Quim. Nova, Vol. 27, No.

4, 586-592, 2004 MTODOS PARA ANLISE DE CIDO CLOROGNICO

Reviso

Carlos Alberto Bastos De Maria* e Ricardo Felipe Alves Moreira Departamento de Cincias Fisiolgicas, Instituto Biomdico, Universidade do Rio de Janeiro, Rua Frei Caneca, 94, 20211-040 Rio de Janeiro - RJ Recebido em 11/12/02; aceito em 1/4/04; publicado na web em 27/05/04

ANALYTICAL METHODS FOR CHLOROGENIC ACID. This paper describes the analytical methods for determination of total chlorogenic acid (CGA) and their individual isomers. Spectrofotometric methods are adequate for total CGA analysis in green coffee but they can provide inflated results for coffee products. High pressure liquid chromatography (HPLC) with gel permeation column and ultraviolet (UV) monitoring is adequate for the simultaneous analysis of total CGA, alkaloids and sugars in coffee products. HPLC-UV-reversed phase is a simple, rapid and precise method for the determination of the individual isomers of CGA. Gas chromatography (GC) also is applied to the analysis of the individual isomers but phenolic acids need to be derivatized before analysis. Both HPLC- and GC-mass spectrometry provide an unequivocal identification of the individual isomers. The capillary electrophoresis method is simple, rapid and adequate to the simultaneous analysis of polyphenols and xanthines. Advantages and limitations of each method are discussed throughout the text. Keywords: total chlorogenic acid; individual isomers; analytical methods.

INTRODUO O termo cido clorognico (ACG) parece ter sido introduzido em 1846 por Payen1 para designar um composto fenlico com funo cida, de estrutura ainda desconhecida, que conferia cor verde ao meio aquoso quando em meio levemente alcalino e exposto ao ar. Esse cido foi isolado em 19072 na forma de um complexo cristalino, denominado clorogenato de cafena, a partir do qual se preparou um cido puro. A estrutura qumica para este composto foi estabelecida por Fischer3 como cido 3-cafeoilqunico (atualmente conhecido como cido 5-cafeoilqunico). Mais tarde, outros compostos fenlicos cidos foram isolados, caracterizados quanto estrutura qumica e agrupados na mesma famlia4. Atualmente, o termo ACG usado para designar uma famlia de steres formados pela esterificao de um ou mais derivados do cido trans-cinmico (Figura 1a) com o cido qunico (cido 1L-1(OH),3,4,5- tetra-hidroxiciclohexanico); este ltimo tem hidroxilas na posio axial nos carbonos 1 e 3 e hidroxilas equatoriais nos carbonos 4 e 5 (Figura 1b). Os ismeros cis dos derivados do cido cinmico j foram detectados em produtos processados, porm no tm sido detectados naqueles in natura5. Esses compostos fenlicos podem ser subdivididos pela identidade do derivado do cido cinmico, nmero e posio dos resduos acila. Os grupos majoritrios (Figura 1e), encontrados na natureza, esto relacionados abaixo: 1- ster do cido cafico (Figura 1c) com o cido qunico (cido cafeoilqunico - ACQ) (ismeros 3-, 4-, 5-) 2- ster de dois resduos do cido cafico com um de cido qunico (cido dicafeoilqunico - diACQ) (ismeros 3,4-, 3,5-, 4,5-) 3- ster do cido ferlico (Figura 1d) com o cido qunico (cido feruloilqunico - AFQ) (ismeros 3-, 4-, 5-). O grupo mais abundante na natureza o ACQ e, portanto, existe uma extensa literatura a seu respeito. Em suas revises Clifford5,6 descreveu a presena de triACQ e tetraACQ na famlia Asteraceae. Em algumas famlias foram descritos os cidos sinapoilqunicos, os

*e-mail: carreb@uol.com.br

Figura 1. Estrutura dos ismeros do ACQ e AFQ: a) cido trans-cinmico; b) D-(-)-cido qunico; c) cido cafico; d) cido ferlico e e) R = OH, cido 5-cafeoilqunico, R = OCH3, cido 5-feruloilqunico. A esterificao tambm possvel nos tomos do carbono 3,4 do cido qunico

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cumaroilqunicos e os conjugados do cido cafico com dicidos alifticos (ex. cidos oxlico e succnico) e com o cido qunico. Esses grupos tm representao restrita e so muito pouco estudados. Nesta reviso, somente sero abordados os mtodos de anlise para os ACQ, diACQ e AFQ. importante enfatizar que ser usada, ao longo desta reviso, a nomenclatura da IUPAC7, que identifica o representante majoritrio da famlia ACG, na natureza, como o 5ACQ, cuja recomendao de que a numerao deva seguir a direo onde h o maior nmero de substituintes no anel do cido qunico (Figura 1). Entretanto, alguns autores insistem em descrever o 5ACQ, principalmente por questo histrica, como 3-ACQ ou mesmo ACG, termos estes bastante usados antes da sistematizao pela IUPAC. Os nomes triviais tambm so usados para ismeros de outros grupos, no entanto, de uso bem mais restrito. Na Tabela 1, so listados os nomes triviais para ACQ e diACQ. Nesta reviso, o termo ACG ser usado para designar o conjunto de ismeros dos grupos ACQ, diACQ e AFQ presente em uma matriz. Tabela 1. Nomes triviais para ismeros do ACQ e diACQ Nomes IUPAC 3-ACQ 4-ACQ 5-ACQ Mistura dos ismeros: 3,4-; 3,5-; 4,5-diACQ Trivial cido clorognico* cido criptoclorognico, banda 510 cidos: isoclorognico, neoclorognico, clorognico (ainda bastante usado) cido isoclorognico

