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Centro Federal de Educao Tecnolgica de Qumica de Nilpolis Unidade Rio de Janeiro Relatrio de Microbiologia: Tcnicas de Contagem Pour-Plate e SpreadPlate

Rio de Janeiro, 16 deMaio de 2008. Alunas: Adriana de Menezes N.: 01 Elizana Azevedo Silva N.: 06 Thays Cristine dos Santos Vieira N.: 15 Turma: QM 171. Professoras: Carolina e Lidiane. Disciplina: Microbiologia. Rio de Janeiro 2008 Tcnicas de Contagem Pour-Plate e Spread-Plate Introduo Terica:

Alm da identificao do tipo do microrganismo de um meio, tambm importante em alguns casos sua quantificao. Como exemplo de casos em que a quantificao de microrganismos torna-se importante, pode-se citar: quantificao da populao de

microrganismos da gua e alimentos para avaliar a qualidade microbiolgica dos mesmos, na anlise da eficincia de agentes antimicrobianos ou a eficcia de prticas higinco-sanitrias para se verificar a populao sobrevivente ao tratamento. E, a vrias tcnicas de contagem de microrganismos.
Assim, os microrganismos podem ser quantificados de forma direta, contando-se microscopicamente o nmero de clulas presentes num determinado material ou superfcie, ou indiretamente, efetuando-se anlises da turbidez, determinao do peso seco, concentrao de substncias qumicas (protenas, pesquisa de determinada enzima ou produto final de uma via metablica, DNA, RNA) ou atravs da contagem do nmero de microrganismos viveis utilizando um meio de cultura apropriado. Esse ltimo mtodo leva em considerao um quesito importante para a tcnica de contagem, que a quantificao de apenas clulas vivas. Pois, em determinadas circunstncias, como aquelas em que se avalia as prticas higinico-sanitrias, preciso determinar a populao de clulas viveis. E, para efetuar a contagem total de bactrias numa determinada suspenso da amostra faz-se diluies decimais seriadas da amostra e inocula-se, usualmente, pela tcnica de Pour-Plate ou Spread-Plate com Ala de Drigalsky, em meios de cultura apropriados. Aps o perodo de incubao em condies de temperatura e atmosfera adequadas faz-se a contagem do nmero de colnias. A diferena de um mtodo para o outro que o mtodo Pour-Plate coloca-se, primeiramente, a alquota de 1ml da amostra com os microrganismos em uma Placa de Petri estril sem, o meio de cultura, pois esse ser colocado por cima dos microrganismos na placa. E, na tcnica Spread-Plate o meio de cultura j se encontra na placa e os microrganismos so colocados por cima do meio e so espalhados com o auxlio da Ala de Drigalsky (figura 1). Figura1 Figura retirada do site: www.cial-paulinia.com.br Porm, as regras so as mesmas para as duas tcnicas de quantificao direta. Sendo elas:

Prncpio Bsico: Cada colnia originada do crescimento e multiplicao de 1 clula bacteriana. As placas devem conter de 30 a 300 colnias e para isso fazem-se as diluies seriadas, como o procedimento feito para essa prtica.

Assim, para a realizao da seguinte prtica utilizou-se a bactria Escherichia coli, que assume a forma de um bacilo e pertence famlia das Enterobacteriaceae. So aerbias e anaerbias facultativas. O seu habitat natural o lmen intestinal dos seres humanos e de outros animais de sangue quente. E possui mltiplos flagelos dispostos em volta de sua clula.

Objetivo: Verificar a validade dos mtodos Spred-Plate e Pour-Plate para a quantificao clulas viveis de microrganismos. Materiais e Reagentes: 1) Pour Plate: Materiais Reagentes Estante para Tubos de Ensaio Cultura de E. coli 2 Tubos de Ensaio com 9mL de gua Peptonada gua Peptonada 2 Placas de Petri Meio de Cultura gar Nutriente 3 Pipetas de 2mL Vrtex Pr-pipete Bico de Bunsen 2) Spread Plate: Materiais Reagentes 1 Ala de Vidro Ala de Driglasky Cultura de E. coli 2 Tubos de Ensaio com 9mL de gua Peptonada gua Peptonada 2 Placas de Petri com Meio Agar Nutriente Meio de Cultura gar Nutriente Bico de Bunsen Bcher com lcool 2 Pipetas de 5mL 1 Pipeta de 2mL Estante de Tubos de Ensaio Pr-pipete Vrtex Procedimentos:

