se estn dividiendo. Su duracin depende de la fase de crecimiento en la que se encontraban las clulas en el momento del pase, y de la densidad de la siembra. - La fase log es la de proliferacin activa, de crecimiento celular, existe divisin celular. Es la fase en la que se congela si se quiere. - La fase estacionaria se alcanza a medida que las clulas van confluyendo, por lo que la tasa de proliferacin va decayendo. Las clulas en esta fase son ms sensibles al dao. - La fase de declive es el periodo de disminucin del nmero de clulas debido a la descompensacin entre la muerte y la tasa de proliferacin.

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9. BIBLIOGRAFA
Microbiologa bsica para el rea de la salud y afines. 2 edicin. Hugo Humberto Montoya Villafae. Editorial Universidad de Antioquia. 2008. Pginas web: http://perso.wanadoo.es/sergioram1/medios_de_cultivo.htm www.educa2.madrid.org/cms.../Medios%20de%20cultivo.pdf