sena de um grupamento orto-di-hidroxila no anel aromtico do cido cafico (Figura 1c), que atuaria como um aceptor de radicais livres14. De fato, a oxidao in vitro de LDL (lipoprotena de baixa densidade) humana foi retardada na presena de cido cafico15. O ACG pode ser facilmente oxidado por polifenoloxidases a o-quinonas, que poderiam interagir com grupamento NH 2 de aminocidos proticos reduzindo o valor nutricional dos alimentos16. Em outro trabalho, foi relatado que o 5-ACQ inibiu as enzimas -amilases, tripsina e lisozima, atravs da formao de ligao covalente com resduos de triptofano e cistena17. Por outro lado, este ismero mostrou propriedades anti-inflamatrias devido a sua capacidade de inibio do processo inflamatrio mediado por citocinas18. J o consumo de altas doses de 5-ACQ, presentes na bebida de caf, aumentou os nveis de homocistena no plasma de humanos19. Esse aminocido no protico um dos fatores de risco para o surgimento de doenas cardiovasculares. Essa variedade de efeitos benficos e malficos atribuda ao ACG, preponderantemente ao 5-ACQ, tem encorajado muitos pesquisadores a trabalhar com essa famlia de compostos fenlicos. A escolha de um mtodo de anlise adequado para se desenvolver estudos com esses componentes de suma importncia. O objetivo desta reviso apresentar uma abordagem crtica dos mtodos analticos disponveis para determinao do contedo de ACG total e dos ismeros individuais do ACQ, diACQ e AFQ. MTODOS ANALTICOS Gravimetria e volumetria O primeiro mtodo analtico desenvolvido para quantificao da famlia ACG em plantas foi publicado por Charaux20. Seu mtodo foi baseado na precipitao seletiva do ACG com sal de chumbo neutro, hidrlise cida do clorogenato de chumbo, saponificao e extrao com ter. Aps a evaporao do ter, o contedo de ACG foi determinado por gravimetria. At o final da dcada de 30, o mtodo gravimtrico desenvolvido por Charaux20 foi o mais usado para a anlise semi-quantitativa do contedo de ACG. Slotta e Neisser21 desenvolveram um mtodo volumtrico semi-quantitativo que consistiu na extrao aquosa do caf seco e desengordurado, precipitao com acetato de chumbo neutro e hidrlise do clorogenato de chumbo com cido sulfrico. Em seguida, foi adicionada uma soluo de iodo e a gerao de iodato ocorreu pela adio posterior de hidrxido de sdio. A soluo ento foi titulada com tiossulfato de sdio. O maior problema com esse mtodo volumtrico foi a reao de outros compostos fenlicos, produtos da pirlise de glicdios, com o iodo, causando uma superestimativa do contedo de ACG. Espectrofotometria Moores e colaboradores22 desenvolveram um mtodo espectrofotomtrico de baixo custo para anlise de ACG em cafs verde (no processado) e torrado, baseado na absoro seletiva destes compostos na regio do espectro de ondas eletromagnticas conhecida como ultravioleta (UV). Inicialmente, a matriz desengordurada foi submetida extrao aquosa e, em seguida, foi feita uma anlise da absorvncia no comprimento de onda de 324 nm. Posteriormente, foi adicionado acetato de chumbo bsico ao extrato aquoso de caf resultando na precipitao do clorogenato de chumbo. Eles verificaram que, aps a precipitao com acetato de chumbo, cerca de 98% da absoro no comprimento de onda de 324 nm, no extrato do caf verde, foi perdida indicando que a absoro neste comprimento de onda foi devida presena de compostos da famlia ACG22. No caso do caf torrado, mesmo aps a precipitao, permanecia no extrato

*Alguns autores ainda insistem em usar esse nome trivial para o 3ACQ, enquanto a maioria dos autores usa o mesmo termo para designar o 5-ACQ; ACQ cido cafeoilqunico; diACQ cido dicafeoilqunico. Informaes baseadas nas refs. 7 e 29. O ACG encontrado em uma gama de alimentos de origem vegetal. O caf uma das principais fontes de ACG na dieta humana e uma xcara da bebida (200 mL) pode conter cerca de 20-675 mg, dependendo da espcie de caf e das condies de processamento5. J a batata inglesa pode fornecer de 50-120 mg de ACG por 100 g de matria seca. A ma um dos frutos mais estudados, podendo conter de 6,2-38,5 mg % de ACQ, enquanto o tomate contm em torno de 1-8 mg %5. Um grupo de frutos tropicais foi analisado quanto ao teor de ACQ, AFQ e diACQ na casca, polpa e semente8. O 5-ACQ foi o ismero encontrado em maior quantidade nos frutos, independente da parte do fruto analisada. De modo geral, as sementes contm um teor muito baixo de ACQ. A casca da jaca apresentou quantidade expressiva de 5ACQ (1300 mg %). Por outro lado, a polpa do marmeleiro foi a mais rica (173 mg %), enquanto a do abiu (47,3 mg %) e a da graviola (47,4 mg %) mostraram valores mais baixos8. Uma amplitude de funes nas plantas tem sido relacionada presena de ACG. Clifford e Ohiokpehai9 encontraram evidncias das propriedades adstringentes do diCQA, que influenciaram negativamente a aceitabilidade da bebida de caf. J o 5-ACQ parece inibir a atividade das enzimas cido indolactico oxidase 5,10 e fosforilase11, relacionadas ao fim do estgio de dormncia e ao incio do processo de desenvolvimento da planta. A partir da dcada de 80, os efeitos protetores e deletrios do ACG, particularmente o 5-ACQ, sobre clulas de espcies do reino animal, foram abordados em diferentes trabalhos. Alguns autores mostraram que o 5-ACQ foi um agente indutor de alteraes no DNA de mamferos12. J Ohnishi e colaboradores13 verificaram seu efeito antioxidante na reduo da hemlise e da peroxidao de hemcias de ratos, induzida por H2O2. Essa ao antioxidante devida pre-