Primeiramente foram realizadas as manobras asspticas adequadas, higienizando-se as mos e esterilizando-se a bancada, ambos com lcool iodado, a fim de reduzir a carga microbiana do local de trabalho. E trabalhou-se, todo o tempo, nas proximidades do Bico de Bunsen, na chamada zona estril. Foram utilizados dois mtodos de contagem do crescimento microbiano, primeiramente o Spread-Plate e aps o Pour-Plate. No mtodo Spread-Plate, foram feitas duas diluies com a soluo concentrada de cultura bacteriana (10-1 e 10-2), ao qual essa cultura, onde estava presente a bactria E.coli, foram diludas em gua peptonada. Essas diluies foram feitas da seguinte forma: Com o auxlio de uma pipeta graduada de 2mL foi adiciona 1mL da soluo concentrada de cultura bacteriana ao tubo de ensaio onde a diluio foi de 10-1, tendo-se, posteriormente, homogeneizado o tubo. Com outra pipeta graduada de 2mL, foi adicionado 1mL da soluo primeiramente diluda (de concentrao 10-1) no tubo de diluio 10-2(posteriormente homogeneizado). Com essa mesma pipeta, retirou-se 0,1mL da soluo diluda de 10-1 e colocou-se em uma Placa de Petri anteriormente esterilizada. Pegou-se uma terceira pipeta graduada e retirou-se, tambm 0,1mL, da soluo diluda de 10-2 e colocou-se em outra Placa de Petri, anteriormente esterilizada. Aps ter posto nas placas as culturas bacterianas diludas, colocou-se sobre ele o gar nutriente em seu estado lquido (o gar deve estar em uma temperatura ideal para que no mate a cultura bacteriana). Completou-se, assim, o mtodo Spread-Plate. No mtodo Pour-Plate, realizou-se as mesmas diluies, da mesma forma como foi feito no mtodo Spread-Plate. Aps serem feitas as diluies, pegou-se uma pipeta graduada e retirou-se 0,1 de cada tubo(diluies 10-1 e 10-2) e colocou-se cada soluo em uma Placa de Petri anteriormente esterilizada e contendo a soluo de gar nutriente. Com o auxlio de uma Ala de Drigalsky, anteriormente flambada, espalhou-se a soluo contendo a cultura microbiana homogeneamente sobre a superfcie do gar. Incubou-se as Placas de Petri em estufa a temperatura de 36-37C por um perodo de 24 horas, aps esse perodo, levou-se as placas para a geladeira. Resultados e Discusso: 1) Pour Plate: Tanto na placa de concentrao 10-1 quanto na placa de concentrao 10-2, no foi possvel contar o numero de colnias, pois estavam acima do limite (entre 30 e 300 colnias). Pode-se perceber que para uma contagem efetiva seria necessrio, no mnimo, mais uma diluio. Na foto abaixo, que mostra os resultados obtidos nessa prtica, visualiza-se porque a contagem no foi possvel.

Figura 2: Resultado da prtica de contagem Tcnica Pour-Plate Placa da esquerda (conc. 10-2) Placa da direita (conc. 10-1). 2) Spread Plate: No foi possvel realizar a contagem em nenhuma das placas. Novamente, assim como na tcnica do Pour-Plate, as concentraes das colnias estavam acima do valor mximo. Nessa tcnica tambm seria necessria mais uma diluio. Nas fotos abaixo, pode-se comparar o resultado obtido com o resultado que seria ideal.

Figura 3: Exemplo de placa contvel Cultura de Salmonella prtica realizada por outra turma (conc. 10-2).

Figura 4: Resultado da prtica de contagem Tcnica Spread-Plate Placa da esquerda (conc. 10-1) Placa da direita (conc. 10-2). Concluso: Aps a visualizao dos resultados da prtica, pode-se concluir que os dois mtodos seriam eficazes para a contagem de colnias bacterianas. Porm, isso no foi possvel em nosso experimento, pois as solues utilizadas ainda possuam altas concentraes de bactrias, sendo necessrio, no mnimo, mais uma diluio para a realizao da contagem. Bibliografia: Acessados em 13/05/2008: www.microbiologia.ufba.br/aulas/Contagem%20em%20placas%20pourplate.rtf www.uma.pt/gcosta/docs/microbiology/prat2.pdf www.dbi.ca/Books/Graphics/image-27.gif

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