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uma frao que absorvia no comprimento de onda de 324 nm, composta de produtos formados durante o processamento trmico. Conseqentemente, o contedo de ACG no caf torrado foi determinado pela diferena na absoro no comprimento de onda de 324 nm antes e aps a precipitao com acetato de chumbo. Aps pequenas modificaes, introduzidas por Weiss23, particularmente a adoo de um fator de correo de 0,002 mg/mL para corrigir a pequena quantidade de clorogenato de chumbo solvel no meio, o mtodo espectrofotomtrico de absoro do UV foi adotado oficialmente pela Association of Official Analytical Chemists (AOAC)24. Clifford e Wight25,26 usaram a espectrofotometria de absoro da luz visvel e do UV para determinao quantitativa de ACG total e ACQ em caf. Eles observaram que uma soluo aquosa de metaperiodato de sdio reagiu com o-, p-dihidroxi-fenis (ACQ) e seus monometil-teres (AFQ) produzindo naftoquinonas, as quais foram detectadas no comprimento de onda de 406 nm 25. Clifford e Wight26 verificaram que os produtos da reao de uma soluo aquosa de molibdato de sdio e sais de fosfato com o ACQ, diACQ e o cido cafico livre absorviam seletivamente nos comprimentos de onda de 370 nm (ACQ + diACQ) e 353 nm (cido cafico). A diferena entre o resultado obtido com o reagente metaperiodato (ACG total) e o obtido com o reagente molibdato (ACQ + diACQ) permitiu a estimativa do contedo de AFQ no caf26. Cromatografias em papel, adsoro e camada delgada A partir da dcada de 50, houve a necessidade de se desenvolver mtodo adequado anlise de ismeros individuais, particularmente dos grupos ACQ e AFQ, cujas estruturas qumicas j tinham sido elucidadas. A cromatografia em papel foi uma das tcnicas usadas para a resoluo de ismeros individuais27. A quantificao dos ismeros do ACQ e AFQ foi conduzida, principalmente, pela anlise da absorvncia na regio do UV ( = 310-330 nm). Um outro mtodo foi baseado na separao dos ismeros por cromatografia de adsoro sobre slica28. A quantificao foi conduzida com base na anlise da absorvncia do UV ( = 325-330 nm). Esse mtodo permitiu separar pela primeira vez um grupo de ismeros do ACG, denominado cido isoclorognico, o qual foi caracterizado pela espectroscopia por ressonncia magntica nuclear como 3,4-diACQ, 3,5-diACQ e 4,5-diACQ. Embora a cromatografia de adsoro sobre slica tenha maior preciso que a cromatografia em papel, ambos os mtodos tm aplicao limitada, particularmente porque so extremamente tediosos e somente semi-quantitativos quando aplicados a matrizes com teor baixo de compostos fenlicos. Grodzinska-Zachwieja e colaboradores29 descreveram um mtodo para separao dos ismeros do grupo ACQ, baseado na cromatografia em camada delgada sobre placas com slica gel. A revelao dos ismeros foi conduzida com uma soluo aquosa de nitrato e molibdato de sdio. O mtodo separa satisfatoriamente os 3 ismeros do ACQ, porm consome muito tempo de anlise. Cromatografia gasosa (CG) A CG foi usada pela primeira vez no ano de 195830 para anlise de ismeros individuais do ACQ e diACQ. O extrato aquoso de caf foi liofilizado e, em seguida, submetido reao de derivatizao com trimetil-cloro-silano ou hexametil-disilazano. O extrato de caf foi, ento, injetado diretamente em uma coluna recheada de CG. A separao dos ACQ e diACQ foi razovel, porm a anlise demorada. A quantificao dos compostos fenlicos foi conduzida por padronizao externa, sendo a deteco realizada com o auxlio de um detector de ionizao em chama (DIC). Os ismeros do ACG derivatizados foram identificados pela CG acoplada espectrometria de massas (EM). Em um outro trabalho, houve maior preciso na

anlise dos ismeros do ACQ e diACQ, quando os compostos fenlicos foram derivatizados com trimetil-silil-acetamida31. Com o desenvolvimento da coluna capilar de slica fundida para aplicao em CG, houve um grande avano na anlise de ismeros individuais do ACG32. Comparada coluna recheada, a coluna capilar de vidro e, principalmente, a de slica fundida propiciaram uma reduo do volume de injeo da amostra, bem como melhor resoluo dos ismeros e um menor tempo de anlise. Hughes e Thorpe32 derivatizaram extratos de caf e procederam identificao e quantificao dos ismeros do ACQ e do diACQ pela CG/EM e CG/ DIC, respectivamente. Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) CLAE-UV A partir da metade da dcada de 70, com a introduo da CLAE, houve um grande avano na anlise de ismeros individuais do ACG em extratos vegetais. Rees e Theaker33 usaram a CLAE para a anlise de alguns ismeros individuais do ACQ, diACQ e AFQ em amostras de caf. A coluna do tipo fase reversa (apolar) consistiu de slica, com partculas de 40 m, parcialmente modificada pela ligao covalente com octadecilsilano (ODS). Essa fase estacionria confere apolaridade ao suporte, porm como a ligao qumica no ocorre em toda a sua extenso, uma quantidade razovel de stios silanol permanece inalterada, permitindo a melhor separao dos ismeros 3-AFQ e 4-ACQ. Rees e Theaker33 usaram uma bomba de presso constante e um detector de absorvncia na regio do UV ( = 325 nm). Esses autores separaram os ismeros do diACQ com uma fase mvel composta de cido propinico e gua. J o 5-ACQ e o 3-AFQ foram separados com uma fase mvel consistindo de cido frmico, cido actico e gua. Os maiores inconvenientes deste mtodo foram a necessidade de 2 corridas cromatogrficas, o nmero baixo de pratos da coluna devido ao tamanho da partcula do suporte e o uso de uma bomba de presso constante, que no compensa as variaes de vazo da fase mvel. Court34 usou uma fase mvel composta de metanol e soluo aquosa de di-hidrogeno-fosfato de potssio (0,1 M) para separar compostos fenlicos em tabaco. Ele usou um sistema gradiente, onde a concentrao do metanol aumentou de 20 para 70% em 60 min, conseguindo separar a maioria dos ismeros do ACQ, diACQ e AFQ em uma nica corrida cromatogrfica. William e colaboradores35 usaram a CLAE para anlise de ismeros do ACQ e do diACQ em amostras de batata doce. A fase mvel, a coluna de fase apolar e o comprimento de onda ( = 313 nm) foram similares aos usados por Court34. A grande novidade do mtodo de William e colaboradores35 foi o isolamento dos compostos fenlicos por extrao em fase slida, cuja coluna continha o mesmo material da coluna analtica. Esses compostos ento foram dessorvidos seletivamente com um sistema de solvente contendo acetonitrila/metanol/ gua. Com o desenvolvimento de fases estacionrias contendo micropartculas (5 m), houve um grande avano na anlise de ACG pela CLAE. Esse tipo de fase estacionria permitiu a separao completa de todos os ismeros do ACG. Na Figura 2 apresentado um cromatograma tpico dos ismeros do ACQ e AFQ em extrato de caf, obtido atravs da CLAE. Van der Stegen e Van Duijn36 usaram uma coluna de fase apolar ODS, composta de micropartculas e conseguiram quantificar todos os ismeros do ACQ, diACQ e AFQ, em extratos de caf, numa nica corrida cromatogrfica. Esses autores usaram um gradiente de metanol em soluo aquosa de citrato de tripotssio (pH = 2,5) como fase mvel. Trugo e Macrae37 usaram condies cromatogrficas similares s de Van der Stegen e Van Duijn36, porm descreveram que a extrao com metanol/gua (40/60, v/v), seguida pela clarificao do extrato com reagente de Carrez

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trifluoractico (0,5 %, v/v) e solvente B acetonitrila. Esse mtodo vantajoso para a obteno de padres puros, j que a fase mvel facilmente removida por evaporao. Entretanto, a vida til da coluna menor, em funo do pH muito baixo da fase mvel (pH 2). Tabela 2. Coeficiente de absortividade molar de ismeros do ACG (x104 mol L-1) Compostos 3-ACQ 4-ACQ 5-ACQ 3,4-diACQ 3,5-diACQ 4,5-diACQ = 330 nm 1,84 1,80 1,95 3,18 3,16 3,32 Compostos 3-AFQ 4-AFQ 5-AFQ = 325 nm 1,93 1,95 1,90

ACQ cido cafeoilqunico; diACQ cido dicafeoilqunico; AFQ cido feruloilqunico. Informaes baseadas na ref. 39. O emprego de detectores que permitiram a anlise da absorvncia em todos os comprimentos de onda da regio do UV, em uma nica corrida cromatogrfica, aumentou a preciso da CLAE. O DAD (diode array detector) tem sido usado para a anlise de compostos fenlicos em plantas41-43 e plasma de ratos44. A determinao simultnea de 5-ACQ, epicatequina e isoquercitrina em plasma de ratos foi conduzida pela anlise da absorvncia nos comprimentos de onda de 325, 278 e 360 nm, respectivamente44. O limite de deteco do 5ACQ foi de 0,04 g/mL de plasma. A grande vantagem do DAD que os ismeros de cada grupo podem ser analisados no comprimento de onda especfico onde ocorre o mximo de absoro de cada componente. Entretanto, esses detectores tm um custo mais elevado em comparao aos detectores de UV convencionais. A sensibilidade da deteco no UV tem sido aumentada consideravelmente pelo processo de derivatizao pr- ou ps-coluna. Neste caso, o analito convertido a um derivado qumico cujo nvel de absoro maior que o composto original. Bandoniene e Murkovic45 usaram a CLAE com derivatizao ps-coluna com o radical 2,2-difenila-1picrilhidrazila, para a determinao da capacidade antioxidativa de compostos fenlicos. A anlise foi baseada na reduo da absoro no comprimento de onda de 515 nm. Quanto menor a absoro, maior a atividade antioxidante do composto. Esta tcnica muito pouco usada em funo da necessidade de se fazer um processo de derivatizao especfico para cada analito. CLAE-UV e CLAE-IR (ndice de refrao) com coluna de permeao em gel Foram publicados alguns artigos enfocando a anlise simultnea de cafena, ACG total, trigonelina e sacarose em caf atravs da CLAE com coluna de permeao em gel46-48. O desenvolvimento de fase estacionria estvel mecanicamente, isto , resistente a presses usadas na CLAE, permitiu o uso da coluna de permeao em gel neste tipo de cromatografia. Os compostos foram separados em uma coluna do tipo TSK G3000-SW. Esta coluna adequada para separao de componentes com massa molecular (MM) em torno de 1.000300.000. Entretanto, os ismeros do ACG, a cafena, a trigonelina e a sacarose apresentam uma MM de cerca de 100-700. Embora esses componentes tenham uma MM muito baixa, a resoluo entre eles foi satisfatria, indicando que houve algum outro fenmeno alm da permeao em gel. Foi sugerida a ocorrncia de interaes hidrofbicas, que contribuiriam para a adsoro desses componentes46. O mtodo foi aplicado ento para anlise de: 1- cafena e ACG total em caf solvel com deteco no UV ( = 280 nm)46; 2- cafena, trigonelina e ACG total em caf verde com deteco no UV

Figura 2. Cromatograma tpico dos ismeros de ACG obtidos pela CLAEUV. Fase mvel: metanol-citrato tri-sdio 0,01M (40:60, v/v) pH=2,3. Deteco: 325 nm. ACQ = cido cafeoilqunico. diACQ = cido dicafeoilqunico. AFQ = cido feruloilqunico

(ferrocianeto de potssio + acetato de zinco), foi o mtodo mais adequado para a extrao dos ismeros do ACG em cafs torrado e solvel. De fato, Ky ecolaboradores38, comparando 5 mtodos de extrao de ACG presente em caf, concluram que o mtodo de Trugo e Macrae37 foi o mais adequado no que diz respeito aos parmetros repetibilidade, preciso, rapidez e baixo custo da anlise. Eles verificaram que o uso de extraes sucessivas com ter de petrleo, clorofrmio e acetato de etila aumentou as perdas de ACG e no foi adequado para a anlise de rotina. O uso de cartucho Sep-Pak para extrao em fase slida causou uma impreciso na anlise, j que os ismeros individuais do ACQ e AFQ ficaram fortemente adsorvidos na matriz de octadecilslica. J a extrao com gua quente produziu a perda parcial de ismeros do grupo do diACQ. Ky e colaboradores38 tambm constataram que o uso do reagente de Carrez foi fundamental para a precipitao de material coloidal, particularmente protenas e polissacardeos, que formam complexos com o ACG em pH cido. Trugo e Macrae37 usaram o coeficiente de absortividade molar de cada ismero do ACG, j descrito na literatura39, para determinar a concentrao de cada ismero no caf, baseado no fator de resposta de um padro autntico de 5-ACQ. Esse artifcio importante, j que os ismeros puros do diACQ, AFQ, 3-ACQ e 4-ACQ no esto disponveis para venda. O comprimento mximo de absoro para todos os ismeros ficou entre 325-330 nm, portanto, o uso do comprimento de onda de 325 nm produziu um erro aceitvel (mximo de 2%). Na Tabela 2, apresentado o coeficiente de absortividade molar dos ismeros do ACQ, diACQ e AFQ. Balyaya e Clifford40 tambm usaram a CLAE para a anlise de ismeros individuais do ACG em extratos de caf. Eles utilizaram coluna de fase apolar e fase mvel, no modo gradiente (100% do solvente A para 100% do solvente B em 56 min), composta de solvente A soluo aquosa de cido

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( = 272 nm)47 e 3- cafena, trigonelina, sacarose e ACG total em caf verde com deteco em monitor de ndice de refrao48. Esse mtodo46 foi comparado cromatografia de fase reversa37 e ao mtodo da AOAC24 para anlise de ACG total. O mtodo CLAE com coluna de permeao em gel, aplicado anlise de ACG total em caf verde, apresentou resultados com um alto nvel de correlao (r>0,9) com os da fase reversa e da AOAC. No entanto, no caso dos cafs torrado e solvel, tanto o mtodo com coluna de permeao em gel como o da fase reversa apresentaram resultados significativamente (p<0,01) mais baixos, quando comparados ao da AOAC. Isto sugere que o mtodo da AOAC no adequado para a anlise quantitativa de ACG total em cafs processados. CLAE-EM O maior avano no mtodo da CLAE com coluna de fase apolar foi o seu acoplamento EM. Este mtodo hifenado permitiu conduzir estudos relacionados distribuio dos ismeros do ACG em diferentes compartimentos biolgicos, particularmente o sangue, onde o contedo de compostos fenlicos extremamente baixo. Como j mencionado anteriormente, o 5-ACQ e o cido cafico so os mais estudados em funo dos seus efeitos biolgicos. Existe uma grande controvrsia se o ACG absorvido intacto no trato gastrointestinal49, ou se submetido hidrlise por esterases50,51. Neste ltimo caso, o cido cafico o composto absorvido durante o processo de digesto e absoro. Dados preliminares indicam que o componente majoritrio no sangue o cido cafico e, portanto, caso o 5-ACQ seja absorvido intacto no trato gastrointestinal isso ocorreria em quantidade muito baixa50,51. Esta informao refora a importncia do uso da CLAE-EM na anlise de ismeros do ACG em compartimentos biolgicos. Foram conduzidos alguns estudos para anlise de cido cafico e 5-ACQ no plasma e na urina de seres humanos atravs da CLAE-EM com ionizao por electrospray (IES) 52. O mtodo foi til para monitorar alteraes nos nveis desses compostos fenlicos induzidas pela dieta. Em relao tcnica de extrao, numa matriz como o sangue repleta de colides, o tratamento com betaglicuronidase ou hidrlise alcalina,

seguido de extrao com metanol51 ou mesmo extrao com metanol sem hidrlise prvia49 essencial para a extrao eficiente dos compostos fenlicos. O primeiro mtodo51 interessante para distinguir os cidos fenlicos livres (ex. cido cafico) associados a protenas daqueles esterificados (ex. 5-ACQ) e, tambm, ligados a protenas. A CLAE-EM tambm foi empregada para anlise de compostos fenlicos em plantas53-56. Li e colaboradores53 isolaram polifenis do tabaco atravs da extrao em fase slida e identificaram os compostos com CLAEIES-EM. Eles verificaram que a sensibilidade do mtodo foi de 50 ng/ mL e 100 ng/mL para o cido cafico e o 5-ACQ, respectivamente. Carini e colaboradores55 usaram a CLAE/EM com uma interface de ionizao qumica presso atmosfrica (IQPA) para identificao de compostos fenlicos em plantas. A mesma tcnica foi usada para anlise de hidroxicinamatos e catequinas na urina de seres humanos57. A CLAE/IQPA-EM forneceu informaes teis sobre a massa molecular e a estrutura qumica dos compostos. Mais recentemente, a CLAE/ IES-EM/EM foi usada para a anlise de 40 constituintes fenlicos em ameixas secas, incluindo ismeros do ACQ58. Esta tcnica permitiu a identificao inequvoca de uma grande quantidade de compostos fenlicos. O 5-ACQ foi o composto fenlico predominante nessas amostras58. Os espectros de massas dos ismeros do ACG foram investigados recentemente atravs da CLAE/EMn por Clifford e colaboradores59. A CLAE-EM1, EM2, EM3, EM4 permitiu a identificao inequvoca dos ismeros do ACQ, AFQ e diACQ. Na Tabela 3, so mostrados os principais fragmentos obtidos pela anlise dos espectros de massas. Os ismeros 3-ACQ e 5-ACQ apresentaram padres de fragmentao similares. A diferenciao foi possvel pela CLAE/EM2, onde o fragmento secundrio m/z = 161,4 foi identificado exclusivamente no espectro de massas do 5-ACQ. Um outro fato relevante foi a presena do fragmento m/z = 179,5, o qual foi mais abundante no ismero 3ACQ (49) em comparao ao 5-ACQ (5). Em relao aos ismeros diACQ, a identificao inequvoca foi obtida pela CLAE-EM2, onde os fragmentos m/z = 173,5 e m/z = 335,6 foram encontrados exclusivamente no espectro de massas do 3,4-diACQ (Tabela 3). Tambm

Tabela 3. Fragmentos obtidos por LC-EMn para ismeros do ACG EM1 Compostos
3-ACQ 4-ACQ 5-ACQ 3-AFQ 4-AFQ 5-AFQ 3,4-diACQ 3,5-diACQ 4,5-diACQ

EM2 on base
191,5 173,5 191,5 193,5 173,5 191,6 353,4 353,5 353,5

EM3 on base
85,6 93,3 85,7 134 93,3 85,6 173,5 191,5 173,5

EM4 on base
135,6 (14) 135,6 (12) 135,7 (12) 106,5 93,4 85,5 93,3

on molecular
353,7 353,5 353,3 367,5 367,4 367,6 515,7 515,2 515,4

Fragmentos secundrios
179,5 (49) 179,5 (68) 179,5 (5) 191,5 (3) 191,8 (87) 173,6 (6) 335,6 (16) 191,6 (20) 161,4 (2) 173,5 (18) 135,7 (10) 135,7 (14)

Fragmentos secundrios
127,1 (93) 111,2 (47) 127,1 (93) 148,8 (30) 111,5 (44) 127,1 (100) 179,5 (91) 179,5 (53) 179,4 (80) 172,3 (60) 172,2 (75) 172,2 (90) 191,7 (53) 173,5 (8) 191,6 (27)

Fragmentos secundrios
111 (70) 127 (95) 111 (38) 172,9 (2) 172,9 (90) 172,9 (15)

ACQ cido cafeoilqunico; diACQ cido dicafeoilqunico; AFQ cido feruloilqunico; ( ) abundncia relativa do fragmento. Informaes baseadas na ref. 59.

Vol. 27, No. 4

Mtodos para Anlise de cido Clorognico

591

contribuiu de forma relevante a CLAE-EM4, onde o fragmento m/z = 111 foi mais abundante no ismero 3,4-diACQ (70) que no 4,5-diACQ (38). Os ismeros do AFQ tambm apresentaram padres de fragmentao com alguma similaridade. A identificao foi melhor obtida pela CLAE-EM3, onde o pico base do 3-AFQ e do 4-AFQ foi o m/z = 134 e o m/z = 93,3, respectivamente, enquanto no 5-AFQ foi o m/z = 85,6. Embora a CLAE-EMn aumente a potencialidade da tcnica no que diz respeito identificao estrutural dos compostos, ela reduz a sensibilidade do mtodo. Eletroforese capilar A eletroforese capilar tambm foi aplicada para a anlise de compostos fenlicos em plantas60-64. O 5-ACQ o ismero do ACG mais comumente analisado por este mtodo. Sheu e colaboradores61 usaram a eletroforese por zona capilar para separar 12 compostos fenlicos, dentre eles o 5-ACQ. A deteco foi no comprimento de onda de 254 nm. Vaher e Koel62 tambm separaram uma gama de compostos polifenlicos de diferentes plantas por eletroforese por zona capilar. Foi possvel obter uma separao confivel de 5-ACQ, trans-resveratrol, catequina e quercetina usando-se tampo borato e acetonitrila. A cromatografia eletrocintica micelar foi empregada para anlise simultnea de 5-ACQ e xantinas64. A separao dos compostos foi satisfatria. Cada composto foi coletado separadamente e identificado atravs da EM. A eletroforese capilar associada EM permite um aumento na sensibilidade do mtodo e a identificao inequvoca dos compostos, entretanto o tempo de anlise maior j que no uma tcnica hifenada. CONCLUSO Na Tabela 4, apresentado um resumo dos principais mtodos para anlise de ACG. O mtodo oficial da AOAC24 barato e apreTabela 4. Principais mtodos para anlise de ACG Mtodo ESPECTROFOTOMETRIA Mtodo AOAC Mtodo Clifford e Wight CG CG-DIC e CG-EM Ismeros do ACG ACG total ACQ+diACQ, estimativa do AFQ Aplicao

senta resultados satisfatrios para anlise de ACG total no caf verde, entretanto, tedioso e difcil de padronizar. O mtodo espectrofotomtrico de Clifford e Wight25,26 simples, rpido e barato, sendo aplicado para a anlise de ACG total e de ACQ + diACQ. Entretanto, esse mtodo no permite a anlise de ismeros individuais e nem fornece estimativa do contedo de diACQ. Em ambos os mtodos espectrofotomtricos, os resultados podem ser superestimados pela presena de interferentes. O mtodo de CG tem alta preciso e sensibilidade, particularmente a CG/EM. Entretanto, o maior inconveniente da CG, como mtodo de anlise de ismeros individuais do ACG, a necessidade de derivatizao desses compostos fenlicos para convert-los em derivados volteis, os quais passam totalmente fase de vapor nas condies de temperatura usadas normalmente na CG. Indubitavelmente, a CLAE o mtodo mais utilizado para a anlise de ismeros individuais do ACG, tanto pela sua simplicidade e rapidez como tambm pela separao satisfatria dos ismeros. No caso somente da anlise dos ismeros do ACQ e diACQ, 4-AFQ e 5AFQ em coluna de fase apolar, o modo isocrtico pode ser usado com separao aceitvel, o que permite um tempo de anlise em torno de 20 min. Neste caso, haver uma superestimativa do 4-ACQ devido coeluio com o 3-AFQ. J o modo gradiente permite a anlise de todos ismeros do ACQ, diACQ e AFQ, porm o tempo de anlise chega a 40 min. A grande vantagem da CLAE-UV com coluna de permeao em gel a possibilidade da anlise simultnea de vrios compostos no caf, o que favorece a automao da anlise. Alm disso, a fase mvel a gua, o que evita o uso de solventes txicos. Entretanto, no caso do ACG a tcnica no permite a anlise de ismeros individuais. Em relao aos detectores empregados na CLAE-UV, o DAD o mais indicado porque aumenta a preciso e exatido da anlise de ismeros do ACG. O uso da CLAE/EM permite a anlise de quantidades diminutas do ACG em plantas e fluidos biolgicos, alm de fornecer um diagnstico da estrutura qumi-

Vantagens e desvantagens

Ref.

Superestimativa do teor de ACG, simples, barato, demorado Simples, rpido, no fornece estimativa do teor de diACQ

24 25, 26

Exige derivatizao dos compostos, dispendiosa, boa preciso. A CG-EM auxilia na identificao estrutural dos compostos

32

CLAE CLAE-UV-fase reversa CLAE-UV/IR permeao em gel CLAE-EM Ismeros do ACG ACG total Ismeros do ACG No exige derivatizao, rpida, dispendiosa, boa preciso, uso de solventes txicos Anlise simultnea de outros componentes do caf, dispendiosa, rpida, usa gua como solvente tima preciso e exatido, alta sensibilidade, dispendiosa, auxilia na identificao estrutural dos compostos 37,40 46-48 54, 58

ELETROFORESE Eletroforese capilar Ismeros do ACG Alta versatilidade, baixo custo, uso ainda pouco difundido 62, 64

CG = cromatografia gasosa; DIC = detector de ionizao em chama; CLAE = cromatografia lquida de alta eficincia; UV = ultravioleta; IR = ndice de refrao; EM = espectrometria de massas

592

De Maria e Moreira

Quim. Nova

ca dos compostos. A CLAE/EM no necessita de derivatizao dos analitos e, portanto, mais rpida que a CG/EM. O mtodo preciso e apresenta alta sensibilidade. Entretanto, o equipamento da CLAE/ EM ainda mais caro que o da CG/EM. Com a reduo do custo do equipamento, a CLAE-EM dever ser uma das tcnicas mais usadas para anlise de ismeros do ACG. A eletroforese capilar permite a separao de um grande nmero de compostos fenlicos com diferentes funes qumicas. Alm disso, a separao simultnea de compostos pertencentes a diferentes classes qumicas, como o caso das xantinas e compostos fenlicos, indica a grande versatilidade da tcnica. Alm do mais, a separao dos compostos pela eletroforese capilar com deteco pela EM tem um menor custo, em comparao CLAE-EM. Entretanto, a anlise pela CLAE-EM mais rpida, j que uma tcnica hifenada. O mtodo de eletroforese capilar ainda pouco difundido, o que pode ser constatado pelo menor nmero de publicaes cientficas em comparao CLAE. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem o apoio da Fundao Carlos Chagas Filho de Amparo Pesquisa do Rio de Janeiro (FAPERJ) e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq). REFERNCIAS
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Payen; Ann. 1846, 60, 286. Gorter, K.; Ann. 1907, 358, 327 Fischer, H. O. L.; Dangschat, G.; Ber. 1932, 65B, 1037. Sondheimer, E.; Szymanski, C. D.; Corse, J. W.; J. Agric. Food Chem. 1961, 9, 146. Clifford, M. N.; J. Sci. Food Agric. 1999, 79, 362. Clifford, M. N.; J. Sci. Food Agric. 2000, 80, 1033. IUPAC; Biochem. J. 1976, 153, 23. Pontes, P. V.; Moreira, R. F. A.; Trugo, L. C.; De Maria, C. A. B.; J. Sci. Food Agric. 2002, 82, 1177. Clifford, M. N.; Ohiokpehai, O.; Anal. Proc. 1983, 20, 83. Clifford, M. N. Em Coffee botany, biochemistry and production ob beans and beverage; Clifford, M. N.; Wilson, R. C., eds.; Elsevier Applied Science Publishers: New York, 1985. Clifford, M. N. Em Coffee vol. 1- Chemistry; Clarke, R. J.; Macrae, R., eds.; Elsevier Applied Science Publishers: New York, 1985. Borish, E. T.; Cosgrove, J. P.; Church, D. F.; Deutsch, W. A.; Pryor, W. A.; Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985, 133, 780. Ohnishi, M.; Morishita, H.; Iwahashi, H.; Toda S.; Shirataki, Y.; Kimura, M.; Kido R.; Phytochemistry 1994, 36, 579. Luzia, M. R.; Trugo, L. C.; da Paixo, K. C. C.; Marclio, R.; De Maria, C. A. B.; Quinteiro, L. M. C.; Lebensm. Wiss. Technol. 1998, 31, 64. Meyer, A. S.; Heinonen, M.; Frankel, E. N.; Food Chem. 1998, 61, 71. Friedman, M.; J. Agric. Food Chem. 1997, 45, 1523. Rohn, S.; Rawel, H. M.; Kroll, J.; J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 3566. Krakauer, T.; Immunopharmacol. Immunotoxicol. 2002, 24, 113. Olthof, M. R.; Hollman, P. C.; Zock P. L.; Katan, M. B.; Am. J. Clin. Nutr. 2001, 73, 532. Charaux, C.; J. Pharm. Chim. 1910, 2, 292. Slotta, K. H.; Neisser, K.; Ber. 1938, 71B, 1611. Moores, R. G.; Mcdermott, D. L.; Wood, T. R.; Anal. Chem. 1948, 20, 620.

11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22.

23. Weiss, L. C.; J. Ass. Off. Anal. Chem. 1953, 36, 663. 24. A.O.A.C.; Official Methods of Analysis, Association of Official Analytical Chemists, 14th ed., Arlington, 1984. 25. Clifford, M. N.; Wight, J.; J. Chromatogr. 1973, 86, 222. 26. Clifford, M. N.; Wight, J.; J. Sci. Food Agric. 1976, 27, 73. 27. Pictet, G.; Brandenberger, H.; J. Chromatogr. 1960, 4, 396. 28. Corse, J.; Lundin, R. E.; Waiss, A. C. Jr.; Phytochemistry 1965, 4, 527. 29. Grodzinska-Zachwiesja, Z.; Kahl, W.; Warchol, A.; J. Chromatogr. 1967, 29, 362. 30. Langer, S. H.; Pantages, P.; Wender, I.; Chem. Ind. 1958, 1664. 31. Sabir, M. A.; Sosulski, F. W.; Finlanyson, A. J.; J. Agric. Food Chem. 1974, 22, 575. 32. Hughes, W. J.; Thorpe T. M.; J. Food Sci. 1987, 52, 1078. 33. Rees, D. I.; Theaker, P. D.; 8th Colloque Scientifique International sur le Caf, ASIC: Paris, 1977. 34. Court, W. A.; J. Chromatogr. 1977, 90, 287. 35. William, M. W. Jr.; Purcell, A. E.; McCollum, G. K.; J. Agric. Food Chem. 1979, 27, 938. 36. Van der Stegen, G. H. D.; Van Duijn, J.; 9 th Colloque Scientifique International sur le Caf, ASIC: Paris, 1980. 37. Trugo, L. C; Macrae, R.; Analyst 1984, 109, 263. 38. Ky, C. L.; Noirot, M.; Hamon, S.; J. Agric. Food Chem. 1997, 45, 786. 39. Rubach, K.; Dissertation, Technische Universitt Berlin, German, 1969. 40. Balyaya, K. J.; Clifford, M. N.; J. Food Sci. Technol. 1995, 32, 104. 41. Bilia, A. R.; Fumarola, M.; Gallori, S.; Mazzi, G.; Vincieri, F. F.; J. Agric. Food Chem. 2000, 48, 4734. 42. Matilla, P.; Kumpulainen, J.; J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 3660. 43. Dawes, H. M.; Keene, J. B.; J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 2398. 44. Chang, Q.; Zhu, M.; Zuo, Z.; Chow, M.; Ho, W. K.; J. Chromatogr., B: Biomed. Sci. Appl. 2001, 760, 227. 45. Bandoniene, D.; Murkovic, M.; J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 2482. 46. Trugo, L. C.; De Maria, C. A. B.; Werneck, C. C.; Food Chem. 1991, 42, 81. 47. De Maria, C. A. B.; Trugo, L. C.; Moreira, R. F. A.; Food Chem. 1995, 52, 447. 48. De Maria, C. A. B.; Trugo, L. C.; Cor, G.; Quim. Nova 1996, 19, 350. 49. Olthof, M. R.; Hollman, P. C.; Katan, M. B.; J. Nutr. 2001, 131, 66. 50. Azuma, K.; Ippoushi, K.; Nakayama, M.; Ito, H.; Higashio, H.; Terao, J.; J. Agric. Food Chem. 2000, 48, 5496. 51. Nardini, M.; Cirillo, E.; Natella, F.; Scaccini, C.; J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 5735. 52. Cremin, P.; Kasim-Karakas, S.; Waterhouse, A. L.; J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 1747. 53. Li, Z.; Wang, L.; Yang, G.; Shi, H.; Jiang, C.; Liu, W.; Zhang, Y.; J. Chromatogr. Sci. 2003, 41, 36. 54. Dueas, M.; Hernndez, T.; Estrella, I.; Rabanal, R.; Food Chem. 2003, 82, 373. 55. Carini, M.; Aldini, G.; Furlanetto, S.; Stefani, R.; Facino, R. M.; J. Pharm. Biomed. Anal. 2001, 24, 517. 56. Tolonen, A.; Joutsamo, T.; Matilla, S.; Kamarainen, T.; Jalonen, J.; Phytochem. Anal. 2002, 13, 316. 57. Nielsen, S. E.; Sandstrom, B.; J. Chromatogr., B: Biomed. Sci. Appl. 2003, 787, 369. 58. Fang, N.; Yu, S.; Prior, R. L.; J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 3579. 59. Clifford, M. N.; Johnston, K. L.; Knight, S.; Kuhnert, N.; J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 2900. 60. Spilkova, J.; Bednar, P.; Stroblikova, R.; Pharmazie 2001, 56, 424. 61. Sheu, S. J.; Chieh, C. L.; Weng, W. C.; J. Chromatogr. 2001, 911, 285. 62. Vaher, M.; Koel, M.; J. Chromatogr., A 2003, 990, 225. 63. Yang, X.; Han, F.M.; Cheng, Z.Y.; Chen, Y.; Se Pu. 1999, 17, 573. 64. Pomilio, A. B.; Trajtemberg, S.; Vitale, A. A.; Phytochem. Anal. 2002, 13, 235.